Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (miR) profiljának vizsgálata Dr. Nemes Karolina, Márk Ágnes, Dr. Hajdu Melinda, Csorba Gézáné, Dr. Kopper László, Dr. Csóka Monika, Dr. Sebestyén Anna II.sz.Gyermekgyógyászati Klinika, I.sz.Patológiai Intézet
Mikro RNS (miR) • 18-40 nukleotid hosszúság (ált. 22 nt) • nem kódoló RNS • szabályozó RNS (miR, miRszerű szabályozó RNS-ek) • humán genom 2%-a miR-t kódol • tumorszupresszor, és onkogén miR • szerep számos sejt és tumorbiológiai folyamat (proliferáció, differenciáció, apoptózis, túlélés...) szabályozásában • Az első bizonyított kapcsolatot a miR-ek és humán daganatok között CLL-ben (miR15 és miR16-1)
DLBCL, ALL és miR DLBCL (diffúz, nagy B-sejtes lymphoma) • miR155 fokozott expressziója (Calin et al. 2004) • miR21 expresszió asszociál a relapszus mentes túléléssel (Ch.H. Lawrie et al. 2008) ALL (akut lymphoblasztos leukémia) • 27 miR-t vizsgálva a miR128a, 128b szignifikánsan magasabb az ALL-es betegekben, a let-7b, és a miR223 pedig az AML-es betegekben (J. D. Rowley et al. 2007) • 46 miR-t vizsgálva 5 miR (miR128b, 181b-1, 204, 218, 331) fokozott expressziót mutat ALL-ben (D.L. Zanette et al. 2007) • miR16 fokozott expressziója asszociál a rossz prognózissal gyerekkori ALL-ben (T. Kaddar et al. 2009)
MiR klinikai felhasználhatóság? • Diagnosztika: a miR expressziós mintázat segítséget nyújthat különböző daganatokcsoportok, valamint rosszul differciált daganatok diagnosztizálásában • Prognózis megítélése: a miR-155 overexpressziója a rossz pronózis előrejelzője lehet B sejtes lymphomákban • Terápiás célpont: anti-sense miR oligonukleotidok (AMO) alkalmazása (onkogén miR-ek expressziójának csökkentésére, tumorszupresszor miR-ek expressziójának fokozására)
Célkitűzések • Irodalmi adatok alapján kiválasztott különböző miR-ek (miR16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155) expressziójának vizsgálata ALL sejtekben és egyéb humán lymphoma sejtvonalakban (a beállításhoz bizonyos lymphomák/leukémiák esetében már vizsgált miR-ek) • Akut lymphoblasztos leukémiás sejtek miR expressziójának összevetése a betegek prognosztikai adataival, betegekben a kemoterápia miR profilra kifejtett hatásának vizsgálata (követéses vizsgálat) • Különböző leukemia/lymphoma sejtvonalakban az in vitro kemoterápiás kezelés miR expresszióra gyakorolt hatásának vizsgálata • Jelátviteli fehérjék expresszió változásának vizsgálata in vitro
Módszerek • Sejtvonalak: KMH2: Hodgkin lymphoma, BHD1: diffúz, mediasztinális, nagy Bsejtes lymphoma, Raji, Ramos, Daudi: Burkitt lymphoma, Mn60, Nalm6: B-sejtes akut lymphoblastos leukémia, Jurkat, CEM: T-sejtes akut lymphoblastos leukaemia, HL60: promyelocytás leukemia
• ALL sejtek izolálása: csontvelői és/vagy perifériás vér minta ficoll grádiens centrifugálása (46 ALL-es beteg, ff-nő;31-15), 37 esetben a kezelési protokoll alatt teljes minta követés
• Taqman miRNA assay:
(miRVanaTM
miRNA Isolation Kit, real time PCR TaqMan MicroRNA Assay-ék (miR16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155, endogén kontroll RNU6B)
B-ALL ff., 19
B-ALL nő, 10
T-ALL nő, 2
T-ALL ff., 6
• Kezelések in vitro: doxorubicin: 24h-96h; 200nM-3,6mM; cytosinarabinosid: 24h-96h; 10 mg/ml-20mg/ml
• Áramlási citometria • Immuncitokémia
Lymphoma/leukémia sejtvonalak miR expressziója sejt-
BHD1
Raji
Daudi BJAB KMH2
HL60
Jurkat
miR16
↑
↑
+
-
miR21
↑
↑
+
miR155
↑↑
+
miR24
↑
miR29b
Mn60 Nalm6
↑
+
↑
+
+
+
↑
+
+
-
-
-
-
↑↑
-
-
-
-
+
-
+
↑↑
↑
+
-
+
↑↑
+
+
-
↑
+
↑
+
-
miR128b
↑↑
↑
+
↑
↑↑
+
↑↑↑↑
↑
↑↑↑
miR1423p
↑
+
+
-
↑
+
↑
+
+
vonalak
MiR profil különböző lymphoma/leukémia sejtvonalakon
ALL-es sejtek miR expressziója kezelés előtt, kezelést követően (3. hónap) • 11 ALL-es gyerek (23 minta) T-ALL B-ALL
Expresszió T-ALL B-ALL változás iránya
miR16
-/+
+
miR16
↑
↓↓
miR21
-
-/+
miR21
↑
↓
miR24
-
++
miR24
↑
↓
miR29b
-
-/+
miR29b
↑
↓
miR128b
+++
++
miR128b
↓↓↓
↓↓↓
miR142-3p
-/+
+
miR142-3p
↑
↓
miR155
-/+
-/+
miR155
↑
↓
T és B-ALL-es betegek miR expresszió változásai
miR expresszió
T-ALL miR155 9
8.73 jó prognózisú beteg
8 7 6 5 4 3 2 1 0
1.28
rossz prognózisú beteg
0.1 122 Kezelés előtt
156 Kezelés 115 Kezelés 3. havi minta előtt
0.38 Kezelés 143 3. havi minta
In vitro kezelés hatása a miR expresszióra In vitro kezelés 72h (BHD1) miR expresszió módosító hatása miR relatív expresszió
120
cytosin-arabinosid
115,61
100
83,84
80
(10 µg/ml) doxorubicin (200nM) kontroll
61,55 60 39,04 40 20
13,87 9,12
16,07
11,1
10,85 4,74
13,99 13,06
0 Co Ara D Co Ara D Co Ara D Co Ara D miR21
miR29b
miR128b
miR155
Összefoglalva • Beállítottuk különböző miR-ek (miR16, 21, 24, 29b, 128b, 1423p, 155) expresszió vizsgálatát, és kimutattuk ezek jelenlétét a vizsgált leukemia/lymphoma sejtekben • 11 ALL-es (5 B-ALL, 6 T-ALL) gyermek követéses vizsgálataiból származó csontvelői mintában (N=23) a terápiás kezelés miR-profil módosító hatása figyelhető meg • Különböző miR expressziót találtunk a T és B sejtes ALL-es betegekcsoport esetében, illetve az adott betegcsoporton belül is különbséget találtunk a jó és rossz prognózisú betegek miR expresszió-változása között a kemoterápiás kezelés hatására • In vitro kemoterápiás kezelés hatására megváltozó miR és fehérje expressziót találtunk lymphoma (BHD1) sejtvonal esetében
Köszönetnyilvánítás Dr. Csóka Monika Dr. Kovács Gábor
Dr. Sebestyén Anna Márk Ági Dr. Hajdu Melinda Dr. Barna Gábor Csorba Gézáné Dr. Bödör Csaba Prof. Kopper László Támogatás: OTKA-K68341
