SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Klinikai Idegtudományok AZ AGYI NORADRENERG ÉS SZEROTONERG RENDSZER LÉZIÓJÁNAK IN VIVO ÉS IN VITRO HATÁSAI PATKÁNYBAN Doktori értekezés
Lukácsné Sziray Nóra
EGIS Gyógyszergyár Nyrt. Preklinikai Kutatási Fıosztály Viselkedésfarmakológiai Laboratórium TÉMAVEZETİ:
Dr. Lévay György Ph. D.
OPPONENSEK:
Dr. Török Tamás D. Sc. Dr. Halász József Ph. D.
BÍRÁLÓBIZOTTSÁG ELNÖKE:
Dr. Fürst Zsuzsanna D. Sc.
BÍRÁLÓBIZOTTSÁG TAGJAI:
Dr. Gonda Xénia Ph. D. Dr. Gál Krisztina Ph. D.
SZIGORLATI BIZOTTSÁG ELNÖKE:
Dr. Gyires Klára D. Sc.
SZIGORLATI BIZOTTSÁG TAGJAI:
Dr. Timár Júlia Ph. D. Dr. Világi Ildikó Ph. D. Budapest
2010
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................... 4 2. BEVEZETÉS .............................................................................................................. 6 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...................................................................................... 8 3.1. A noradrenerg neurotranszmisszió - fiziológiás/pathofiziológiás vonatkozások8 3.2. A szerotonerg neurotranszmisszió - fiziológiás/pathofiziológiás vonatkozások ........................................................................................................................................15 3.3. A hippocampalis NA- és 5-HT-transzmisszió .....................................................22 3.3.1. A hippocampalis NA-felszabadulás szabályozása .......................................24 3.3.2. A hippocampalis 5-HT-felszabadulás szabályozása.....................................25 3.4. Szelektív neurotoxinok ..........................................................................................26 3.4.1. N-(2-kloroetil)-N-etil -2-bromobenzilamin (DSP-4)....................................27 3.4.2. 5,7-dihidroxi-triptamin (5,7-DHT) ...............................................................31 4. CÉLKITŐZÉSEK .................................................................................................... 35 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .............................................................................. 36 5.1. A kísérletek általános jellemzıi ............................................................................36 5.2. Kísérleti állatok és tartási körülményeik.............................................................36 5.3. A kísérletek során használt anyagok ...................................................................37 5.4. Statisztikai számítások ..........................................................................................37 5.5. A mőtéti eljárások kidolgozása ............................................................................38 5.5.1. A noradrenerg rendszer irtása (NA-X) .........................................................38 5.5.2. A szerotonerg rendszer irtása (5-HT-X).......................................................39 5.5.3. A noradrenerg és szerotonerg rendszer együttes irtása (XX, dupla irtás) ....39 5.5.4. Álmőtés.........................................................................................................40 5.6. Az irtási metodika ellenırzése ..............................................................................40 5.6.1. A választott koordináták ellenırzése Evans-kékkel .....................................40 5.6.2. A hippocampalis monoamin-tartalom ellenırzése HPLC-analízissel ..........40 5.7. A szorongásra gyakorolt hatás vizsgálata ...........................................................41 5.7.1. Emelt keresztpalló teszt ................................................................................41 5.7.2. Fény-sötét teszt .............................................................................................42 5.7.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata ...........................................44 5.7.3.1. Stressz-indukálta szociális elkerülés teszt ............................................44 5.7.3.2. Sokkolás alatti viselkedés elemzése ......................................................45 5.7.3.3. Szociális interakció teszt .......................................................................45 5.7.3.4. MK-801 hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre....................46 5.8. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata ..............................................46 5.8.1. Passzív elkerülés teszt ..................................................................................46 5.8.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt .........48 5.8.3. Tárgyfelismerés teszt....................................................................................51 5.9. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás vizsgálata................................52 5.10. Radioaktív transzmitter- felszabadulás mérése szuperfúziós technikával.....53 5.10.1. [3H]NA-felszabadulás mérése ....................................................................53 5.10.2. [3H]5-HT-felszabadulás mérése .................................................................54 6. EREDMÉNYEK ....................................................................................................... 55 6.1. Az irtási metodika ellenırzése ..............................................................................55 6.1.1. A választott koordináták ellenırzése Evans-kékkel .....................................55 2
6.1.2. A transzmitterszintek változásainak ellenırzése HPLC-analízissel.............55 6.2. A szorongásra gyakorolt hatás .............................................................................56 6.2.1. Emelt keresztpalló teszt ................................................................................56 6.2.2. Fény-sötét teszt .............................................................................................58 6.2.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata ...........................................59 6.2.3.1. Stressz-indukálta szociális elkerülés teszt ............................................59 6.2.3.2. MK-801 hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre....................60 6.3. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás................................................................61 6.3.1. Passzív elkerülés teszt ..................................................................................61 6.3.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt .........62 6.3.3. Tárgyfelismerés teszt....................................................................................64 6.4. Az irtások hatása a spontán motoros aktivitásra ...............................................64 6.5. Az irtások hatása a [3H]transzmitter-felszabadulásra.......................................65 6.5.1. [3H]NA-felszabadulás...................................................................................65 6.5.2. [3H]5-HT-felszabadulás................................................................................67 6.5.2.2. Az irtások hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra....................................68 7. MEGBESZÉLÉS ...................................................................................................... 71 7.1. Az irtási metodika kidolgozása.............................................................................71 7.2. A szorongásra gyakorolt hatás .............................................................................72 7.2.1. Emelt keresztpalló teszt ................................................................................73 7.2.2. Fény-sötét teszt .............................................................................................74 7.2.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata ...........................................76 7.3. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás................................................................79 7.3.1. Passzív elkerülés teszt ..................................................................................79 7.3.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt .........81 7.3.3. Tárgyfelismerés teszt....................................................................................83 7.4. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás..................................................84 7.5. A [3H]transzmitter-felszabadulásra gyakorolt hatás .........................................85 7.5.1. A [3H]NA-felszabadulásra gyakorolt hatás ..................................................85 7.5.2. A [3H]5-HT-felszabadulásra gyakorolt hatás ...............................................88 7.5.2.1. Dezipramin hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra intakt szeleteken.....88 7.5.2.2. Az irtások hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra....................................89 8. KÖVETKEZTETÉSEK........................................................................................... 91 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................. 93 10. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................ 95 11. A SZERZİ PUBLIKÁCIÓINAK ÉS SZABADALMAINAK JEGYZÉKE .. 126 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.............................................................................. 129
3
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
Az alábbiakban az értekezésben leggyakrabban elıforduló kifejezések rövidítését soroltuk fel, egyéb rövidítések magyarázata a szövegben, illetve az ábraaláírásokban olvasható. [3H]
trícium, tríciált
5,7-DHT
5,7-dihidroxi-triptamin
5-HIAA
5-hidroxi-indolecetsav
5-HT
szerotonin
5-HTT
szerotonin-transzporter
6-OHDA
6-hidroxi-dopamin
ACh
acetilkolin
AMPA
α-amino-3-hidroxil-5-metil-4-izoxazol-propionát
ANOVA
varianciaanalízis
CA
cornu ammonis (ammon szarv)
DA
dopamin
DAG
diacil-glicerol
DAT
dopamin-transzporter
DG
gyrus dentatus (dentate gyrus)
DMI
dezipramin (dezmetil-imipramin)
DRN
n. raphe dorsalis (dorsal raphe nucleus)
DSP-4
N-(2-kloroetil)-N-etil -2-bromobenzilamin
fiz.só
fiziológiás sóoldat
GABA
γ-amino-vajsav
Glu
glutaminsav, glutamát
HPA
hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg (tengely)
HPLC
magas hatékonyságú folyadékkromatográfia
Hz
Herz
i.c.v.
intracerebroventrikuláris, agykamrába történı (adagolás)
i.p.
intraperitoneális, hasüregbe történı (adagolás)
IP3
inozitol-1,4,5-trifoszfát
KIR
központi idegrendszer
LC
locus coeruleus 4
LTA
lateralis tegmentalis area
mCPP
meta-klorofenilpiperazin
MRN
n. raphe medialis (median raphe nucleus)
N
elemszám
n.
nucleus
NA
noradrenalin
NAT
noradrenalin-transzporter
NMDA
N-metil-D-aszpartát
PAG
periaqueductalis szürkeállomány
PCPA
para-klorofenilalanin
PLC
foszfolipáz-C
PS-LTP
csoportos akciós potenciál-hosszútávú potencírozás
SSRI
szelektív szerotonin-visszavétel gátló
TCA
triciklusos antidepresszáns
5
2. BEVEZETÉS
A noradrenalin és a szerotonin a klasszikus neurotranszmitterek közé tartozó biogén aminok. Felfedezésük a XX. század fontos tudományos eredménye. Mind a központi idegrendszerben, mind a periférián megtalálhatóak, számos fiziológiás folyamatban vesznek részt. A két rendszer szoros, sokféle hatásmechanizmuson keresztül megvalósuló kölcsönhatásban van egymással. Egyensúlyuk megbomlása számos neuropszichiátriai betegség etiológiájában játszik szerepet, ilyenek a szorongásos zavarok, illetve a progresszív tanulás-memóriazavarral járó kórképek, a demenciák is (Millan 2003, King és mtsai 2009, Scullion és mtsai 2009). E betegségek neurobiológiai hátterének, illetve gyógyszeres kezelési lehetıségeinek kutatása napjainkban gyors ütemben folyik, hiszen a szorongásos zavarok világszerte a leggyakoribb pszichiátriai betegségek közé tartoznak: 1 éves prevalenciájuk világviszonylatban 12,6-17,2 % között mozog (Bandelow és mtsai 2002), hazánkban pedig még magasabb: 17,7% (Szádóczky 2000). A magas kort megérı emberek abszolút és relatív számának gyarapodásával pedig a demencia-szindrómák prevalenciája és incidenciája is exponenciálisan növekszik. A kutatások fontos eszköze a neurotranszmitter-rendszerek kémiai úton történı roncsolása szelektív neurotoxinokkal, így modellezve az élettani öregedés, illetve pathofiziológiás folyamatok során jelentkezı neurondegenerációkat. A nemzetközi tudományos irodalomban az utóbbi években számos olyan publikáció jelent meg, ahol a noradrenerg, illetve szerotonerg rendszer célzott irtásának hatásait vizsgálták in vivo viselkedésfarmakológiai, illetve in vitro szelet-technikákon. Az eredmények sokszor egymásnak ellentmondóak fıleg a szorongás, illetve a tanulás-memória területén, igaz, hogy az alkalmazott neurotoxin-dózisok és beviteli módok nem egységesek. Bár számoltak be közlemények szelektív neurotoxinok szimultán adagolásával elért kettıs léziókról is (Birthelmer és mtsai 2003), e két rendszer együttes irtására nem találtunk példát a kísérlettervezések idıpontjában. Az EGIS Gyógyszergyárban folyó preklinikai kutatási munka részeként számos potenciális vegyület tesztelését végeztük anxiolitikus hatásirányban. Köztudott, hogy a szorongásoldó vegyületek jelentıs része a szerotonerg és/vagy noradrenerg rendszeren keresztül fejti ki hatását. Egyik potenciális anxiolitikus hatású molekulánk hatásmechanizmusának
felderítéséhez
alkalmaztuk
elıször
a
szerotonerg-
és
noradrenerg rendszer lézióját. Az elgondolásunk az volt, hogy ha a vegyület 6
szorongásoldó hatása csökken, esetleg eltőnik az irtott állatokon, akkor ez bizonyíték arra, hogy a hatásban a kiiktatott rendszernek szerepe van. Az anxiolitikus hatást az emelt keresztpalló teszten vizsgáltuk, ahol váratlanul azt tapasztaltuk, hogy a szerotonerg- és noradrenerg irtás önmagában csökkenti a szorongást. Ezen eredmények birtokában szerettük volna tudni, hogy mi történik ha a két rendszert együttesen irtjuk ki, mivel a szakirodalomban erre akkor nem találtunk információt. Jelen értekezésemben összefoglalom azokat az eredményeket, melyeket munkánk során kaptunk miközben arra kerestük a választ, hogy a NA-erg és 5-HT-erg monoléziók, valamint az általunk elıször alkalmazott és publikált kettıs irtás (a két rendszer szimultán léziója) milyen befolyással bír a szorongásra és a kognitív folyamatokra. Az irtások segítségével a két rendszer egymásra gyakorolt hatását is próbáltuk mélyebben feltárni. Céljaink elérése érdekében in vivo viselkedésteszteket, és in vitro szelet-technikákat alkalmaztunk.
7
3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
3.1. A noradrenerg neurotranszmisszió - fiziológiás/pathofiziológiás vonatkozások
A noradrenalin a központi idegrendszerben (KIR) és a periférián egyaránt jelen lévı transzmitter, melyet 1904-ben szintetizált Friedrich Stolz (Kozisek és Bylund 2007). A mellékvesevelıbıl felszabaduló, szintén katekolamin kémiai szerkezető adrenalinnal együtt, az adrenerg receptorokon keresztül szerteágazó hatást fejt ki a szervezetben zajló folyamatokra. Brodie és Shore 1950-es években felállított elmélete szerint a noradrenalin a szerotoninnal közösen, de antagonizmusban irányítja az autonóm funkciókat, melyek a különbözı viselkedések hátterében állnak. E séma szerint a NA-neuronok által irányított ergotrop rendszer felkészíti a szervezetet a cselekvésre; dominanciája összefüggésbe hozható a megnövekedett éberséggel, nagyobb szimpatikus aktivitással, vázizomtónusfokozódással, és a küvilág ingereire való erısebb válaszkészséggel. A szerotoninirányított trophotrop rendszer aktivációja ezzel szemben szedációban, alvásban, a periféria megnövekedett paraszimpatikus aktivitásában, csökkent lokomócióban és csökkent válaszkészségben nyilvánul meg (Brodie és Shore 1957). Bár ez a hipotézis jelentısen leegyszerősíti a folyamatokat, sok igazság van benne. A szimpatikus autonóm idegrendszer stimulációjára történı katekolamin-felszabadulás megemeli a pulzusszámot, bronchodilatációt okoz, és a vaszkuláris tónust fokozza. A KIR-ben az adrenerg receptorok számos funkciót befolyásolnak, ezek közül a tanulás-memória, az éberség és a stresszre adott összetett válasz a legfıbbek (Kozisek és Bylund 2007). Ezeken kívül jelentıs szerepük van a szorongásban, affektív státusz kialakításában, jutalmazási-büntetési rendszerben (függıségeknél a „motiváció” kialakítása),
a
vérnyomásszabályozásban,
a
táplálékfelvételben,
neuroendokrin
folyamatokban, fájdalomérzésben. Metabotróp receptorai (ld. késıbb) miatt a transzmitter ezen folyamatokra lassan kialakuló, elnyújtott hatást gyakorol (Sperlágh és mtsai 2007).
Neuroanatómia Topográfiai és morfológiai szempontok alapján Dahlström és Fuxe 7 alcsoportját (A1A7) különítette el a NA-erg neuronoknak a központi idegrendszerben (Dahlström és Fuxe 1964). Ezek a sejttesteket tartalmazó magok a nyúltvelıben, a hídban, és a 8
formatio reticularisban helyezkednek el, és szerteágazó, divergens projekciókkal hálózzák be a központi idegrendszert. Björklund és Lindvall a magokat három csoportba sorolta, így megkülönböztetve a dorsalis nyúltvelıi-, a lateralis tegmentalis- és a locus coeruleus (LC) noradrenerg rendszerét (Grzanna és Fritschy 1991). Ez utóbbi a legnagyobb kiterjedéső, patkányban és fıemlısökben gyakorlatilag csak NA-erg sejtekbıl áll, melyek azonban gyakran tartalmaznak a noradrenalinon kívül más neurotranszmittereket, neuropeptideket is. Ezen kolokalizáció oka még nem teljesen tisztázott. Az LC a KIR legnagyobb területeket beidegzı magja, az agyi NA-projekciók 70%-a belıle ered. Sejttestjeinek jellemzı tulajdonsága, hogy dendritjeik több száz µm hosszú, diffúz projeciókat alkotnak (Aston-Jones 2002). Axonjaik pedig varikozitásokat tartalmaznak, melyek segítségével a neuronok nem-szinaptikus interakciókban tudnak részt venni (pl. a hippocampusban, lásd késıbb) (Vizi és Kiss 1998).
1. ábra. Noradrenerg pályarendszer és szinapszis az emberi agyban. Magyarázat a szövegben található. Rövidítések: TH: tirozin-hidroxiláz; DOPA:dihidroxi-fenilalanin; AMPT: α-metil-para-tirozin; AADC: aromás aminosav-dekarboxiláz; VMAT: vezikuláris monoamin-transzporter; DBH: dopamin-βhidroxiláz; COMT: katekol-o-metil-transzferáz; MHPG: 3-metoxi-4-hidroxi-fenilglikol; NM: normetanefrin; AC: adenilát-cikláz; MAO: monoamin-oxidáz; PLC: foszfolipáz-C; IP3: inozitol-1,4,5-trifoszfát; DAG: diacil-glicerol. Forrás: Szabo és mtsai 2004.
9
A noradrenerg pályák elhelyezkedése a következı (1. ábra): 1.
felszálló: medialis elıagyi kötegben
2.
leszálló: híd és gerincvelı között
3.
kisagyi összeköttetések moharostok formájában.
Afferentáció: az LC számottevı serkentı glutamáterg és adrenerg beidegzést kap az erıs autonóm funkciókkal bíró n. paragigantocellularisból - ez a megfigyelés összhangban van az LC szimpatikus aktivitásban észlelt szerepével. A glutamáterg befolyás - melynek serkentése prokognitív, inaktivációja pedig memóriarontó hatással járt kondicionált elkerüléses és térbeli memóriateszteken (Clayton és Williams 2000 a,b)- valamint az LC erıs kortikális projekciói magyarázatul szolgálnak az LC neuronok kognícióban (averzív kondicionálás, stresszre adott kondicionált válaszreakciók) betöltött szerepére (Aston-Jones és mtsai 1986). A glutamáterg input szerepet játszik az ópiát megvonáskor tapasztalható LC-aktivitásfokozódásban is (Akaoka és Aston-Jones 1991), bár e jelenségnél nem elhanyagolható a morfin LC-preparátumon kimutatott, a neuronok kisülési rátáját csökkentı hatásának megszőnése a megvonás következtében. Az ópiátok befolyása az LC-neuronokra hozzájárul a fizikális dependencia kialakulásához (Fürst 2007). Az ópiát megvonást kísérı averzív érzetek kifejlıdésében pedig a BNST-t (bed nucleus of stria terminalis) beidegzı, a nyúltvelı caudalis részébıl induló A2 csoportba tartozó neuronoknak van jelentıs szerepe (Delfs és mtsai 2000). Az LC gátló GABA-erg afferentációt a prepositus hipoglossiból kap, míg enkefalint tartalmazó rostok innen és a n. paragigantocellularisból érkeznek hozzá. Hisztamin-innervációja a n. tuberomamillarisból ered, és erıs szerotonerg beidegzése is van, mely eredése még kérdéses. Nemrég fedezték fel, hogy patkányokban a valószínőleg a hypothalamusból eredı, orexin (hipokretin) neuropeptid-tartalmú rostok is beidegzik az LC-t, melyek szerepet játszanak a táplálékfelvétel mellett az alvás regulációjában is, így bizonyítást nyert a NA-neuronok régóta feltételezett szerepe az alvás-ébrenlét folyamataiban. A cirkadián zavarokban (melyek depresszióban gyakran elıfordulnak) játszott szerepe pedig a n. suprachiasmaticus indirekt afferentációjával magyarázható (Sakurai és mtsai 1998). A sejttestektıl távoli, a magon túlnyúló dendritek a középagyi PAG-ból (periaqueductalis szürkeállomány), a prefrontalis cortexbıl, a n. medialis preopticusból és a hypothalamusból kapnak jelentıs innervációt. Mostanában derült arra fény, hogy az amygdalával és a n. tractus solitariival is direkt afferens kapcsolatuk van. Ezen összeköttetésekbıl kap az LC a 10
limbikus/emocionális funkciókra illetve autonomitásra vonatkozó információkat (Aston-Jones 2002).
Efferentáció: az LC-ból induló, fıként visceralis információkat szállító rostok dúsan szerteágazva csaknem behálózzák az egész idegrendszert: projektálnak a kisagyba, prefrontalis cortexbe, striatumba, thalamusba, hippocampusba, amygdalába és a gerincvelıbe (Aston-Jones 2002, Sperlágh és mtsai 2007). Utóbbi rostok a leszálló fájdalommoduláló pályával - melynek irányító központja a PAG - való kapcsolatuk révén részt vesznek a spinalis nociceptio gátlásában (Fürst 2007). A PAG nemcsak a fájdalomérzésben, hanem mint az egyik szorongás- és aggresszióközpont, a prefrontalis cortexszel, amygdalával és hippocampussal együtt a fenyegetı külvilági ingerekre adott szorongásos/aggresszív válaszok integrálásában is fontos szerepet játszik (Zagrodzka és mtsai 1994, Halász és mtsai 2002, Millan 2003, Mikics és mtsai 2009). A központok erıs NA-erg innervációja magyarázza a NA meghatározó szerepét az averzív ingerekre adott komplex válaszokban. A NA sokszor egymással ellentétes hatásai (pl. a szorongásra) nehezítik e szerep pontos definiálását (Haller és Halász 2001, Millan 2003). Az LC gazdagon innerválja a n.raphe dorsalist is: ez a tény funkcionális interakciót sejtet a NA-erg és 5-HT-erg rendszer között (Baraban és Aghajanian 1981, Salomon és mtsai 2006). A lateralis tegmentalis areaból pedig a hypothalamusba és a gerincvelıbe
érkeznek
stresszválaszban
rostok.
stratégiai
A
fontosságú
hypothalamus HPA-tengely
paraventricularis központja,
ami
magja
a
komplex
visszacsatolásos rendszert alkot a már említett szorongás-és aggresszióközpontokkal; a NA-beidegzés tengelyre gyakorolt serkentı hatásával elısegíti a stresszel való megküzdést (Jankord és Herman 2008). Újabban
fedezték
fel,
hogy
az
LC
individuális
neuronjai
szelektív
kollaterálisokat küldenek a szomatoszenzoros rendszer magjaiba a külön-külön történı beidegzés helyett. Ez lehet az egyik oka a NA koordinált felszabadulásának a különbözı pályákból (Simpson és mtsai 1997). A diffúz és divergens efferes innerváció magyarázza, hogy az LC noradrenerg rendszere targetspecifikus, lokális hatások helyett inkább globális, moduláló és integratív szerepet tölt be a KIR-ben (Grzanna és Fritschy 1991, Szabo és mtsai 2004).
11
Metabolizmus A NA a preszinaptikus idegvégzıdések vezikuláiban szintetizálódik, az oda aktív transzporttal bejutó tirozinból keletkezik DOPA-n és DA-n keresztül, melyet a VMAT juttat be a vezikulába, ahol a DBH hidrolizálja NA-vá (1. ábra, a rövidítések magyarázatát lásd az aláírásban). A végkoncentrációt a TH enzim szintje határozza meg, melyet az AMPT kompetitíven blokkol, így csökkentve az NA szintet. Az NA kisebb részt a citoplazmában, nagyobb részt a preszinaptikus vezikulában raktározódik, utóbbiból szabadul fel ingerület hatására. A fel nem használt transzmittert a citoszolból a VMAT, a szinaptikus résbıl pedig a NAT (ld. késıbb) veszi vissza. A VMAT gátlója a régen vérnyomáscsökkentıként használt rezerpin. A vissza nem vett NA-t a szinaptikus résben a COMT, a neuronban pedig a MAO bontja el (NM, MHPG) (Szabo és mtsai 2004, Gray és Roth 2007) .
2. ábra. Az adrenerg receptorcsalád. Gi :Gi fehérje-kapcsolt receptorok, Gs: Gs fehérje-kapcsolt receptorok, Gq: Gq fehérje-kapcsolt receptorok. Forrás: Kozisek és Bylund 2007.
12
Adrenerg receptorok Az α és β adrenerg receptorokat 1948-ban fedezte fel Alhquist. Késıbb sorolták be ıket három (α1, α2 és β) csoportba, majd alcsoportokba genetikai, farmakológiai és biokémiai különbözıségeik alapján (2. ábra). Mindegyik receptor metabotróp, G fehérjéhez kapcsolt, de a másodlagos hírvivı rendszerük csoportonként különbözik (Kozisek és Bylund 2007). Az α1 csoportba tartozó 1A 1B és 1D receptorok a PLC aktivitását növelik, mely a membránlipidekbıl hidrolízissel IP3-at és DAG-ot állít elı, melyek azután Ca2+-t szabadítanak fel, illetıleg a proteinkináz C-t aktiválják, így irányítva a sejtek metabolikus folyamatait. Gátlásuk szedatív hatású. Az 1B receptorokon keresztül valósul meg a n. raphe dorsalis 5-HT-erg neuronjainak excitátoros kontrollja (Salomon és mtsai 2006). Az α2 csoport 2A-C altípusa inhibitoros kapcsolatban áll az adenilát-cikláz (AC) enzimmel – így csökkenti a cAMP szintjét, valamint a ligandfüggı kálium- és kalciumcsatornákat regulálja. A humán 2A receptor homológja az egérben és patkányban megtalálható 2D receptor (Bylund és mtsai 1994). Az α2 receptorok nagy része preszinaptikusan elhelyezkedı autoreceptor, melyek aktivációja gátolja a NA- és egyéb transzmitterek felszabadulását. Számos antidepresszáns (mianszerin, mirtazapin) illetve antipszichotikum (klozapin) rendelkezik közvetlen α2 receptor-gátló hatással, illetve krónikus szedésük deszenzitizálja e receptorokat, így növelve a transzmissziót (Vizi és Kiss 1998). Az LC-ben az α2 receptorok az ópiát receptorokkal együtt helyezkednek el, ennek tudható be hogy az α2 –agonista klonidin, mely erıs centrális vérnyomáscsökkentı vegyület, szedatív és szemnyomáscsökkentı hatásai mellett gasztroprotektív és fájdalomcsillapító tulajdonságú, valamint az ópiátelvonás tüneteit is enyhíti (Gyires és mtsai 2007, Fürst 2007, 2008). A β receptorcsalád az AC enzimet serkenti, ezzel a cAMP-szintjét növelve. A β1 receptorok a neuronokban, míg a β2 receptorok a gliában és az erek falában találhatók, a β3 receptorok pedig a KIR-en kívül, a barna zsírszövetben helyezkednek el. A β1 receptorok
deszenzitizációja,
down-regulációja
fontos
szerepet
játszik
az
antidepresszánsok hatásmechanizmusában. Az adrenerg receptoroknak fontos szerepe van a tanulás-memória folyamatokban is (memória-konszolidáció, emocionális emlékek regulációja): α- és β-agonisták in vitro potencírozzák a csoportos akciós potenciál amplitúdóját a hippocampusban (Chaulk és Harley 1998), antagonisták in vivo pedig hatásosnak
bizonyultak
az
averzív
emlékek 13
újraélésével
járó
poszttraumás
stresszbetegség tüneteinek enyhítésében (ld.késıbb), e hatásukban a szorongás vegetatív tüneteinek enyhítése (tachycardia) is szerepet játszhat. Újabb kutatások szerint βreceptor-függı az az intracelluláris kaszkádmechanizmus is, mely a konszolidáció folyamatában jelen levı memória-reaktiváció indít be (Przybyslawski és mtsai 1999).
Monoamin transzporterek, NAT A NAT a többi klasszikus monoamin transzporterrel (5-HTT, DAT) együtt a Na+/neurotranszmitter szimporter családhoz tartozik. Ezek a 12 transzmembrán doménbıl álló plazmamembrán fehérjék a monoaminokat veszik vissza a szinaptikus résbıl a neuronba, így szabályozva a koncentrációjukat a szinaptikus résben, és ezzel a transzmisszió
hosszát
és
intenzitását.
A
monoamin
szállítása
Na+
és
Cl-
kotranszportjával történik. Foszforilációval a transzport iránya megfordítható, ezáltal karrier-mediált transzmitter-felszabadulás következik be (Raiteri és mtsai 2002). Számos tényezı befolyásolja mőködésüket: neuronális aktivitás, peptid hormonok, protein-kinázok (Ravna és mtsai 2003). Közös ligandjaik a pszichostimuláns kábítószer kokain és amfetamin, elıbbi számos hatása mellett transzportergátló, utóbbi a transzporter mőködési irányát megfordító úgynevezett „release-elı ágens” (Torres és mtsai 2003, Jones és mtsai 2009). Jelen értekezés szempontjából fontos tulajdonságuk, hogy a szelektív neurotoxinok (DSP-4, 5,7-DHT) is rajtuk keresztül jutnak be a terminálisokba, de a transzporterek affinitása és érzékenysége eltérı irányukban (Nobin és Björklund 1978, Fritschy és Grzanna 1992). Metabolizmusuk változása, illetve gén-polimorfizmusuk számos pszichiátriai betegség patomechanizmusában játszik szerepet. A transzporterek szinte kizárólag saját neuronjaik sejttestjein, dendritjein és axon-terminálisain expresszálódnak (Ordway és mtsai 1997). A NAT és a DAT heterológ felvevı tulajdonságokkal bír, ugyanis mindkettı képes NA és DA transzportjára (Giros és mtsai 1994). A NAT szintje az LC-ben, az erıs NA-innervációjú n. raphe dorsalisban, a hippocampusban és a cortexben a legmagasabb (Baraban és Aghajanian 1981, Torres és mtsai 2003). A NAT a pszichostimuláns kábítószerek mellett támadáspontja számos antidepresszánsnak (dezipramin, reboxetin), valamint a szelektív neurotoxin DSP-4-nek és 5,7-DHT-nek (Tejani-Butt és mtsai 1990, Scullion és mtsai 2009). Utóbbihoz nagyságrendekkel kisebb az affinitása (Nobin és Björklund 1978).
14
3.2.A szerotonerg neurotranszmisszió - fiziológiás/pathofiziológiás vonatkozások
„Serotonin is an enigma. It is at once implicated in virtually everything but responsible for nothing.” B.L. Jacobs és C. A. Fornal 1995.
Az indolamin szerkezető biogén amin napjainkban használatos nevét Rapport adta az 1940-es évek végén, mivel a periférián a vérszérumban volt megtalálható, és érösszehúzó hatással rendelkezett (Rapport és mtsai 1948). Késıbb rájöttek, hogy az intestinalis mucosa chromaffin sejtjei által kiválasztott „szekretin” nevő anyag, illetve az Erspamer által az 1930-as években felfedezett „enteramin” is azonosak vele (Szabo és mtsai 2004). A fenti idézet nagyon találó, ugyanis a már említett trofotróp hatások és érfalsimaizom-reguláció mellett jelentıs szerepe van a szorongásban, az affektív státusz kialakításában, pszichózis kialakulásában (hallucinációk), az aggresszivitásban, táplálékfelvétel szabályozásában, fájdalomérzésben, hányásban, migrén kialakulásában, irányítja a cirkadián ritmust (alvás-ébrenléttel való kapcsolat), valamint szabályozza a testhıt és a neuroendokrin funkciókat is. Hatásai – a NA-hoz hasonlóan – inkább moduláló jellegőek (Sperlágh és mtsai 2007).
Neuroanatómia A KIR-ben a szerotonerg neuronok sejttestjei a nyúltvelıben, a hídban, illetve a középagyi formatio reticularis területén található raphe magokban találhatóak, és 9 különbözı csoportot képeznek (B1-9). A legnagyobb szerotonerg mag a n. raphe dorsalis (DRN), mely rostralis és caudalis részbıl áll, és a KIR 5-HT-erg neuronjainak mintegy 50%-át tartalmazza. A szerotonerg pályák elhelyezkedése a következı (3. ábra): 1.
felszálló:
medialisan:
hypothalamusba,
mediolateralisan:
area
corticalis
lateralisan: n. caudatusba (extrapyramidalis rendszer) 2.
leszálló: nyúltvelı és gerincvelı között
3.
kisagyi összeköttetések moharostok formájában
15
preopticusba területekbe
3. ábra. Szerotonerg pályarendszer és szinapszis az emberi agyban. Magyarázat a szövegben található. Rövidítések: TrpH: triptofán-hidroxiláz; 5-HTP: 5-hidroxi-triptofán; PCPA: para-klorofenilalanin; AADC: aromás aminosav-dekarboxiláz; ; 5-HTT: szerotonin-transzporter; 5-HIAA: 5-hidroxiindolecetsav; TCA: triciklusos antidepresszáns; LSD: lizergsav-dietilamid; MDMA: 3,4-metiléndioxi-Nmetamfetamin (Extasy); cAMP: ciklikus adenozin-monofoszfát; VMAT: vezikuláris monoamintranszporter; AC: adenilát-cikláz; MAOI: monoamin-oxidáz-inhibitor; PLC: foszfolipáz-C; IP3: inozitol1,4,5-trifoszfát; DAG: diacil-glicerol Forrás: Szabo és mtsai 2004.
A szerotonerg idegsejtek efferens hálózata a legnagyobb kiterjedéső és a legbonyolultabb, az egész KIR-t átszövi. A NA-hoz hasonlóan sőrőn projektál a már említett corticolimbicus szorongás- és aggresszióközpontokba is: a rostralisan elhelyezkedı magok közül a DRN beidegzi a prefrontalis cortexet, amygdalát és a dorsalis hippocampust, míg az n. raphe medialis (MRN) elsıdlegesen a thalamusba, septumba, n. accumbensbe, hypothalamusba, gyrus cinguliba, striatumba, valamint a dorsalis és ventralis hippocampusba küld projekciókat (Halász és mtsai 2002, Millan 2003, Szabo és mtsai 2004). A caudalis raphe magok pedig a mély kisagyi magokat, a cerebellaris cortexet, valamint a gerincvelıt idegzik be. Az utóbbiba leszálló, már említett,
a
n.
raphe
magnuson
a
gerincvelı
felé
haladó
PAG-központú
fájdalommoduláló pálya jelentıs részben tartalmaz szerotonerg rostokat, melyek gátolják a gerincvelı hátsó szarvi neuronjait, és így algogén hatásúak (Fürst 2007).
16
A DRN- és MRN-projekciók hálózata valószínőleg eltérı hatásokkal bír a szorongás szabályozásában (Millan 2003). Deakin és Graeff hipotézise is az 5-HT anxietásban betöltött kettıs szerepét feltételezi. Elgondolásuk az, hogy a vészhelyzetben aktiválódó DRN elıagyi traktusán keresztül futó neuronok kisülése serkenti a kondicionáláson alapuló tanult válaszreakciókat beindító amygdala mőködését, tehát anxiogén hatású. Ezzel szemben a DRN periventricularis részébıl induló projekciók gátolják a nem kondicionált, öröklött félelmi reakciókat irányító dorsalis PAG-ot, ezzel anxiolízist okozva. Az amygdala mőködési zavara generalizált szorongásbetegségben nyilvánul meg, míg a dorsalis PAG túlérzékenysége pánikrohamokat eredményez. A szerotonin ezen feltételezett ellentétes hatásai a különbözı agyterületek mőködésére,
magyarázzák
azt
a sok
ellentmondó
állatkísérletes
és
humán
gyógyszerterápiás eredményt, melyek az 5-HT és az 5-HT-transzmissziót befolyásoló farmakonok anxietással való összefüggését vizsgálva születtek (Graeff és mtsai 1996, 1997; Haller és Halász 2001, Millan 2003, Sziray és mtsai 2010). A fentebb részletezett sőrő neuronhálózat pedig megokolja a Jacobs és Fornal által mondottakat, melyek értelmében az 5-HT - az NA-hoz hasonlóan - direkt hatások helyett inkább szerteágazó, integratív befolyással bír a központi idegrendszeri folyamatokra (Azmitia és WhitakerAzmitia 1991, Gray és Roth 2007).
Metabolizmus A szerotonin a KIR-ben az 5-HT neuronok vezikuláiban szintetizálódik, prekurzora a táplálékkal felvett esszenciális aminosav triptofán, melyet a TrpH enzim konvertál 5HTP-vé, amibıl az AADC enzim segítségével történı dekarboxiláció során keletkezik 5-HT (3. ábra, a rövidítések magyarázatát lásd az aláírásban). Az anabolizmus sebességének meghatározója a TrpH, melynek szintjét sokféle rövid és hosszútávú regulátoros mechanizmus (másodlagos hírvivı proteinkinázok, cAMP) befolyásolja. A PCPA irrevezibilisen gátolja az enzimet, így hozva létre 5-HT-depléciót. Az indolamin szintjének csökkenését okozza a triptofán-mentes étrend, valamint a halogénezett amfetaminszármazékok, mint amilyen a mára már a humán gyógyszerterápiából kivont étvágycsökkentı hatású fenfluramin. Ez utóbbi, a szintén amfetaminszármazék diszkódrog MDMA-hoz hasonlóan roncsolja a terminálisokat, illetve az 5-HTT funkciójának megváltoztatásával megnöveli az 5-HT felszabadulását, ezzel hosszantartó 5-HT szint csökkenést okozva (Harvey 1975; Schmidt és mtsai 1986). A szinaptikus résben a transzmitter egy része a MAO enzim oxidatív dezaminációján megy keresztül, 17
majd az aldehid-dehidrogenáz enzim segítségével 5-HIAA lesz belıle. Az 5-HIAAmérés diagnosztikus eszköz: csökkent szintje a cerebrospinális folyadékban az öngyilkosságot már megkísérelt depressziós betegekben megnövekedett szuicidális rizikót jelez, ami utal az 5-HT (auto)aggresszióban betöltött szerepére (Mann és mtsai 1990). A nem katabolizált 5-HT-t az 5-HTT aktív transzporttal visszaveszi a preszinaptikus végzıdésbe, ahol vagy a mitokondriális MAO bontja el, vagy a VMAT segítségével visszakerül a vezikulákba, ahol együtt tárolódik más mediátorokkal (P anyag, szomatosztatin). A VMAT-gátló rezerpin az NA-hoz hasonlóan az 5-HT szintjét is csökkenti.
5-HTT Az agyban az 5-HT neuronokat tartalmazó magokban a sejttesteken, a belılük kiinduló projekciók axonjain és axon-terminálisaiban, illetve az ezeket körülvevı gliaszövetben, és asztrocitákban expresszálódik (Torres és mtsai 2003, Szabo és mtsai 2004), legnagyobb koncentrációban a cortexben és a hippocampus CA1 és CA3 régiójában található (Sur és mtsai 1996). Az 5-HTT a pszichostimuláns kábítószereken kívül az SSRI-k és számos TCA támadáspontja (Rothman és Baumann 2003, Jones és mtsai 2009). Az 5,7-DHT lézionáló hatásának is egyik célpontja, a toxin ugyanis jelentısen csökkenti a transzporter protein expresszióját (Wang és mtsai 2005). A DSP-4-et kisebb mértékben, de szintén felveszi, de kevésbé érzékeny a toxin roncsoló hatásaira mint a NA-erg neuronok (Fritscy és Grzanna 1991). A NAT-hez és DAT-hoz hasonlóan az 5HTT is heterológ tulajdonságú: képes NA felvételére (Vizi és mtsai 2004). A HPAtengellyel (mely – mint már említettük – fontos szerepet játszik a szorongásban, stresszválaszban és az affektív kórképekben) való összeköttetésére utal, hogy a glükokortikoid dexametazon-infúzió csökkenti az expresszióját idıs patkányokban (Fumagalli és mtsai 1996). Metabolizmusának változásai tapasztalhatók többek között alkoholizmusban, depresszióban, obszesszív-kompulzív betegségben (OCD), szociális fóbiában, impulzív aggresszióban (Tiihonen és mtsai 1997). AZ 5-HTT gén polimorfizmusa összefüggésbe hozható többek között a depresszióra való hajlammal, OCD-vel, figyelemhiányos hiperaktivitással (Torres és mtsai 2003). Újabb kutatások szerint a transzporter génjének s allélja (5HTTLPR s allél) szignifikáns kapcsolatban áll a neuroticizmus számos összetevıjével (szorongás, szorongásra való hajlam, depresszió, szomatizáció, affektív
18
labilitás), és ez a kapcsolat egészséges populációban is kimutatható (Gonda és mtsai 2009).
Receptorok A szerotonin receptorai 7 családba sorolhatóak (5-HT1-7; 4. ábra). Az 5-HT3 kivételével, mely excitátoros ionotróp típusú, az összes G-protein-kapcsolt metabotróp receptor. Az 5-HT1 család aktivációja az AC enzim gátlásával csökkenti a cAMP szintjét, így gátló hatással bírnak a sejtekben zajló metabolikus folyamatokra; ezzel szemben az 5-HT2 család pozitívan befolyásolja a PLC-, az 5-HT4-7 típusok pedig az AC enzim mőködését, tehát aktivációjuk eredménye serkentés (Humphrey és mtsai 1993).
4. ábra. A szerotonerg receptorcsalád. Rövidítések: c-AMP: ciklikus adenozin monofoszfát, PLC: foszfolipáz–C, Gi/o :Gi/o fehérje kapcsolt receptorok, Gs: Gs fehérje kapcsolt receptorok, Gq: Gq fehérje kapcsolt receptorok Forrás: Gray és Roth 2007.
19
Az 5-HT1 receptoroknak 5 altípusa van: A, B, D, E és F. A legsokoldalúbb hatásokkal bíró 1A fıleg a limbikus struktúrákban található meg: a hippocampusban (fıleg a CA1-régióban, ahol a GABA-erg interneuronokra gátló hatást fejt ki), az amygdalában és az entorhinalis cortexben, ahol posztszinaptikus aktivációja serkenti; a raphe
magok
sejttestjein
pedig
preszinaptikus
autoreceptorként
gátolja
a
transzmitterfelszabadulást (Aghajanian és mtsai 2002). Ezen raphe-autoreceptorok deszenzitizációja játszik szerepet az antidepresszánsok késıi hatáskezdetében (Piñeyro és Blier 1999). Ez az altípus nem érzékeny a szerotonerg transzmisszió léziók és gyógyszeres befolyás általi változásaira, viszont a mellékvese eredető szteroidok a receptorsőrőség csökkenését idézik elı, a receptor gén-expressziójának tónusos gátlása révén.
Ez
a
kortikoszteron-adminisztrációra
illetve
stresszre
adott
válasz
adrenalectomiával kivédhetı volt rágcsálókban (Szabo és mtsai 2004). A kortikoszteron adagolás e hatás mellett idıs patkányokban a szerotonerg idegsejtek pusztulását, illetve axonjaik degenerációját is eredményezte az 5,7-DHT neurotoxinhoz hasonlóan (Nyakas és mtsai 2003). Az 5-HT1A funkciók csökkenése szerepet játszik többek között a szorongásos- és kedélybetegségek patomechanizmusában. A receptor a nocicepcióban is szerepet játszik, a rajta ható analgetikumok új lehetıséget jelenthetnek a fájdalomcsillapításban (Fürst 2008). Parciális agonistája a szorongáscsökkentı hatású buspiron, illetve az atípusos antipszichotikum aripiprazol. Agonistái és antagonistái egyaránt szorongáscsökkentı hatásúak (Haller és Halász 2001). Az 1B receptorok is elsısorban gátló hatású autoreceptorok a substantia nigraban. Itt, és az agyi erek falában található meg a rágcsálókból hiányzó 1D altípus (náluk az 1B receptor egyenértékő ezzel), mindkét receptor agonistája az antimigrén hatású szumatriptán. Az 1E és 1F altípusok élettani szerepe még nem ismert (Gray és Roth 2007). Az 5-HT2 család receptordenzitása nem változik a szerotonerg preszinapszist lézionáló 5,7-DHT hatására, tehát a receptorok elhelyezkedése posztszinaptikus (Szabo és mtsai 2004). A 2B jelentısége fıleg a periférián számottevı. 2A a KIR nagy területein megtalálható, az alvásban, fájdalomérzésben játszik szerepet, szelektív antagonistája a ketanserin. Feltételezik, hogy a 2A receptorok a GABA-erg interneuronokon keresztül hiperpolarizáló hatást fejtenek ki a LC NA-erg neuronjaira (Salomon és mtsai 2006). A 2C fıleg a limbikus rendszerben, hypothalamusban és az agytörzsben található, gyakran a 2A-val kolokalizációban, közös agonistáik a hallucinogén LSD és az állatkísérletekben szorongáskeltıként alkalmazott mCPP (Bilkei-Gorzó és mtsai 1998, Haller és Halász 2001). Számos antidepresszáns 20
(mianszerin, mirtazapin - Rihmer és Purebl 2009) és anxiolitikus hatású vegyület (deramciklán: EGIS-3886, az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. originalitása - Gacsályi és mtsai 1997), valamint az atípusos antipszichotikumok legtöbbje (Timár 2007) rendelkezik jelentıs 5-HT2A/C antagonista hatásokkal. Ez bizonyítja a receptorok szerepét a skizofrénia, depresszió és a szorongásos kórképek patomechanizmusában. A 2C-antagonizmus a receptor táplálékfelvételt befolyásoló hatása miatt szerepet játszhat a sok ilyen típusú gyógyszernél mellékhatásaként tapasztalt súlynövekedésben (Tecott és mtsai 1995). Az 5-HT3 receptorcsaládot ligandfüggı ioncsatornák alkotják, a KIR-ben fıleg a hányásközpont area postremaban és a hippocampusban találhatók. Újabb kutatások szerint
ez
utóbbi
területen
és
egyéb
szorongásközpontokban
a
GABA-erg
interneuronokat funkcionális interakcióban irányítják a CB1 kannabinoid-receptorokkal, így modulálva az anxietást (Mikics és mtsai 2009). Antagonistái, a „szetronok”, hatásos antiemetikumok (Wolf 2000). Az ondanszetron hatásosnak bizonyult patkányokban morfin-dependencia és -tolerancia kivédésében (Hui és mtsai 1996), illetve a megvonás tüneteinek enyhítésében (Pinelli és mtsai 1997). Friss felfedezés szerint utóbbi tulajdonsága embereken is jelentkezik (Chu és mtsai 2009), így ígéretes adjuváns lehet az ópiát típusú kábítószerekrıl való leszoktatás folyamatában. Az 5-HT4 a monoaminok és a GABA felszabadulását modulálja az agyban, az 5HT5 receptorok fıként a hypothalamusban, hippocampusban, agykamrák falában és a gliában fordulnak elı, szerepük nem tisztázott (Hoyer és mtsai 2002). Az 5-HT6 receptorok antagonistája számos antipszichotikum (klozapin) és TCA (amitriptilin) (Roth és mtsai1994). A kolinerg és glutamáterg transzmisszióra való befolyásuknak tulajdonítják, hogy gátlóik prokognitív hatással rendelkeznek kognitív diszfunkciókkal járó kórképekben (Alzheimer- és egyéb demenciák, skizofrénia és depresszió) (Miguel-Hidalgo 2001, Garcia-Alloza és mtsai 2004). Állatkísérletekben Morris vízi útvesztıben javították a térbeli tanulás-memóriafolyamatokat (Gray és Roth 2007). A szorongásban is szerepet játszanak kondicionált félelem paradigmában kapott eredmények szerint (Yoshioka és mtsai 1998). A striatumban, n. accumbensben, hippocampusban és a cortexben helyezkednek el. Az 5-HT7 receptoroknak újabb kutatások szerint a cirkadián ritmus szabályozásában, a tanulás-memória folyamatokban van szerepük. Az utóbbival összefüggı hippokampális hosszútávú potencírozás (LTP) nehezen volt kiváltható 5HT7 receptor - knockout egerekben (Roberts és mtsai 2004). A KIR-ben a 21
hypothalamus, thalamus, hippocampus, cortex tartalmaz 5-HT7 receptorokat (Gray és Roth 2007).
3.3.A hippocampalis NA- és 5-HT-transzmisszió
A limbicus rendszer részét képezı hippocampus, mely mint már említettük, központja mind az averzív külsı ingerekre adott válaszok (szorongás, aggresszió), mind a tanulásmemóriafolyamatok neuronális szabályozóköreinek, valamint a LC és a raphe magok összeköttetésein kívül egyik fontos tere a NA és 5-HT rendszer szoros kommunikációjának is. A hippocampus 90 %-ban Glu-erg neuronokból áll. E principális neuronok a piramidális és granulasejtek. A CA3-CA1 régió NA és 5-HT rostok által erısen innervált Glu-erg szinapszisai teret adnak a hosszútávú jelfokozódás jelenségének, ami a memória-formálódás sejtszintő elektrofiziológiai modelljének tekinthetı (Bliss és Collingridge 1993). A fennmaradó 10 % gátló GABA-erg interneuron, amelyek szervezett hálózata kontrollálja a principális sejteket (Freund és Buzsáki 1996). A hippocampus számottevı NA-erg, 5-HT-erg és kolinerg innervációval bír, az afferens rostok az LC-bıl, raphe magokból és a septalis magokból erednek. Ezek a transzmitterek axon-varikozitásaik révén 80-90%-ban nem-szinaptikus interakciókat létesítenek, csak a fennmaradó kis hányad képez szinaptikus kapcsolatot (5. ábra). A NA-erg neuronok axon-varikozitásai legnagyobb sőrőségben a gyrus dentatusban vannak jelen, de a CA1 és CA3 régió is erısen innervált. A NAvarikozitások a GABA-erg interneuronokkal, és a Glu-erg piramissejetkkel képeznek szinapszist, a többi kapcsolatuk nem-szinaptikus (Umbriaco és mtsai 1995). A szerotonin DRN-ból származó axonjai vékonyak, sok kis varikozitással, melyek nemszinaptikus interakciókat létesítenek, melynek során diffúzióval érik el a receptorokat. Az MRN rostok (az összes rost kb. 20 %-a) viszont csak szinaptikus transzmisszióban részt vevı nagy butonokat tartalmaznak (Freund és Buzsáki 1996), melyek fıleg a GABA-erg interneuronok sejttestjein és dendritjein konvergálnak (Umbriaco és mtsai 1995).
22
5. ábra. A hippocampus felépítésének sematikus rajza az afferens pályákkal. A téglalapok és négyzet extra-, míg a körök intrahippocampalis eredést jelölnek, a nyilak a nem-szinaptikus transzmitterfelszabadulást ábrázolják. NOS: NO szintáz. Magyarázatot lásd a szövegben. Forrás: Vizi és Kiss 1998.
A NA-erg és 5-HT-erg rendszer befolyása a szinaptikus plaszticitásban, így a tanulás-memóriafolyamatokban kulcsszerepet játszó kolinerg és Glu-erg transzmisszióra a hippocampusban összetett. A direkt és indirekt (utóbbi fıleg a GABA-erg interneuronokra való hatás következményeként megnyilvánuló) hatások következtében egyazon rendszer serkenthet vagy gátolhat a hippocampus régióitól, illetve a transzmitter-koncentrációtól függıen (Leung és Miller 1988, Vizi és Kiss 1998, King és mtsai 2009).
23
3.3.1. A hippocampalis NA-felszabadulás szabályozása
Ahogy a 6. ábrán látható, a NA-felszabadulás szabályozása preszinaptikus autoreceptorok, illetve heteroreceptorok segítségével valósul meg a hippocampusban. Az α1 autoreceptor valószínőleg jelen van a varikozitásokon és serkentı hatású, míg az α2A (patkányban α2D) altípus negatív feedback mechanizmus révén csökkenti az effluxot. Öregedı patkányokban e feedback hatékonysága és a receptor sőrősége is csökken (Zsilla és mtsai 1994). β-agonisták patkány hippocampus szeletben növelték a [3H]NA-felszabadulást, de a receptorok szerepe még kérdéses. Az excitátoros aminosav Glu, NMDA, AMPA és kainát mind serkentik a NA-felszabadulást (Vizi és Kiss 1998). A GABA két módon befolyásolja a NA-effluxot: egyrészt heteroreceptorai segítségével: a GABAA serkent, míg a GABAB gátol; másrészt a varikozitásokon a NAT mellett megtalálható GABA heterotranszporter segítségével, mely, a GABA felvételével a varikozitásba, serkenti az abból történı katekolamin-felszabadulást (Raiteri és mtsai 2002). A kolinerg nikotinos (N) heteroreceptor direkt serkentı hatású, míg a muszkarinos 1 altípus (M1) mikrodialízis tanulmányban, valószínőleg indirekt módon növelte a NA-effluxot. A szerotonin hatásai a NA-varikozitásokra nagyon összetettek. Az 5-HT1A agonisták serkentik az NA-felszabadulást, valószínőleg extrahippocampalis, indirekt mechanizmuson keresztül (Vizi és Kiss 1998). Az 5-HT2/1C-agonista DOI ((2,5dimetoxi-4-jodofenil)-2-aminopropán) hippocampalis szeletben serkentette a tríciált NA-felszabadulást, míg in vivo mikrodialízis módszert alkalmazva gátolta azt (Vizi és Kiss 1998). Hippocampus szeletben az 5-HT3 agonistái növelték a tríciált NAfelszabadulást, míg in vivo mikrodialízis technikával gátló hatásúnak bizonyultak (Mongeau és mtsai 1994). Bonyolítja a NA- és 5-HT-erg rendszer hippocampalis kapcsolatát az a tény, hogy a NA-erg axon-varikozitásokon levı α2 receptorokon az 5HT parciális agonistaként viselkedik (Vizi és Kiss 1998). A nitrogén-oxid (NO) szabadgyök, melynek nagy szerepe van a neurodegeneratív folyamatokban, a Glufelszabadulás mellett a NA-effluxot és a NAT mőködését is befolyásolja nemszinaptikus úton (5. ábra). A NOS gátlása serkenti a karrier-mediált NA-felszabadulást (Kiss és mtsai 1996, Cadet és Brannock 1998). Az 5-HT, M1 és β receptorok elhelyezkedése a varikozitásokon még nem tisztázott.
24
6. ábra. A hippocampalis NA-felszabadulás receptoriális szabályozása. + és ↑: serkentés, - és ↓: gátlás, ?: feltételezés, mikrodial.: mikrodialízis. Magyarázatot lásd a szövegben. Forrás: Vizi és Kiss 1998.
3.3.2. A hippocampalis 5-HT-felszabadulás szabályozása
A szerotonin az 5-HT1D (patkányban 5-HT1B) autoreceptor segítségével negatív feedback mechanizmussal gátolja saját felszabadulását (7. ábra). Az 5-HT3-receptorok nem találhatók meg preszinaptikusan, így a tapasztalat szerint serkentı hatásuk indirekt módon valósul meg (Blier és mtsai 1993). Az excitátoros aminosav NMDA mikrodialízis kísérletben valószínőleg indirekt mechanizmussal csökkentette az indolamin-effluxot, míg az AMPA és kainát hippocampalis synaptosomákban növelte azt. A GABA tónusos gátló hatást fejt ki GABAA és GABAB receptor-altípusain keresztül az 5-HT effluxra. Az NA az 5-HT-erg terminálisokon elhelyezkedı, valószínőleg α2A receptor-altípusán keresztül gátolja az indolamin felszabadulását (Benkirane és mtsai 1985). Az 5-HT3 és az NMDA receptor elhelyezkedése a varikozitásokon még nem tisztázott (Vizi és Kiss 1998).
25
7. ábra. A hippocampalis 5-HT-felszabadulás receptoriális szabályozása. + és ↑: serkentés, - és ↓: gátlás, ?: feltételezés, mikrodial.: mikrodialízis. Magyarázatot lásd a szövegben. Forrás: Vizi és Kiss 1998.
3.4. Szelektív neurotoxinok
A lézionáló kémiai ágensek alkalmazása a transzmitter-rendszerek, így a viszonylag diffúz szervezıdéső, kiterjedt monoamin-rendszerek vizsgálatában is a katekolamindepletáló 6-OHDA 1967-es bevezetésével vette kezdetét (Thoenen és Tranzer 1968), és az 1970-es, 80-as években terjedt el széles körben az egyre újabb toxinok megjelenésével (Baumgarten és Björklund 1976, Jonsson és mtsai 1981). Használatuk a modern géntechnológiai és egyéb eljárások felfedezése ellenére napjainkban is tart (Scullion és mtsai 2009, King és mtsai 2009) és nagyobbrészt kiszorította a kevésbé hatékony mechanikus és elektrolitikus módszerekkel történı lézionálást (Nobin és Björklund 1978). A pályák célzott irtása általában az adott transzmitter tartós és jelentıs csökkenését, valamint idegsejtjei degenerációját eredményezi a különbözı szövetekben. Így lehetıvé válik a lézionált transzmitterrendszerek morfológiai vizsgálata, más agyi jelátvivıkkel való kapcsolatának feltérképezése, valamint olyan fiziológiás és
26
pathológiás folyamatok és neurodegeneratív betegségek modellezése, mint amilyenek többek között az öregedés, a különbözı hátterő demenciák és kognitív zavarok (Decker és McGaugh 1989, Jackisch és mtsai 2008, Nyakas és mtsai 2009), depresszió (Harro és mtsai 1999), Parkinson-tünetegyüttes (Hirsch és mtsai 2003). Az ágensek használatával vizsgálható, hogy a rendszerek csökkent mőködésénél hogyan alakulnak az élettani és kóros folyamatok a szervezetben, hogyan folyik a regeneráció és a kompenzáló mechanizmusok. Farmakológiai szempontból pedig felderíthetı segítségükkel a gyógyszermolekulák hatása a modellezett betegségre, valamint a különbözı jelátvivık szerepe a farmakonok hatásmechanizmusában (Breese és Mueller 1978, Fuxe és mtsai1978, Winstanley és mtsai 2004, Nyakas és mtsai 2009).
3.4.1. N-(2-kloroetil)-N-etil -2-bromobenzilamin (DSP-4)
8. ábra. A DSP-4 szerkezeti képlete
Az alább idézett közleményekben a kísérleteket patkányokon végezték, kivéve Ross és munkatársai 1973-as publikációját, melyben egereket használtak (Ross és mtsai 1973). Ross és munkatársai írták le 1973-ban a β-kloro-alkilamin kémiai szerkezető DSP-4 (8. ábra) toxikus hatását a centrális és a periférián elhelyezkedı noradrenerg neuronokra egerekben (Ross és mtsai 1973). A toxin hosszantartóan gátolta az NAfelvételt a noradrenerg neuronokba in vivo és in vitro körülmények közt is. E hatása szelektívnek bizonyult, ugyanis a szerotonin és a dopamin felvétele nem változott a jelenlétében. Ross patkányban is hasonlókat tapasztalt (Ross 1976): a toxin dózisfüggıen csökkentette a noradrenalin-szintet. 50 mg/kg-os dózisban 7 nappal az intraperitoneális adminisztráció után 70 %-os NA-tartalom csökkenés volt detektálható a cerebralis cortex egész területén, mely még 14 nap elteltével is fennált. A szív átriumszövetében ugyanakkor csak kisebb mértékő és átmeneti volt a csökkenés. Az agyi dopaminszint nem változott, a szerotonin-tartalom viszont csak 75%-a volt a kontroll értékeknek, ami szignifikáns eltérésnek bizonyult. A noradrenalin-szint 27
változásához hasonló nagyságrendben csökkent a tríciált NA-felvétel is a frontalis cortexben. Ugyanezen régióban a vezikuláris monoamin-szintézisben részt vevı DBH (dopamin-β-hidroxiláz) enzim aktivitása 90 % fölötti csökkenést mutatott, ami kisebb mértékben ugyan, de 8 hónap elteltével is kimutatható volt. A hypothalamusban és a szívben enyhébb volt az enzimaktivitás negatív irányú változása, és rövidebb ideig is állt fenn. Mindhárom szövetféleségrıl elmondható azonban, hogy késıbb jelentkezett bennük az enzimaktivitás csökkenése a visszavételben beállt változások korai detektálhatóságához képest. A DSP-4 elıbb felsorolt hatásait 10 mg/kg dezipramin (DMI) antagonizálta. A DMI a TCA-k csoportjába tartozó imipramin fı aktív metabolitja, mely sokkal nagyobb affinitást mutat a NAT-hoz mint az 5-HTT-hez vagy DAT-hoz, így szelektíven gátolja a NA-felvételt az axon-terminálisokba (Owens és mtsai 1997, Magyar és Szökı 2007). 5 mg/kg rezerpinnel való elıkezelés pedig kimutatta, hogy a vezikuláris monoamintranszporterhez - mely az antihipertenzívumként már elavult rezerpin fı támadáspontja (Mahata és mtsai 1996) - nem kötıdik, így tehát igazolást nyert Ross azon hipotézise, hogy a toxin a szinaptikus membránhoz kapcsolt transzfer helyein hat elsıdlegesen. E kötıhelyek
közelében
feltételezése
szerint
a
molekula
ciklikus
szerkezető
aziridiniummá metabolizálódik, mely vegyület erıs alkiláló tulajdonsága révén valószínőleg kovalens kötéssel kapcsolódik a NAT-hez. E kémiai kötés erıssége a különbözı szövetekben valószínőleg eltér, ezzel magyarázható szerinte, hogy a DSP-4 hatáskezdet, -erısség és -tartam tekintetében variabilitást mutat az agyi régiókban, illetve a környéki idegrendszer területein. Eredményei azt mutatják, hogy az alkilálás, melynek NAT-gátló hatása a toxin beadása után rövid idıvel megmutatkozik a NAfelvétel csökkenésében, lassabb hatáskezdető degeneratív folyamatokat is beindít a neuronokban, melyek következménye a hónapokkal a toxin beadása után is kimutatható dopamin-β-hidroxiláz enzim- aktivitás csökkenése az érintett régiókban. Maga a NAT is roncsolódik: a NAT-szelektív tríciált nizoxetin-kötıdés teljes megszőnését detektálták DSP-4 adminisztráció után (Tejani-Butt és mtsai 1990). A szövetek nem egyformán érzékenyek e két hatásra, melyek eredıjeként létrejövı szöveti NA-depléció, NAtartalom csökkenés is krónikusan fennáll; a hippocampus érzékenyebbnek mutatkozott a frontalis cortexnél (Jackisch és mtsai 2008). Mivel a DSP-4 Ross és munkatársai szerint nagy szelektivitást mutatott a NAerg neuronok felé, és a vér-agy gáton való átjutása következtében adagolása is kényelmesen megoldható volt, széles körben kezdték használni a noradrenerg rendszer 28
lézionálására. Ennek hatására számos munkacsoport immunhisztokémiai módszereket használva intenzíven vizsgálta a degenerációs, illetve az irtás után azonnal beinduló kompenzációs
mechanizmusokat.
Kimutatták,
hogy
a
DSP-4
hatásai
a
legkifejezettebbek az LC által innervált agyterületeken (cortex, hippocampus, cerebellum, gerincvelı). A cortexben és a hippocampusban egyaránt 60-90%-os, a cerebellumban és gerincvelıben 80-90%-os NA-szint csökkenés volt mérhetı 50 mg/kg toxin egyszeri i.p. beadása után 7-20 nappal, illetve még 5 héttel a beadást követıen is. A kevert beidegzéső hypothalamus és a híd-nyúltvelı kevésbé érintett területek, itt 5575%-ára esett vissza a NA-tartalom a kontroll értékekehez képest (Jonsson és mtsai 1981, Zagrodzka és mtsai 1994, Ogasawara és mtsai 1996, Kask és mtsai 1997, Häidkind és mtsai 2002, Fukui és mtsai 2004, Scullion és mtsai 2009). Az 5-HT-tartalom-csökkenés a cortexben elérte a 40%-ot (Ogasawara és mtsai 1996), míg más szerzık ennél csekélyebb, 20% körüli csökkenést detektáltak (Fukui és mtsai 2004), vagy nem találtak változást (Häidkind és mtsai 2002); a hippocampusban Ogasawara és munkatársai 32%-os csökkenést mértek. A hypothalamusban 15%-os csökkenés volt tapasztalható (Fukui és mtsai 2004). A szerotonin-depléció kivédhetı a szerotonin-visszavételt szelektíven blokkoló anyagokkal mint amilyenek a fı indikációként depresszióban használatos SSRI-k (Ross 1976, Jonsson és mtsai 1981), de alkalmazásuk mellett is beszámoltak szignifikáns 5-HT-deplécióról. (Liang 1998, Zagrodzka és mtsai 1994). A dopamintartalom tekintetében a legtöbb szerzı nem talált változást ezen agyterületekben, valamint a striatumban sem (Jonsson és mtsai 1981, Ogasawara és mtsai 1996, Kask és mtsai 1997, Häidkind és mtsai 2002) az 50 mg/kg-os dózis alkalmazásakor, ugyanakkor pár közlemény említ a DSP-4 hatására bekövetkezı enyhe, 25% körüli dopaminszint-csökkenést a cortex, hippocampus, hypothalamus és a cerebellum szöveteiben (Jonsson és mtsai 1981, Fukui és mtsai 2004). Mivel bizonyítást nyert, hogy a méregnek nincs toxikus hatása a DA-erg neuronokra (Jonsson és mtsai 1981, Hallmann és Jonsson 1984, Srinivasan és Schmidt 2004), a szerotonerg idegsejtek esetében pedig szintén ezt feltételezte Ross (1976), valószínősíthetı, hogy a DA- és 5HT-forgalomban leírt csökkenéseknek hasonló oka van: a mindkét rendszer neuronjaira tónusos facilitáló hatással bíró LC-input kiesésének a következményei (Zagrodszka és mtsai 1994, Srinivasan és Schmidt 2004). Fritschy és Grzanna 50 mg/kg DSP-4 i.p. adminisztrációja után pár órával már jelentıs,
24
órával
szinte
100%-os
NA-depléciót 29
mutatott
ki
NA-antitest-
immunperoxidáz- festéssel az LC által innervált területek axon-terminálisaiban. Valószínősítették, hogy ez az akut hatás a toxin noradrenalin-transzporterrel való interakciójának a következménye. DBH festéssel négy-öt nap múlva a depletált axonok degenerációja is kimutathatóvá vált, és az axonok két hét elteltével szinte teljesen hiányoztak a vizsgált területeken. Ugyanebben az idıpontban az LC rostralis és caudalis harmadában 19%-os sejttestpusztulást találtak, míg a nagy része érintetlen maradt; 6 hónap múlva a sejtpusztulás elérte a 39 %-ot, 1 év elmúltával pedig az 57%-ot (Fritschy és mtsai 1990, Fritschy és Grzanna 1991,1992). Ezzel igazolták Ross már említett feltételezését, mely szerint a DSP-4 graduálisan megmutatkozó, hosszan tartó neurodegenerációt okoz. Egyes közlemények szerint a DSP-4 gátolja a a MAO (monoamin-oxidáz)-B
enzim
(Lyles
mőködését
és
Callingham
1981)
és
a
mitochondrialis oxidatív foszforilációt is (Dudley és mtsai 1990), mely hatások szintén hozzájárulhatnak a hosszú hatástartamú degeneratív folyamatokhoz. Ezek ellen hatnak az irtás után azonnal beinduló, a degenerációval parallel zajló kompenzációs mechanizmusok az épen maradt neuronokban és környezetükben. Olyan adaptív válozások tartoznak ide, melyek fenntartják a transzmitterek elérhetıségét az extracelluláris térben a szöveti tartalom erıs csökkenése ellenére is. Ezt bizonyítja, hogy in vivo mikrodialízis vizsgálatban 50 mg/kg DSP-4 i.p. beadása után 7 nappal a szöveti NA-tartalom szignifikáns csökkenésével egyidejőleg nem csökkent a NA-efflux, és a bazális
extracelluláris
NA-szintek
sem
tértek
el
a
kontroll
szintektıl.
A
kompenzáló/regenerációs mechanizmusok közé tartozik az épen maradt neuronokban az emelkedett tüzelési arány, megnövekedett transzmitterszintézis és -felszabadulás, csökkent
inaktív
állapot
a
csökkent
visszavétel
miatt,
az
adrenoceptorsőrőség/érzékenység változása pre- és posztszinapikusan, valamint a regeneratív axon-sarjadzás a lézionált területeken (Kask és mtsai 1997). Ez utóbbi 3-4 héttel a toxin adása után kezdıdött a hippocampusban, és ennek köszönhetıen 6 hónappal a toxin okozta teljes axonhiány után a de novo reinnerváció sőrősége nem tért el számottevıen a kontrolltól, 1 év után pedig hiperinnerváció volt tapasztalható. A regenerációs mechanizmusok nem egyformán zajlanak az érintett agyterületeken illetve a periféria szöveteiben, de mindenhol reverzibilissé teszik a toxin hatását (Fritschy és Grzanna 1992, Prieto és Giralt 2001).
30
3.4.2. 5,7-dihidroxi-triptamin (5,7-DHT)
9. ábra. Az 5,7-DHT szerkezeti képlete
Az alább idézett közleményekben a kísérleteket patkányokon végezték. Az 5,7-DHT toxikus befolyását a szerotonerg transzmitterrendszerre a DSP-4 publikálásával nagyjából egyidıben, 1972-ben írta le Baumgarten és Lachenmayer (1972). Az indolamin szerkezető molekula (9. ábra) az elsıként szintetizált, szintén szerotonin-struktúranalóg 5,6-DHT-nál nagyobb stabilitása és kevesebb nem specifikus toxikus hatása miatt szélesebb körben terjedt el mint lézionáló ágens (Breese és mtsai 1974, Stewart és mtsai 1978, Nobin és Björklund 1978, Fuxe és mtsai 1978). Toxikus hatásaiban hasonlít a DSP-4 noradrenerg rendszerre gyakorolt befolyására: a szerotonint depletálja, visszavételét gátolja a raphe magokból aszcendáló rostok preszinaptikus termináljaiban, valamint axondegenerációt okoz és citotoxikus a magokban lévı sejttestekre (Hensler és mtsai 1994, Frechilla és mtsai 2000). Mivel nem jut át a vér-agy gáton, így fıként intracerebroventrikulárisan vagy intraciszternálisan történik a beadása a globális központi idegrendszeri lézió érdekében (Fuller 1978). E két adagolási mód azonban eltérı irtási mintázatot eredményezhet, ugyanis a segítségükkel elért depléció mértéke nem konstans az agy különbözı régióiban
(Breese
és
Mueller
1978).
A
területi
specificitást
az
intraciszternális/intraventrikuláris beviteli módoknál a régiókba történı diffúzió sebessége, valamint a toxinra különbözı érzékenységő szövetek regenerálódásának gyorsasága határozza meg (Fuller 1978). A hypothalamus, híd-nyúltvelı, és a gerincvelı 5-HT depléciója a legkifejezettebb a toxin i.c.v. adagolásakor (Baumgarten és mtsai 1973, Hall és mtsai 1999), de az érzékenyebb területek közé tartozik a hippocampus is (Shimizu és mtsai 1992). Az üregekbe való adminisztráció mellett lokálisan agyrégiókba (striatum, amygdala, raphe magok), illetve idegrostokba
31
(mediális elıagyi köteg, afferens szerotonerg rostok) is adagolják közvetlenül az 5,7DHT-t (Fuxe és mtsai 1978, Paris és mtsai 1989, Liang 1998, Frechilla és mtsai 2000, King és mtsai 2009), azonban a legnagyobb kiterjedéső irtást i.c.v. adagolva fejti ki (King és mtsai 2009). Lokális alkalmazhatóságából adódó hátránya a szisztémásan adható,
szintén
szerotonerg
lézionálásra
használt
halogénezett
amfetaminszármazékokkal (para-klóramfetamin, para-brómamfetamin) szemben egyben elınyt is jelent a direkt központi idegrendszeri hatások vizsgálatánál, ugyanis ez utóbbiak gyors diffúziójuk miatt nem elég effektívek közvetlenül az agyi régiókba juttatva (Fuller 1978, Johnson és mtsai 1990). Ezenkívül az 5,7-DHT hatásai gyorsabban alakunak ki a szerotonerg neuronokon és irreverzibilisek, míg az amfetaminszármazékok által elindított roncsolás lassúbb, és a folyamat kezdeti szakaszában még visszafordítható (Meek és mtsai 1971, Fuller és mtsai 1975, Fuller 1978). 200 µg toxin intraciszternális beadása után 14 nappal Breese és Mueller (1978) 70% körüli 5-HT-szint csökkenést tapasztalt agyszövetben, mely 270 nap múlva is fennált. A dopamintartalom nem vátozott a 270 napos idıintervallumban. A noradrenalin-szint viszont csak 85%-a volt a kontroll értékeknek 14 nap elteltével, bár ez a változás 90 nap után már nem volt kimutatható. Más közleményekben 75 illetve 200 µg toxin intraciszternális adagolása 40% körüli NA-koncentráció csökkenést eredményezett az agyszövetben, míg a DA-szintet egyik koncentráció sem változtatta meg szignifikánsan 10 nappal az irtás után (Gerson és Baldessarini 1974, Nobin és Björklund 1978, Stewart és mtsai 1978). A noradrenalin-szint csökkentése és a -felvétel gátlása sajnálatos, a szelektivitást negatívan befolyásoló tulajdonsága az 5,7-DHT-nek, mely azonban nem növekszik egyenes arányban a beadott toxin mennyiségével (Nobin és Björklund 1978), és részlegesen kivédhetı noradrenerg-felvétel gátló vegyületekkel, például dezipraminnal (Gerson és Baldessarini 1974, Björklund és mtsai 1975, Stewart és mtsai 1978, Liang 1998). 20-25 mg/kg DMI intraperitoneális adagolása 30-60 perccel 250-300 µg 5,7-DHT i.c.v. beadása elıtt számos agyterületen kivédte a szöveti katekolamin-tartalom csökkenését, 80-90%-os elıagyi és agytörzsi 5-HT-depléció mellett. Ugyanakkor pl. a striatalis NA-tartalom szignifikánsan csökkent, ugyanitt a DA-körforgalom intakt maradt. E hatások irtás után 7 nappal már kialakultak, és 21 nap elteltével sem változtak az elıagyban és az agytörzsben (Breese és Mueller 1978, Stewart és mtsai 1978, Plaznik és mtsai 1997, Hall és mtsai 1999, Huang és Herbert 2005). 32
A DMI részleges védı hatásai miatt valószínősíthetı volt, hogy a katekolaminerg neuronok a monoamin-transzporteren keresztül akkumulálják az 5,7DHT-t, amit az is megerısített, hogy a toxin 10-6 M koncentrációban szignifikánsan károsította a [3H]NA-felvételt in vitro körülmények között. 200 µg toxin a [3H]5-HT felvételében 65%-os csökkenést eredményezett corticalis szeletben in vitro (Nobin és Björklund 1978). A szelektív szerotonin-visszavétel-gátló fluoxetinnel (15 mg/kg i.p.) történı elıkezelés viszont nem antagonizálta sem az NA-, sem az 5-HT-tartalom csökkenését (Breese és Cooper 1975). Utóbbi jelenség oka valószínőleg a fluoxetin 5,7DHT-nél kisebb affinitása a szerotonin-transzporterhez ebben a koncentrációban, illetve az SSRI-k protektív hatásaival szemben tanúsított magas egyéni variabilitás (Fuxe és mtsai 1978). Monoamin oxidáz (MAO)-gátlóval történı elıkezelés blokkolta a toxin hatásait, így Creveling és Rotman feltételezte (1978), hogy a MAO-enzim-katalizálta folyamatban keletkezı metabolitja a hatásos citotoxikum. Az idegvégzıdésekben a monoamin-transzporterekkel történı felvétele után az 5,7-DHT autoxidáción, oxidatív deamináción megy keresztül, melynek során szuperoxid gyökök képzıdésén át reaktív quinonszármazék keletkezik belıle. E formájában károsítja a preszinaptikus fehérjéket, tehát hatásmechanizmusában nagy jelentısége van a celluláris oxidatív mechanizmusoknak (Frechilla és mtsai 2000, Baumgarten és Lachenmayer 2004). Abból, hogy a toxin in vitro irreverzibilisen kötıdött a mitokondrium-preparátumokhoz, arra következtetnek, hogy a mitokondriális fehérjék e reakció elsı alanyai. Ezt az elgondolást támasztja alá, hogy az axonterminálisok mitokondriumaiban mutathatók ki elıször a lézió jelei (Frechilla és mtsai 2000). Fluoreszcens hisztokémiai módszerekkel 50 µg 5,7-DHT i.c.v. beadása után 60 perccel vizualizálható volt a toxin felhalmozódása a monoaminerg struktúrákban. 24 órán belül a szerotonerg axonok gyors és krónikus megfogyatkozása volt tapasztalható az agykamrák közelében, míg 12 nap után a kamráktól távolabbi axon-terminálisok is eltőntek. 150 µg-os dózisnál pedig szerotonerg sejttest-pusztulás volt tapasztalható 1-3 hónap elteltével a nyúltvelıi raphe magokban (Nobin és Björklund 1978). Az axonális degeneráció
jelei
kisebb
mértékben
ugyan,
de
a
centrális
katekolaminerg
terminálisokban is mutatkoztak, és ez ellen a DMI elıkezelés sem nyújtott teljes védelmet (Björklund és mtsai 1975). A regenerációs/kompenzáló mechanizmusok irtás utáni beindulására utal, hogy 300 µg 5,7-DHT i.c.v. adagolása után 14 nappal in vivo mikrodialízis módszerrel nem sikerült szignifikáns csökkenést kimutatni a striatális extracelluláris 5-HT-tartalomban, 33
a szöveti tartalom erıs szignifikáns csökkenése ellenére (Hall és mtsai 1999). Más szerzık is beszámoltak arról, hogy az 5-HT-depléciót nem követi a bazális indolaminszint csökkenése (Kirby és mtsai 1995, Romero és mtsai 1998). E jelenség hasonló a NA-lézió után tapasztaltakhoz (ld. fentebb), és okai is hasonlók: preszinaptikusan megnövekedett 5-HT-szintézis melletti csökkent visszavétel, a tüzelési mintázat megváltozása; posztszinaptikusan a receptorérzékenység növekedése és a receptorösszetétel megváltozása, ez utóbbi régióspecifikus folyamat. DMI + 5,7-DHT kezelésen átesett állatokban a szerotonin-prekurzor 5-hidroxi-triptofán adagolása mioklónusos görcsökkel és tremorral járó magatartási választ („szerotonin-szindróma”) eredményezett.
Ez
a
centrális
szerotonerg
szinapszisok
denerváció
utáni
túlérzékenységére utal, ami szintén adaptációs változásnak tekinthetı (Stewart és mtsai 1978). A sok hasonlóság ellenére a szerotonin-rendszer kompenzációs mechanizmusai némiképp különböznek más monoaminokéitól, ugyanis az 5-HT-metabolit 5-HIAA (5hidroxi-indolecetsav) szintjei hasonlóan mozognak a szerotoninéval, arányuk nem változik a lézió után (Hall és mtsai 1999, Frechilla és mtsai 2000).
A két neurotoxin a fentebb leírtak alapján széles körben használt, hatékony eszköze
a
monoamin-rendszerek
szelektív
lézionálásának.
Mindazonáltal
a
használatukkal végzett kísérletek eredményeinek értékelésekor figyelembe kell venni nem specifikus hatásaikat, és azt, hogy az agyrégiók a toxinokra való érzékenység és a kompenzációs mechanizmusok tekintetében nagy diverzitást mutatnak.
34
4. CÉLKITŐZÉSEK
1. a noradrenerg- és szerotonerg rendszer szimpla, valamint újdonságként a mások által még nem végzett együttes (dupla) irtásának megvalósítása neurotoxinok i.c.v. adagolásával
2. a szimpla és dupla irtások hatásának vizsgálata az anxiolízisre -
emelt keresztpalló teszten
-
az emelt keresztpallóhoz hasonló etológiai hátterő fény-sötét teszten
-
az emelt keresztpallótól eltérı etológiai hátterő stressz-indukálta szociális elkerülés teszten
3. a szimpla és dupla irtások hatásának vizsgálata a tanulás-memória folyamatokra -
in vivo: passzív elkerülés- és tárgyfelismerés teszten
-
in vitro: csoportos akciós potenciál-hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszten
4. a noradrenerg- és szerotonerg rendszer interakciójának vizsgálata in vitro szuperfúziós technikával az irtott állatok hippocampalis szeletein
35
5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
5.1. A kísérletek általános jellemzıi
Kísérleteinkben mőtét szempontjából a következı csoportok szerepeltek: 1. Intakt = Int (mőtéten át nem esett), a csoport arra szolgált, hogy megvizsgálhassuk hogy a mőtéti beavatkozásnak önmagában van-e hatása a tesztekben. 2. Álmőtött = Álm (toxin helyett vivıanyagot kapott, mőtéti beavatkozáson átesett 3. szimpla NA-erg rendszer-irtott = NA-X 4. szimpla 5-HT-erg rendszer-irtott = 5-HT-X 5. NA-erg + 5-HT-erg rendszer-irtott (dupla irtott) = XX
Az in vivo paradigmákban az állatok randomizálva kerültek tesztelésre, és a toxinbeadástól eltekintve nem részesültek elıkezelésben. A kísérleteket kivitelezı személyek nem ismerték a randomizált csoportbeosztásokat.
5.2. Kísérleti állatok és tartási körülményeik
Kísérleteinkben hím SPRD patkányokat (forrás: EGIS Gyógyszergyár Nyrt., Budapest) használtunk, melyek 270-300g súlyúak voltak a sztereotaxikus mőtétek idején. A mőtéti beavatkozásokat megelızıen az állatokat mőanyag állattartó dobozokban (Macrolon, Lignifer
Kft.)
tartottuk
ötösével
egy
hangszigetelt,
klimatizált
helyiségben
(hımérséklet: 23 ± 2 oC, relatív páratartalom: 60 ± 10 %). A szoba mesterséges megvilágítást kapott 6:00 óra és 18:00 óra között. A mőtéten átesett állatokat (és intakt társaikat is az azonos körülmények végett) egyesével tartottuk, és az almozás során naponta kézbefogtuk ıket, hogy a kézbevétel mint stresszhatás ne befolyásolja a tesztek eredményét. Az állatok a rágcsálók számára gyártott, autoklávozott pellethez (Altromin, LATI Kft, Gödöllı) és a szőrt csapvízhez korlátozás nélkül hozzáfértek. A viselkedésteszteket minimum 7 napos lábadozási idıszak elteltével kezdtük meg, az irtások idıfüggı hatását is vizsgáló in vitro kísérleteket pedig 1, 6, 7, 14 és 30 nappal irtás után folytattuk le (részletesen lásd a konkrét leírásoknál). A lábadozási idıszak alatt a normálistól eltérı viselkedést - pl. meningitis vagy egyéb központi idegrendszeri
36
gyulladás tüneteit- mutató állatok nem vettek részt a tesztekben. A kísérleteket mindig azonos idıintervallumban: 9:00 -13:00 óra közt folytattuk le. A beavatkozásokat az Európai Bizottság Tudományos Tanácsa irányelveinek (86/609/EEC) megfelelıen, az EGIS Gyógyszergyár Nyrt Állatjóléti Bizottságának ellenırzésével és jóváhagyásával végeztük, törekedve az állatoknak okozott kellemetlenségek és fájdalom, valamint a felhasznált állatszám minimalizálására.
5.3. A kísérletek során használt anyagok
A mőtéti altatáshoz használt többkomponenső Equithesint a következı összetevıkbıl készítettük (a mennyiségek 100 ml-re megadva): klorál-hidrát (4,2 g), magnéziumszulfát-7-hidrát (2,12 g), Nembutal injekció (pentobarbitál-Na, 6g /100 ml vivıanyag) (16,2 ml), 1,2-propilénglikol (40,0 ml), etanol 96 m/m % (10,0 ml) és desztillált víz (30,0 ml). A vegyszereket a Sigma-Aldrich Nyrt.-tıl (Budapest) illetve a Reanal Nyrttıl (Budapest) vásároltuk. A Nembutal injekció a Ceva Phylaxia Oltóanyagtermelı Zrt. (Budapest) készítménye. A szelektív szerotonerg neurotoxin 5,7-dihidroxitriptamin (5,7-DHT)
és
szelektív
noradrenerg
neurotoxin
N-(2-klóretil)-N-etil-2-
bromobenzilamin-HCl (DSP-4), valamint az NMDA-csatorna blokkoló MK-801 (dizocilpin) a Sigma-Aldrich Nyrt.-tıl származott. A fluoxetin-HCl-t és a dezipraminHCl-t az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. (Budapest) szintetizálta. Szuszpenziókészítéshez metil-cellulózt (DOW Chemical Company 1131 Building, Midland, Michigan USA) használtunk. Az Evans-kék indikátor a Reanal Nyrt-tıl származik. A HPLCdetektálásnál és a transzmitterfelszabadulások mérésénél használt vegyszerek a Merck GmBH-tól (Darmstadt, Németország), Fluka GmBH-tól (Buchs, Svájc), a Reanal Nyrttıl (Budapest), és a Sigma Nyrt-tıl (Budapest) származnak. A tríciált izotópok([3H]DA, l-7,8-[3H]NA és [3H]5-HT) a Radiochemical Center (Amersham, Egyesült Királyság) termékei.
5.4. Statisztikai számítások
A mérési adatokból, valamint a belılük származtatott változókból minden csoportnál kiszámoltuk az átlagot és a standard hibát, az eredményeket bemutató grafikonokon 37
ezeket jelenítettük meg (átlag ± standard hiba). A csoportok átlagait egyutas, illetve összetartozó adatok csoportjainál ismétléses ANOVA-t alkalmazva vetettük össze, post hoc tesztként Fisher-LSD–módszert használtunk. Nem összetartozó adatpároknál kétmintás t-próbát végeztünk. Az eredmények taglalása során a kísérleteknél feltüntetjük az alkalmazott statisztikai módszert. A számításokat Statistica 8.0 (StatSoft Incorporation, Tulsa, USA) számítógépes program segítségével kiviteleztük, az ábrákat GraphPad Prism 4.0 program (GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA) felhasználásával készítettük. A szignifikanciaszinteket p<0,001 nagyságrendig tüntettük fel.
5.5. A mőtéti eljárások kidolgozása
Az eljárások kidolgozásánál az volt a célunk, hogy szelektív neurotoxinok agykamrába való adagolásával jelentıs, minimum 70 % körüli - a leggyakrabban alkalmazott 50 mg/ kg-os i.p. DSP-4 dózis hatékonyságával ekvivalens - NA- illetve 90% körüli 5-HTkoncentráció csökkenést hozzunk létre a hippocampusban az intakt és az álmőtött állatok szintjeihez viszonyítva. Úgy kellett megválasztanunk a toxinok dózisát, hogy szimpla irtásnál a másik transzmitter szintje szignifikánsan magasabb maradjon az irtott jelátvivı koncentrációjánál a toxinok nemkívánatos nem specifikus hatásai ellenére is. A mőtéti beavatkozások következtében elhullott, vagy központi idegrendszeri gyulladás tüneteit mutató állatok agyát szövettani módszerekkel vizsgáltuk meg az esetleges hibás mőtéttechnikai okok kiderítése céljából.
5.5.1. A noradrenerg rendszer irtása (NA-X)
Az állatokat mőtét elıtt 30 perccel elıkezeltük a szelektív szerotonin-visszavétel-gátló fluoxetinnel (10 mg /2 ml fiz.só /kg i.p.), hogy a szerotonerg idegsejteket megvédjük a toxin hatásától. A mőtétre kerülı állatot Equithesinnel (0,3 ml/kg i.p.) elaltattuk, Kopf sztereotaxisban rögzítettük a koponyáját, majd leborotváltuk a fejtetın a szırt, és a fejbırön metszést ejtve hozzáférhetıvé tettük a csontfelszínt. A koponyacsontot a lentebb megadott koordináták szerint fogászati fúróval megfúrtuk, majd a jobb lateralis agykamrába (sztereotaxikus koordináták: antero-posterior: -0,9 mm, medio-lateralis: 1,4 mm, dorso-ventralis: -3,4 mm a bregmától számítva; Paxinos és Watson 1998-as 38
atlasza szerint) vékony kanülön keresztül Cole-Parmer digitális mikroliter-pumpa segítségével a következıket adtuk be: 10 µl, 0,1% aszkorbinsavat tartalmazó steril fiz. sóban (továbbiakban oldószer) oldott 400 µg DSP-4 (szelektív NA-erg neurotoxin)+ 10 µl oldószer egymás után, a 2 infúzió közt 5 perc várakozási idıt tartva. A pumpa folyási sebessége 1,7 µl/perc volt a kamraőri nyomás állandóságának fenntartása érdekében (10. ábra).
10. ábra. A neurotoxinok agykamrába történı adagolása.
5.5.2. A szerotonerg rendszer irtása (5-HT-X)
Az eljárás megegyezett a noradrenerg irtással, az alább felsorolt eltérések kivételével: az állatokat a triciklusos antidepresszánsok körébe tartozó dezipraminnal (20mg/2ml fiz.só/kg) kezeltük elı, mely noradrenalin-transzporter-gátló hatása révén védi a NA-erg sejteket a szerotonerg neurotoxin felvételétıl. Az agykamrába 10 µl oldószerben oldott 300 µg 5,7-DHT (szelektív 5-HT-erg neurotoxin) + 10 µl oldószer került beadásra egymás után.
5.5.3. A noradrenerg és szerotonerg rendszer együttes irtása (XX, dupla irtás)
Az eljárás megegyezett a noradrenerg irtással, az alább felsorolt eltérések kivételével: az állatok fiz.sós (2 ml/kg) elıkezelést kaptak annak érdekében, hogy a kísérleti
39
körülmények az összes irtásnál megegyezzenek. Az agykamrába 10 µl oldószerben oldott 300 µg 5,7-DHT + 10 µl oldószerben oldott 400 µg DSP-4 került beadásra egymás után.
5.5.4. Álmőtés
Az eljárás megegyezett a noradrenerg irtással, az alább felsorolt eltérések kivételével: az állatok fiz.sós (2 ml/kg) elıkezelést kaptak annak érdekében, hogy a kísérleti körülmények az összes irtásnál megegyezzenek. Az agykamrába 2 x 10 µl oldószer került beadásra.
5.6. Az irtási metodika ellenırzése
5.6.1. A választott koordináták ellenırzése Evans-kékkel
Annak
érdekében
hogy
meggyızıdjünk
az
általunk
választott
koordináták
helyességérıl, az elıkísérletek során az állatoknak 20 µl 0,1 %-os Evans-kék indikátort adtunk be i.c.v. az 5.5.1. pontban feltüntetett koordinátákat és folyási sebességet alkalmazva. A beadás után az állatokat Equithesinnel túlaltattuk, guillotinnal dekapitáltuk, agyukat kiszedtük, és borotvapengével koronális síkban átmetszettük a beadás agyfelszíni pontjánál. A metszeten az indikátor szétterjedését az agyban szabad szemmel vizsgáltuk.
5.6.2. A hippocampalis monoamin-tartalom ellenırzése HPLC-analízissel
A két monoamin és a szerotonin-metabolit 5-HIAA változásait a mőtétek hatására nagy teljesítményő
folyadékkromatográfiás
(HPLC)
módszerrel
határoztuk
meg
a
kísérletekben résztvevı összes állatnál. Mivel a hippocampus gazdag mind az LC-bıl származó NA-erg, mind a raphe magokból jövı 5-HT-erg innervációban, ezért ezt az agyterületet választottuk ki a meghatározáshoz (Vizi és Kiss 1998). Az analíziseket Adams és Marsden szerint végeztük (Adams és Marsden 1982). A patkányok guillotinnal történı lefejezése után hippocampusukat jéghőtés mellett eltávolítottuk, és a
40
mintákat 0,5 mM etiléndiamin-tetraecetsavat (EDTA) és 0,4 mM nátrium-piroszulfitot (Na2S2O5) tartalmazó 0,2 N perklórsavban homogenizáltuk fehérjementesítés céljából. A homogenizátumokat lecentrifugáltuk, és a felülúszóból leszívott alikvotokat használtuk analizáláshoz, amit Beckman System Gold HPLC (oszlop: C-18 ESA Catecholamine HR-80) és ESA Coulochem II elektrokémiai detektorral végeztünk. A mobil fázis 75 mM NaH2PO4 –et, 1,4 mM oktánszulfonsavat, 50 µM EDTA-t (pH =3.1) és 5 % acetonitrilt tartalmazott. A munkaelektród potenciálja + 250 mV-ra volt beállítva. A monoamin-tartalmat ismert koncentrációjú standardok segítségével határoztuk meg, és ng/g (nedves szövet)-ban fejeztük ki.
5.7.A szorongásra gyakorolt hatás vizsgálata
5.7.1. Emelt keresztpalló teszt
Az emelt keresztpalló teszt egy nem kondicionálással kialakított, hanem a rágcsálók magasságtól és nyílt terektıl való veleszületett félelmén és az ezzel ellentétesen ható, az ıket új területek bejárására késztetı hajtóerın alapuló explorációs konfliktus-modell (Millan 2003, Litvin és mtsai 2008). Ez az egyik legelterjedtebb anxiolitikus szőrıteszt az orvosi biológiai alapkutatásban és a gyógyszeriparban is, ezért elıször ezen vizsgáltuk az irtások hatásait a szorongásra. A kísérletet Pellow és mtsai módosított módszere szerint végeztük (Pellow és mtsai 1985). A vizsgálathoz a talajtól 60 cm magasra megemelt 50 cm hosszú és 15 cm széles karokkal rendelkezı fa padlózatú keresztet használtunk. A kereszt két szembenlévı karjának két hosszanti oldala és a vége 40 cm magasan zárt (zárt karok), csak a kereszt középsı 15 x 15 cm-es része (centrális area) felé nyitott. A másik két, egymással szemben lévı karnak nincs fala (nyitott karok) (11. ábra). A nyitott karokba történı belépések száma, valamint az ott töltött idı mennyisége alapján határoztuk meg a beavatkozások hatását az anxietásra. Minél több idıt tölt egy állat a keresztpalló számára averzív nyitott karjaiban, illetıleg minél többször lép be azokba, annál kevésbé szorong. A mérés kezdetekor az állatot a labirintus közepére helyeztük, a mérıhelyiséget elhagytuk, és videokamerán keresztül követtük a labirintuson belüli mozgását. Ha egy állat leesett a keresztpallóról, azt a kísérletbıl kizártuk. A mérési idı 5 perc volt, ezalatt regisztráltuk az állatok nyitott karban töltött idejét, valamint a nyitott és zárt karokba történı belépéseinek számát. 41
11. ábra. Emelt keresztpalló.
5.7.2. Fény-sötét teszt
Az emelt keresztpallón kapott eredmények birtokában kíváncsiak voltunk, hogy egy hasonló etológiai hátterő szorongástesztben hogyan viselkednek az irtott állatok. A fény-sötét teszt az emelt keresztpalló módszerrel megegyezıen a rágcsálókban meglévı, a számukra potenciálisan veszélyes helyektıl való természetes averzióra és az ezzel ellentétesen ható felfedezési hajtóerıre alapozott explorációs konfliktus-modell (Rodgers 1997, Millan 2003, Ramos 2008). A méréseket Bilkei-Gorzó és mtsai módosított eljárása szerint folytattuk le (Bilkei-Gorzó és mtsai 1998). Kísérleteinkben az irtásoknak nem az általa leírt mCPPkeltette patológiás szorongásra gyakorolt befolyását kívántuk vizsgálni, hanem a keresztpallóhoz hasonlóan az állatok veleszületett félelmére kifejtett hatásokat szerettük volna feltérképezni. Ezért elıkísérleteket végeztünk, melyekben megvilágítással próbáltuk averzívvá tenni a világos rekeszt. A 60 Watt teljesítményő fehér égı által kibocsátott fény egerekben már elégségesnek bizonyult ahhoz, hogy a térfélen lecsökkentse a tartózkodási idejüket és mozgásaktivitásukat (Costall és mtsai 1989, Bourin és Hascoët 2003), ezért mi is ezt alkalmaztuk. Eredményeink szerint ez a
42
megvilágítás intakt patkányokban az mCPP-vel megegyezı erısségő averziót keltett (az eredményeket nem részletezzük), tehát további méréseink során ezzel világítottuk meg a világos térrészt. A kísérlethez 5 db, egyenként két rekeszbıl álló automata dobozt használtunk (Omnitech, Digiscan, Model RXYZCM 16), melyek egy másik helyiségben levı, számítógéphez csatlakoztatott digitális aktivitásmérıvel voltak összekötve (Omnitech, Digiscan analizátor). A dobozokban a sötét és a világos térfél azonos mérető volt: 39x20x29 cm, közöttük az átjárást egy 8x8 cm-es nyílás biztosította. A világos térfél egy 60 Wattos fehér égıvel volt megvilágítva a doboz aljától számítva 30 cm magasságban. A sötét térfél tetıvel volt lefedve (12. ábra). Az állatok mozgását a térfeleken infravörös led égık segítségével monitoroztuk (16 db térfelenként, 2 cm magasan elhelyezve a doboz aljától). A fénymegszakításokat a Digiscan analizátor automatikusan regisztrálta, az adatokat Oasis szoftverrel értékeltük ki. A mérés kezdetén az állatokat egyesével a világos térfél közepére helyeztük, és mozgásukat 5 percig detektáltuk. A következı paramétereket vettük figyelembe a teszt értékelésénél: a világos, illetve sötét térfélen mozgással töltött idı mp-ben kifejezve (világos- és sötét mozgási idı), valamint a térfeleken történı vízszintes aktivitás a fénymegszakítások számaként megjelenítve (világos- és sötét vízszintes aktivitás). Minél több idıt töltött az állat mozgással, illetve minél magasabb volt vízszintes aktivitásának szintje a világos térfélen, annál kevésbé szorongott.
12. ábra.Fény-sötét mérıdoboz.
43
5.7.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata
5.7.3.1.Stressz-indukálta szociális elkerülés teszt
Az irtások hatását a szorongásra egy kondicionált félelmen alapuló modellen is meg kívántuk vizsgálni, ezért végeztük el ezt a tesztet, melyet Haller és mtsai dolgoztak ki (Haller és Bakos 2002, Haller és mtsai 2003), és Leveleki és mtsai validáltak farmakológiai szempontból (Leveleki és mtsai 2006). A módszer a szubkrónikus generalizált szorongásbetegség modelljének tekinthetı, segítségével akut stressz indukálta kondicionált szociális félelmet alakítunk ki az állatokban. A viselkedésbeli deficit (szociális elkerülı magatartás) a stresszortól eltérı kontextusban jelentkezik A teszt során elkerülhetetlen talpsokkolással idéztünk elı az állatokban olyan akut stressz-reakciót, mely 20-24 óra elteltével szubkrónikus generalizált szorongást vált ki. Ez a szorongás 5-10 napig fennálló, tartós szociális elkerülésben nyilvánul meg. A kiterjedt agykérgi gátlás és a kognitív funkciók sérülése eredményeképpen az állat elveszíti ösztönös érdeklıdését ismeretlen fajtársával szemben, illetve jelenlétét averzív ingerként éli meg. Az állatok az elektromos talpsokkot egy 20×20×16 cm-es elsötétített fekete plexidobozban, a padlózatot képezı fémrácson keresztül kapták 12 percen keresztül félpercenként, 100 V-os váltóárammal, 3 mA áramerısséggel, 1 mp-en keresztül. A teszt kivitelezése 24 órával az elektromos talpsokk-sorozat adását követıen történt. A tesztelésre használt 4 mérıdoboz egyenként 3 fülkébıl állt (13. ábra). Ebbıl “a” (15x50x40cm) és “b” (20x40x40 cm) fülke egy felhúzható ajtót tartalmazó átlátszatlan fallal volt elválasztva. A harmadik fülkét (“c” : 20x40x40 cm) – melyben az ismeretlen, a vizsgált állatnál idısebb és nagyobb tömegő (< 350 g) hím fajtárs (opponens) foglalt helyet - egy lyuggatott, átlátszó plexilemez választotta el “b” fülkétıl. A vizsgálati szoba a kísérlet alatt halvány vörös fénnyel volt megvilágítva. A tesztelt állatot az “a” fülkébe helyeztük 3 percre (habituációs idı). A habituáció után az ajtót felhúztuk, és figyeltük, hogy a teszt-állat miként reagál az opponens jelenlétére az 5 perces mérési idı alatt.
44
13. ábra. A stressz-indukálta szociális elkerülés teszt mérıdoboza. Forrás: Leveleki és mtsai 2006.
Az egész kísérletet a mennyezetre függesztett kamera segítségével DVD-re rögzítettük, miközben egy másik szobából monitoron kísértük figyelemmel. A kísérlet során 2 változót értékeltünk: az átlépések számát az opponens térfelére („b” fülke) (opponens belépések, darabszám), illetve az opponens térfelén eltöltött idıt (opponens idı, mp). Minél magasabb ez a két változó, az állat annál kevésbé mutat elkerülı magatartást. Kiegészítı kísérleteket is végeztünk, hogy a teszten kapott eredményeket helyesen tudjuk értelmezni.
5.7.3.2. Sokkolás alatti viselkedés elemzése
Annak vizsgálatára, hogy az irtások önmagukban befolyásolták-e a fájdalomérzést és ezzel a talpsokkok hatását, az állatok sokkolás alatti viselkedését kielemeztük (leírást lásd Sziray és mtsai 2007).
5.7.3.3. Szociális interakció teszt
Kizárandó, hogy a szociális elkerülés teszten kapott eredmények az irtások miatt az általános szociális viselkedésben végbement változások következményei, újonnan irtott állatcsoporton elvégeztük a szociális interakció tesztet (leírást lásd Sziray és mtsai 2007).
45
5.7.3.4. MK-801 hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre
Annak érdekében, hogy bizonyítsuk azt a feltételezésünket mely szerint a sokkolás a glutamáterg rendszeren keresztül gyakorol hatást a szociális elkerülésre, intakt állatoknak MK-801-et (dizocilpin) adtunk i.p., mely egy szelektív, nem kompetitív NMDA-receptor antagonista -csatorna blokkoló- vegyület (Sperlágh és mtsai 2007): 1. 0,05 és 0,1 mg/kg-ban 30 perccel sokkolás elıtt, egyrészt a megfelelı dózis megállapítása céljából, másrészt hogy megtudjuk, hogy a szer blokkolja-e az averzív emléknyom konszolidációját. 2. 0,1 mg/kg-ban 24 órával sokkolás után, 30 perccel a szociális elkerülés teszt elıtt, annak megállapítására, hogy az MK-801 gátolja-e a memórianyom visszahívását.
5.8. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata
5.8.1. Passzív elkerülés teszt
Elsıként ezt a gyógyszeriparban széles körben elterjedt, averzív kondicionáláson alapuló asszociációs módszert alkalmaztuk, mely lehetıvé teszi a beavatkozások hatásának vizsgálatát külön a tanulás, a memória-konszolidáció illetve a memórianyomvisszahívás folyamatában. A módszer lényege, hogy a kísérleti állatokat egy számukra kellemetlen (erısen megvilágított) helyre tesszük, majd lehetıséget kapnak, hogy innen nekik vonzóbb körülmények közé mehessenek. Amint a kevésbé averzív helyre (sötét térfél) belépnek, elkerülhetetlen talpsokkot kapnak. A vonzó hely + kellemetlen inger társítása az akvizíció, azaz az emléknyom elsajátítása (tanulás, memória-konszolidáció). Egészséges állatok adott idı (átlagosan 24 óra) elteltével sokkal többet várnak mielıtt bemerészkednének újra oda, ahol elızıleg áramütés érte ıket, hiszen élénken él emlékezetükben a talpsokk; viszont hajtja ıket az explorációs kényszer, tehát a kellemetlen emlék ellenére sokan közülük elıbb-utóbb ismét belépnek az averzív helyre. Ez a késlekedés a retenció, vagyis a memórianyom megtartásának megnyilvánulása, mely az emlékezéshez nélkülözhetetlen folyamat. Az ily módon rögzített emléknyom egészséges állatokban akár hetekig, hónapokig megmaradhat. A vizsgálatok ún. átlépéses típusú passzív elkerülés vizsgálatára alkalmas hat csatornás készülékben történtek, Sahgal módosított metódusa szerint (Sahgal 1993). A 46
mérıszerkezet két egymással szemben lévı 20x20x16cm-es plexidobozból áll (14. ábra). Az egyik doboz átlátszó plexi, a másik nem fényáteresztı, feketére festett. A dobozok között egy elválasztó fal van, amelyen egy 7,5x8cm-es nyílás található. A nyílás számítógép vezérelte ajtóval zárható illetve nyitható. A patkány áthaladását az egyik dobozból a másikba a nyílásban elhelyezett két párhuzamos fotocella sor érzékeli. Az ajtó az állat áthaladását követıen automatikusan lecsukódik. A sötét oldal padlója rozsdamentes acélrudakból áll, amelyen keresztül elektromos áramütés (sokk) adható. A világos oldalt egy 10Watt fényerejő izzó világítja meg. A csatornák számítógéppel vannak összekötve, az állat mozgásának adatait a Konnel KKt. által írt program győjti (Konnel KKt, Budapest).
14. ábra. A passzív elkerülés mérıdoboza.
Méréseinket két egymást követı napon, 24 órás eltéréssel végeztük. Az elsı napi mérés az akvizíció (ismeretszerzés), ahol az állat a szituációhoz kapcsolódó ismeretet szerzett (sötét dobozban áramütést kapott), a második napi mérés pedig a retenció (a megszerzett ismeretre való emlékezés) volt. Elsı napi mérés (akvizíció): az állatot zárt térelválasztó ajtó mellett a shuttle-box világos térfelébe helyeztük. 30 másodperc után az ajtó kinyílt, és az állat szabadon átmehetett a sötét részre. Ezzel egy idıben megkezdıdött az átlépési latencia mérése (az az idıtartam, ami alatt az állat a világos dobozból a sötét dobozba átmegy). Amint az állat áthaladt a sötét dobozba, az ajtó lecsukódott és a latenciamérés leállt. A belépést követıen 3 másodperccel az állatot (kivéve a nem sokkolt kontroll csoportok állatait) kellemetlen áramütés érte, talpsokk 47
formájában (0,4 mA 10 másodpercig, impulzusszám: 6). Az áramütés erısségét úgy állítottuk be, hogy a módszer alkalmas legyen a kogníciót rontó, illetve javító hatás kimutatására is. Amennyiben egy állat a maximális mérési idı alatt (3 perc) nem lépett át a sötét térfélre, akkor a vizsgálat további fázisaiból kizártuk. Az áramütés után az állatokat azonnal eltávolítottuk a készülékbıl. Második napi mérés (retenció): az állatokat 24 óra elteltével ismét a mérıapparátusba helyeztük. A procedúra megegyezett az akvizíciós napon történtekkel. A beállítási paraméterek az akvizíciós napon használtakkal azonosak voltak, kivéve az impulzusszámot, ami ezen a napon 0 volt. A sötét térfélbe lépést követıen az állatok így egy csoport esetében sem kaptak áramütést. A regisztrált paraméter mindkét napon az átlépési latencia (mp) volt, a második napi adat szignifikáns növekedése az elsı napihoz képest azt jelenti, hogy az állat emlékszik az áramütésre, számára averzívvá vált a sötét térfél.
5.8.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt
Annak eldöntésére, hogy a passzív elkerülés teszten kapott eredményünk a léziók memória-konszolidációt (tanulás) vagy az emléknyom megtartását és visszahívását (emlékezés) befolyásoló hatása miatt alakult-e ki, a memória-formálódás sejtszintő elektrofiziológiai modelljének tekinthetı in vitro teszten vizsgáltuk az irtások hatását. Az állatok hippocampus-szeletein a szinaptikus mezıpotenciál (csoportos akciós potenciál: Population Spike – PS) tartós serkentését (Long Term Potentiation – LTP) váltottuk ki nagyfrekvenciás elektromos ingerléssel. A teszttel a térbeli kognitív folyamatokat (hippocampalis memória) lehet feltérképezni. Az alkalmazott stimuláló ingerlés frekvenciájától, illetve mintázatától függıen, az idegi kapcsolatok tartós gátlása (Long Term Depression), vagy serkentése (LTP) érhetı el. Ezáltal a módszer alkalmas mőtéti, gyógyszeres vagy más jellegő beavatkozások akár tanulást rontó, akár javító hatásainak kimutatására is (Laroche és és mtsai 1989). Kísérleteinkben olyan ingerlést alkalmaztunk, mely szubmaximális LTP kiváltását eredményezi, így elsısorban rontó hatás kimutatására jó, de markáns javító hatást is lehet mellette detektálni. A kísérleteket az álmőtött, noradrenerg irtott és szerotonerg irtott állatok esetében 14 nappal a mőtétek után végeztük. A dupla irtás LTP-re gyakorolt hatásának esetleges idıbeli változására is kíváncsiak voltunk, így a dupla irtott állatok agyszeleteit 1, 6, 14 és 30 nappal az irtásokat követıen preparáltuk ki és használtuk fel kísérleteinkhez. 48
A méréseket Kapus és mtsai módosított metódusa szerint végeztük (Kapus és mtsai 2004). Az állatokat éteres altatás alatt dekapitáltuk, agyukat eltávolítottuk. Ezt követıen jeges oldatos hőtés mellett kipreparáltuk a hippocampusukat, és karbogenizált (95% O2 + 5% CO2) preparáló oldatba helyeztük. A preparáló oldat összetétele 124 mM NaCl; 3,5 mM KCl; 1,2 mM NaH2PO4; 2 mM MgCl2; 1,5 mM CaCl2; 10 mM glükóz; 30 mM NaHCO3 volt. A hippocampusból McIlwain szövetszeletelıvel 400 µm-es harántmetszeteket készítettünk, és az elıbbi oldatban 33 oC-on inkubáltuk ıket 60 percig. Ezt követıen a szeleteket áthelyeztük egy „interface” típusú plexi agyszelet kamrába, ahol a szeletek egy nejlonhálón feküdtek úgy, hogy a tápoldattal csak alulról érintkezzenek, míg felsı felszínüket folyamatosan vízpárával áramoltattuk (15. ábra). A kamrában állandó hımérsékletet (33 ± 0,2 oC), állandó páratartalmat és pH-t, valamint folyamatos oldatutánpótlást (2 ml/perc) biztosítottunk.
15. ábra. Interface típusú mérıkamra az agyszelettel és az elektródákkal.
A szeletek CA1 régiójának stratum pyramidale rétegébıl vezettük el a mezıpotenciálokat (extracelluláris elvezetés). Az ingerlı Ni/Cr bipoláris elektródát a preszinaptikus
Schaeffer-collateralisokba,
míg
a
regisztráló
boroszilikát-üveg
elektródát, mely 2 M-os NaCl oldattal volt feltöltve, a piramis sejtek sejttest rétegébe szúrtuk (16. ábra). Innen a piramissejtek összegzett, csoportos akciós potenciálját (PS) tudtuk mérni. A Shcaeffer collateralist minden 20 másodpercben stimuláltuk a maximális válasz 50 %-ának megfelelı erısségő alapingerrel (feszültség négyszög-
49
impulzusok: 0,1 ms, 0,06 Hz). Az így keltett csoportos akciós potenciálokat extracelluláris erısítın (Axon Instruments) keresztül felerısítve és digitalizálva, egy IBM kompatibilis számítógéppel vételeztük be. A jelek feldolgozására és kiértékelésére egy saját készítéső szoftvert használtunk, minden három egymást követı jelet átlagoltunk. A szinaptikus válasz stabilizálódása után az LTP-t magas frekvenciájú (1 mp, 50 Hz) ingerléssel keltettük, melynek intenzitása megegyezett a kontroll válaszoknál alkalmazott intenzitással. Az LTP-t a PS amplitúdójának permanens fokozódásaként határoztuk meg, és a kontroll értékekhez (5 átlagolt jel amplitúdója) viszonyított %-os amplitúdóváltozást számoltuk. A pozitív irányba való változás szinaptikus transzmisszió fokozódást, tehát a kognitív funkciók felélénkülését, a tanulási képességek javulását; míg a csökkenés azok romlását jelzi.
16. ábra. Az LTP keletkezésében részt vevı hippocampalis régiók és pályák. Forrás: Wikipedia.
50
5.8.3. Tárgyfelismerés teszt
Annak eldöntésére, hogy a PS-LTP teszten kapott hatás in vivo elıjön-e, egy, a passzív elkerüléstıl különbözı etológiai hátterő, nem kondicionálással létrehozott tanulást mérı, de hasonló kogníciós folyamatokat vizsgáló tesztet, a tárgyfelismerést végeztük el. A tárgyfelismerésben a perirhinalis és entorhinalis cortexnek tulajdonítanak nagy jelentıséget (Winters és Bussey 2005, Balderas és mtsai 2008, Albasser és mtsai 2010). A módszerrel a vizuális rekogníciós memória (a már ismert tárgyak felismerésének képessége) mérhetı, és a serkentı, prokognitív folyamatok kimutatására alkalmas (Fernandez és Frick 2004, Miyamoto és mtsai 2005). A módszer azon az elven alapszik, hogy a rágcsálók új környezetbe kerülve azt felfedezik, tüzetesen megvizsgálják. Hasonlóképpen viselkednek a területükön elhelyezett ismeretlen tárgyakkal is. A kísérlet során tehát nem jutalmazással vagy averzív ingerrel kondicionált, hanem spontán tanulási folyamatot vizsgálunk. Kísérleteinket Bevins és Besheer módosított metódusa szerint végeztük (Bevins és Besheer 2006). A vizsgálatok során a kísérlet elıtti napon az állatokat egyesével egy 50 cm széles, 70 cm hosszú és 40 cm magas, fenyıforgács alommal bélelt, fekete plexidobozba helyeztük. A patkányok 2,5 percig ismerkedtek a dobozzal. 24 óra múlva, a kísérlet 1. napján (akvizíció) a dobozba két egyforma tárgy került: két darab, rozsdamentes acélból készült négyzet alapú hasáb (5x5x14 cm), fekvı helyzetben, vagy két, egyenlıszárú háromszög alapú hasáb (8,5x5x14 cm), nagyobbik lapjára állítva, azaz mindkét tárgy az 5x14 cm mérető lapján állt. A tárgyakat közvetlenül a doboz hosszabb hátsó falához állítottuk úgy, hogy egyenlı távolságra legyenek egymástól és a hozzájuk közelebb esı rövidebb faltól (17. ábra). A mérés kezdetén az állatokat egyesével a dobozba helyeztük fejjel a 2 tárgytól ellentétes irányban, azoktól egyenlı távolságra, és stopperrel mértük a tárgyak vizsgálatával (szaglászásával) eltöltött idıt (explorációs idı, másodpercben). Explorációnak számított, ha az állat <= 2 cm-re megközelítve a tárgyat, a tárgyra nézett, illetve orrával, mancsával közvetlen kontaktust létesített a tárggyal. Nem számított explorációnak, ha a tárgyra felmászva nem a tárgyat vizsgálta hanem környezetét, illetve ha a tárgy körüli/mögötti forgácsot szaglászta. Ha a két tárgy explorációja együttesen elérte a 20 másodpercet – ez rendszerint 2-4 perc dobozban töltött idıt jelent -, az állatokat kivettük a dobozból. Azt az állatot amelyik 5 perc alatt sem explorálta a 2 tárgyat együttesen 20 másodpercig, kizártuk a kísérletbıl. A kísérlet 2. napján, 24 <= óra múlva (retenció) az egyik, már ismert tárgyat kicseréltük egy újra 51
(téglalap alapú hasábot háromszög alapú hasábra, vagy fordítva) a dobozban, és ismét elvégeztük az explorációs idı mérését. Ekkor már a dobozban töltött összidı minden állatnál egyforma volt (4 perc), és azt mértük, hogy az állat ezalatt mennyi idıt töltött az ismert, illetve az új, ismeretlen tárgy explorációjával. Az intakt állatok 24 óra elteltével már nem emlékeznek a látott tárgyra, így azt megközelítıleg annyi ideig vizsgálják, mint az újat. A prokognitív hatás abban nyilvánul meg, hogy az új tárgy explorációs ideje szignifikánsan nı az ismertéhez képest. A másodpercben kifejezett idıértékekbıl származtattuk a rekogníciós indexet ({új tárgy explorációs ideje/ (ismert tárgy + új tárgy explorációs ideje)}x100).
17. ábra. A tárgyfelismerés teszt sémája.
5.9. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás vizsgálata
Hogy meggyızıdjünk arról, hogy az in vivo teszteken az állatok viselkedését nem befolyásolta az irtások központi idegrendszerre gyakorolt esetleges szedatív vagy élénkítı hatása, az ezen tesztekben résztvevı állatok spontán motoros aktivitását minden
esetben
teszteltük
aktiméterben
is,
így
mentesítve
a
mérést
a
szorongástesztekben alkalmazott szituációk általános lokomóciót is befolyásoló emocionális paramétereitıl (Hascoët és Bourin 1998, Kliethermes és mtsai 2004). A kísérleteket Borsy és mtsai módosított eljárása szerint végeztük (Borsy és mtsai 1960). A méréshez egy 6 csatornás aktivitásmérıt használtunk (Biokémiai
52
Laboratórium Szevíz Kft, Magyarország). Az 57x20x28 cm mérető csatornákba az állatokat egyesével helyeztük be. A csatornák oldalain egymástól és a sarkoktól 190 mm-re, az aljzattól 40 mm-re elhelyezett led-sorozat volt. A 15 perces tesztidı alatt az állatok vízszintes aktivitása került regisztrálásra a fénymegszakítások számával kifejezve. A kontroll értékekhez képest növekvı lokomóció központi idegrendszeri izgató, míg a csökkenı aktivitás szedáló hatásra utal.
5.10. Radioaktív transzmitter- felszabadulás mérése szuperfúziós technikával
A NA-erg és 5-HT-erg rendszer interakciójának in vitro módszerrel való felderítésére az irtott állatok agyszeleteibıl NA- és 5–HT-felszabadulásokat vizsgáltunk szuperfúziós technikával a mőtétek után 7 és 14 nappal Hársing és és mtsai által leírt módszerek szerint (Hársing és Vizi 1991, Hársing és mtsai 2004) (18. ábra).
18. ábra. A transzmitter-felszabadulás mérıberendezése a 4 szuperfúziós szövetkamrával.
5.10.1. [3H]NA-felszabadulás mérése
Az állatok agyából dekapitálás után a jobb oldali hippocampust jéghideg, karbogenizált (95% O2 + 5% CO2) Krebs-oldatban (összetétele [mmol/l]: NaCl: 113; KCl: 4,7; CaCl2: 2,5; KH2PO4: 1,2; MgSO4: 1,2; NaHCO3: 25; glükóz: 11,5) kipreparáltuk. A hippocampusokat, sarkaikból 1000-1000 µm eltávolítása után, 4 egyenlı szeletre
53
vágtuk, a szeletek súlyát lemértük. 1 állat 1-es és 3-as szeletét használtuk mérésre ugyanazon szervkamrában, a másik két szeletet HPLC-s transzmittertartalommeghatározás céljából félretettük. Az izotóp felvételét a szeletekbe tríciált NA-val ([3H]NA koncentráció: 1,25 µCi/ml) végeztük 30 percig 37 oC-on, karbogenizált Krebs-oldatban. Az elıperfúziót a szuperfúziós kamrákban 1 ml/perc áramlási sebességgel, karbogenizált Krebs–oldattal végeztük 60 percig, a fel nem vett izotóp kimosása érdekében. Az effluens kidobásra került. A perfúzió során 22 db frakciót győjtöttünk (3 perc/frakció-3 ml/frakciónként). A szövetek ingerlése a 4. és a 15. frakcióban történt 20 V, 2 Hz, 2 ms, 2 perc ingerlési paraméterekkel, Experimetria elektrostimulátor segítségével (Experimetria Kft, Budapest). A perfúzió végén frakciónként 700 µl-es alikvotokat vettünk ki, 2 ml szcintillációs
folyadékot
adtunk
hozzájuk,
és
az
így
kapott
mintákból
folyadékszcintillációs spektrométer készülékben (Packard Tri-Carb 2900 TR) lemértük az izotópbomlásból származó beütésszámokat (DPM=desintegration per minute; a percenkénti szétesések száma). A kísérlet végén a szöveti radioaktivitás meghatározása céljából a szöveteket kamránként összegyőjtöttük, és 100 µl desztillált vízben homogenizáltuk. A homogenizátumokat 1500 g-n 10 percig 4 ˚C-on lecentrifugáltuk, felülúszójuk térfogatának 1/8-részéhez 2ml szcintillációs folyadékot adtunk, és a mintákat lemértük a Packard készülékben. A nyersadatokból Corel Quattro Pro Suite 8.0 (Corel Corporation Ltd. 1997) programmal végeztük az adatfeldolgozást. A nyugalmi periódusban és a 2 elektromos ingerlés
során
frakciónként
felszabadult
radioaktivitás
frakcionális
(Fr.)
felszabadulásként lett meghatározva (a felszabadulás idıpontjában a szöveti radioaktivitás %-ában kifejezve: Fr. felszabadulás %). Az 1. és 2. stimuláció hatására mérhetı radioaktivitás növekedés az effluensben (FRS1 és FRS2 : görbe alatti területek) szintén a programmal lettek számolva. 5.10.2. [3H]5-HT-felszabadulás mérése
A procedúra az elızıekben leírtakkal megegyezett, kivéve hogy az izotóp felvételét a szeletekbe [3H]5-HT-vel végeztük 2,5 µCi/ml koncentrációban. Az intakt szeleteken folyó kísérletek egy részében az izotópfelvétel alatt, valamint az elıperfúzió kezdetétıl a mintagyőjtés végéig a Krebs-oldathoz 1 µM koncentrációban DMI-t adtunk.
54
6. EREDMÉNYEK
6.1. Az irtási metodika ellenırzése
6.1.1. A választott koordináták ellenırzése Evans-kékkel
Az elıkísérletek során a mőtött állatok több mint 90 %-ának agyában a már ismertetett sztereotaxikus koordináták szerint intracerebro-ventrikulárisan beadott 20 µl Evans-kék indikátor a szúrcsatorna és a 4 agykamra által alkotott összefüggı folyadéktérben volt csak jelen (19. ábra).
19. ábra. A választott koordináták ellenırzése indikátorral.
6.1.2. A transzmitterszintek változásainak ellenırzése HPLC-analízissel
Ahogy az 1. táblázatban látható, 400 µg DSP-4 illetıleg 300 µg 5,7-DHT egyszeri i.c.v.
beadása
drasztikus
változásokkal
járt
az
állatok
hippocampalis
transzmitterszintjeiben (F(4,81)=52,63; egyutas ANOVA p<0,001 a noradrenerg szintekre; F(4,81)=90,68; egyutas ANOVA p<0,001 a szerotonerg szintekre). A
55
noradrenerg neurotoxin ~ 70%-os NA-, míg a szerotonerg ~90%-os 5-HT tartalom csökkenést ereményezett a szimpla-irtott állatok hippocampusában az álmőtéshez képest (post hoc p<0,001 mindkét transzmitter esetében). A két neurotoxin együttes beadása 80% körüli NA-, és 90% körüli 5-HT-csökkenést okozott, ami egyik esetben sem tért el szignifikánsan a szimpla-irtásokkal elért csökkenésektıl (post hoc p=0,06 a NA-X és XX , p=0,97 az 5-HT-X és XX csoport között). Mindkét toxin kisebb mértékben ugyan, de szignifikánsan csökkentette a másik transzmitter szintjét is a szimpla-irtott állatokban post hoc (p<0,001 a DSP-4, p<0,01 az 5,7-DHT esetében), a csökkenés mégis jelentısen kisebb volt a lézionált transzmitter szintjének változásánál, így a szimpla irtott csoportok mindkét jelátvivı tekintetében erısen szignifikánsan eltértek egymástól (post hoc p<0,001 az NA- és 5-HT- szintekre) A két neurotoxin az NA/5-HT arányt tehát a megfelelı irányba tolta el: a DSP-4 szerotonerg-, míg az 5,7-DHT noradrenerg túlsúlyt indukált. Az intakt és az álmőtött állatok hippocampalis transzmitterszintjei nem különböztek egymástól (post hoc p=0,16 az NA-; p=0,72 az 5-HT- tartalom esetében). A szerotonin-metabolit 5-HIAA szintjei a szerotoninéval megegyezı változásokat mutattak az összes csoportnál (adatok nincsenek feltüntetve).
1. táblázat. Az irtások hatása az állatok hippocampalis szöveteinek endogén NA- és 5-HT-szintjeire
(ng/g szövet)
NA
5-HT
N
Intakt
315 ± 12
293 ± 15
16
Álmőtött
282 ± 13
286 ± 22
16
NA-X
92 ± 16 ***
139 ± 20 ***
17
5-HT-X
215 ± 24 ** +++
21 ± 2 *** +++
19
XX
49 ± 4 ***
20 ± 2 *** +++
18
Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. NA-X: NA-erg irtott, 5-HT-X: 5-HT-irtott; XX: dupla- (NA+5-HT) irtott csoport. A csillagok az álmőtöttektıl való (**: p<0,01; ***: p<0,001), míg a keresztek az NA-X csoporttól való (+++: p<0,001) post hoc szignifikáns eltérést jelölik.
6.2.A szorongásra gyakorolt hatás
6.2.1. Emelt keresztpalló teszt
Az emelt keresztpallón mind a nyitott karban töltött idıt, mind a nyitott karba történı belépések
számát
(ezt
a
két
paramétert 56
használjuk
konvencionálisan
a
gyógyszerkutatásban a szorongás mérésére) hasonló mértékben, 50 %-ot meghaladóan, statisztikailag erısen szignifikánsan (post hoc p<0,001) emelte mind a noradrenerg, mind a szerotonerg lézió az álmőtéshez képest (F(4,81)=23,47; egyutas ANOVA p<0,001: nyitott kari idı; F(4,81)=16,77; egyutas ANOVA p<0,001: nyitott belépések). A dupla irtás a nyitott karban töltött idı tekintetében további szignifikáns anxiolitikus hatásfokozódást okozott (post hoc p<0,01 a szimpla irtásokhoz, p<0,001 az álmőtéthez és az intakt csoporthoz képest). A zárt karba történı belépések esetében az álmőtött állatoktól egyik csoport sem tért el szignifikánsan (post hoc 0,07
Nyitott karban töltött idı
Nyitott karba történı belépések 10
***
100
##
##
80
***
***
8
belépésszám
másodperc
120
60
###
40 20
6
***
***
***
NA-X
5-HT-X
XX
4 2
###
0
0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
Int
Álm
Zárt karba történı belépések 10
belépésszám
8 6 4 2 0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
20. ábra. Az irtások hatása a szorongásra emelt keresztpallón. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. A csillagok az álmőtöttektıl való, a kettıs keresztek a dupla-irtottaktól való post hoc szignifikáns eltérést jelölik (##: p<0,01; ###,***: p<0,001),. N=16-19/csoport.
57
6.2.2. Fény-sötét teszt
A fény-sötét teszten elért eredményeinket a 21. ábrán foglaltuk össze. Az ábrán látható, hogy a szerotonerg rendszer irtása szignifikáns anxiolitikus hatást eredményezett a teszt két, anxiolízist jellemzı paraméterén, azaz emelte mind a mozgással töltött idıt (F(4,65)=2,69; egyutas ANOVA p<0,05) mind a vízszintes aktivitást (F(4,65)=2,92; egyutas ANOVA p<0,05) a világos térfélen az intakt (post hoc p<0,05), az álmőtött és a NA-irtott állatokhoz képest (mindkét esetben post hoc p<0,01). A dupla irtás egyik csoporttól sem tért el szignifikánsan a két paraméter egyikénél sem. A sötét térfélen sem a mozgással töltött idı (F(4,65)=1,60; egyutas ANOVA p=0,18), sem a vízszintes aktivitás (F(4,65)=1,79; egyutas ANOVA p=0,14) tekintetében nem volt különbség a csoportok közt. Az intakt és az álmőtött csoport között egyik paraméternél sem volt szignifikáns az eltérés (post hoc p=0,42 a mozgási idıre-, p=0,5 a vízszintes aktivitásra a világos térfélen).
Sötét térfélen mozgással töltött idı
Világos térfélen mozgással töltött idı
120
120
másodperc
másodperc
100
*
100
**
80
**
60 40
80 60 40 20
20
0
0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
Int
XX
1200
fénymegszakítások száma
fénymegszakítások száma
*
** **
800 400 0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
NA-X
5-HT-X
XX
Sötét térfélen vízszintes aktivitás
Világos térfélen vízszintes aktivitás 2000 1600
Álm
2000 1600 1200 800 400 0 Int
XX
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
21. ábra. Az irtások hatása a szorongásra a fény-sötét teszten. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (*: p<0,05; **: p<0,01). N=11-16/csoport.
58
6.2.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata
6.2.3.1. Stressz-indukálta szociális elkerülés teszt
A stressz-indukálta szociális elkerülés teszten a következıket kaptuk (22. ábra): a sokkolás után 24 órával a stressz-indukálta szociális elkerülı magatartást jellemzı mindkét paraméter – az opponensi térfélen töltött idı, illetve az oda történı belépések száma – esetében szignifikáns eltérés mutatkozott a csoportok viselkedésében (F(6,67) = 9,96; egyutas ANOVA p<0,001; F(6,67) = 6,97; egyutas ANOVA p<0,001 az idıre és a belépésekre). Mind az intakt, mind az álmőtött csoportnál létrejött a sokk magatartásbeli deficitet okozó hatása, hiszen a sokkolt állatok jóval kevesebb idıt töltöttek az opponensi térfélen, és kevesebbszer léptek is be oda sokkot nem kapott társaiknál (post hoc p<0,01 az idıre mindkét csoportnál; p<0,01 az intakt, p<0,05 az álmőtött csoportnál a belépések számára). A szerotonerg pályák irtása szignifikánsan fokozta a sokk következményeként létrejött elkerülı viselkedés intenzitását, azaz csökkentette az opponensi térfélen töltött idıt (post hoc p<0,01), míg a noradrenerg rendszer léziója gátolta a viselkedés kialakulását, növelve ezt az idıtartamot (post hoc p<0,05) a sokkon átesett álmőtött csoporthoz viszonyítva. Ez a hatás a belépések számában is megmutatkozott, bár itt csak a NA-X csoportnál volt szignifikáns az eltérés (post hoc p<0,05), a szerotonerg-irtottnál csak a tendencia volt megfigyelhetı (post hoc p=0,09). A regresszió- és korrelációs analízis az állatok hippocampalis NA- és 5-HTszintjei és a tesztben mutatott magatartásuk közt szintén kimutatta, hogy az agyi szerotonin-szintek egyenes arányban, míg a noradrenalin-szintek fordított arányban állnak az opponens térfélen töltött idıvel, illetve az oda történı belépések számával. A dupla irtás egyik paraméterben sem eredményezett szignifikáns különbséget az álmőtött sokkolt kontroll eredményeitıl (post hoc p=0,33 az idıre; p=0,23 a belépések számára).
Az állatok sokkolás alatti viselkedésének elemzésekor és a szociális interakció paradigmában nem találtunk különbséget a csoportok közt (a fentebb nem részletezett eredményeket lásd Sziray és és mtsai 2007-es közleményében).
59
Opponensi térfélen töltött idı
** **
8
*** ***
150 100 50
**
* *
4
*** **
2
I In nt ts ok k
Á l Á lm m so kk N A 5- X s H T- okk X so XX k k so kk
0
I In nt ts ok k
0
6
Á l Á lm m so kk N A 5- X s H T- okk X so XX k k so kk
másodperc
**
*
belépésszám
250 200
Opponensi térfélre történı belépések
22. ábra. Az irtások hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. Sokk: elızetesen talpsokkban részesült csoport. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001). N=10-12/csoport.
6.2.3.2. MK-801 hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre
A szelektív, nem kompetitív NMDA-receptor antagonista MK-801 (dizocilpin) 30 perccel a sokkolás elıtt (mely 24 órával elızte meg a stressz-indukálta szociális elkerülés-tesztet) adva dózisfüggıen gátolta a stressz-indukálta szociális elkerülı magatartás kialakulását mind az opponensi térfélen töltött idı (F(3,28) = 19,71; egyutas ANOVA p< 0,001), mind pedig az oda történı belépések (F(3,28) = 11.65; egyutas ANOVA p<0,001) tekintetében a sokkolt kontroll állatokhoz viszonyítva (23. ábra). Ez a hatás csak a 0,1 mg/kg-os dózisban érte el a statisztikai szignifikanciát (post hoc p<0,001 az idı; p<0,01 a belépésszám esetében). Ebben a dózisban viszont 30 perccel a viselkedésteszt elıtt, tehát 24 órával a sokkolás után adva is megakadályozta a viselkedésbeli deficit létrejöttét (F(2,24) = 11,71; egyutas ANOVA p<0,001; post hoc p<0,001 az opponensi térfélen töltött idıre, és F (2,24) = 10,95; egyutas ANOVA p<0,001; post hoc p<0,01 az opponensi térfélre történı belépésekre).
60
Opponensi térfélen töltött idı
Opponensi térfélre történı belépések
250
***
*** belépésszám
másodperc
200
8
150 100 50
***
4 2 0
0 Kontroll
0
0,05
0,1
Kontroll
mg/kg MK-801
Opponensi térfélen töltött idı 250
***
0
0,05
8
***
*** belépésszám
150 100 50 0 0
mg/kg MK-801
Opponensi térfélre történı belépések
200
Kontroll
0,1
sokkolás 30 perccel kezelés után
sokkolás 30 perccel kezelés után
másodperc
**
6
0,1
mg/kg MK-801
sokkolás 24 órával kezelés elıtt
**
6 4 2 0 Kontroll
0
0,1
mg/kg MK-801
sokkolás 24 órával kezelés elıtt
23. ábra. Az NMDA-antagonista MK-801 hatása a stressz-indukálta szociális elkerülésre 24 órával sokkolás után, illetve 30 perccel elıtte adva. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Kontroll: talpsokkot nem kapott csoport. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (**: p<0,01; ***: p<0,001). N=8-9/csoport.
6.3. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás
6.3.1. Passzív elkerülés teszt
A tesztben mind a talpsokkot nem kapott kontroll állatok, mind pedig a sokkoláson átesett csoportok esetében szignifikáns különbségeket találtunk az átlagokban (F(9,59)=2,47; ismétléses ANOVA p<0,05) (24. ábra). A nem sokkolt kontrolloknál az elsı napi (akvizíció) és a második napi (retenció) átlépési latencia közt a szerotonergrendszer-irtott, és a dupla-irtott csoportnál volt csak szignifikáns a különbség, mindkét esetben növekedett a második napi latenciaidı az elsı nap mérthez képest (post hoc p<0,05 mindkét irtásnál). Az elsı nap talpsokkot kapott állatoknál az intakt, álmőtött és noradrenerg-irtott csoportok második napi átlépési latenciája erısen szignifikáns mértékben megnıtt az elsı napihoz képest (post hoc p<0,01 mindhárom csoportnál), a dupla-irtottaknál is szignifikáns volt a növekedés, csak kisebb mértékben (post hoc
61
p<0,05). A szerotonerg-irtott csoportnál viszont nem volt különbség a két nap közt az átlépési latenciák tekintetében (post hoc p=0,40). A kontroll és a sokkolt csoportok retenciós értékeit összehasonlítva csak az intakt, álmőtött és noradrenerg-irtott állatoknál volt szignifikáns a különbség, mindhárom esetben a sokkolt csoport átlépési latenciája volt magasabb (F(9,59) = 2,14; egyutas ANOVA p<0,05; post hoc p<0,05 mindhárom csoportnál). Sem a szerotonerg-, sem a dupla-irtott csoportnál nem volt szignifikáns az eltérés a két paraméter közt (post hoc p=0,34 az 5-HT-X, és p=0,80 az XX csoportnál). Sokkolt
Kontroll (nem sokkolt) Átlépési latencia (mp)
140
Akvizíció
120
Retenció
100 80
*
*
60 40 20
Átlépési latencia (mp)
140 120 100
**
**
** *
80 60 40 20 0
0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
Int
XX
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
Retenció Átlépési latencia (mp)
140
Kontroll
120 100
*
*
*
Sokkolt
80 60 40 20 0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
24. ábra. Az irtások hatása a passzív elkerülı magatartásra. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. Kontroll: talpsokkot nem kapott csoport. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (*: p<0,05; **: p<0,01). N=5-9/csoport.
6.3.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt
Ebben az in vitro szinaptikus plaszticitási modellben az irtás utáni 14. napon szignifikáns különbség volt kimutatható a csoportátlagok közt (F(2,30)=4,18; egyutas ANOVA p<0,05) (25. ábra). A noradrenerg-irtott állatok hippocampalis szeleteiben statisztikailag jelentıs (post hoc p<0,01) növekedés volt észlelhetı a PS %-os amplitúdóváltozásában az álmőtött szeletekhez képest. A szerotonerg deficites szeletek esetében nem volt változás a szinaptikus transzmisszióban sem az álmőtött (post hoc 62
p=0,29), sem pedig a NA-X (post hoc p=0,08) csoporthoz viszonyítva. Az irtás utáni 30. napra eltőnt a különbség a szeletek között (F(2,33)=0,80 egyutas ANOVA p=0,45). A dupla-irtott állatokból származó hippocampusok nem különböztek az álmőtöttekétıl a csoportos akciós potenciál amplitúdóváltozását tekintve semelyik vizsgálati idıpontban (kétmintás t-próbával t=0,38, df=22; t=0,15, df=20; t=1,77, df=20; t=1,07, df=26 1, 6, 14 illetve 30 nappal irtás után), bár a lézió utáni 14. napon itt is a NA-X-nél tapasztaltakhoz hasonló amplitúdó-fokozódás volt mérhetı. Az intakt és az álmőtött állatokból származó szeletek PS amplitúdóváltozásai közt nem volt szignifikáns eltérés (adatok nincsenek megjelenítve).
Irtás utáni 14. nap 100
**
amplitúdóváltozás (%)
amplitúdóváltozás (%)
100
Irtás utáni 30. nap
75 50 25
75 50 25 0
0 Álm
NA-X
5-HT-X
Álm
amplitúdóváltozás (%)
100
NA-X
5-HT-X
Álm XX
75 50 25 0 1.nap
6.nap
14.nap
30.nap
irtás után
25. ábra. Az irtások hatása az LTP-re hippocampus szeletben. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott állatok hippocampalis szeleteinek csoportja. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (**: p<0,01). N=10-15/csoport.
63
6.3.3. Tárgyfelismerés teszt
Amint a 26. ábrán látható, a második napi (retenció) méréskor nem volt szignifikáns különbség a már elızı nap látott és a még ismeretlen új tárgy explorációs ideje közt egyik csoportnál sem (F(4,40)=0,10; ismétléses ANOVA p=0,98). A nyersadatokból származtatott rekogníciós index [{új tárgy explorációs ideje/ (ismert tárgy + új tárgy explorációs ideje)}x100] esetében sem volt eltérés a csoportok közt (F(4,40)=0,38; egyutas ANOVA p=0,82), tehát az állatok nem ismerték fel a már látott tárgyat. Rekogníciós index
Retenció 100
ismert tárgy új tárgy
10
80
8
60
%
Explorációs idı (mp)
12
6
40 4
20
2
0
0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
Int
XX
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
26. ábra. Az irtások hatása a tárgyfelismerésre. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. Rekogníciós index={új tárgy explorációs ideje/ (ismert tárgy + új tárgy explorációs ideje)}x100. N=7-12/csoport.
6.4. Az irtások hatása a spontán motoros aktivitásra
A csoportok között nem volt szignifikáns különbség a spontán lokomotoros aktivitásban a 15 perces mérés alatt (F(4,66)=0,49; egyutas ANOVA p=0,74) (27. ábra).
fénymegszakítások száma
0'-15' 250 200 150 100 50 0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
27. ábra. Az irtások hatása a spontán motoros aktivitásra. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla(noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. N=12-16/csoport.
64
6.5. Az irtások hatása a [3H]transzmitter-felszabadulásra 6.5.1. [3H]NA-felszabadulás
A 28. ábrán foglaltuk össze a különbözı hippocampalis szeletekbıl a nyugalmi periódusban és elektromos ingerlésre történı [3H]NA-felszabadulás görbéit. Az ábrázolt mérések a mőtéti beavatkozások után 14 nappal történtek. Az Y tengelyen a frakciónként kiáramló radioaktivitást a felszabadulás idıpontjában a szöveti radioaktivitás %-ában adtuk meg (Fr. felszabadulás %). Látható, hogy mindkét (a 4. és a 15. frakció alatt történı) ingerlés hatására megnıtt a szeletekbıl kiáramló tríciált transzmitter mennyisége az összes csoportnál, ez a növekedés a noradrenerg-irtott szeleteknél volt a legmagasabb mindkét ingerléskor. Ennél a csoportnál a második igerlés után a nyugalmi kiáramlás növekedése tapasztalható a többi csoport alapvonalához képest.
12
Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
Fr. felszabadulás (%)
10
8
6
4
2
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
frakciók 28. ábra. [3H]NA-felszabadulás hippocampus szeletbıl a mőtétek utáni 14. napon: frakcionális felszabadulási görbék. Az elektromos ingerlések a 4. és 15. frakciónál történtek. Fr. felszabadulás % = kiáramló radioaktivitás a felszabadulás idıpontjában a szöveti radioaktivitás %-ában kifejezve. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport N=6-11/csoport.
65
A statisztikai számításokat a frakcionális felszabadulási görbe alatti területekbıl végeztük, melyeket a 29. ábrán jelenítettünk meg. FRS1 a 4. frakció alatt történı elsı, míg FRS2 a 15. frakció alatt történı második elektromos stimuláció hatására létrejövı frakcionális felszabadulási csúcsok alatti területeket jelenti. Az elsı ingerlés görbe alatti területeiben (FRS1) szignifikáns eltérés mutatkozott a csoportok közt (F(4,34)=7,29; egyutas ANOVA p<0,001). A noradrenerg-irtott állatok agyszeletei esetében, erısen szignifikánsan megnıtt a stimuláció hatására az effluensben mérhetı radioaktivitás az összes többi csoporthoz képest (post hoc p<0,001 mindegyik esetben). Ez az emelkedés a második ingerléskor (FRS2) már csak tendenciaként jelentkezett, a csoportok közt nem volt szignifikáns az eltérés (F(4,34)=1,44; egyutas ANOVA p=0,24).
FRS2
FRS1
***
***
***
12
10
görbe alatti terület
görbe alatti terület
12
***
8 6 4 2 0
10 8 6 4 2 0
Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
29. ábra. [3H]NA-felszabadulás elektromos ingerlés hatására hippocampus szeletbıl a mőtétek utáni 14. napon. FRS1 az 1., FRS2 a 2. ingerlés alatt felszabadult radioaktivitást jelöli. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport. A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik ***: p<0,001). N=6-11/csoport.
Az irtások [3H]NA-felszabadulásra gyakorolt hatását az idı függvényében is teszteltük: álmőtött és szerotonerg-irtott szeletekbıl a léziók után 7 nappal is elvégeztük a radioaktív transzmitter-efflux mérését. Az eredmények statisztikai szempontból nem különböztek a 14 nappal a mőtétek után mért értékektıl sem az FRS1, sem az FRS2 paraméter esetében, és a frakcionális felszabadulási görbék lefutása is hasonló volt (eredményeket nem mutatjuk be külön).
66
6.5.2. [3H]5-HT-felszabadulás 6.5.2.1. Dezipramin hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra intakt szeleteken
A 30. ábrán láthatóak az intakt állatok hippocampalis szeleteibıl a nyugalmi periódusban és elektromos stimulációra történı felszabadulási görbék, frakciónként. A kontroll csoport perfundáló folyadéka nem tartalmazott DMI-t, a szeletek másik csoportjának perfundáló oldatához a 30 perces izotópfelvétel alatt, míg a harmadik esetben az elıperfúzió kezdetétıl a kísérlet végéig (a 22. frakció lejöveteléig) 1 µM koncentrációban adagoltuk a NAT-gátló vegyületet. Látható, hogy mindkét (a 4. és a 15. frakció alatt történı) ingerlés hatására egyformán növekedett a szeletekbıl kiáramló tríciált transzmitter mennyisége mindhárom csoportnál.
12
Kontroll
DMI 30'
DMI
Fr. felszabadulás (%)
10
8
6
4
2
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
frakciók 3
30. ábra. [ H]5-HT-felszabadulás intakt és dezipraminnal kezelt hippocampus szeletbıl: frakcionális felszabadulási görbék. Az elektromos ingerlések a 4. és 15. frakciónál történtek. Fr. felszabadulás % = kiáramló radioaktivitás a felszabadulás idıpontjában a szöveti radioaktivitás %-ában kifejezve. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. DMI 30’: 1 µM dezipramin az izotópfelvétel ideje alatt, DMI: 1 µM dezipramin az elıperfúzió kezdetétıl a kísérlet végéig adva a perfundáló oldathoz. N=6-7/csoport.
A görbe alatti területek tekintetében nem volt kimutatható szignifikáns eltérés a csoportok közt sem az elsı (FRS1: F(2,17)=0,56; egyutas ANOVA p=0,58), sem pedig a második (FRS2: F(2,17)=0,08; egyutas ANOVA p=0,92) ingerléskor (31. ábra).
67
FRS2
FRS1 5
görbe alatti terület
görbe alatti terület
5 4 3 2 1
4 3 2 1 0
0 Kontroll
DMI 30'
Kontroll
DMI
DMI 30'
DMI
31. ábra. [3H]5-HT-felszabadulás elektromos ingerlés hatására hippocampus szeletbıl a mőtétek utáni 14. napon. FRS1 az. 1., FRS2 a 2. ingerlés alatt felszabadult radioaktivitást jelöli. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. DMI 30’: 1 µM dezipramin az izotópfelvétel ideje alatt, DMI: 1 µM dezipramin az elıperfúzió kezdetétıl a kísérlet végéig adva a perfundáló oldathoz. N=6-7/csoport.
6.5.2.2. Az irtások hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra A [3H]5-HT frakciónkénti kiáramlása az intakt, illetve a különbözı mőtéti beavatkozásokon átesett patkányok hippocampalis szeleteibıl a léziók után 14 nappal, a 32. ábrán van megjelenítve. Az intakt és az álmőtött szeletek görbéinek lefutása hasonló volt az elızı kísérletben a kontroll és a dezipraminnal kezelt intakt szeletekéhez, mindkét ingerlés hatására jelentıs felszabadulási csúcsok keletkeztek. A noradrenerg-irtott szeletekbıl ettıl eltérıen csak kis mennyiségő volt a radioaktív kiáramlás mindkét stimulációkor, és a görbe alapvonala is feljebb került. A szerotonergilletve dupla irtott szeletekbıl az elektromos ingerlések nem váltottak ki fokozott radioaktív transzmitter-kiáramlást egyik idıpontban sem, a nyugalmi [3H]5-HTfelszabadulás viszont mindkét esetben magasabb volt, mint a többi csoportban.
68
12
Int
NA-X
Álm
5-HT-X
XX
Fr. felszabadulás (%)
10
8
6
4
2
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
frakciók 32. ábra. [3H]5-HT-felszabadulás hippocampus szeletbıl a mőtétek utáni 14. napon: frakcionális felszabadulási görbék. Az elektromos ingerlések a 4. és 15. frakciónál történtek. Fr. felszabadulás % = kiáramló radioaktivitás a felszabadulás idıpontjában a szöveti radioaktivitás %-ában kifejezve. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport N=6-13/csoport.
Az elsı ingerlés hatására felszabaduló radioaktivitásokban szignifikáns különbséget találtunk (FRS1: F(4,33)=9,10; egyutas ANOVA p<0,001). A szerotonergés a dupla-irtott szeletekbıl jelentısen kevesebb tríciált 5-HT szabadult fel mint a NAX- (post hoc p< 0,05 az 5-HT-X; p<0,01 az XX csoporthoz viszonyítva), és az álmőtött (post hoc p<0,001 mindkét esetben) állatok szöveteibıl. A noradrenerg lézió is csökkentette a mérhetı radioaktivitást az álmőtéthez viszonyítva, az eltérés a szignifikancia határon volt (post hoc p=0,054). A második ingerléskor nagyon hasonló eredményeket kaptunk (FRS2: F(4,33)=12,21; egyutas ANOVA p<0,001), azzal a különbséggel, hogy a szerotonergirtott szövetbıl történı felszabadulás a nyugalmi értékek alá csökkent, valamint a noradrenerg-lézió és az álmőtés között is szignifikáns lett a különbség (post hoc p<0,05). Az intakt és az álmőtött, valamint a szerotonerg- és a dupla-irtott csoportok közt páronként egyik paraméterben sem volt eltérés (post hoc p=0,85 az FRS1; p=0,87 az FRS2 esetében az intakt és az álmőtött; p=0,99 az FRS1; p=0,52 az FRS2 esetében a 5-HT-X és XX csoportoknál) (33. ábra).
69
FRS1
FRS2 5
*** 4
görbe alatti terület
görbe alatti terület
5
*** **
3
*
2 1 0 Int
Álm
NA-X
5-HT-X
*
3
** **
2 1 0 -1
XX
*** ***
4
Int
Álm
NA-X
5-HT-X
XX
33. ábra. [3H]5-HT-felszabadulás elektromos ingerlés hatására hippocampus szeletbıl a mőtétek utáni 14. napon. FRS1 az 1., FRS2 a 2. ingerlés alatt felszabadult radioaktivitást jelöli. Az adatok átlag ± standard hiba formában szerepelnek. Int: intakt, Álm: álmőtött, NA-X: noradrenerg irtott, 5-HT-X: szerotonerg-irtott; XX: dupla- (noradrenerg + szerotonerg) irtott csoport A csillagok a csoportok közti post hoc szignifikáns eltérést jelölik (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001). N=6-13/csoport.
Az
irtások
hatásának
idıfüggését
a
szerotonerg-felszabadulásra
is
megvizsgáltuk. Álmőtött és noradrenerg-irtott szeletekbıl a beavatkozások után 7 nappal is elvégeztük a méréseket. Ennél a transzmitternél sem tértek el statisztikai szempontból az eredményeink a 14 nappal a mőtétek után mért értékektıl sem az FRS1, sem az FRS2 paraméter esetében, valamint a frakcionális felszabadulási görbék lefutása is hasonló volt (eredményeket nem mutatjuk be külön).
70
7. MEGBESZÉLÉS
7.1. Az irtási metodika kidolgozása
Elıkísérleteink során sikerült megfelelı mőtéti eljárást kidolgoznunk patkányokban a noradrenerg- és szerotonerg rendszer léziójára neurotoxinok i.c.v. alkalmazásával, és a két rendszer szimultán irtása is sikeresnek bizonyult ellenırzéseink szerint. A szakirodalomban a noradrenerg rendszer irtására széles körben elterjed módszer a DSP-4 adása i.p. 50 mg/kg dózisban, mivel a toxin átjut a vér-agy gáton (lásd Irodalmi áttekintés). Ugyanakkor számos közleményben használják lokálisan agyi szövetbe (amygdala) illetve a lateralis ventriculumba fecskendezve is (Kumar és mtsai 1994, Liang 1998). A szerotonerg neuronok léziójára általánosan használt 5,7-DHT viszont csak intracerebralisan adva hatékony, leggyakrabban agykamrába adagolják (Fuller 1978), mivel ez a beviteli mód nagyobb mértékő általános léziót biztosít mint a magokba való adagolás (King és mtsai 2009). Mivel munkánk során fontos szempont volt hogy a NA- és 5-HT-depléción átesett állatok kísérleti körülményei - beleértve a fizikális beavatkozásokat is - megegyezzenek, így mindkét toxint i.c.v. adagoltuk. Ezen felül az is a DSP-4 i.c.v. adminisztrációja mellett szólt, hogy az 5,7-DHT-vel megegyezıen, ez esetben is a toxin centrális hatásait szerettük volna vizsgálni, így intracerebralis alkalmazása célravezetıbb volt. Agykamrába történı adagolásnál a beadott dózis 100-400 µg között mozgott a közleményekben (Chan és mtsai 1991, Kumar és Karanth 1994). A legmagasabb dózis is csak 80% körüli NA-szint csökkenést okozott a hippocampusban. Igaz, ez a dózis szignifikánsan csökkentette a hippocampalis 5-HT-szintet is, de mivel a szerzık nem használtak SSRI-elıkezelést az indolamin terminálisok védelmére, mi pedig terveztük azt, a 400 µg alkalmazása mellett döntöttünk. Elıkísérleteinkben ennél kisebb dózis alkalmazásakor ugyanis nem értük el a kívánt, 50 mg/kg DSP-4 i.p. beadásával azonos mértékő NA-depléciót. Az 5,7-DHT esetében, i.c.v. alkalmazásakor szélesebb volt az irodalomban leírt dózistartomány: 80–1100 µg (Winstanley és mtsai 2004, Romano és mtsai 2006). A legtöbb közleményben 250-300 µg-ot alkalmaztak, amely 80-90 %-os elıagyi és agytörzsi 5-HT-depléciót okozott. A szöveti 5-HT-tartalom a striatumban csak minimum 300 µg alkalmazásakor csökkent szignifikánsan (Hall és mtsai 1999). Mi a 300 µg-os dózist használtuk kísérleteinkben a minél nagyobb roncsolás elérése érdekében. A katekolaminerg rendszer védelmére az irodalomban leírt DMI elıkezelést 71
alkalmaztuk (Stanton és Sarvey 1985, Plaznik és mtsai 1997, Hall és mtsai 1999, Huang és Herbert 2005). Mindkét neurotoxin beadási helyének a jobb lateralis agykamrát választottuk (sztereotaxikus koordináták: antero-posterior:-0,9 mm, medio-lateralis: -1,4 mm, dorsoventralis: -3,4 mm a bregmától számítva). Ezen koordináták használata helyesnek bizonyult, amint azt Evans-kék indikátor beadásával igazoltuk. A
toxinokkal
a
kiválasztott
dózisokban
elértük
a
kívánt
mértékő
transzmittercsökkenéseket. HPLC-analízissel kimutattuk, hogy a szimpla-irtott állatok hippocampus-szeleteiben a 400 µg DSP-4 70% körüli NA-, míg a 300 µg 5,7-DHT 90%-on túli 5-HT- és 5-HIAA-tartalom csökkenést ereményezett az álmőtéshez képest. A két toxin általunk elıször alkalmazott, i.c.v. történı együttes adásakor hasonló változások következtek be a transzmitterek koncentrációjában: a dupla-irtott állatok szintjei nem különböztek szignifikánsan a szimpla-irtottakétól. Bár a két idegméreg szelektívként van jellemezve a szakirodalomban, az irodalmi áttekintésben már említett, széles körben tapasztalt nem specifikus hatásuk, hogy más monoaminok szintjét is csökkentik. A más transzmitterek termináljainak védelmében rutinszerően alkalmazott transzportergátló vegyületekkel (dezipraminnal és fluoxetinnel) történı elıkezelés elısegítette, hogy a nemkívánatos csökkenések jelentısen kisebbek voltak a lézionált transzmitterek szintjének változásánál. Így a DSP-4 alkalmazásával szerotonerg-, míg az 5,7-DHT adminisztrációjával noradrenerg túlsúlyt tudtunk létrehozni a lézionált állatokban. A mőtéti beavatkozásnak önmagában nem volt hatása a transzmitterszintekre, illetve a szerotonin-metabolit 5-HIAA koncentrációjára (tehát az 5-HTmetabolizmusra) sem (Sziray és mtsai 2007, 2010).
7.2. A szorongásra gyakorolt hatás
Az irodalmi áttekintésbıl kitőnik, hogy a NA-erg és 5-HT-erg pályák beidegzik a szorongásközpontokat, melyeken keresztül komplex hatásokat gyakorolnak az averzív ingerek következtében létrejövı anxietásra. Ezek a kontrolláló mechanizmusok még nem teljesen tisztázottak, de az valószínő, hogy a két rendszer direkt hatások helyett inkább moduláló szerepet tölt be a szorongás szabályozásában (Millan 2003, Romano és mtsai 2006, Sziray és mtsai 2007; 2010). A neuropeptidek (kortikotropin-releasing faktor, kolecisztokinin, neuropeptid Y, neurotenzin) szerepe fontosnak tőnik, mivel 72
számos tanulmány kimutatta a NA- és 5-HT-léziók befolyását e neuromodulátorokra, bár az eredmények a hatásirányokat illetıen – csakúgy mint a szorongástesztekben – ellentmondóak (Harro és mtsai 1992, Griebel és mtsai 2000, Huang és Herbert 2005, Lieben és mtsai 2006). Az eltérı eredmények okai az irtásos technikák, illetve az alkalmazott
paradigmák
különbözıségébıl,
valamint
a két
rendszer sokrétő
befolyásából adódhatnak (pl. az 5-HT rendszer már említett feltételezett kettıs szerepe az anxietásban).
7.2.1. Emelt keresztpalló teszt
Az emelt keresztpalló teszten, mely egy, a rágcsálók ösztönös félelmén alapuló explorációs konfliktusmodell, mind a noradrenerg, mind pedig a szerotonerg lézió erıteljes szorongáscsökkentı hatással bírt mindkét, anxietásra jellemzı paraméter (nyitott karban töltött idı, és oda történı belépések) tekintetében. Ezen eredményeink összhangban állnak a mások által kapottakkal: 25 mg/kg DSP-4 i.p. a csoportban nevelt patkányokon növelte a nyitott karban való aktivitást, tehát szorongáscsökkentınek bizonyult (Lapiz és mtsai 2001). Az 5,7-DHT hatásai a beadás helyétıl függıen változtak, de i.c.v. adva anxiolitkus hatással bírt az emelt keresztpalló teszten (Briley és mtsai 1990, Graeff és mtsai 1997, Miyakawa és mtsai 2003). Érdekes eredményként a két monoamin-rendszer együttes irtásakor további szorongáscsökkenést tapasztaltunk: a dupla-irtott állatok szignifikánsan hosszabb ideig tartózkodtak a nyitott karban szimplairtott társaikhoz képest. A zárt karba történı belépések számában a csoportok egyike sem tért el az álmőtött csoporttól. Ez a paraméter jó mérıszáma a keresztpallón történı lokomotoros aktivitásnak (File 2001, Rodgers 1997), tehát ez az ereményünk azt bizonyítja, hogy a nyílt kari belépések különbsége nem az állatok általános mozgásaktivitásában
bekövetkezett
változások
eredménye,
hanem
tényleges
anxiolitikus hatás következménye. A mőtéti beavatkozásnak önmagában nem volt hatása az anxiolitikus paraméterekre (Sziray és mtsai 2010).
73
7.2.2. Fény-sötét teszt
A fény-sötét teszten a csoportok anxiolitikus hatásmintázata eltért az emelt keresztpallón kapott eredményektıl, hiszen itt csak a szerotonerg lézió járt szignifikáns szorongáscsökkentı hatással. Ez nem várt jelenség volt. A szakirodalomban ugyanis széles körben elterjedt az a vélemény, hogy a fény-sötét paradigma az emelt keresztpallóval megegyezı etológiai háttérrel rendelkezik (Gyertyán 1992, Rodgers 1997, Millan 2003, McCool és Chappell 2007, Ramos 2008). Mint spontán explorációs válaszon alapuló modellek, a kontrollálhatatlan stresszhez kötıdı anxietást (depresszív anxietás) jelenítik meg, hiszen a tesztek közben az állatok képtelenek kilépni a számukra averzív szituációból-környezetbıl (Bourin és Hascoët 2003). Feltételezések szerint a keresztpalló nyitott karjai a fény-sötét készülék világos térrészének felelnek meg a gyakorlatban (Bourin 1997). A két teszt farmakológiai szempontból is sok hasonlóságot mutat, a benzodiazepin-típusú szorongásoldó vegyületek (diazepam, klórdiazepoxid) például hatékonyak rajtuk (Chaouloff és mtsai 1997, Carobrez és Bertoglio 2005, McCool és Chappell 2007). Ezek fényében azt vártuk, hogy az irtások anxiolitikus hatásai e tesztben megegyeznek, vagy legalábbis hasonló tendenciát mutatnak az emelt keresztpallón kapottakhoz. Várakozásunkkal szemben csak a szerotonerg rendszer-irtott állatok viselkedése jelzett szignifikáns anxiolitikus hatást az álmőtött kontrollokhoz képest a világos térfélhez köthetı két, az anxietást legjobban jellemzı paraméteren (világos térfélen mozgással töltött idı, vízszintes aktivitás a világos térfélen). A mőtéti beavatkozás önmagában e teszten sem befolyásolta e változókat (Sziray és mtsai 2010). Megjegyezzük, hogy a teszt esetében a szakirodalomban az anxietást jellemzı változók tekintetében többféle elgondolás létezik. A paradigma megalkotói normál lokomóció mellett a két térfél közti átlépések számának növekedését tekintették anxiolitikus hatásnak (Crawley és Goodwin 1980) Ez számos egértörzsön nem volt megfigyelhetı (a tesztet egerekre fejlesztették ki elıször), illetve inkább a pszichostimuláns és a szedatív hatásokkal korrelált (Hascoët és Bourin 1998). Costall már a világos térfélen megnövekvı lokomotoros aktivitást (a sötét térfélen való következményes csökkenéssel együtt) definiálta szorongáscsökkenésként (Costall és mtsai 1989). İ használta a világos térfélbıl a sötétbe történı belépési latenciát is, mint a szorongás jellemzı változóját, de ennek haszna jelenleg vitatott. Hascoët és Bourin (1998) az explorációs magatartás/mozgások mellett a két térfélen töltött idıt (a teljes kísérleti idı %-ában 74
megadva) találta a legjobb jellemzınek. Sánchez patkányokon végzett kísérleteiben anxietásra vonatkozó változókként detektálta az állatok horizontális (vonal-átlépések) és vertikális (ágaskodó) aktivitását, a sötét térfélre való belépések számát, illetıleg a világos térfélen töltött idıket, e paramétereket a kontroll értékek %-ában adva meg (Sánchez 1996). A szakirodalomban használt változók közös jellemzıje, hogy az állatok explorációját mérik. Az állatok explorációs aktivitásának növekedése korrelál a szorongásuk csökkenésével. Az általunk használt berendezésben és teszt-elrendezésben a világos térfélen mozgással eltöltött idı bizonyult a legstabilabb változónak a szorongás jellemzésére (Bilkei-Gorzó és mtsai 1998), ezért ezt, és a szintén a világos térfélen történı explorációt jellemzı másik paramétert, a horizontális aktivitást vettük figyelembe az irtások szorongásra gyakorolt hatásának vizsgálatakor. A sötét térfélen is mértük e két paramétert, így információt kaptunk az állatok általános aktivitásáról a szerkezet kevésbé averzív részén. Méréseink szerint egyik paraméterben sem volt eltérés a csoportok közt, ami arra utal, hogy a világos térfélen megnyilvánuló különbség tényleges anxiolízis következménye, nem pedig egy esetleges általános aktivitásfokozó hatásé. A két paraméter (mozgással töltött idı és vízszintes aktivitás) mindkét térfélen párhuzamosan alakult mindegyik csoportnál. Ez azt mutatja, hogy a csoportok hasonló sebességgel
exploráltak,
ami
szintén
azt
bizonyítja,
hogy
általános
mozgásaktivitásukban nem volt különbség. A teszten a napi rutin munkánk során vizsgált anxiolitikus referensek (pl. diazepam) hasonló eredményeket adnak a sötét térfél paramétereit illetıen. Itt utalunk rá, hogy a sötét térfélen történı aktivitás nem azonosítható az állatok konfliktushelyzeten kívül mért spontán lokomóciójával (Bourin és Hascoët 2003), így az általános aktivitásra vonatkozó következtetéseinket az aktiméterben kapott eredényeinket is figyelembe véve vontuk le. Az irtásoknak az azonos hátterőnek tekintett keresztpallón és fény-sötét berendezésben általunk tapasztalt eltérı hatásaihoz hasonló diszkrepanciát mások is leírtak. Elıagy-specifikus kalcineurin knockout egerek a fény-sötét készülék világos térfelén kevesebb, míg az emelt keresztpalló nyitott karjában több idıt töltenek a vad típusokhoz viszonyítva (Miyakawa és mtsai 2003). Egerek esetében számos törzs is eltérı viselkedést mutat e két teszten (Griebel és mtsai 2000, Mathiasen és mtsai 2008), ami arra enged következtetni, hogy a paradigmák eltérı magatartásokat jelenítenek meg. Takao és Miyakawa egyenesen azt feltételezi, hogy különbözı típusú, nevezetesen a nyílt, illetve a világos terektıl való szorongást mérnek (Takao és Miyakawa 2006). 75
Patkányokkal végzett kísérletekben McCool és Chappell, jóllehet szignifikáns kovariációt találtak a világos térfélen, illetve a nyitott karokban töltött idık között a kontroll állatoknál, azt is leírják, hogy ezek az állatok a tesztidı közel 50 %-át töltötték a fény-sötét készülék, míg csak körülbelül 20 %-át az emelt keresztpalló számukra averzív területén. Ebbıl arra következtetnek, hogy számos hasonlóságuk ellenére a két paradigma egyedi magatartásokat jelenít meg a szorongást illetıen (McCool és Chappell 2007). Ramos és mtsai hasonló diszkrepanciát észleltek: méréseik szerint a nyitott kari idı és a világos térféli mozgás csak kevesebb mint 15 %-ban korrelált egymással (Ramos és mtsai 2008). Preklinikai molekula-szkrínelési munkánk során magunk is számtalanszor tapasztaltuk, hogy olyan vegyületek, melyek jelentıs szorongáscsökkentı hatással bírnak a fény-sötét tesztben, az emelt keresztpallón nem hatékonyak, és fordítva. Ezen eltérések miatt az alap-és az alkalmazott kutatásban is többféle teszten vizsgálják párhuzamosan a hatékonyságot (Ramos 2008, Ramos és mtsai 2008). Általánosságban elmondható, hogy a szorongástesztek között fennálló farmakológiai és etológiai átfedések ellenére nincs nagymértékő korreláció az általuk modellezett, szorongáshoz köthetı viselkedésformák közt. Ez pedig annak a jeleként fogható fel, hogy a szorongás sokdimenziós entitás, melynek 1-1 összetevıjét jelenítik meg az eltérı pszichobiológiai jelentéssel bíró paradigmák (Ramos 2008).
7.2.3. Stressz-indukálta szociális elkerülés vizsgálata
Az elızı két teszttıl eltérı etológiai hátterő, stresszel kiváltott, kondicionált szubkrónikus szorongást modellezı szociális elkerülés-paradigmában az irtások hatása az anxietásra az eddigiektıl részben eltérıen alakult. Eredményeink azt mutatták, hogy a nordarenerg deficit szorongáscsökkentı, míg a szerotonin-hiány anxiogén hatással bír, mivel a DSP-4-et kapott állatoknál nem alakult ki a sokk-indukálta elkerülı magatartás, ellenben az 5,7-DHT-kezelés következményeként ez a viselkedésbeli deficit felerısödött. Ezekbıl arra következtetünk, hogy a NA-erg neurotranszmisszió elısegíti a szociális elkerülés kialakulását. Ezzel ellentétesen hat a szerotonerg jelátvitel, ami gátolja azt, hiszen hiányában kifejezettebben jelentkezik ez a fenomenon. Az elvégzett korrelációs analízis szerint a NA/5-HT hányados és a szociális elkerülı magatartás intenzitása egyenes arányban állnak egymással. Ezen eredményeink összhangban állnak más laboratóriumok által leírtakkal. Inoue és mtsai kimutatták, hogy a szerotonerg neurotranszmisszió fokozása 76
csökkentette a traumatikus élmények hatására bekövetkezı viselkedési válasz kialakulását (Inoue és mtsai 1996). Más szerzık pedig azt tapasztalták, hogy a noradrenerg lézió következtében az állatok kevésbé reagáltak averzív ingerekre megdermedéssel (freezing) (Mason és Fibiger 1979, Neophytou és mtsai 2001). Eredményeink
farmakológiai
szempontból
is
alátámaszthatók.
A
humán
gyógyszerterápiában a poszt-traumás stresszbetegség (PTSD) tüneteinek enyhítésére sikerrel alkalmazzák a noradrenerg jelátvitelt csökkentı α2 adrenerg receptor agonista klonidint, valamint posztszinaptikus α1 és β-receptor blokkolókat (prazozin és propranolol); illetve a szelektív szerotonin-visszavétel gátlókat (SSRI-ket), melyek a szerotonerg transzmissziót fokozzák (fıleg a szertralint, paroxetint, és fluoxetint: Asnis és mtsai 2004, Martényi 2005, Strawn és Geracioti 2008, Taylor és mtsai 2008). Itt kell megjegyeznünk, hogy a szerotonin általános védı szerepe ellenére, a különbözı 5-HTreceptorok eltérı hatással bírnak a stresszfolyamatok következményeire, így a fıként 5HT2 antagonista, de emellett parciális 5-HT1A agonista profillal rendelkezı nefazodon antidepresszáns is használatos farmakon a PTSD adjuváns terápiájában (Adamec és mtsai 2004, Martényi 2005). A dupla irtott állatok magatartása nem tért el a sokkolt álmőtöttekétıl, ami azt mutatja, hogy a stresszre adott válaszmagatartás ki tud alakulni akkor is, ha mindkét jelátvivı rendszer súlyosan sérül. Vagyis a szociális elkerülı viselkedés kifejlıdésében nem az abszolút transzmitter-szintek a döntıek, hanem a két rendszer egymáshoz viszonyított aránya. Ez arra enged következtetni, hogy a noradrenerg és szerotonerg pályák inkább finoman modulálják, semmint indukálják a stresszhatásra bekövetkezı szociális elkerülés kifejezıdését. A mőtéti beavatkozásnak önmagában itt sem volt befolyása a stressz-indukálta szociális elkerülı magatartásra. A NA- és 5-HT-rostok már említett, spinalis nocicepcióra gyakorolt hatásai miatt, ki kellett zárnunk a léziók következtében megváltozott fájdalomérzet miatti abnormális talpsokk-érzékelés lehetıségét. Mivel elıkísérleteinkben a sokkolás alatti viselkedésmintázat egyezı volt a csoportoknál, így megállapítottuk, hogy az irtások nem befolyásolták sem a fájdalomérzetet, sem a talpsokk emocionális hatásait (megélését). A sokkolás stresszkeltı ingerként tehát használható volt a lézionált állatok esetében
is.
Ezen
tapasztalataink
összhangban
állnak
más
laboratóriumok
eredményeivel, melyekben az 5,7-DHT, i.c.v. és a felszálló raphe-rostokba adva, a lézionált patkányok hot plate fájdalomteszten, és morfin-indukálta analgéziában nem
77
mutattak az intakt állatoktól eltérı fájdalomérzést, valamint elektromos talpsokkra is egyformán reagált a két csoport (Fuxe és mtsai 1978, Plaznik és mtsai 1997). A szociális interakció-tesztben sem mutatkozott eltérés az irtások hatására az állatok általános szociális viselkedésmintázatában. Ez bizonyíték arra, hogy a stresszindukálta szociális elkerülés teszten kapott eredmények ténylegesen a léziók szociális elkerülı magatartásra kifejtett hatásainak tudhatók be, nem pedig a megváltozott szociális viselkedés következményei. Irodalmi kutatásaink azt valószínősítették, hogy a sokk, mint stresszor, szociális elkerülést okozó anxiogén hatását a glutamáterg rendszer indukálja, NMDA-függı mechanizmusokon keresztül (Adamec és mtsai 1999, Padovan és mtsai 2000). Kísérleteinkben az NMDA-receptor antagonista MK-801-et 0,1 mg/kg-os i.p. dózisban, sokkolás elıtt, illetve után adva sem tapasztaltunk elkerülı viselkedést az állatok részérıl, tehát a blokád nemcsak a viselkedésbeli deficit inicializálását, hanem a fenntartását, megjelenését is megakadályozta intakt állatokban. Ezen eredményeink szerint
helyes
volt
elgondolásunk,
mely
szerint
az
elkerülı
viselkedésben
megnyilvánuló stresszválasz glutamáterg hatásra alakul ki. A glutamáterg befolyást az 5-HT-rendszer gátolja, az NA-rendszer pedig serkenti, de mindkettı csak moduláló szerepet tölt be a folyamatban (Sziray és mtsai 2007).
A léziók hatásai az anxietásra az általunk alkalmazott három paradigmában nem egységesen alakultak. A noradrenerg irtás az emelt keresztpallón és a stressz-indukálta szociális elkerülés teszten anxiolitikus hatásúnak bizonyult, míg a fény-sötét teszten nem befolyásolta a szorongással összefüggı viselkedési változókat. A szerotonerg deficit csökkentette az állatok szorongását az emelt keresztpallón és a fény-sötét teszten, a sokkhatás miatti elkerülı magatartást viszont erısítette. A két rendszer együttes irtása az emelt keresztpalló teszten a szimpla lézióknál szignifikánsan erısebb anxiolitikus hatást eredményezett; a fény-sötét-, valamint a stressz-indukálta szociális elkerülés paradigmákban viszont a dupla irtott állatok szorongásos paraméterei nem különböztek az álmőtött csoporttól. Ezek az eltérések valószínőleg annak tudhatóak be, hogy a három teszt a szorongás különbözı válfajait modellezi. Az emelt keresztpallón a nyílt terektıl való, a fény-sötét dobozban a megvilágított terektıl való, míg a stresszindukálta szociális elkerülésnél a kondicionált anxietásra vonatkozó lézió-hatásokat mértük, és a két rendszer szerepe különbözı ezekben a szorongástípusokban. 78
7.3. A kognitív funkciókra gyakorolt hatás
Mint már említettük, a tanulási- és memóriafolyamatokban fontos szerepet játszó kolinerg és glutamáterg transzmisszióra a felszálló NA-erg és 5-HT-erg pályák összetett hatásokat gyakorolnak (Ögren 1985, Decker és McGaugh 1989, Moran és mtsai 1992, Ogasawara és mtsai 1996). Az irtásos technikák beszámolnak tanulás/memória rontásról, serkentésrıl, és hatástalanságról is, a különbözı, kogníciót vizsgáló in vivo és in vitro tesztekben (Volpe és mtsai 1992, King és mtsai 2009). Az eredmények különbözıségének oka – csakúgy mint az anxietás esetében – a két rendszer kognícióra gyakorolt komplex, receptoriális és indirekt hatásokon keresztül megnyilvánuló befolyásában keresendı (King és mtsai 2009).
7.3.1. Passzív elkerülés teszt
A centrális NA-erg funkciók megváltozása befolyással bír az akvizíciós és retenciós folyamatoktra az averzív tanulásnál (aktív és passzív elkerülés), de az eredmények erısen függenek az alkalmazott paradigmától (aktív/passzív, egyutas/több utas, együléses/több üléses kísérleti elrendezés). Fontos megemlíteni, hogy a KIR NA-szintje kritikus szerepet játszik az averzív kondicionáló ingerként alkalmazott, elkerülhetetlen elektromos sokk hatásainak kialakulásában (Ögren 1985, Kumar és Karanth 1994). 10 és 30 µg DSP-4 amygdalába adva, károsította a retenciót egy üléses passzív elkerülés paradigmában, 14 nappal a lézió után (Liang 1998). A toxin szisztémás adagolása (50 mg/kg i.p.) 7 nappal a kísérletet megelızıen, egyutas aktív elkerülés tesztben sem az akvizícióra, sem a retencióra nem volt hatással sem patkányokban (Ögren 1985), sem egerekben (Decker és McGaugh 1989). Ugyanakkor a több ülésbıl álló, lelépéses (stepdown) típusú passzív elkerülési választ rontotta, ha 1 óránál több idı telt el az akvizíció és a retenció közt (Ogasawara és mtsai 1996). Archer és mukatársai (1985) kísérleteiben a DSP-4 1, illetve 2 héttel a tesztek elıtt adagolva rontotta a kétutas aktív elkerülés választ, ellenben a passzív elkerülésre nem volt hatással. A centrális NA-erg és kolinerg rendszer kapcsolatára utal, hogy a muszkarin-receptor antagonista szkopolamin memóriarontó hatását a DSP-4 tovább rontotta 8 karú útvesztıben, patkányokban (Ogasawara és mtsai 1996). Ugyanakkor passzív elkerülés tesztben nem interferált a szkopolamin kogníciórontó hatásával egerekben (Decker és McGaugh 1989).
79
A szerotonerg irtások tekintetében 15 µg 5,7-DHT amygdalába történı, illetve 150 µg 5,7-DHT i.c.v. adagolása nem volt hatással a retencióra több üléses, átlépéses típusú passzív elkerülés paradigmában (Liang 1998, Hritcu és mtsai 2007). Az 5-HT depléciója para-klóramfetaminnal, egy utas aktív elkerülés paradigmában mind az akvizíciót, mind a retenciót gátolta, és ezek a hatások nem voltak ellensúlyozhatók DSP-4 szisztémás adagolásával (50 mg/kg i.p., 7 nappal a kísérlet elıtt). Az 5-HT és NA rendszer korábban feltételezett ellentétes szerepe az 5-HT-indukálta elkerüléses válasz deficitjében tehát nem igazolódott be. Más eredményekbıl pedig arra lehet következtetni, hogy az 5-HT és az ACh szeparált, de nem feltétlenül független folyamatokon keresztül szabályozzák az averzív tanulást (Ögren 1985). A passzív elkerülés tesztben a nem sokkolt állatoknál nem várt jelenséget tapasztaltunk: a szerotonerg- és a dupla-irtott csoportoknál szignifikánsan nıtt a második napi belépési latencia az elsı naphoz képest. Az állatok nem kaptak számukra averzív ingert talpsokk formájában a sötét térfélen, tehát egyik csoportnál sem vártunk különbséget a két nap belépési latenciája közt. Mivel nem történt kondicionálás, ezért a jelenséget nem kognícióbeli, hanem affektív eltérésként értelmeztük. Feltételezéseink szerint a szerotonerg- és a dupla-irtott patkányok társaiknál kisebb mértékben szorongtak a megvilágított térféltıl. Az elsı napon valószínőleg az ismeretlen sötét térfél explorációjára késztetı ösztönös hajtóerı még elég erısnek bizonyult bennük ahhoz, hogy a többi csoporthoz hasonló latenciaidıvel átlépjenek oda, azonban a második napon a világos térrész kevésbé volt averzív számukra, így társaiknál szignifikánsan több idı múlva hagyták csak el azt. Ezt az elgondolásunkat alátámasztják a fény-sötét teszt világos térfelén kapott eredményeink, ahol a szerotonerg-itrott állatok anxiolitikus paraméterei szignifikánsan magasabbak voltak az intakt, álmőtött és noradrenerg-irtott csoportokéinál, viszont a dupla-irtott állatokéitól nem tértek el. A sokkolt csoportoknál, ahol már értelmezhetı a kondicionálásos tanulás, csak az 5,7DHT-vel kezelt állatoknál nem nıtt a második napi latencia az elsı napihoz képest, azaz ennél a csoportnál nem alakult ki a passzív elkerülı válasz kondicionálás hatására. Az álmőtött állatok szignifikánsan hosszabb idı múlva léptek át a sötét térfélre a második nap, így elmondhatjuk, hogy a mőtéti beavatkozás önmagában nem zavarta meg a kondicionálás folyamatát. A talpsokkot nem kapott kontroll és a sokkolt csoportok retenciós értékeit is összevetettük, és ebben az esetben a szerotonerg-irtás mellett a dupla-irtás is antagonizálta a passzív elkerülı válaszmagatartás kialakulását, azaz az állatok kogníciós folyamatait negatív irányban befolyásolta mindkét lézió-típus. Mivel 80
ez utóbbi összehasonlításunkkal figyelembe vettük a nem sokkolt állatok két csoportjánál a viselkedésben jelentkezı anxiolitikus összetevıt is, ezt a statisztikai számítást tekintettük mérvadónak a kognícióra gyakorolt hatások értékelésében. A szimpla és dupla irtásokkal elért eredményeink összhangban állnak a DSP-4 és a paraklóramfetamin szisztémás adagolása után kapott korábbi eredményekkel egyutas passzív elkerülı tesztben (Archer és mtsai 1985, Ögren 1985, Decker és McGaugh 1989).
7.3.2. Csoportos akciós potenciál-Hosszútávú potencírozás (PS-LTP) teszt
A hippocampalis NMDA-függı (CA1 Schaeffer kollaterálisok, és DG) és nem NMDAfüggı
(CA3
moharostok)
LTP-tesztet
a
szinaptikus
plaszticitás
egyik
megnyilvánulásaként a memória-formálódás sejtszintő elektrofiziológiai modelljének tekintik (Ohashi és mtsai 2003). Az NA és 5-HT LTP-re gyakorolt hatásait illetıen, az alkalmazott ingerlés helyétıl és tulajdonságaitól (frekvencia, idıtartam) függıen, számos különbözı eredményt írtak le. A kívülrıl bevitt, vagy endogén NA LTP-t indukált a β-receptorokon keresztül a DG-ben (Stanton és Sarvey 1985, Harley 1991), és a moharostokban (Hopkins és Johnston 1988). A CA1 régióban ellenben csak elenyészı hatása volt az LTP keletkezésére (Katsuki és mtsai 1997), illetve gátolta azt (Mody és mtsai 1983). 6OHDA segítségével NA-depletált hippocampus szeletek CA1 régiójában nem lehetett LTP-t kiváltani (Yang és mtsai 2002), más tanulmány viszont arról számol be, hogy a toxin általi depléció, 14-21 nappal irtás után, nem volt hatással a CA1 régió LTP-vel kapcsolatos funkcióira, csak a DG-ben csökkentette azt (Stanton és Sarvey 1985). A sokféle eredmény miatt valószínőnek látszik, hogy az NA inkább moduláló szerepet tölt be a hippocampalis szinaptikus plaszticitásban (Katsuki és mtsai 1997). Az 5-HT serkentette a hippocampalis NMDA-függı LTP-t a CA1 régióban patkányban, amely hatást az 5-HT3-antagonista ondanszetron blokkolt. Ugyanakkor tengerimalac hippocampus szelet CA3 régiójának moharostjaiban az ondanszetron és graniszetron szignifikánsan növelte a nem NMDA-függı LTP nagyságát, utóbbi hatását az M1 receptor antagonista atropin gátolta (Maeda és mtsai 1994). Szintén a CA1régióban az 5-HT gátló hatásúnak bizonyult, a gátlást az 5-HT1A receptorokon és a GABA-erg interneuronok serkentésével fejtette ki (Corradetti és mtsai 1992). A DG-ben az 5-HT az 1A receptorain keresztül csökentette az LTP amplitúdóját (Sakai és Tanaka 81
1993). 50 µg 5,7-DHT intraciszternálisan adva újszülött patkányokban nem volt hatással a DG-ben az LTP-re (Haring és Yan 1999), viszont felnıtt állatokban 200 µg toxin i.c.v. serkentette azt a CA1 régióban (Ohashi és mtsai 2003). Ugynakkor 330 µg dózisban adva i.c.v. Stanton és Sarvey eredményei szerint sem a DG-ben, sem a CA1 régióban nem befolyásolta az LTP-t 14-21 nappal irtás után (Stanton és Sarvey 1985). A mi méréseinkben a PS-LTP teszten, a CA1 Schaeffer kollaterálisokból való elvezetést alkalmazva, nem volt tapasztalható transzmisszió-csökkenés a szerotonerg- és a dupla-irtott állatok hippocampus-szeleteiben sem 14, sem pedig 30 nappal az irtások után. In vitro körülmények között tehát nem jelentkezett a két beavatkozás in vivo kimutatott kogníciórontó hatása. Ez az eredményünk összhangban áll a Stanton és Sarvey által leírtakkal (Stanton és Sarvey 1985), és arra utal, hogy lehetséges, hogy a passzív elkerülés teszten jelentkezı kognitív deficit a két lézió memórianyommegtartásra (retenció) gyakorolt negatív hatásának következménye. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a PS-LTP eljárás, mint in vitro szelet-technika, sokban különbözik az in vivo kondicionált passzív elkerülés paradigmától (számos eltérı agyterület bevonódása, a válasz flexibilis volta: Izquierdo és McGaugh 2000). A PS-LTP teszt inkább a hippocampalis térbeli kogníciós folyamatokról ad információt, de azokkal sem mindig korrelál (Leiva és mtsai 2009). Így a szeleteken kapott eredményeinkbıl a passzív elkerülı viselkedés okaira csak nagy óvatossággal következtethetünk. A DSP-4- kezelésen átesett patkányok hippocampalis szeleteiben az irtás után 14 nappal jelentkezı szinaptikus transzmisziófokozódás a noradrenerg deficit tanulást (akvizíciót) serkentı prokognitív hatására enged következtetni. A hatás idıfüggı voltára utal, hogy a toxin beadása után 30 nappal már nem volt tapasztalható szignifikáns emelkedés a szeletek neurotranszmissziójában. Ez az eredményünk egybecseng azzal, hogy Mody és mtsai (1983) a NA LTP-gátló hatását írták le a CA1-régióban ennélfogva a NA-depléció a gátló hatás kiiktatása miatt következményes serkentést okoz, amit mi is kimutattunk. A passzív elkerülés paradigmában a noradrenerg lézión átesett, sokkolt állatok második napi belépési latenciája hasonlóságot mutatott az intakt és álmőtött sokkolt kontrollok értékeihez, így ebben az in vivo tesztben a noradrenerg deficit prokognitív hatása nem volt kimutatható.
82
7.3.3. Tárgyfelismerés teszt
Egereken végzett kísérletekben, 50 mg/kg DSP-4 i.p. adagolása után 1 héttel nem különbözött a kontroll és a lézionált állatok rekogníciós indexe (Scullion és mtsai 2009). Patkányokban az 5,7-DHT adminisztrációja mindkét oldali laterális agykamrába (2x75 µg), illetve a DRN-be (3 µg), szintén nem befolyásolta a tárgyfelismerést: a lézionált állatok (a kontroll csoporthoz hasonlóan) nem explorálták szignifikánsan hosszabb ideig az ismeretlen tárgyat (Lieben és mtsai 2006, King és mtsai 2009). A spontán exploráción alapuló tárgyfelismerés teszten mi sem tudtuk kimutatni a noradrenerg lézió prokognitív hatását in vivo körülmények között. A többi irtástípus, valamint az álmőtés sem javította az állatok vizuális rekogníciós memóriáját, ugyanis, az intakt csoporthoz hasonlóan, a mőtéteken átesett patkányok sem emlékeztek a már látott tárgyakra.
A fenntebb leírtak értelmében tehát elmondhatjuk, hogy a szerotonerg lézió és a két rendszer együttes irtása az in vivo kondicionált tanulási paradigmában (passzív elkerülés teszt) negatív hatású volt, azonban ezek a hatások nem jelentek meg a vizuális memória vizsgálatakor a tárgyfelismerés teszten, illetve hippocampalis szeleteken a PS-LTP paradigmában in vitro. A noradrenerg deficit idıfüggı prokognitív hatása csak a PSLTP teszten volt mérhetı, in vivo nem erısítette a passzív elkerülı magatartást önmagában, valamint nem antagonizálta a szerotonin-hiány válaszgyengítı hatását sem. Az állatok vizuális memóriájára sem volt befolyása. Szinaptikus transzmissziót fokozó hatása szerint a noradrenerg deficittıl in vivo a térbeli kognitív folyamatok javulása várható. Ezért lehetséges, hogy a hippocampus-függı, spaciális tanulás/memóriafolyamatokat célzottan vizsgáló kognitív tesztekben (Morris-féle vízi útvesztı, nyolckarú labirintus) esetleg sikerülne kimutatni a NA-erg lézió prokognitív hatását. Ezen paradigmákban viszont viszonylag hosszú az állatok trenírozási ideje (Dawson és mtsai 2006, Olton 1987, Bardgett és mtsai 2008), ezért felvetül a sikertelenség a hatás idıfüggı volta, illetve az irtást követıen azonnal beinduló kompenzáló mechanizmusok hosszú távú befolyása miatt. A szakirodalomban pedig – jóllehet beszámolnak a PSLTP teszten és a Morris-féle vízi útvesztın kapott hatások közötti összhangról (Biessels és mtsai 1998), számos közleménybenben az eredmények diszkrepanciája jelenik meg (Del Olmo és mtsai 2006, Leiva és és mtsai 2009). Az LTP és a térbeli memória 83
hátterében álló hasonló molekuláris mechanizmusok (Lynch 2004, Pastalkova és mtsai 2006) ellenére számos különbözıség is van az in vitro történések és az in vivo memóriaformálódás hippocampalis folyamatában, amelyek miatt az egyik teszten kapott eredmények nem terjeszthetık ki más paradigmákra (Izquierdo és McGaugh 2000, Kenney és Gould 2008).
7.4. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás
A noradrenalin dopamin-transzmissziót faciltáló hatása patkányagyban régóta ismert (lásd az irodalmi áttekintésben is). Az LC noradrenerg idegsejtjei kontrollálják a dopamin felszabadulását, és az olyan dopamin-vezérelte funkciókat, mint a lokomóció, vagy a testtartás (Ponzio és mtsai 1981, Ventura és mtsai 2003). Ez magyarázza, hogy bár a DSP-4-nek nincs direkt hatása a DA-erg neuronokra (Jonsson és és mtsai 1981), DSP-4 kezelés után a striatalis DA elektromos ingerlésre történı felszabadulásának csökkenését, illetve kisebb dózisban adva fokozott corticalis DA-metabolizmust tapasztaltak a szöveti dopamintartalmak változatlansága mellett (Marien és mtsai 1994, Kask és mtsai 1997, Häidkind és mtsai 2002). A szerotonerg rendszer esetében maga a szerotonin direkt hatásként hipolokomóciót okoz (Messing 1978), hiszen az 5-HT-erg neuronok tónusos gátló hatást fejtenek ki a substantia nigra DA-erg sejtjeire (Ögren 1985). Az irtásnál használt 5,7-DHT pedig, csekély mértékben ugyan, de károsítja a nigrostriatalis DA-erg axonterminálisokat is, és bár ez a hatás nem mutatkozik meg az agyi dopamintartalom változásában a toxin magas dózisaiban sem (Fuxe és mtsai 1978, Nobin és Björklund 1978), a beinduló kompenzációs mechanizmusok hatással lehetnek a lokomócióra (Plaznik és mtsai 1997). Ezen összetett hatások miatt nem meglepı, hogy szerzık beszámolnak DSP-4 adminisztráció után úgy hiperaktivitásról (Srinivasan és Schmidt 2003), mint hipoaktivitásról (Archer és Fredriksson 2000). Ugyanez tapasztalható 5,7DHT adása után is (Hole és mtsai 1976, Breese és Mueller 1978, Messing 1978). Az eredmények azonban nagyban függenek az alkalmazott dózistól, beviteli úttól és az irtás után eltelt idıtıl. A fentebb leírtak miatt feltétlenül szükségesnek tartottuk kizárni azt, hogy a viselkedésteszteken kapott eredményeink az irtások lokomócióbeli változásokat okozó hatásainak legyenek az eredıi. A kísérleteinkben felhasznált állatok aktiméterben 84
vizsgált spontán mozgásaktivitására nem volt hatással semelyik mőtéti beavatkozás sem. Az aktiméteres mérés megbízható módszer a spontán aktivitás monitorozására, mivel mentes a viselkedéstesztekben mérhetı lokomóció affektív összetevıitıl (Bourin és Hascoët 2003). Ezek az eredményeink összhangban állnak számos közleménnyel, melyekben szintén nem írtak le változást a noradrenerg- (Srinivasan és Schmidt 2004), illetve a szerotonerg-deficites állatok spontán mozgásaktivitásában (Plaznik és mtsai 1997, Hall és mtsai 1999, Pum és mtsai 2009). Saját korábbi HPLC-méréseinkben a kontroll és lézionált állatok striatumában irodalmi adatokhoz hasonlóan (Jonsson és mtsai 1981, Kumar és Karanth 1994, Frechilla és mtsai 2000, Huang és Herbert 2005), mi sem találtunk szignifikáns különbséget a dopaminerg transzmisszióban (Sziray és mtsai 2007). Tehát elmondhatjuk hogy az álmőtésnek illetve a lézióknak nem volt sem gátló, sem serkentı mellékhatásuk a központi idegrendszerre, mely a lokomóció változásában megmutatkozhatott volna. Így az alkalmazott viselkedési paradigmákon mért
eredményeink
nem
e
befolyások
következményei,
hanem
az
állatok
anxietására/kogníciójára gyakorolt lézió-hatásoké.
7.5. A [3H]transzmitter-felszabadulásra gyakorolt hatás 7.5.1. A [3H]NA-felszabadulásra gyakorolt hatás
Az irtások NA-felszabadulásra gyakorolt hatásának vizsgálatakor nem várt eredmény volt, hogy irtás után 14 nappal a NA-lézionált hippocampalis szeletek [3H]NA-effluxa nemcsak hogy megmaradt, hanem mindkét ingerléskor (az elsınél kiugróan, erısen szignifikánsan, a másodiknál csak tendenciózusan) megnıtt az összes többi csoport értékeihez képest. Ez azért is volt meglepı, mivel - mint ahogy már leírtuk - a DSP-4 adása után, tapasztalatok szerint, az endogén NA-szint változásához hasonló nagyságrendben csökken a tríciált NA felvétele is a frontalis cortexben. Az irtás ellenére megtartott felszabadulásról számol be egy, az irodalmi áttekintésben már említett közlemény is (Kask és mtsai 1997): mikrodialízis vizsgálatában frontalis cortexben 50 mg/kg DSP-4 i.p. beadása után 7 nappal, KCl-os kémiai ingerlés hatására nem csökkent a NA-efflux, és a bazális extracelluláris NAszintek sem tértek el a kontroll szintektıl. Ugyanakkor a post mortem szöveti NAtartalom több mint 50%-al csökkent. Az α2-antagonista atipamezol (3 mg/kg i.p.) 100%85
al megnövelte a NA-kiáramlást az intakt állatokban, míg a lézionáltaknál ez a növekedés csak 30%-os volt. Az atipamezolra való csökkent válaszkészség oka lehet a preszinaptikus α2-receptor downreguláció. Ez az irodalmi áttekintésben részletezett kompenzációs mechanizmusok beindulását bizonyítja, mellyel az épen maradt neuronok,
és
környezetük
igyekeznek
fenntartani
a
bazális
extracelluláris
transzmitterkoncentrációt. Más tanulmányban a DA- és NA-erg terminálisokat roncsoló 6-OHDA-t unilateralisan a dorsalis NA-erg kötegbe adagolva szintén nem volt különbség a kontroll és lézionált állatok mikrodializátumaiban az alapállapotban és ingerlés után mért hippocampalis NA-koncentrációkban, még 50% körüli szöveti NAdepléció esetén sem. Ezek szerint a szöveti és az extracelluláris monoamin-csökkenés nem korreláltatható direkt módon egymással az adaptációs változások miatt (Abercrombie és Zigmond 1989). Az α2-downreguláció miatti autoinhibíció-csökkenés mellett a GABAB- interneuronokon lévı α1, illetve az itt szintén serkentı (!) hatású preszinaptikus α2 receptoroknak sincs NA-erg aktivációja az irtás miatt, ezért csökken a GABA-felszabadulás (Vizi és Kiss 1998). A gátló interneuronok kiiktatása (a gátlás gátlása) következtében nem csak az épen maradt NA-neuronokból, hanem más preszinapszisokból, varikozitásokból származó katekolamin-felszabadulás is megnı. Vizi eredményei szerint ugyanis NAT-KO (génkiütött) egerekben a szerotonerg varikozitások képesek akkumulálni és felszabadítani [3H]NA-t, az 5-HTT már említett heterológ tulajdonsága miatt (Vizi és mtsai 2004). A DAT is képesnek bizonyult NA transzportjára (Giros és mtsai 1994). Tehát lehetséges, hogy esetünkben a DSP-4 által roncsolt NAT szerepét átvette más monoamin transzporter (5-HTT, DAT), így az NAfelszabadulás az 5-HT-erg varikozitásokból, és a hippocampusba projektáló DA-erg preszinapszisokból is történt, bár utóbbinak- csekély száma miatt-kisebb a jelentısége (Vizi és mtsai 2004). A NAT általi visszavétel toxin miatti megszőnése is elısegíthette a NA-efflux szignifikáns növekedését az elsı ingerlés alkalmával. A gátló GABA-erg hatások csökkenése mellett, a GABA serkentı hatása - amit a NA-erg varikozitásokon elhelyezkedı GABA-heterotranszportereken keresztül a NA-erg neuronokba jutva fejt ki a NA-felszabadulásra - felerısödik. Ugyanis a heterotranszportert gátló α2- hatás a már említettek miatt csökken (Fassio és mtsai 1996, Raiteri és mtsai 2002). A szintén preszinaptikusan elhelyezkedı, serkentı GABAA receptor hatásai nem érintik az elektromos ingerrel kiváltott felszabadulást, csak a bazális effluxot (Vizi és Kiss 1998). A tapasztalt jelenségek mögött általunk még ismeretlen, a környezı hippocampalis szövetbıl származó direkt és indirekt hatások állhatnak, melyek 86
felfedése további kísérletek tárgya. Az in vivo mikrodialízis és az in vitro szelettechnika közti különbség (utóbbinál [3H]transzmitter mérése, agyi és perifériás élı környezet hiánya, más agyterületbıl való mérés, stb.) lehet az oka, hogy az idézett munkákban - tılünk eltérıen - nem tapasztaltak a kontrolltól való szignifikáns eltérést az ingerlésre történı NA-felszabadulásban. Meg kell jegyeznünk, hogy más tanulmányban DSP-4 adása után a [3H]NA-kiáramlás csökkenését tapasztalták elektromos ingerlésre, azonban a relatív kiáramlás megegyezett a kontroll szeleteken mérttel. Ez a szerzık szerint arra utal, hogy az épen maradt terminálok tökéletesen mőködtek (Jackisch és mtsai 2008). A tanulmányban leírt >90%-os hippocampalis NAdepléció és az általunk elért 70% körüli transzmitterszintcsökkenés lehet a magyarázat az ellentétes eredményeinkre. Az esetünkben megmaradt több ép neuron nagyobb transzmitter-felszabadulást tett lehetıvé. Az általunk tapasztalt nyugalmi [3H]NAkiáramlás növekedését a DSP-4-kezelt állatok szeleteiben viszont a tanulmányban is leírták. Ez valószínőleg a megnövekedett NA-forgalom következménye, illetve egyes szerzık a DSP-4 irtás után egy ideig fennálló „leakage”-hatását okolják a jelenségért (Hughes és Stanford 1998). A szerotonerg lézió nem járt szignifikáns változásokkal a NA-felszabadulásban. Az 5-HT-innerváció 5,7-DHT-adagolás miatti kiesésének hippocampalis [3H]NAeffluxra való hatástalanságáról számol be Birthelmer munkacsoportja is (Birthelmer és mtsai 2003). Az egybevágó eredmények mutathatják azt, hogy az indolamin-rendszer komplex hatásai nem annyira erısek a [3H]NA-felszabadulásra, hogy hiányukban zavar álljon be benne. Az is lehetséges, hogy a denerváció miatt annyira megnövekedik az NA-rendszer-érzékenysége az 5-HT-ra, hogy a kis hányad épen maradt, a kompenzációs mechanizmusok beindulása miatt „túlteljesítı” szerotonerg sejt hatásai elégségesnek bizonyulnak az intakthoz közeli állapot fenntartásához. Ellentmondani látszik eddigi következtetéseinknek a dupla irtás mellett is megtartott efflux jelensége. Mindazonáltal lehetséges hogy helyes a gondolatmenetünk, csak a két rendszer egyidejő denervációja - mely a szimpla NA-erg irtás után tapasztalt 70%-os szöveti transzmitterszint-csökkenésnél mintegy 10%-al jelentısebb depléciót okozott az NA esetében - már olyan erıs ingert jelent magára a megmaradt NA-erg neuronpopulációra, illetve környezetére, hogy a kompezációra/restitúcióra irányuló adaptációs mechanizmusok is erısebben jelentkeznek, mint szimpla irtás után. Ez megnyilvánulhat pl. az intakt DA-rendszer és a maradék 5-HT-rendszer szimpla irtás után tapasztaltnál nagyobb bevonódásában a NA-rendszer feladataiba, valamint a 87
serkentı GABA-hatások fölerısödésében a szimpla NA-léziónál leírt módokon, a kevés megmaradt NA-neuron felfokozott érzékenysége következtében. Az 5-HTT sem intakt körülmények között „vállalja át” a NA transzportját, hanem csak a NAT jelentıs léziója esetén (Vizi és mtsai 2004). Az irtások ellenére megtartott izotópfelszabadulásban szerepet játszhat még az 5-HT parciális agonista hatásának gyengülése az 5-HT-lézió miatt az épen maradt noradrenerg varikozitásokon lévı α2 gátló autoreceptorokon (Vizi és Kiss 1998), valamint egyéb indirekt hatások, melyek felfedése további kísérletek tárgya. Az irtások hatásainak vizsgálata az idı függvényében nem hozott különbséget a szeletek [3H]NA-felszabadulását tekintve 7 és a 14 nappal az irtás után, tehát megállapíthatjuk, hogy a léziók fentebb részletezett hatásai a [3H]NA-felszabadulásra 7 napnál már teljesen megjelennek, és 14 napnál változatlanok. Ezen eredményünk összhangban van az irodalomban leírt gyakorlattal, mely szerint az irtások utáni in vitro és in vivo kísérletek nagy részét a léziót követı 7-14 nap lábadozási periódus után végzik (Kask és mtsai 1997, Jackisch és mtsai 2008). Ekkorra az irtások hosszabb távon jelentkezı hatásainak nagy része is kifejlıdik, viszont a kompenzáló mechanizmusok miatti helyreállítódás még kis mértékő. Az intakt és álmőtött állatok agyszeleteinek eredményei egyik paraméterben sem különböztek egymástól, tehát elmondhatjuk, hogy az álmőtés önmagában nem befolyásolja a hippocampalis [3H]NA-felszabadulást.
7.5.2. A [3H]5-HT-felszabadulásra gyakorolt hatás 7.5.2.1. Dezipramin hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra intakt szeleteken
A TCA-k körébe tartozó, szelektív NAT-gátló DMI-t azért adtuk intakt állatokból származó hippocampalis szeletekhez, mert az volt a feltételezésünk, hogy amint az 5HTT módosítja a [3H]NA-felszabadulást, úgy a NAT is befolyásolja a [3H]5-HTeffluxot. Ez a feltételezésünk nem igazolódott, hiszen sem a radiotranszmitterrel való szövetfeltöltéskor, sem az inkubálás kezdetétıl a 22. frakció végéig 1µM-ban adva, a DMI nem befolyásolta az intakt szeletekbıl felszabaduló radioaktivitás mennyiségét. E jelenség lehetséges magyarázata, hogy - bár egymás szoros struktúrhomológjai, és az 5HTT képes transzportálni a noradrenalint (Vizi és mtsai 2004), ez fordítva nem igaz, a 88
NAT nem transzportálja a szerotonint, csak a dopamint (Giros és mtsai 1994, Torres és mtsai 2003). Így tehát a DMI NAT-gátló hatása nem okoz csökkenést a stimulált [3H]5HT-felszabadulásban.
7.5.2.2. Az irtások hatása a [3H]5-HT-felszabadulásra
Az
irtások
[3H]5-HT-felszabadulásra
gyakorolt
hatásainak
vizsgálatakor
azt
tapasztaltuk, hogy az NA-erg lézió következtében csökken a hippocampalis [3H]5-HTfelszabadulás mindkét ingerlésre (az elsınél csak tendenciózusan, a másodiknál már szignifikánsan) az intakt és az álmőtött állatok szeleteihez képest. Azonban még így is szignifikánsan nagyobb, mint a szimpla 5-HT-lézionált, illetve a dupla irtáson átesett állatok szeleteiben. Ez az eredményünk összhangban van az irodalomban leírtakkal. Egyrészt, ahogy az irodalmi áttekintésben már említettük, a NA-erg transzmisszió az α1D/B receptorokon keresztül tónusosan stimulálja az 5-HT-felszabadulást (Salomon és mtsai 2006). E stimuláció kiiktatása a lézióval tehát a tríciált 5-HT-efflux csökkenésével is jár. Másrészt, a hippocampusban az NA, az 5-HT-erg terminálisokon elhelyezkedı, valószínőleg α2A altípusú receptorán keresztül gátolja az indolamin felszabadulását. Leírták, hogy DSP-4 hatására történı denerváció miatt e receptorok érzékenysége fokozódott, amely csökkent [3H]5-HT-effluxban nyilvánult meg (Benkirane és mtsai 1985). Meg kell jegyeznünk, hogy Jackisch és mtsai (2008) i.p. DSP-4 kezelt állatok hippocampalis szeleteiben a [3H]5-HT-felszabadulás növekedését tapasztalták. Viszont – mint azt már említettük – a szerzık által elért hippocampalis NA-depléció magasabb volt a miénknél, valamint, ellentétben velünk, nem tapasztaltak szöveti 5-HT-szint csökkenést sem a DSP-4 hatására. Így az eltérı beviteli mód és dózis miatti eltérı mértékő lézió lehet a magyarázat az ellentétes eredményeinkre. Az 5,7-DHT hatására szinte teljesen megszőnt a hippocampalis [3H]5-HTfelszabadulás. Ez az eredményünk összhangban áll más tanulmányban leírtakkal, ahol fornixba és cingularis kötegbe adagolt 5,7-DHT csökkentette az elektromos ingerrel facilitált [3H]5-HT-effluxot (Birthelmer és mtsai 2003). Ezzel is igazolódni látszik az intakt szeleteknél kifejtett feltételezésünk, hogy valószínőleg az 5-HT-t a NAT nem transzportálja, vagy ha igen, nem olyan mértékben, hogy az 5-HTT kiesését kompenzálni tudja. A [3H]5-HT DAT általi felvétele és felszabadítása a striatumban ismert jelenség (Vizi és mtsai 2004). Mivel a hippocampusban kevés a DA-erg 89
terminális, ezért ha esetleg itt is „helyettesíti” a DAT a lézió miatt kiesett 5-HTT mőködését, akkor is túl elenyészı e segítség a [3H]5-HT-felszabadulás fenntartásához (Vizi és mtsai 2004). A dupla irtás hatására szinte teljesen megszőnt a jelzett izotóp effluxa. Tehát az 5-HT-rendszernek a NA-rendszernél radikálisabb (>90%-os) depléciója, valamint a lézionált szerotonerg rendszerben zajló, a NA-rendszerétıl eltérı kompenzációs mechanizmusok nem tették lehetıvé a felszabadulás változatlanságához szükséges emelkedett extracelluláris 5-HT koncentráció fenntartását. Az irtások hatásainak vizsgálata az idı függvényében a [3H]5-HTfelszabadulásra, valamint az intakt és álmőtött szeletek eredményeinek összehasonlítása a [3H]NA-felszabadulásnál tapasztaltakkal megegyezı eredményeket hozott. A lézionált szeletekbıl történı [3H]5-HT-efflux frakcionális felszabadulási görbéinek lefutása megegyezett az irtások után 7 és 14 nappal, valamint a mőtéti beavatkozás önmagában a szerotonin esetében sem befolyásolta a hippocampalis radioaktív transzmitterfelszabadulást.
90
8. KÖVETKEZTETÉSEK
400 µg DSP-4 i.c.v. adagolásával, a szerotonerg axon-terminálisok fluoxetinnel történı védelme mellett sikeres NA-erg léziót, míg 300 µg 5,7-DHT i.c.v. adagolásával, a NAerg idegvégzıdések védelmében alkalmazott dezipramin elıkezelés mellett sikeres 5HT-erg léziót hoztunk létre patkányokban. A neurotoxinok egyidejő alkalmazásával elsıként hajtottuk végre a két rendszer együttes irtását. A hippocampalis NA-tartalom 70% körüli, valamint az 5-HT-szint 90% körüli csökkenése az irtások következtében azt bizonyítja, hogy az általunk választott neurotoxin dózisok és a beadás koordinátái megfelelıek. A másik jelátvivı rendszer kisebb mértékő, de szignifikáns depléciója a szimpla irtásoknál, a toxinok nem specifikus hatásainak, illetve az alkalmazott transzportergátlók nem teljeskörő védelmének a következménye. E hiányosságok miatt a neurotoxinok alkalmazásával tehát nem érhetı el teljes szelektivitású, totális lézió, csak az NA/5-HT egyensúly változtatható meg.
A nem kondicionált, spontán exploráción alapuló emelt keresztpalló- és fény-sötétteszteken a léziók eltérı anxiolitikus hatásmintázatot mutattak, ezért megállapíthatjuk, hogy a két paradigma az irtások szempontjából eltérı szorongástípust modellez. A keresztpalló a nyílt terektıl, míg a fény-sötét teszt a megvilágított terektıl való anxietást méri. E két szorongástípust eltérıen befolyásolja a NA- és 5-HT-rendszer.
Az NMDA-antagonista MK-801 (0,1 mg/kg, i.p.) intakt állatokon tapasztalt hatásai miatt kimondhatjuk, hogy a kondicionált félelmen alapuló szociális elkerülés tesztben modellezett
stressz-indukálta
szubkrónikus
szorongás
NMDA-függı
folyamat
következménye, kialakulását a NA- és 5-HT rendszer modulálja.
A passzív elkerülés paradigmában kapott adataink arra engednek következtetni, hogy az 5-HT-lézió és a dupla irtás a passzív elkerülı viselkedés deficitjét okozta. Mivel ez a deficit a nem sokkolt csoportoknál is megjelent, ezért nem zárható ki, hogy keletkezésében a kognitív hatások mellett az anxiolízis is szerepet játszik.
A NA-deficit prokognitív hatása PS-LTP teszten csak szők idıintervallumban állt fenn: irtás után 14 nappal kimutatható volt, de 30 napra már eltőnt.
91
Az irtások nem voltak hatással az állatok tárgyfelismerési képességére - ez utalhat arra, hogy a két rendszer nem játszik hangsúlyos szerepet a vizuális memóriafolyamatokban, illetve arra is, hogy a kompenzációs mechanizmusok miatti adaptív változások – a mérés idején már bizonyos mértékben antagonizálták a léziók hatásait. A léziók in vitro hippocampalis [3H]NA- és [3H]5-HT-felszabadulásra kifejtett hatásai ellentétben a PS-LTP-teszten tapasztalt hatásokkal - nem mutattak idıfüggést a vizsgált intervallumban: 7 nappal irtás után megmutatkoztak, és 14 nap elteltével sem változtak.
Az álmőtés és az irtások nem változtatták meg az állatok spontán motoros aktivitását, fájdalomérzékelését, az elkerülhetetlen sokkolás emocionális vonzatait, valamint az általános szociális viselkedést. A mőtéti beavatkozás sem befolyásolta önmagában a lokomóciót, szorongást, kognitív folyamatokat, és nem volt hatással a [3H]NA- és 5HT-felszabadulásra sem. Eredményeink tehát az irtások tényleges hatásait tükrözik a szorongásra, a kognitív folyamatokra, és a radioaktív transzmitter-felszabadulásra.
A kapott eredmények a NA- és 5-HT-rendszer anxietásra, kognitív folyamatokra, és a hippocampalis szövet tríciált transzmitter-felszabadulására való összetett, moduláló befolyásainak, valamint az irtások után beinduló, kompenzáló és regeneráló mechanizmusok komplex hatásainak a következményei, melyek feltérképezése további vizsgálatokat igényel.
92
9. ÖSSZEFOGLALÁS
A DSP-4 és 5,7-DHT szelektív neurotoxinok i.c.v. alkalmazásával elért egyes-, és az általunk elsıként létrehozott kettıs NA-/5-HT-depléció nem mutatott egységes hatásokat az anxietásra és a kognícióra. Az NA-erg irtás az emelt keresztpallón modellezett nyílt terektıl való, és a stressz-indukálta szociális elkerülés teszten megjelenített kondicionált szorongás esetében anxiolitikus hatásúnak bizonyult, míg a fény-sötét teszten nem mutatott hatást a megvilágított terektıl való szorongásra. Az 5HT-erg lézió csökkentette az állatok szorongását a nyílt és megvilágított terektıl, a sokkhatásal kondicionált szociális elkerülı magatartást viszont erısítette. A monoaminok szimultán irtása a nyílt terektıl való anxietás tekintetében a szimpla irtásoknál erısebb antagonizáló hatást eredményezett, a megvilágított terektıl való, valamint a kondicionált szociális averzióra viszont nem volt szignifikáns befolyása. A nem kompetitív NMDA-antagonista MK-801 sokkolás elıtti és utáni adásával intakt állatokban bizonyítottuk, hogy az elkerülı viselkedésben megnyilvánuló stresszválasz NMDA-függı Glu-erg mechanizmusok hatására alakul ki, melyeket a csak moduláló szerepet betöltı 5-HT-rendszer gátol, az NA-rendszer pedig serkent. Az 5-HT-erg lézió és a két rendszer együttes irtása passzív elkerülés tesztben kogníciórontó hatást mutatott in vivo, azonban e hatás nem jelent meg a tárgyfelismerésteszten, illetve az in vitro PS-LTP paradigmában agyszeletben. A NA-erg deficit idıfüggı prokognitív hatása egyedül a PS-LTP teszten volt mérhetı, in vivo nem erısítette a passzív elkerülı magatartást önmagában, nem antagonizálta az 5-HT-hiány válaszgyengítı hatását, és az állatok vizuális memóriájára sem volt befolyása. A stimulált hippocampalis [3H]NA-felszabadulás az NA-deficites szeletekbıl az elsı ingerléskor szignifikánsan nagyobb volt a többi csoporténál, míg a [3H]5-HT-efflux szinte megszőnt a szimpla 5-HT- és a dupla irtás hatására, intakt szeletekben pedig nem változott a kísérlet különbözı idıpontjaiban adott DMI-re. Az irtások nem változtatták meg az állatok spontán motoros aktivitását, a mőtéti beavatkozás sem befolyásolta önmagában a lokomóciót, szorongást, kognitív folyamatokat, és nem volt hatással a [3H]NA- és 5-HT-felszabadulásra sem. A fentebb felsorolt eredményeink tükrözik a NA- és 5-HT-rendszer anxietásra, kognitív folyamatokra, valamint a szöveti radioaktív transzmitterfelszabadulásra való összetett, moduláló befolyását, valamint az irtások után beinduló kompenzáló és regeneráló mechanizmusok komplex hatásait. 93
SUMMARY
Single and simultaneous lesions – performance of the latter is a novelty by our group – of the NA- and 5-HT-systems with selective neurotoxins i.c.v., resulted in different effects regarding anxiety and cognition. NA-depletion decreased both open-space anxiety related behavior on the elevated plus maze, and conditioned social avoidance response in the stress-induced social avoidance paradigm. It had no effect on the brightspace anxiety in the light-dark test. 5-HT-depletion decreased both open- and bright space anxiety, but in turn strenghtened the conditioned avoidance response. The parallel lesion of the monoamines yielded stronger antagonistic effect to open-space anxiety compared to the mono-depletions, but displayed no significant influence on bright-space anxiety and conditioned social aversion. By administering the non-competitive NMDAantagonist MK-801 to intact animals before and after conditioning, we have demonstrated that the stress-response manifesting in this behavioral deficit, develops under the influence of NMDA-dependent glutamatergic mechanisms. These mechanisms are attenuated by the 5-HT- and increased by the NA systems. 5-HT-ergic and parallel lesions displayed negative effect on cognition in the passive avoidance test in vivo, however both were devoid of this effect regarding the object recognition-, and the in vitro PS-LTP paradigms. The time-dependent procognitive effect of NA-deficit was developed only in the PS-LTP test, as the lesion neither improved in vivo passive avoidance behavior, or antagonized the attenuating effect of 5-HT-depletion, and it had no influence on visual memory of the animals either. The evoked hippocampal [3H]NA-release for the first stimulation was significantly stronger from NA-lesioned slices compared to the other slices, whilst [3H]5-HT-efflux almost quenched at slices with 5-HT- or both NA- and 5-HT-deficits, and it remained constant in intact slices despite administration of DMI in different timepoints of the experiment. Lesions did not alter the spontaneous locomotor activity, and the surgical intervention itself had no effect on locomotion, anxiety, cognitive processes, or [3H]NA- and 5-HT-release. Our results listed above reflect the complex modulating influence of NA- and 5HT on anxiety, cognition and [3H]transmitter-release, just as the multiple effects of the compensating and regenerating mechanisms beginning right after lesions. 94
10. IRODALOMJEGYZÉK
1.
Abercrombie ED, Zigmond MJ. (1989) Partial injury to central noradrenergic neurons: reduction of tissue norepinephrine content is greater than reduction of extracellular norepinephrine measured by microdialysis. J Neurosci, 9(11):4062-7.
2.
Adamec R, Creamer K, Bartoszyk GD, Burton P. (2004) Prophylactic and therapeutic effects of acute systemic injections of EMD 281014, a selective serotonin 2A receptor antagonist on anxiety induced by predator stress in rats. Eur J Pharmacol, 504(1-2):79-96.
3.
Adamec RE, Burton P, Shallow T, Budgell J. (1999) NMDA receptors mediate lasting increases in anxiety-like behavior produced by the stress of predator exposure-implications for anxiety associated
with
posttraumatic stress disorder. Physiol Behav, 65(4-5):723-37.
4.
Adams RN, Marsden CA. Electrochemical detection methods for monoamine measurements in vitro and in vivo. In: Iversen LL, Iversen SD, Snyder SH (eds.), Handbook of Psychopharmacology Vol. 15., Chapter 1. Plenum, New York, 1982: 1-74.
5.
Aghajanian GK, Sanders-Bush E. Serotonin. In: Davis KL, Charney D, Coyle JT, Nemeroff C (eds.), Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. Lippincott Williams & Wilkins, New York, 2002: 15-34.
6.
Akaoka H, Aston-Jones G. (1991) Opiate withdrawal-induced hyperactivity of locus coeruleus neurons is substantially mediated by augmented excitatory amino acid input. J Neurosci, 11(12):3830-9.
7.
Albasser MM, Poirier GL, Aggleton JP. (2010) Qualitatively different modes of perirhinal-hippocampal engagement when rats explore novel
95
vs. familiar objects as revealed by c-Fos imaging. Eur J Neurosci, 31(1):134-47.
8.
Al-Zahrani SS, Al-Ruwaitea AS, Ho MY, Bradshaw CM, Szabadi E. (1997) Destruction of central noradrenergic neurones with DSP4 impairs the acquisition of temporal discrimination but does not affect memory for duration in a delayed conditional discrimination task. Psychopharmacology (Berl), 130(2):166-73.
9.
Andrade TG, Graeff FG. (2001) Effect of electrolytic and neurotoxic lesions of the median raphe nucleus on anxiety and stress. Pharmacol Biochem Behav, 70(1):1-14.
10.
Archer T, Fredriksson A. (2000) Effects of clonidine and alphaadrenoceptor antagonists on motor activity in DSP4-treated mice I: dose-, time- and parameter-dependency. Neurotox Res, 1(4):235-47.
11.
Archer T, Jonsson G, Ross SB. (1985) Active and passive avoidance following the administration of systemic DSP4, xylamine, or pchloroamphetamine. Behav Neural Biol, 43(3):238-49.
12.
Asnis GM, Kohn SR, Henderson M, Brown NL. (2004) SSRIs versus non-SSRIs in post-traumatic stress disorder: an update with recommendations. Drugs, 64(4):383-404.
13.
Aston-Jones G. Norepinephrine. In: Davis KL, Charney D, Coyle JT, Nemeroff C (eds.), Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. Lippincott Williams & Wilkins, New York, 2002: 47-57.
14.
Aston-Jones G, Ennis M, Pieribone VA, Nickell WT, Shipley MT. (1986) The brain nucleus locus coeruleus: restricted afferent control of a broad efferent network. Science, 234(4777):734-7.
96
15.
Azmitia EC, Whitaker-Azmitia PM. (1991) Awakening the sleeping giant: anatomy and plasticity of the brain serotonergic system. J Clin Psychiatry, 52 Suppl.:4-16.
16.
Balderas I, Rodriguez-Ortiz CJ, Salgado-Tonda P, Chavez-Hurtado J, McGaugh JL, Bermudez-Rattoni F. (2008) The consolidation of object and context recognition memory involve different regions of the temporal lobe. Learn Mem, 15(9):618-24.
17.
Bandelow B, Zohar J, Hollander E, Kasper S, Möller HJ. (2002) World Federation of Societies of Biological Psychiatry Task Force on Treatment
Guidelines
for
Anxiety,
Obsessive-Compulsive
and
Posttraumatic Stress Disorders: World Federation of Societies of Biological Psychiatry (WFSBP) guidelines for the pharmacological treatment of anxiety, obsessive-compulsive and posttraumatic stress disorders. World J Biol Psychiatry, 3(4):171-99.
18.
Baraban JM, Aghajanian GK. (1981) Noradrenergic innervation of serotonergic neurons in the dorsal raphe: demonstration by electron microscopic autoradiography. Brain Res, 204(1):1-11.
19.
Bardgett ME, Points M, Ramsey-Faulkner C, Topmiller J, Roflow J, McDaniel T, Lamontagne T, Griffith MS. (2008) The effects of clonidine on discrete-trial delayed spatial alternation in two rat models of memory loss. Neuropsychopharmacology, 33(8):1980-91.
20.
Baumgarten HG, Lachenmayer L. (2004) Serotonin neurotoxins-past and present. Neurotox Res, 6(7-8):589-614.
21.
Baumgarten HG, Björklund A. (1976) Neurotoxic indoleamines and monoamine neurons. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 16:101-11.
22.
Baumgarten HG, Björklund A, Lachenmayer L, Nobin A. (1973) Evaluation of the effects of 5,7-dihydroxytryptamine on serotonin and 97
catecholamine neurons in the rat CNS. Acta Physiol Scand Suppl, 391:1-19.
23.
Baumgarten HG, Lachenmayer L. (1972) 5,7-dihydroxytryptamine: improvement in chemical lesioning of indoleamine neurons in the mammalian brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat, 135(3):399-414.
24.
Benkirane S, Arbilla S, Langer SZ. (1985) Supersensitivity of alpha 2adrenoceptors modulating [3H]5-HT release after noradrenergic denervation with DSP4. Eur J Pharmacol, 119(1-2):131-3.
25.
Bevins RA, Besheer J. (2006) Object recognition in rats and mice: a one-trial non-matching-to-sample learning task to study 'recognition memory. Nat Protoc, 1(3):1306-11.
26.
Biessels GJ, Kamal A, Urban IJ, Spruijt BM, Erkelens DW, Gispen WH. (1998) Water maze learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocin-diabetic rats: effects of insulin treatment. Brain Res, 800(1):125-35.
27.
Bilkei-Gorzó A, Gyertyán I, Lévay G. (1998) mCPP-induced anxiety in the light-dark box in rats- a new method for screening anxiolytic activity. Psychopharmacology, 136:291-298.
28.
Birthelmer A, Ehret A, Amtage F, Förster S, Lehmann O, Jeltsch H, Cassel JC, Jackisch R. (2003) Neurotransmitter release and its presynaptic modulation in the rat hippocampus after selective damage to cholinergic or/and serotonergic afferents. Brain Res Bull, 59(5):37181.
29.
Björklund
A,
Baumgarten
HG,
Rensch
A.
(1975)
5,7-
Dihydroxytryptamine: improvement of its selectivity for serotonin neurons in the CNS by pretreatment with desipramine. J Neurochem, 24(4):833-5. 98
30.
Blier P, Monroe PJ, Bouchard C, Smith DL, Smith DJ. (1993) 5-HT3 receptors which modulate [3H]5-HT release in the guinea pig hypothalamus are not autoreceptors. Synapse, 15(2):143-8.
31.
Bliss TV, Collingridge GL. (1993) A synaptic model of memory: longterm potentiation in the hippocampus. Nature, 361(6407):31-9.
32.
Borsy J, Csanyi E, Lazar I. (1960) A method of assaying tranquilizing drugs based on the inhibition of orientational hypermotility. Arch Int Pharmacodyn Ther, 124:180-90.
33.
Bourin M, Hascoët M. (2003) The mouse light/dark box test. Eur J Pharmacol, 463(1-3):55-65.
34.
Bourin M. (1997) Animal models of anxiety: are they suitable for predicting drug action in humans? Pol J Pharmacol, 49(2-3):79-84.
35.
Breese GR, Mueller RA. (1978) Alterations in the neurocytotoxicity of 5,7-dihydroxytryptamine by pharmacologic agents in adult and developing rats. Ann N Y Acad Sci, 305:160-74.
36.
Breese GR, Cooper BR. (1975) Behavioral and biochemical interactions of 5,7-dihydroxytryptamine with various drugs when administered intracisternally to adult and developing rats. Brain Res, 98(3):517-27.
37.
Breese GR, Cooper BR, Grant LD, Smith RD. (1974) Biochemical and behavioural
alterations
following
5,6-dihydroxytryptamine
administration into brain. Neuropharmacology, 13(3):177-87.
38.
Briley M, Chopin P, Moret C (1990) Effect of serotonergic lesion on "anxious" behaviour measured in the elevated plus-maze test in the rat. Psychopharmacology (Berl), 101(2): 187-9.
99
39.
Brodie BB, Shore PA. (1957) A concept for a role of serotonin and norepinephrine as chemical mediators in the brain. Ann N Y Acad Sci, 66(3):631-42.
40.
Bylund DB, Eikenberg DC, Hieble JP, Langer SZ, Lefkowitz RJ, Minneman KP, Molinoff PB, Ruffolo RR Jr, Trendelenburg U. (1994) International Union of Pharmacology nomenclature of adrenoceptors. Pharmacol Rev, 46(2):121-36.
41.
Cadet JL, Brannock C. (1998) Free radicals and the pathobiology of brain dopamine systems. Neurochem Int, 32(2):117-31.
42.
Carli M, Prontera C, Samanin R. (1989) Evidence that central 5hydroxytryptaminergic neurones are involved in the anxiolytic activity of buspirone. Br J Pharmacol, 96(4): 829-36.
43.
Carobrez AP, Bertoglio LJ. (2005) Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neurosci Biobehav Rev, 29(8):1193-205.
44.
Chan JY, Pan S, Chan SH. (1991) Participation of noradrenergic neurotransmission in angiotensin III-induced dipsogenic behavior in the rat. Life Sci, 48(13):1293-301.
45.
Chaouloff F, Durand M, Mormède P. (1997) Anxiety- and activityrelated effects of diazepam and chlordiazepoxide in the rat light/dark and dark/light tests. Behav Brain Res, 85(1):27-35.
46.
Chaulk PC, Harley CW. (1998) Intracerebroventricular norepinephrine potentiation of the perforant path-evoked potential in dentate gyrus of anesthetized and awake rats: A role for both alpha- and betaadrenoceptor activation. Brain Res, 787(1):59-70.
100
47.
Chu LF, Liang DY, Li X, Sahbaie P, D'arcy N, Liao G, Peltz G, David Clark J. (2009) From mouse to man: the 5-HT3 receptor modulates physical dependence on opioid narcotics. Pharmacogenet Genomics, 19(3):193-205.
48.
Clayton EC, Williams CL. a. (2000) Posttraining inactivation of excitatory afferent input to the locus coeruleus impairs retention in an inhibitory avoidance learning task. Neurobiol Learn Mem, 73(2):12740.
49.
Clayton EC, Williams CL. b. (2000) Glutamatergic influences on the nucleus paragigantocellularis: contribution to performance in avoidance and spatial memory tasks. Behav Neurosci, 114(4):707-12.
50.
Corradetti R, Ballerini L, Pugliese AM, Pepeu G. (1992) Serotonin blocks the long-term potentiation induced by primed burst stimulation in the CA1 region of rat hippocampal slices. Neuroscience, 46(3):511-8.
51.
Costall B, Jones BJ, Kelly ME, Naylor RJ, Tomkins DM. (1989) Exploration of mice in a black and white test box: validation as a model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav, 32(3):777-85.
52.
Crawley J, Goodwin FK. (1980) Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav, 13(2):167-70.
53.
Creveling CR, Rotman A. (1978) Mechanism of action of dihydroxytryptamines. Ann N Y Acad Sci, 305:57-73.
54.
Dahlström A, Fuxe K. (1964) Localization of monoamines in the lower brain stem. Experientia,20(7):398-9.
55.
Dawson GR, Maubach KA, Collinson N, Cobain M, Everitt BJ, MacLeod AM, Choudhury HI, McDonald LM, Pillai G, Rycroft W, 101
Smith AJ, Sternfeld F, Tattersall FD, Wafford KA, Reynolds DS, Seabrook GR, Atack JR. (2006) An inverse agonist selective for alpha5 subunit-containing GABAA receptors enhances cognition. J Pharmacol Exp Ther, 316(3):1335-45.
56.
Decker MW, McGaugh JL. (1989) Effects of concurrent manipulations of cholinergic and noradrenergic function on learning and retention in mice. Brain Res, 477(1-2):29-37.
57.
Del Olmo N, Higuera-Matas A, Miguéns M, García-Lecumberri C, Borcel E, Solís JM, Ambrosio E. (2006) Hippocampal synaptic plasticity and water maze learning in cocaine self-administered rats. Ann N Y Acad Sci, 1074:427-37.
58.
Delfs JM, Zhu Y, Druhan JP, Aston-Jones G. (2000) Noradrenaline in the ventral forebrain is critical for opiate withdrawal-induced aversion. Nature, 403(6768):430-4.
59.
Descarries L, Watkins KC, Garcia S, Beaudet A. (1982) The serotonin neurons in nucleus raphe dorsalis of adult rat: a light and electron microscope radioautographic study. J Comp Neurol, 207(3):239-54.
60.
Dudley MW, Howard BD, Cho AK. (1990) The interaction of the betahaloethyl benzylamines, xylamine, and DSP-4 with catecholaminergic neurons. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 30:387-403.
61.
Fassio A, Bonanno G, Fontana G, Usai C, Marchi M, Raiteri M. (1996) Role of external and internal calcium on heterocarrier-mediated transmitter release. J Neurochem, 66(4):1468-74.
62.
Fernandez SM, Frick KM. (2004) Chronic oral estrogen affects memory and neurochemistry in middle-aged female mice. Behav Neurosci, 118(6):1340-51.
102
63.
File SE. (2001) Factors controlling measures of anxiety and responses to novelty in the mouse. Behav Brain Res, 125(1-2):151-7.
64.
Frechilla D, Insausti R, Ruiz-Golvano P, García-Osta A, Rubio MP, Almendral JM, Del Río J. (2000) Implanted BDNF-producing fibroblasts prevent neurotoxin-induced serotonergic denervation in the rat striatum. Brain Res Mol Brain Res, 76(2): 306-14.
65.
Freund TF, Buzsáki G. (1996) Interneurons of the hippocampus. Hippocampus, 6(4):347-470.
66.
Fritschy JM, Grzanna R. (1992) Restoration of ascending noradrenergic projections by residual locus coeruleus neurons: compensatory response to neurotoxin-induced cell death in the adult rat brain. J Comp Neurol, 321(3):421-41.
67.
Fritschy JM, Grzanna R. (1991) Selective effects of DSP-4 on locus coeruleus axons: are there pharmacologically different types of noradrenergic axons in the central nervous system? Prog Brain Res, 88:257-68.
68.
Fritschy JM, Geffard M, Grzanna R.(1990) The response of noradrenergic axons to systemically administered DSP-4 in the rat: an immunohistochemical study using antibodies to noradrenaline and dopamine-beta-hydroxylase. J Chem Neuroanat, 3(4):309-21.
69.
Fukui M, Takishita A, Zhang N, Nakagawa T, Minami M, Satoh M. (2004) Involvement of locus coeruleus noradrenergic neurons in supraspinal antinociception by alpha,beta-methylene-ATP in rats. J Pharmacol Sci, 94(2):153-60.
70.
Fuller RW. (1978) Neurochemical effects of serotonin neurotoxins: an introduction. Ann N Y Acad Sci, 305:178-81.
103
71.
Fuller RW, Perry KW, Molloy BB. (1975) Reversible and irreversible phases of serotonin depletion by 4-chloroamphetamine. Eur J Pharmacol, 33(1):119-24.
72.
Fumagalli F, Jones SR, Caron MG, Seidler FJ, Slotkin TA. (1996) Expression of mRNA coding for the serotonin transporter in aged vs. young rat brain: differential effects of glucocorticoids. Brain Res, 719(1-2):225-8.
73.
Fuxe K, Ogren SO, Agnati LF, Jonsson G, Gustafsson JA. (1978) 5,7Dihydroxytryptamine as a tool to study the functional role of central 5hydroxytryptamine neurons. Ann N Y Acad Sci, 305:346-69.
74.
Fürst Z. (2008) Central and peripheral mechanisms in antinociception: current
and
future
perspectives.
Neuropsychopharmacol
Hung,
10(3):127-30.
75.
Fürst Z. VI.fejezet (A központi idegrendszer gyógyszertana) 32. rész: Opioid agonisták és antagonisták. In: Gyires K, Fürst Z (fıszerk.), Farmakológia és farmakoterápia I. Farmakológia. A gyógyszeres terápia alapjai. Medicina, Budapest, 2007: 468-501.
76.
Gacsályi I, Schmidt É, Gyertyán I, Vasar E, Lang A, Haapalinna A, Fekete M, Hietala J, Syvälahti E, Tuomainen PM, Männisto PT. (1997) Receptor binding profile and anxiolytic type activity of deramciclane (EGIS-3886) in animal models. Drug Dev Res, 40: 333-348.
77.
Garcia-Alloza M, Hirst WD, Chen CP, Lasheras B, Francis PT, Ramírez MJ. (2004) Differential involvement of 5-HT(1B/1D) and 5HT6 receptors in cognitive and non-cognitive symptoms in Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology, 29(2):410-6.
104
78.
Gerson
S,
Baldessarini
RJ.
(1974)
Non-specific
actions
of
dihydroxylated tryptamines in the central nervous system of the rat. J Pharm Pharmacol, 26(1):71-3.
79.
Giros B, Wang YM, Suter S, McLeskey SB, Pifl C, Caron MG. (1994) Delineation of discrete domains for substrate, cocaine, and tricyclic antidepressant interactions using chimeric dopamine-norepinephrine transporters. J Biol Chem, 269(23):15985-8.
80.
Gonda X, Fountoulakis KN, Juhasz G, Rihmer Z, Lazary J, Laszik A, Akiskal HS, Bagdy G. (2009) Association of the s allele of the 5HTTLPR with neuroticism-related traits and temperaments in a psychiatrically healthy population. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci, 259(2):106-13.
81.
Graeff FG, Viana MB, Mora PO. (1997) Dual role of 5-HT in defense and anxiety. Neurosci Biobehav Rev, 21(6): 791-9.
82.
Graeff FG, Guimarães FS, De Andrade TG, Deakin JF. (1996) Role of 5-HT in stress, anxiety, and depression. Pharmacol Biochem Behav, 54(1):129-41.
83.
Gray JA, Roth BL. Serotonin systems. In: Sibley DR, Hanin I, Kuhar M, Skolnick P (eds.), Handbook of Contemporary Neuropharmacology. Wiley & Sons, Hoboken NJ, 2007: 257-297.
84.
Griebel G, Belzung C, Perrault G, Sanger DJ. (2000) Differences in anxiety-related behaviours and in sensitivity to diazepam in inbred and outbred strains of mice. Psychopharmacology (Berl), 148(2): 164-70.
85.
Grzanna R, Fritschy JM. (1991) Efferent projections of different subpopulations of central noradrenaline neurons. Prog Brain Res, 88:89101.
105
86.
Gyertyán I. (1992) Animal models of anxiety: a critical review. Acta Physiol Hung, 79(4):369-79.
87.
Gyires K, Zádori ZS, Shujaa N, Minorics R, Falkay G, Mátyus P. (2007) Analysis of the role of central and peripheral alpha2adrenoceptor subtypes in gastric mucosal defense in the rat. Neurochem Int, 51(5):289-96.
88.
Häidkind R, Kivastik T, Eller M, Kolts I, Oreland L, Harro J. (2002) Denervation of the locus coeruleus projections by treatment with the selective
neurotoxin
DSP-4
[N
(2-chloroethyl)-N-ethyl-2-
bromobenzylamine] reduces dopamine release potential in the nucleus accumbens shell in conscious rats. Neurosci Lett, 332(2):79-82.
89.
Halász J, Liposits Z, Kruk MR, Haller J. (2002) Neural background of glucocorticoid dysfunction-induced abnormal aggression in rats: involvement of fear- and stress-related structures. Eur J Neurosci, 15(3):561-9.
90.
Hall FS, Devries AC, Fong GW, Huang S, Pert A. (1999) Effects of 5,7-dihydroxytryptamine depletion of tissue serotonin levels on extracellular serotonin in the striatum assessed with in vivo microdialysis: relationship to behavior. Synapse, 33(1): 16-25.
91.
Haller J, Leveleki C, Baranyi J, Mikics E, Bakos N. (2003) Stress, social avoidance and anxiolytics: a potential model of stress-induced anxiety.Behav Pharmacol, 14(5-6):439-46.
92.
Haller J, Bakos N. (2002) Stress-induced social avoidance: a new model of stress-induced anxiety? Physiol Behav, 77(2-3):327-32.
93.
Haller J, Halász J. A szorongás neuroendokrinológiája. In: Buda B, Kopp M (szerk.), Magatartástudományok. Medicina, Budapest, 2001: 377-382. 106
94.
Hallman H, Jonsson G. (1984) Neurochemical studies on central dopamine neurons-regional characterization of dopamine turnover. Med Biol, 62(3):198-209.
95.
Haring JH, Yan W. (1999) Dentate granule cell function after neonatal treatment with parachloroamphetamine or 5,7-dihydroxytryptamine. Brain Res Dev Brain Res, 114(2):269-72.
96.
Harley C. (1991) Noradrenergic and locus coeruleus modulation of the perforant path-evoked potential in rat dentate gyrus supports a role for the locus coeruleus in attentional and memorial processes. Prog Brain Res, 88:307-21.
97.
Harro J, Pähkla R, Modiri A-R, Harro M, Kask A, Oreland L. (1999) Dose-dependent effects of noradrenergic denervation by DSP-4 treatment on forced swimming and beta-adrenoceptor binding in the rat. J Neural Transm, 106(7-8):619-29.
98.
Harro J, Jossan SS, Oreland L. (1992) Changes in cholecystokinin receptor binding in rat brain after selective damage of locus coeruleus projections by DSP-4 treatment. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 346(4): 425-31.
99.
Harsing LG Jr, Prauda I, Barkoczy J, Matyus P, Juranyi Z. (2004) A 5HT7 heteroreceptor-mediated inhibition of [3H]serotonin release in raphe nuclei slices of the rat: evidence for a serotonergic-glutamatergic interaction. Neurochem Res, 29(8):1487-97.
100.
Harsing LG Jr, Vizi ES (1991) Evidence that two stereochemically different alpha-2 adrenoceptors modulate norepinephrine release in rat cerebral cortex. J Pharmacol Exp Ther, 256(1):44-9.
107
101.
Harvey JA, McMaster SE. (1975) Fenfluramine: evidence for a neurotoxic action on midbrain and a long-term depletion of serotonin. Psychopharmacol Commun, 1(2):217-28.
102.
Hascoët M, Bourin M. (1998) A new approach to the light/dark test procedure in mice. Pharmacol Biochem Behav, 60(3):645-53.
103.
Hensler JG, Ferry RC, Labow DM, Kovachich GB, Frazer A. (1994) Quantitative autoradiography of the serotonin transporter to assess the distribution of serotonergic projections from the dorsal raphe nucleus. Synapse, 17(1):1-15.
104.
Hirsch EC, Höglinger G, Rousselet E, Breidert T, Parain K, Feger J, Ruberg M, Prigent A, Cohen-Salmon C, Launay JM. (2003) Animal models of Parkinson's disease in rodents induced by toxins: an update. J Neural Transm Suppl, (65):89-100.
105.
Hole K, Fuxe K, Jonsson G. (1976) Behavioral effects of 5, 7dihydroxytryptamine
lesions
of
ascending
5-hydroxytryptamine
pathways. Brain Res, 107(2):385-99.
106.
Hopkins WF, Johnston D. (1988) Noradrenergic enhancement of longterm potentiation at mossy fiber synapses in the hippocampus. J Neurophysiol, 59(2):667-87.
107.
Hoyer D, Hannon JP, Martin GR. (2002) Molecular, pharmacological and functional diversity of 5-HT receptors. Pharmacol Biochem Behav, 71(4):533-54.
108.
Hritcu L, Clicinschi M, Nabeshima T. (2007) Brain serotonin depletion impairs short-term memory, but not long-term memory in rats. Physiol Behav, 91(5):652-7.
108
109.
Huang GJ, Herbert J. (2005) Serotonin modulates the suppressive effects of corticosterone on proliferating progenitor cells in the dentate gyrus of the hippocampus in the adult rat. Neuropsychopharmacology, 30(2):231-41.
110.
Hughes ZA, Stanford SC. (1998) A partial noradrenergic lesion induced by DSP-4 increases extracellular noradrenaline concentration in rat frontal cortex: a microdialysis study in vivo. Psychopharmacology (Berl), 136(3):299-303.
111.
Hui SC, Sevilla EL, Ogle CW. (1996) Prevention by the 5-HT3 receptor antagonist, ondansetron, of morphine-dependence and tolerance in the rat. Br J Pharmacol, 118(4):1044-50.
112.
Humphrey PP, Hartig P, Hoyer D. (1993) A proposed new nomenclature for 5-HT receptors. Trends Pharmacol Sci, 14(6):233-6.
113.
Inoue T, Tsuchiya K, Koyama T. (1996) Serotonergic activation reduces defensive freezing in the conditioned fear paradigm. Pharmacol Biochem Behav, 53(4):825-31.
114.
Izquierdo I, McGaugh JL. (2000) Behavioural pharmacology and its contribution to the molecular basis of memory consolidation. Behav Pharmacol, 11(7-8):517-34.
115.
Jackisch R, Gansser S, Cassel JC. (2008) Noradrenergic denervation facilitates the release of acetylcholine and serotonin in the hippocampus: towards a mechanism underlying upregulations described in MCI patients? Exp Neurol, 213(2):345-53.
116.
Jacobs BL, Fornal CA. Serotonin and behaviour: A general hypothesis. In: Bloom FE, Kupfer DJ (eds.), Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Raven, New York, 1995: 461-470.
109
117.
Jankord R, Herman JP. (2008) Limbic regulation of hypothalamopituitary-adrenocortical function during acute and chronic stress. Ann N Y Acad Sci, 1148:64-73.
118.
Johnson MP, Huang XM, Oberlender R, Nash JF, Nichols DE. (1990) Behavioral, biochemical and neurotoxicological actions of the alphaethyl homologue of p-chloroamphetamine. Eur J Pharmacol, 191(1):110.
119.
Jones JD, Hall FS, Uhl GR, Riley AL. (2009) Dopamine, norepinephrine and serotonin transporter gene deletions differentially alter cocaine-induced taste aversion. Pharmacol Biochem Behav, Dec 4. [Epub ahead of print].
120.
Jonsson G, Hallman H, Ponzio F, Ross S. (1981) DSP4 (N-(2chloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzylamine)-a useful denervation tool for central and peripheral noradrenaline neurons. Eur J Pharmacol, 72: 173-188.
121.
Kapus G, Kertész S, Gigler G, Simó A, Vegh M, Barkóczy J, Hársing LG, Szabó G, Lévay G. (2004) Comparison of the AMPA antagonist action of new 2,3-benzodiazepines in vitro and their neuroprotective effects in vivo. Pharm Res, 21(2):317-23.
122.
Kask A, Harro J, Tuomaine P, Rägo L, Männistö PT. (1997) Overflow of noradrenaline and dopamine in frontal cortex after [N-(2chloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzylamine] (DSP-4) treatment: in vivo microdialysis study in anaesthetized rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 355(2):267-72.
123.
Katsuki H, Izumi Y, Zorumski CF. (1997) Noradrenergic regulation of synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region. J Neurophysiol, 77(6):3013-20.
110
124.
Kenney JW, Gould TJ. (2008) Modulation of hippocampus-dependent learning and synaptic plasticity by nicotine. Mol Neurobiol, 38(1):10121.
125.
King MV, Spicer CH, Sleight AJ, Marsden CA, Fone KC. (2009) Impact of regional 5-HT depletion on the cognitive enhancing effects of a typical 5-ht(6) receptor antagonist, Ro 04-6790, in the Novel Object Discrimination task. Psychopharmacology (Berl), 202(1-3):111-23.
126.
Kirby LG, Kreiss DS, Singh A, Lucki I. (1995) Effect of destruction of serotonin neurons on basal and fenfluramine-induced serotonin release in striatum. Synapse, 20(2):99-105.
127.
Kiss JP, Sershen H, Lajtha A, Vizi ES. (1996) Inhibition of neuronal nitric oxide synthase potentiates the dimethylphenylpiperaziniumevoked carrier-mediated release of noradrenaline from rat hippocampal slices. Neurosci Lett, 215(2):115-8.
128.
Kliethermes CL, Cronise K, Crabbe JC. (2004) Anxiety-like behavior in mice in two apparatuses during withdrawal from chronic ethanol vapor inhalation. Alcohol Clin Exp Res, 28(7):1012-9.
129.
Kozisek ME, Bylund DB. Norepinephrine/Epinephrine. In: Sibley DR, Hanin I, Kuhar M, Skolnick P (eds.), Handbook of Contemporary Neuropharmacology. Wiley & Sons, Hoboken NJ, 2007: 193-220.
130.
Kumar KB, Karanth KS. (1994) Effects of DSP-4-induced depletion of brain norepinephrine on appetitive and aversive memory retrieval. Indian J Exp Biol, 32(10): 724-8.
131.
Lapiz MD, Mateo Y, Durkin S, Parker T, Marsden CA. (2001) Effects of central noradrenaline depletion by the selective neurotoxin DSP-4 on the behaviour of the isolated rat in the elevated plus maze and water maze. Psychopharmacology (Berl), 155(3):251-9. 111
132.
Laroche S, Doyere V, Bloch V. (1989) Linear relation between the magnitude of long-term potentiation in the dentate gyrus and associative learning in the rat. A demonstration using commissural inhibition and local infusion of an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist. Neuroscience, 28(2):375-86.
133.
Leiva J, Palestini M, Infante C, Goldschmidt A, Motles E. (2009) Copper suppresses hippocampus LTP in the rat, but does not alter learning or memory in the morris water maze. Brain Res, 1256:69-75.
134.
Leung PP, Miller JJ. (1988) Dual role of norepinephrine in the hippocampal CA1 region of the rat: inhibition and disinhibition. Can J Physiol Pharmacol, 66(6):814-9.
135.
Leveleki C, Sziray N, Levay G, Barsvári B, Soproni K, Mikics E, Haller J. (2006) Pharmacological evaluation of the stress-induced social avoidance model of anxiety. Brain Res Bull, 69(2):153-60.
136.
Liang KC. (1998) Pretraining infusion of DSP-4 into the amygdala impaired retention in the inhibitory avoidance task: involvement of norepinephrine but not serotonin in memory facilitation. Chin J Physiol, 41(4):223-33.
137.
Lieben CK, Steinbusch HW, Blokland A. (2006) 5,7-DHT lesion of the dorsal raphe nuclei impairs object recognition but not affective behavior and corticosterone response to stressor in the rat. Behav Brain Res, 168(2):197-207.
138.
Lyles GA, Callingham BA. (1981) The effect of DSP-4 (N-[2chloroethyl]-N-ethyl-2-bromobenzylamine) on monoamine oxidase activities in tissues of the rat. J Pharm Pharmacol., 33(10):632-8.
112
139.
Lynch MA. (2004) Long-term potentiation and memory. Physiol Rev, 84(1):87-136.
140.
Maeda T, Kaneko S, Satoh M. (1994) Inhibitory influence via 5-HT3 receptors on the induction of LTP in mossy fiber-CA3 system of guinea-pig hippocampal slices. Neurosci Res, 18(4):277-82.
141.
Magyar
K,
Szökı
É.
VI.fejezet
(A
központi
idegrendszer
gyógyszertana) 31. rész: Antidepresszív és antimániás vegyületek. In: Gyires K, Fürst Z (fıszerk.), Farmakológia és farmakoterápia I. Farmakológia. A gyógyszeres terápia alapjai. Medicina, Budapest, 2007: 456-467.
142.
Mahata M, Mahata SK, Parmer RJ, O'Connor DT. (1996) Vesicular monoamine transport inhibitors. Novel action at calcium channels to prevent catecholamine secretion. Hypertension, 28(3):414-20.
143.
Mann JJ, Arango V, Underwood MD. (1990) Serotonin and suicidal behavior. Ann N Y Acad Sci, 600:476-84; discussion: 484-5.
144.
Marien M, Lategan A, Colpaert FC. Noradrenergic control of striatal dopamine. In: Briley M and Marien M (szerk.): Noradrenergic mechhanisms in Parkinson’s disease. CRC Press, Boca Raton, 1994. 127-138.
145.
Martényi F. (2005) Three paradigms in the treatment of posttraumatic stress disorder. Neuropsychopharmacol Hung, 7(1):11-21.
146.
Mason ST, Fibiger HC. (1979) Noradrenaline and avoidance learning in the rat. Brain Res, 161(2):321-33.
147.
Mathiasen LS, Mirza NR, Rodgers RJ. (2008) Strain- and modeldependenteffects of chlordiazepoxide, L-838,417 and zolpidem on
113
anxiety-like behaviours in laboratory mice. Pharmacol Biochem Behav, 90(1):19-36.
148.
McCool BA, Chappell A. (2007) Strychnine and taurine modulation of amygdala-associated anxiety-like behavior is 'state' dependent. Behav Brain Res, 178(1):70-81.
149.
Meek
JL,
Fuxe
K,
Carlsson
A.
(1971)
Blockade
of
p-
chloromethamphetamine induced 5-hydroxytryptamine depletion by chlorimipramine,
chlorpheniramine
and
meperidine.
Biochem
Pharmacol, 20(3):707-9.
150.
Messing RB. (1978) Behavioral effects of serotonin neurotoxins: an overview. Ann N Y Acad Sci, 305:480-96.
151.
Miguel-Hidalgo JJ. (2001) SB-271046 (SmithKline Beecham). Curr Opin Investig Drugs, 2(1):118-22.
152.
Mikics E, Vas J, Aliczki M, Halasz J, Haller J. (2009) Interactions between the anxiogenic effects of CB1 gene disruption and 5-HT3 neurotransmission. Behav Pharmacol, 20(3):265-72.
153.
Millan MJ. (2003) The neurobiology and control of anxious states. Prog Neurobiol, 70(2):83-244.
154.
Miyakawa T, Leiter LM, Gerber DJ, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Zeng H, Caron MG, Tonegawa S. (2003) Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci, 100(15):8987-92.
155.
Miyamoto Y, Chen L, Sato M, Sokabe M, Nabeshima T, Pawson T, Sakai R, Mori N. (2005) Hippocampal synaptic modulation by the phosphotyrosine adapter protein ShcC/N-Shc via interaction with the NMDA receptor. J Neurosci, 25(7):1826-35. 114
156.
Mody I, Leung P, Miller JJ. (1983) Role of norepinephrine in seizurelike activity of hippocampal pyramidal cells maintained in vitro: alteration by 6-hydroxydopamine lesions of norepinephrine-containing systems. Can J Physiol Pharmacol, 61(8):841-6.
157.
Mongeau R, De Montigny C, Blier P. (1994) Activation of 5-HT3 receptors enhances the electrically evoked release of [3H]noradrenaline in rat brain limbic structures. Eur J Pharmacol, 1256(3):269-79.
158.
Moran PM, LeMaître MH, Philouze V, Reymann JM, Allain H, Leonard BE. (1992) Reversal of learning and memory impairments following lesion of the nucleus basalis magnocellularis (NBM) by concurrent noradrenergic depletion using DSP4 in the rat. Brain Res, 595(2):327-33.
159.
Neophytou SI, Aspley S, Butler S, Beckett S, Marsden CA. (2001) Effects of lesioning noradrenergic neurones in the locus coeruleus on conditioned and unconditioned aversive behaviour in the rat. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 25(6):1307-21.
160.
Netto SM, Silveira R, Coimbra NC, Joca SR, Guimarães FS. (2002) Anxiogenic effect of median raphe nucleus lesion in stressed rats. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 26(6): 1135-41.
161.
Nobin A, Björklund A. (1978) Degenerative effects of various neurotoxic indoleamines on central monoamine neurons. Ann N Y Acad Sci, 305:305-27.
162.
Nyakas C, Felszeghy K, Szabó R, Keijser JN, Luiten PG, Szombathelyi Z, Tihanyi K. (2009) Neuroprotective effects of vinpocetine and its major
metabolite
cis-apovincaminic
acid
on
NMDA-induced
neurotoxicity in a rat entorhinal cortex lesion model. CNS Neurosci Ther, 15(2):89-99. 115
163.
Nyakas C, Mulder J, Felszeghy K, Keijser JN, Mehra R, Luiten PG. (2003) Chronic excess of corticosterone increases serotonergic fibre degeneration in aged rats. J Neuroendocrinol, 15(5):498-507.
164.
Ogasawara T, Itoh Y, Tamura M, Ukai Y, Yoshikuni Y, Kimura K. (1996) NS-3, a TRH-analog, reverses memory disruption by stimulating cholinergic and noradrenergic systems. Pharmacol Biochem Behav, 53(2): 391-9.
165.
Ohashi S, Matsumoto M, Togashi H, Ueno K, Yoshioka M. (2003) The serotonergic modulation of synaptic plasticity in the rat hippocampomedial prefrontal cortex pathway. Neurosci Lett, 342(3):179-82.
166.
Olton DS. (1987) The radial arm maze as a tool in behavioral pharmacology. Physiol Behav, 40(6):793-7.
167.
Ordway GA, Stockmeier CA, Cason GW, Klimek V. (1997) Pharmacology and distribution of norepinephrine transporters in the human locus coeruleus and raphe nuclei. J Neurosci, 17(5):1710-9.
168.
Owens
MJ,
Morgan
Neurotransmitter
WN,
receptor
and
Plott
SJ,
transporter
Nemeroff binding
CB.
1997
profile
of
antidepressants and their metabolites. J Pharmacol Exp Ther, 283(3):1305-22.
169.
Ögren SO. (1985) Central serotonin neurones in avoidance learning: interactions with noradrenaline and dopamine neurones. Pharmacol Biochem Behav, 23(1):107-23.
170.
Padovan CM, Del Bel EA, Guimarães FS. (2000) Behavioral effects in the elevated plus maze of an NMDA antagonist injected into the dorsal hippocampus: influence of restraint stress. Pharmacol Biochem Behav, 67(2):325-30. 116
171.
Paris JM, Mitsushio H, Lorens SA. (1989) Intra-raphe neurokinininduced hyperactivity: effects of 5,7-dihydroxytryptamine lesions. Brain Res, 476(1):183-8.
172.
Pastalkova E, Serrano P, Pinkhasova D, Wallace E, Fenton AA, Sacktor TC. (2006) Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science, 313(5790):1141-4.
173.
Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Deluxe Fourth Edition, Academic Press, USA, 1998.
174.
Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. (1985) Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods, 14(3):149-67.
175.
Pinelli A, Trivulzio S, Tomasoni L. (1997) Effects of ondansetron administration on opioid withdrawal syndrome observed in rats. Eur J Pharmacol, 340(2-3):111-9.
176.
Piñeyro G, Blier P. (1999) Autoregulation of serotonin neurons: role in antidepressant drug action. Pharmacol Rev, 51(3):533-91.
177.
Plaznik A, Jessa M, Nazar M. (1997) The behavioral effects of NMDA antagonists in serotonin depleted rats. Pharmacol Biochem Behav, 58(1): 159-66.
178.
Ponzio F, Hallman H, Jonsson G. (1981) Noradrenaline and dopamine interaction in rat brain during development. Med Biol, 59(3):161-9.
179.
Prieto M, Giralt MT. (2001) Effects of N-(2-chloroethyl)-N-ethyl-2bromobenzylamine (DSP4) on alpha2-adrenoceptors which regulate the synthesis and release of noradrenaline in the rat brain. Pharmacol Toxicol, 88(3):152-8. 117
180.
Przybyslawski J, Roullet P, Sara SJ. (1999) Attenuation of emotional and nonemotional memories after their reactivation: role of beta adrenergic receptors. J Neurosci,19(15):6623-8.
181.
Pum ME, Huston JP, Müller CP. (2009) The role of cortical serotonin in anxiety and locomotor activity in Wistar rats. Behav Neurosci, 123(2):449-54.
182.
Raiteri L, Raiteri M, Bonanno G. (2002) Coexistence and function of different neurotransmitter transporters in the plasma membrane of CNS neurons. Prog Neurobiol, 68(4):287-309.
183.
Ramos A, Pereira E, Martins GC, Wehrmeister TD, Izídio GS. (2008) Integrating the open field, elevated plus maze and light/dark box to assess different types of emotional behaviors in one single trial. Behav Brain Res, 193(2): 277-88.
184.
Ramos A. (2008) Animal models of anxiety: do I need multiple tests? Trends Pharmacol Sci, 29(10):493-8.
185.
Rapport MM, Green AA, Page IH. (1948) Serum vasoconstrictor, serotonin; isolation and characterization. J Biol Chem, 176(3):1243-51.
186.
Ravna AW, Sylte I, Dahl SG. (2003) Molecular mechanism of citalopram and cocaine interactions with neurotransmitter transporters. J Pharmacol Exp Ther, 307(1):34-41.
187.
Rihmer Z, Purebl G. (2009) Mirtazapine-pharmacologic action and clinical advantages. Neuropsychopharmacol Hung, 11(1):35-40.
188.
Roberts AJ, Krucker T, Levy CL, Slanina KA, Sutcliffe JG, Hedlund PB. (2004) Mice lacking 5-HT receptors show specific impairments in contextual learning. Eur J Neurosci, 19(7):1913-22. 118
189.
Rodgers RJ. (1997) Animal models of 'anxiety': where next? Behav Pharmacol, 8(6-7):477-96; discussion 497-504.
190.
Romano AG, Quinn JL, Liu R, Dave KD, Schwab D, Alexander G, Aloyo VJ, Harvey JA. (2006) Effect of serotonin depletion on 5-HT2Amediated learning in the rabbit: evidence for constitutive activity of the 5-HT2A receptor in vivo. Psychopharmacology (Berl), 184: 173-181.
191.
Romero L, Jernej B, Bel N, Cicin-Sain L, Cortés R, Artigas F. (1998) Basal and stimulated extracellular serotonin concentration in the brain of rats with altered serotonin uptake. Synapse, 28(4):313-21.
192.
Ross SB. (1976) Long-term effects of N-2-chlorethyl-N-ethyl-2bromobenzylamine hydrochloride on noradrenergic neurones in the rat brain and heart. Br J Pharmacol, 58(4):521-7.
193.
Ross SB, Johansson JG, Lindborg B, Dahlbom R. (1973) Cyclizing compounds. I. Tertiary N-(2-bromobenzyl)-N-haloalkylamines with adrenergic blocking action. Acta Pharm Suec, 10(1):29-42.
194.
Roth BL, Craigo SC, Choudhary MS, Uluer A, Monsma FJ Jr, Shen Y, Meltzer HY, Sibley DR. (1994) Binding of typical and atypical antipsychotic
agents
to
5-hydroxytryptamine-6
and
5-
hydroxytryptamine-7 receptors. J Pharmacol Exp Ther, 268(3):1403-10.
195.
Rothman RB, Baumann MH. (2003) Monoamine transporters and psychostimulant drugs. Eur J Pharmacol, 479(1-3):23-40.
196.
Sahgal A. Passive avoidance procedures. In: Sahgal A. (szerk.), Behavioural neuroscience: A practical approach (Vol. 1, pp. 49-56). New York: Oxford University Press, 1993.
119
197.
Sakai N, Tanaka C. (1993) Inhibitory modulation of long-term potentiation via the 5-HT1A receptor in slices of the rat hippocampal dentate gyrus. Brain Res, 613(2):326-30.
198.
Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM, Tanaka H, Williams SC, Richardson JA, Kozlowski GP, Wilson S, Arch JR, Buckingham RE, Haynes AC, Carr SA, Annan RS, McNulty DE, Liu WS, Terrett JA, Elshourbagy NA, Bergsma DJ, Yanagisawa M. (1998) Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell, 92(4):573-85.
199.
Salomon L, Lanteri C, Glowinski J, Tassin JP. (2006) Behavioral sensitization to amphetamine results from an uncoupling between noradrenergic and serotonergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(19):7476-81.
200.
Sánchez C. (1996) 5-HT(1A) receptors play an important role in modulation of behavior of rats in a two-compartment black and white box. Behav Pharmacol, 7(8):788-797.
201.
Schmidt
CJ,
Wu
L,
Methylenedioxymethamphetamine:
Lovenberg a
W.
potentially
(1986) neurotoxic
amphetamine analogue. Eur J Pharmacol, 124(1-2):175-8.
202.
Scullion GA, Kendall DA, Sunter D, Marsden CA, Pardon MC. (2009) Central noradrenergic depletion by DSP-4 prevents stress-induced memory impairments in the object recognition task. Neuroscience, 164(2):415-23.
203.
Shimizu H, Tatsuno T, Tanaka H, Hirose A, Araki Y, Nakamura M. (1992) Serotonergic mechanisms in anxiolytic effect of tandospirone in the Vogel conflict test. Jpn J Pharmacol, 59(1): 105-12.
120
204.
Simpson KL, Altman DW, Wang L, Kirifides ML, Lin RC, Waterhouse BD. (1997) Lateralization and functional organization of the locus coeruleus projection to the trigeminal somatosensory pathway in rat. J Comp Neurol, 385(1):135-47.
205.
Sperlágh B, Vizi ES, Timár J, Kiss J, Zelles T. VI.fejezet (A központi idegrendszer gyógyszertana) 24. rész: Bevezetés a pszichotróp szerek farmakológiájába. In: Gyires K, Fürst Z (fıszerk.), Farmakológia és farmakoterápia I. Farmakológia. A gyógyszeres terápia alapjai. Medicina, Budapest, 2007: 343-359.
206.
Srinivasan J, Schmidt WJ. (2004) Functional recovery of locus coeruleus noradrenergic neurons after DSP-4 lesion: effects on dopamine levels and neuroleptic induced-parkinsonian symptoms in rats. J Neural Transm, 111(1): 13-26.
207.
Srinivasan J, Schmidt WJ. (2003) Potentiation of parkinsonian symptoms by depletion of locus coeruleus noradrenaline in 6hydroxydopamine-induced partial degeneration of substantia nigra in rats. Eur J Neurosci, 17(12):2586-92.
208.
Stanton PK, Sarvey JM. (1985) Depletion of norepinephrine, but not serotonin, reduces long-term potentiation in the dentate gyrus of rat hippocampal slices. J Neurosci, 5(8):2169-76.
209.
Stewart RM, Gerson SC, Sperk G, Campbell A, Baldessarini RJ. (1978) Biochemical, behavioral, and pharmacologic studies of the effects of dihydroxytryptamines in the rodent brain. Ann N Y Acad Sci, 305:198207.
210.
Strawn JR, Geracioti TD Jr. (2008) Noradrenergic dysfunction and the psychopharmacology of posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety, 25(3):260-71.
121
211.
Sur C, Betz H, Schloss P. (1996) Immunocytochemical detection of the serotonin transporter in rat brain. Neuroscience, 73(1):217-31.
212.
Szabo ST, Gould TD, Manji HK. Neurotransmitters, receptors, signal transduction, and second messengers in Psychiatric Disorders. In: Schatberg AF, Nemeroff CB (eds.), Textbook of Psychopharmacology. American Psychiatric Publishing, Wasinghton DC, 2004: 3-18.
213.
Szádóczky E. Kedélybetegségek és szorongásos zavarok prevalenciája Magyarországon. Print-Tech, Budapest, 2000: 15.
214.
Sziray N, Kuki Z, Nagy KM, Markó B, Kompagne H, Levay G. (2010) Effects of single and simultaneous lesions of serotonergic and noradrenergic pathways on open-space and bright-space anxiety-like behavior in two animal models. Behav Brain Res, 209(1):93-98.
215.
Sziray N, Leveleki C, Levay G, Markó B, Hársing LG Jr, Mikics E, Barsy B, Haller J. (2007) Mechanisms underlying the long-term behavioral effects of traumatic experience in rats: the role of serotonin/noradrenaline balance and NMDA receptors. Brain Res Bull, 71(4):376-85.
216.
Takao K, Miyakawa T. (2006) Light/dark transition test for mice. J Vis Exp, (1):104.
217.
Taylor HR, Freeman MK, Cates ME. (2008) Prazosin for treatment of nightmares related to posttraumatic stress disorder. Am J Health Syst Pharm,65(8):716-22.
218.
Tecott LH, Sun LM, Akana SF, Strack AM, Loweinsztein DH, Dallman MF. (1995) Eating disorder and epilepsy in mice lacking 5-HT2c serotonin receptors. Nature, 374: 542-546.
122
219.
Tejani-Butt SM, Brunswick DJ, Frazer A (1990) [3H]nisoxetine: a new radioligand for norepinephrine uptake sites in brain. Eur J Pharmacol, 191:239 –243.
220.
Thoenen H, Tranzer JP. (1968) Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-Hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch Exp Pathol Pharmakol, 261(3):271-88.
221.
Tiihonen J, Kuikka JT, Bergström KA, Karhu J, Viinamäki H, Lehtonen J, Hallikainen T, Yang J, Hakola P. (1997) Single-photon emission tomography imaging of monoamine transporters in impulsive violent behaviour. Eur J Nucl Med, 24(10):1253-60.
222.
Timár J. VI.fejezet (A központi idegrendszer gyógyszertana) 30. rész: Antipszichotikus hatású vegyületek (neuroleptikumok). In: Gyires K, Fürst Z (fıszerk.), Farmakológia és farmakoterápia I. Farmakológia. A gyógyszeres terápia alapjai. Medicina, Budapest, 2007: 444-455.
223.
Torres GE, Gainetdinov RR, Caron MG. (2003) Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nat Rev Neurosci, 4(1):13-25.
224.
Umbriaco D, Garcia S, Beaulieu C, Descarries L. (1995) Relational features of acetylcholine, noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum radiatum of adult rat hippocampus (CA1). Hippocampus, 5(6):605-20.
225.
Ventura R, Cabib S, Alcaro A, Orsini C, Puglisi-Allegra S. (2003) Norepinephrine in the prefrontal cortex is critical for amphetamineinduced reward and mesoaccumbens dopamine release. J Neurosci, 23(5):1879-85.
226.
Vizi ES, Zsilla G, Caron MG, Kiss JP. (2004) Uptake and release of norepinephrine by serotonergic terminals in norepinephrine transporter 123
knock-out mice: implications for the action of selective serotonin reuptake inhibitors. J Neurosci, 24(36):7888-94.
227.
Vizi ES, Kiss JP. (1998) Neurochemistry and pharmacology of the major hippocampal transmitter systems: synaptic and nonsynaptic interactions. Hippocampus, 8(6):566-607.
228.
Wang X, Baumann MH, Xu H, Morales M, Rothman RB.(2005) (+/-)3,4-Methylenedioxymethamphetamine administration to rats does not decrease levels of the serotonin transporter protein or alter its distribution between endosomes and the plasma membrane. J Pharmacol Exp Ther, 314(3):1002-12.
229.
Winstanley CA, Theobald DE, Dalley JW, Glennon JC, Robbins TW. (2004) 5-HT2A and 5-HT2C receptor antagonists have opposing effects on a measure of impulsivity: interactions with global 5-HT depletion. Psychopharmacology(Berl), 176: 376-385.
230.
Winters BD, Bussey TJ. (2005) Glutamate receptors in perirhinal cortex mediate encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. J Neurosci, 25(17):4243-51.
231.
Wolf H. (2000) Preclinical and clinical pharmacology of the 5-HT3 receptor antagonists. Scand J Rheumatol, 113: 37-45.
232.
Yang HW, Lin YW, Yen CD, Min MY. (2002) Change in bi-directional plasticity at CA1 synapses in hippocampal slices taken from 6hydroxydopamine-treated rats: the role of endogenous norepinephrine. Eur J Neurosci, 16(6):1117-28.
233.
Yoshioka M, Matsumoto M, Togashi H, Mori K. (1998) Central distribution and function of 5-ht6 receptor subtype in the rat brain. Ann N Y Acad Sci,861:244.
124
234.
Zagrodzka J, Wieczorek M, Romaniuk A. (1994) Social interactions in rats: behavioral and neurochemical alterations in DSP-4-treated rats. Pharmacol Biochem Behav, 49(3):541-8.
235.
Zsilla G, Zelles T, Mike A, Kékes-Szabó A, Milusheva E, Vizi ES. (1994) Differential changes in presynaptic modulation of transmitter release during aging. Int J Dev Neurosci, 12(2):107-15.
125
11. A SZERZİ PUBLIKÁCIÓINAK ÉS SZABADALMAINAK JEGYZÉKE
A disszertációhoz kapcsolódó közlemények
1.
Sziray N, Kuki Z, Nagy KM, Markó B, Kompagne H, Levay G. (2010) Effects of single and simultaneous lesions of serotonergic and noradrenergic pathways on open-space and bright-space anxiety-like behavior in two animal models. Behav Brain Res, 209(1):93-98. IF: 3,171
2.
Sziray N, Leveleki C, Levay G, Markó B, Hársing LG Jr, Mikics E, Barsy B, Haller J. (2007) Mechanisms underlying the long-term behavioral effects of traumatic experience in rats: the role of serotonin/noradrenaline balance and NMDA receptors. Brain Res Bull, 71(4):376-85. IF: 1,943
3.
Leveleki C, Sziray N, Levay G, Barsvári B, Soproni K, Mikics E, Haller J. (2006) Pharmacological evaluation of the stress-induced social avoidance model of anxiety. Brain Res Bull, 69(2):153-60. IF: 1,684
A szerzı egyéb közleményei
1.
Megyeri K, Marko B, Sziray N, Gacsalyi I, Juranyi Z, Levay G, Harsing LG Jr. (2007) Effects of 2,3-benzodiazepine AMPA receptor antagonists on dopamine turnover in the striatum of rats with experimental parkinsonism. Brain Res Bull, 71(5):501-7. IF: 1,943
2.
Juranyi Z, Sziray N, Marko B, Levay G, Harsing LG Jr. (2004) AMPA receptor blockade potentiates the stimulatory effect of L-DOPA on dopamine release in dopamine-deficient corticostriatal slice preparation. Crit Rev Neurobiol, 16(1-2):129-39. IF: Ø
3.
Harsing LG Jr, Gacsalyi I, Szabo G, Schmidt E, Sziray N, Sebban C, Tesolin-Decros B, Matyus P, Egyed A, Spedding M, Levay G. (2003) 126
The glycine transporter-1 inhibitors NFPS and Org 24461: a pharmacological study. Pharmacol Biochem Behav, 74(4):811-25. IF: 2,307
A szerzı szabadalmai
1.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Alkil-oxindolok piperazin származékai. Bejelentés száma: P0400953, (2004).
2.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Alkil-oxindolok piperazin származékai. Bejelentés száma: P0400954, (2004).
3.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Dialkil-oxindolok piridin származékai. Bejelentés száma: P0400955, (2004).
4.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Alkil-oxindolok piridin származékai. Bejelentés száma: P0400956, (2004).
5.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Dialkil-oxindolok piperazin származékai. Bejelentés száma: P0400957, (2004).
6.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray,
127
N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Alkil-oxindolok piperazin származékai. Bejelentés száma: P0500461, (2005).
7.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Alkil-oxindolok piridin származékai. Bejelentés száma: P0500462, (2005).
8.
Volk, B., Barkóczy, J., Simig, Gy., Mezei, T., Dezsıfi, R., Gacsályi, I., Pallagi, K., Gigler, G., Lévay, Gy., Móricz, K., Leveleki, Cs., Sziray, N., Szénási, G., Egyed, A., Hársing, L.G.: Dialkil-oxindolok piridin származékai. Bejelentés száma: P0500463, (2005).
128
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönettel tartozom mindenekelıtt témavezetımnek, Dr. Lévay Györgynek, aki lehetıséget biztosított arra, hogy vezetésével végezhessem az értekezéssel kapcsolatos teendıimet. İ ajánlotta ezt a kutatási témát, és segítségemre volt újabb kísérletek felvetésével, illetve bátorításával mikor elakadtam a munkafolyamatban. Rendszeres, kitartó számonkérése ösztönzıleg hatott a dolgozat megírásában. Hálás vagyok Dr. Hársing Lászlónak, akinek igazgatóhelyettesi vezetése alatt győlt össze az anyag az értekezéshez. Hársing Dr. adott lehetıséget arra, hogy Pittsburghben elsajátíthassam a viselkedésfarmakológiától merıben más szelet-technikákat, és az EGIS-ben is biztosította a szükséges kísérletek elvégzésének lehetıségét, kedvességével és szakmai tanácsaival támogatva. Köszönöm továbbá osztályvezetımnek, Dr. Gacsályi Istvánnak, hogy segítségével össze tudtam egyeztetni a napi rutin feladatokat és a sokszor a gyári kutatástól merıben eltérı, alapkutatás-jellegő kísérleteket. Segítıkész hozzáállása, szakmai tanácsai nélkül nem jöhetett volna létre ez a dolgozat. Hálával tartozom csoportvezetımnek, Dr. Megyeri Katalinnak, aki nagy segítségemre volt a léziós technikák kidolgozásában, és jóval nagyobb szakmai tapasztalata ellenére mindig egyenrangú partnerként kezelt. Dr. Haller Józseffel közös kísérletsorozatunk eredményeként cikk született, köszönettel tartozom neki a megírásban nyújtott segítségéért,
precizitásáért.
Köszönöm
továbbá
munkatársaimnak,
Kompagne
Hajnalkának és Leveleki Csillának a kísérletek elvégzésében és értékelésében, valamint Dr. Móricz Krisztinának, Gigler Gábornak, Dr. Kapus Gábornak és Dr. Jurányi Zsoltnak az eredmények értelmezésében való közremőködésüket, segítı kritikájukat. Köszönöm Dr. Albert Mihálynak a szövettani ellenırzéseket, Dr. Dinya Eleknek a statisztikai tanácsokat, Markó Bernadettnek és Nagy Katalinnak pedig mintáim precíz HPLC-analízisét. Katának külön köszönet barátságááért és szobatársként állandó bátorításáért, rossz hangulataim elviseléséért- ezek miatt Nagyné Gyönös Ildikónak, másik szobatársamnak is nagyon hálás vagyok. Kuki Zsófia és Dr. Varga Péter a mőtétek elvégzésében nyújtott sok segítséget. Köszönet illeti a Preklinikai Kutatási Fıosztály asszisztenseit, szeretném kiemelni Klementné Korona Erika és Hajdúné Gısi Erika felbecsülhetetlen értékő, magas színvonalú segítségét, észrevételeit. Gaál Attila és Dr. Ágoston Márta az ábrák és fényképek elkészítésében segített. Végül hálás vagyok férjemnek és kisfiamnak, valamint szüleimnek és testvéremnek, hogy elviselték megosztott figyelmemet, és végig támaszaim voltak a dolgozat megszületése közben. 129
