MAGYAR NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÁS Bevezetés Ph.D. munkám során az agynak a neurodegeneratív folyamatok iránti érzékenységét vizsgáltam, különös tekintettel a korai neonatális fejlődést befolyásoló különböző faktorok és a felnőttkori hormonális állapotok hatására. Részletesebben, állatkísérleteket hajtottunk végre, melyek során a posztnatális handling és a neuropeptid ACTH-(4-9) analóggal azaz ORG 2766-tal történő posztnatális kezelés hosszú távú hatásait vizsgáltuk. Az állatok stressz reaktivitását, tanulási képességét, valamint a neurodegenerációval szembeni érzékenységét teszteltük felnőtt életkorban. Továbbá felnőtt nőstény patkányokon ösztradiol kezelést hajtottunk végre, hogy bővebb ismereteket nyerjünk az ösztrogéneknek a tanulásra kifejtett hatásáról és az akut agyi károsodással szembeni lehetséges védő szerepéről. A legtöbb kísérletben a bazális előagyi kolinerg rendszerre összpontosítottunk, különös tekintettel annak plaszticitására és a károsodással szembeni érzékenységére. Kolinerg neuronok, tanulás és memória A kolinerg rendszer általánosan jelentős szerepet játszik a kognitív funkciókban, de szerepe talán a legfontosabb a tanulás és emléknyomrögzítés kezdeti szakaszában, mely során a figyelmet és ‘érdeklődést’ fokozza. Ez a két tényező alapvetően szükséges ahhoz, hogy valamit meg tudjunk tanulni és emlékezzünk rá. Továbbá az acetilkolinerg neuronok károsodása fontos szerepet játszik a tanulási képességek csökkenésében, mely felléphet akut idegrendszeri károsodás után mint pl. az agyvérzés, és kialakulhat lassan progrediáló agykárosodásokkor, mint pl. az öregedési folyamat során és neurodegeneratív betegségekben, úgy mint Alzheimer-kórban. Mai idősödő társadalmunk és a neurodegeneratív betegségek emelkedő száma arra késztet minket, hogy az idegrendszer károsodását befolyásoló környezeti faktorokat és folyamatokat minél jobban megismerjük és ezt a tudást a megelőzésben és gyógyításban felhasználjuk. A korai fejlődés során az agy különösen érzékeny a különböző környezeti hatásokra, úgy mint a külvilágból származó stimulusokra, az anyai-szülői gondoskodás mértékére és az anyai eredetű endokrin faktorokra. Tudományos állatkísérletek kimutatták, hogy az anya-kölyök kapcsolatban bekövetkező specifikus változások, illetve a korai fejlődési periódus során adott bizonyos gyógyszeres kezelések hosszú távon fennmaradó elváltozásokat okozhatnak az agyban. Valószínűleg fontos biológiai funkciója van annak, hogy a születést követő periódusban a környezeti faktorok iránti érzékenység ennyire fokozott. Ez az érzékenység lehetőséget teremt arra, hogy az utódok optimálisan alkalmazkodjanak ahhoz a környezethez, amiben megszülettek és felnőnek. Ez a
208
Összefoglalás
plaszticitás azonban azzal is együttjár, hogy bizonyos környezeti hatások kedvezőtlenül befolyásolhatják a fejlődést és az így indukált elváltozások az egyén fokozottabb sérülékenységét eredményezhetik. Neurobiológiai és viselkedési tanulmányok igazolták, hogy az ösztrogének női nemi hormon szerepük mellett olyan agyfunkciókat is befolyásolnak, melyek függetlenek a szaporodástól. Az ösztrogének többféle neurotranszmitter rendszerre is hatnak, többek között a bazális előagyi kolinerg neuronokra. Az ösztrogének potenciális neuroprotektív hatását sugallják azok a klinikai tanulmányok, melyek kimutatták, hogy a posztmenopauzális ösztrogén kezelés a neurodegeneratív betegségek, mint pl. az Alzheimer-kór kialakulásának esélyét csökkenti és az agyvérzés utáni felépülést is elősegíti. Kísérletek Kísérleteinkhez Wistar patkányokat használtunk. A kezeléseket vagy a korai fejlődési stádiumban (posztnatális handling és ACTH-(4-9) analóg kezelés) vagy felnőttkorban (ösztradiol kezelés) hajtottuk végre. Ezt követően először mindegyik kísérletben a kezelésnek a felnőttkori viselkedésre kifejtett hatását vizsgáltuk, majd a kolinerg rendszernek a neurodegenerációval szembeni érzékenységét teszteltük. A viselkedési tesztek során különösen a tanulási képességeket tanulmányoztuk, néhány kísérletben a viselkedési és endokrin stresszválaszkészséget is vizsgáltuk. Ez utóbbit azért tartottuk fontosnak, mert a stressz rendszerben illetve a stressz érzékenységben bekövetkező változások jelentősen befolyásolhatják mind a tanulási képességet illetve a neurodegeneratív folyamatok iránti érzékenységet. A kolinerg rendszernek a neurodegenerációval szembeni érzékenységét egy állatmodell segítségével vizsgáltuk, mely során N-metil-D-aszpartát (NMDA) agyi infúziójával agyi károsodást indukáltunk. Az NMDA molekula a glutamát neurotranszmitter egyik specifikus receptortípusához kötődik és azon keresztül erős serkentő hatást fejt ki. A nagy NMDA dózisnak (40 illetve 60 nmol) köszönhetően az idegsejtek túlzott excitációja lép fel, mely azok károsodásához vagy pusztulásához vezet. A természetes körülmények között előforduló neurodegeneratív folyamatokban általánosan fontos szerepet játszik az idegsejteknek az excitatórikus neurotranszmitterek általi túlzott stimulációja. Kísérleteinkben az NMDA-t szelektív módon a kolinerg nucleus basalis magnocellularisba (NBM) injektáltuk. Ezt követően az NBM-ben lévő kolinerg sejtek pusztulását és azok agykéregbe projiciáló rostjainak a degenerációját mértük meg, és azt vizsgáltuk, hogy a károsodás mértékét hogyan befolyásolják a különböző posztnatális manipulációk és a felnőttkori ösztradiol kezelés. Posztnatális handling Ph.D. munkám első kísérleteiben a posztnatális handling hosszú távú hatásait vizsgáltam. Ezeket a kísérleteket korábbi megfigyelések serkentették, melyek
Összefoglalás
209
kimutatták, hogy patkánykölyköknek a születést követő első hetekben történő, rövid ideig tartó elválasztása anyjuktól hatással van az anya-kölyök kapcsolatra. Ennek talán a legfontosabb következménye az anyai gondoskodás fokozódása, úgy mint a kölykök fokozottabb nyalogatása és tisztogatása. Továbbá úgy tűnik, hogy ez a fokozott anyai gondoskodás maradandó változásokhoz vezethet az utódok fiziológiájában és viselkedésében is. Kísérleteinkben néhány fészekalj kölykeit posztnatálisan handlingeltük, míg a többi fészekalj kölykei zavartalanul folyamatosan együttmaradtak az anyjukkal. A posztnatalis handling során az állatokat a 3-hetes szopási periódus során naponta egy rövid időre (csak 15 percre) elválasztottuk az anyjuktól. Az elválasztás mindennap ugyanabban az időpontban történt és a 15 perces elválasztás során a kölyköket rövid ideig simogattuk majd egy meleg tartóba helyeztük őket, hogy lehetséges lehülésüket megelőzzük. A 15 perces elválasztás után a kölyköket és anyjukat ismét visszahelyeztük a saját ketrecükbe. A születést követő 24. napon a handlingelt és a kontroll kölyköket végleg elválasztottuk az anyjuktól. A kölykök standardizált körülmények között tovább fejlődtek és amikor elérték a fiatal felnőttkort, a 3. hónap után további kísérleteket hajtottunk velük végre. Az első kísérlet azt mutatta, hogy a posztnatális handlingelés hosszú távú elváltozásokat indukál a neuroendokrin és viselkedési stressz reaktivitásban (2. fejezet) A viselkedési tesztek eredményei azt jelezték, hogy a posztnatálisan handlingelt állatok kevésbé félnek/szoronganak egy új környezetben. A hormonszint mérések eredményei megerősítették ezt a megfigyelést, ugyanis a veszélyes, új környezet által kiváltott stresszválasz során a posztnatálisan handlingelt állatoknak a stressz hormonszintjei (kortikoszteron és prolaktin) csak kisebb mértékben emelkedtek meg és előbb visszatértek az eredeti bazális szintre, mint a kontroll állatoké. Igaz kisebb mértékben, de ugyanez megfigyelhető volt az adrenalin válaszban is. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a posztnatálisan handlingelt állatok felnőttkorukban kevésbé stressz érzékenyek és félénkek összehasonlítva a posztnatálisan nem handlingelt kontroll állatokkal. Ezen eredményeink, valamint más laboratóriumok által publikált hasonló eredmények alapján arra gondolhatnánk, hogy a posztnatális handlingnek általánosan pozitív hatása van. Azonban egy további kísérletünkből, mely során a posztnatális handlingnek a kolinerg neuronok vulnerabilitására kifejtett hatását vizsgáltuk, úgy tűnik, hogy a válasz nem ennyire egyszerű. A stressz érzékenységre kifejtett ‘pozitív hatással’ ellentétben, az agykárosodási modell eredményei arra utalnak, hogy a posztnatálisan handlingelt állatok felnőttkorban érzékenyebbek az akut neurotoxikus inzultusra. Az NMDA-nak az NBM-be történő infúziója után a posztnatálisan handlingelt állatokban szignifikánsan kevesebb kolinerg rostot találtunk az agykéregben. A fokozott vulnerabilitást okozó pontos mechanizmus azonban még további vizsgálatokat kíván.
210
Összefoglalás
Posztnatális kezelés az ACTH-(4-9) analóg ORG 2766-tal Kísérletek második sorozatában arra kerestük a választ, hogy a posztnatális ACTH-(4-9) analóg ORG 2766 kezelésnek milyen hosszú távú neurobiológiai hatásai vannak. Az ACTH molekula elsősorban mint stressz hormon ismert, mely a mellékvesekéreg kortikoszteron szekrécióját serkenti. Azonban az ACTH-nak jelentős hatása van a központi idegrendszerre is, mely úton befolyásolja a viselkedést és valószínűleg hatással van a neuronális plaszticitásra. Az ACTH-(4-9) molekulát biokémiai modifikációk alkalmazásával az ACTH-(4-10) molekulából állították elő. A kiindulási vegyület csak idegrendszeri hatásokkal rendelkezik és a periférián szinte hatás nélküli. A biokémiai modifikációknak köszönhetően az idegrendszeri hatások még kifejezettebbé váltak. Számos korábbi tanulmányban kimutatták azt, hogy az ACTH-(4-9) analógnak nemcsak a viselkedésre kifejtett hatásai jelentősek, hanem pozitív hatással van a neuronális plaszticitásra és elősegíti a kísérletes agykárosodást követő felépülést is. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy ennek a neuropeptid analógnak serkentő és trofikus hatása van az idegrendszerre. Így számunkra fontosnak és érdekesnek tűnt az ACTH-(4-9) analóg hatásait a korai posztnatális fázisban tanulmányozni, amikor a központi idegrendszer fejlődése még jelentősen zajlik. Az ACTH-(4-9) analóggal végzett újszölöttkori kísérleteinket korábbi eredmények (Nyakas és mtsai) stimulálták, melyek azt jelezték, hogy az újszölöttkori ACTH-(4-9) analóg kezelés hosszú távú változást indukál egy agyi strukturában (hippokampusz), mely fontos szerepet játszik a stresszválasz regulációjában. Ezt követő kísérleteinkben újszülött patkányoknak a születést követő 1., 3. és 5. napon 1 µg/testtömeg kg ACTH-(4-9) analóg szubkután injekcióját adtuk, míg ugyanazokból a fészekaljakból származó kontroll állatok fiziológiás sóoldat injekciót kaptak. A kísérleti és kontroll állatok a továbbiakban standard körülmények között nőttek fel. A felnőttkori magatartási tesztek eredményei azt mutatták, hogy az újszölöttkori ACTH-(4-9) analóg kezelésnek nem volt hatása az állatok (viselkedési) stressz reaktivitására, azonban hosszú távon befolyásolta azok tanulási képességét, mégpedig specifikusan serkentette a tanulást a Morris-féle water maze térbeli tanulási tesztben (4. fejezet). Ezenkívül egy idősebb patkányokkal végzett másik kísérletben fokozott exploratív viselkedést találtunk a posztnatálisan ACTH-(4-9) analóggal kezelt állatoknál (6. fejezet). Eredményeink azt sugallják, hogy a posztnatális ACTH-(4-9) analóggal történő kezelés fokozott felnőttkori éberséget és környezet iránti figyelmet eredményez. Ezenkívűl a posztnatális ORG 2766 kezelés szignifikánsan csökkentette a felnőttkori NMDA lézió-indukálta kolinerg neuronális károsodást összehasonlítva a kontroll állatokkal (5. fejezet), és ez ellentétes volt a korábbi kísérletünkben talált posztnatális handling hatásával. Az NMDA infúziót követően a posztnatálisan ACTH-(4-9) analóggal kezelt állatokban egyaránt kisebb mértékű kolinerg
Összefoglalás
211
sejtpusztulás volt detektálható az NBM-ben és hasonlóan sokkal kisebb mértékű agykérgi rostkiesés volt megfigyelhető. Eredményeink azt mutatják, hogy a posztnatális ORG 2766 kezelés hatással van a neuronok excitotoxikus stimulációjakor fellépő belső neuroprotektív mechanizmusokra, és valószínűleg a neuronális és glia sejteknek a fokozott válaszkészségéhez vezet. Végül, idősebb állatokkal végzett kísérletünkben azt találtuk, hogy kontroll körülmények között a kolinerg rostok denzitása, specifikusan a hippokampusz CA3 régiójában, magasabb volt a posztnatálisan ORG 2766-tal kezelt állatokban a kontrollokkal összehasonlítva. Ezen eredményeink együttesen arra utalnak, hogy a posztnatális ACTH-(4-9) analóg kezelésnek hosszú távon fennmaradó hatásai vannak a kolinerg rendszerre. Felnőttkori 17β-ösztradiol kezelés A posztnatális manipulációk hosszú távú hatásainak vizsgálata mellett kísérleteinknek egy harmadik csoportja a felnőttkori ösztradiol kezelés hatásainak a tanulmányozására irányult. Ezekben a kísérletekben először nőstény patkányokon petefészekirtást hajtottunk végre, hogy az ösztrogén belső forrását eltávolítsuk. Ezt követően az állatok fele 17β-ösztradiol-3-benzoát (10 mg/250 testtömeg gramm , szubkután injekció, minden 2. nap) kezelésben részesült, míg a kontroll állatok a hatás nélküli olajos vivőanyagot kapták. Eredményeink azt mutatják, hogy a felnőttkori 17β-ösztradiol kezelésnek kifejezetten serkentő hatása van a nőstény patkányok tanulási képességére. Egy asszociációs tanulási tesztben, az ún. ‘two-way active shock avoidance’ tesztben a hormonnal kezelt állatok sokkal gyorsabban tanultak, mint a vivőanyaggal kezelt kontrollok (7. fejezet). Mivel jól ismert, hogy az ösztradiol kezelés serkenti a kortikoszteron termelést, ami szintén szerepet játszhat a tanulási folyamatok szabályozásában, ezért egy következő kísérletben ezen interakciónak a lehetséges szerepét vizsgáltuk (8. fejezet). Mellékveseirtott állatokat különböző koncentrációjú kortikoszteronnal kezeltük szubkután elhelyezett tabletta formájában. Továbbá a korábbi kísérlethez hasonlóan a petefészekirtott állatok ösztradiol vagy kontroll kezelésben is részesültek. Az eredmények azt mutatták, hogy a kortikoszteron nem játszik szerepet az ösztradiolnak az asszociatív tanulásra kifejtett pozitív hatásában (8. fejezet). Azonban az ösztradiol kezelés nem minden tanulási tesztben hatásos, amint ez a passzív shock avoidance tesztből kiderült. Ebben az asszociatív tanulási tesztben az ösztradiol kezelés sem önállóan sem kortikoszteron kezeléssel kombinálva nem befolyásolta a tanulási teljesítményt (7., 8. fejezet). Viselkedési hatásai mellett, az ösztradiol kezelésnek serkentő hatása volt a kolinerg rendszerre, mely a szomatoszenzoros kéregben mért fokozott kolinerg rostdenzitásban nyilvánult meg (7. fejezet). Ellenben az ösztradiol kezelésnek nem volt védő szerepe az NMDA lézió-indukálta excitatórikus kolinerg károsodással szemben, az előagyi kolinerg sejtpusztulás és az agykérgi rostkiesés egyaránt
212
Összefoglalás
azonos mértékű volt az ösztradiollal kezelt illetve kontroll állatokban. Azonban az ösztradiollal kezelt állatokban a szinaptikus kapcsolat egyik markerének, a preszinaptikus szinaptofizin fehérjének a mennyisége nem csökkent az NMDA lézió okozta kolinerg rost kiesés követően, míg a kontroll állatoknál a várható csökkenés volt detektálható. Ez azt sugallja, hogy az ösztradiol-kezelt állatokban a kiesett agykérgi kolinerg beidegzést valószínűleg más neurotranszmitter rendszerek pótolták és ezáltal változatlan maradt a szinaptikus összdenzitás. Következtetések Eredményeinket összefoglalva megállapítható az, hogy akár kisebb mértékű manipulációk valamint specifikus gyógyszeres kezelések alkalmazása a korai posztnatális periódusban jelentős hatással van a kölykök fejlődésére. Ezek szemmel látható maradandó élettani és viselkedési elváltozásokhoz vezetnek, továbbá hatással lehetnek a felnőttkori neurodegeneratív folyamatok iránti érzékenységre. Az újszülöttkori handlinggel kapcsolatos eredményeink azt mutatják, hogy a normális anya-kölyök interakciónak röviddel a születést követően történő befolyásolása, valószínűleg az anyai gondoskodás serkentése útján, a kölykökben csökkent félelmet és neuroendokrin stressz érzékenységet eredményez felnőttkorban, míg a modellünkben alkalmazott akut agykárosodás iránti érzékenységet növeli. Ezzel szemben az újszülöttkori ACTH-(4-9) analóggal történő kezelés nem befolyásolta a felnőttkori stresszválaszkészséget, azonban valószínűleg specifikus neuronális körökre hatva hosszú távon serkentette az állatok térbeli tanulási képességet. Továbbá az excitatórikus neuronális károsodás iránti érzékenységet csökkentette. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a posztnatális handlingnek és egyéb újszülöttkori eseményeknek az egészségre illetve betegségre vonatkozó következményeit nehéz általánosítani. Az újszülöttkori hatások okozta változások csökkenthetik az érzékenységet bizonyos betegség típusok iránt (például a stresszel-összefüggő depresszió iránt) míg más betegségekkel kapcsolatban fokozhatják a sérülékenységet (például agyi károsodás agyvérzést követően). Igaz felnőttkorban az agy plaszticitása kisebb mértékű, mint a születés körüli időszakban, mégis bizonyos mértékű plaszticitás a felnőtt agyban is jelen van és mint eredményeink is mutatják ez befolyásolható endokrin faktorok, pl. ösztradiol által. Az ösztradiolnak pozitív hatása van az agykéreg kolinerg rostrendszerére és bizonyos tanulási teljesítményekre. Ezenkívül, az ösztradiol kezelés közvetlenül nem csökkenti a kolinerg neuronok akut excitatórikus károsodását, de kompenzatórikus válaszokat és további más neurotranszmitter rendszereket stimulál. Valószínűleg ezeken a mechanizmusokon keresztül a posztmenopauzális ösztradiol kezelésnek kedvező hatása van az agyi kognitív funkciókra, mind az öregedés során és a különböző demenciákban, köztük az Alzheimer-kórban.
Összefoglalás
213
Az idegrendszer betegségei, úgy mint az akut agyvérzés vagy a lassabban kifejlődő neurodegeneratív betegségek nem egyetlen oknak vagy folyamatnak a következményei, hanem különböző és komplex interaktív folyamatok eredményei. A környezeti faktorok által - különösen a fejlődés korai szakaszában - indukált élettani változásoknak fontos szerepük van a központi idegrendszer sérülékenységében megfigyelhető nagy egyéni variabilitásban. E lehetséges faktoroknak és az általuk indukált (kór)élettani folyamatoknak a tanulmányozása állatkísérletek segítségével alapvető jelentőségű lehet abban, hogy a gyermek- és felnőttkori neurológiai betegségeket jobban megértsük illetve azok megelőzésének és kezelésének a módját megtaláljuk.
