1
Kode/Nama Rumpun Ilmu: 112/Kimia Tema : Kesehatan
LAPORAN TAHUNAN PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis Secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode Tahun ke-1 dari rencana 2 tahun
Ketua Peneliti Dr. Yeni Wahyuni Hartati (NIDN: 0024097101) Anggota Peneliti Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. (NIDN: 0025047105) Santhy Wyantuti, S.Si. M.Si (NIDN: 0026107301)
UNIVERSITAS PADJADJARAN Oktober 2014
2
3
RINGKASAN
Biosensor adalah suatu alat yang menggabungkan lapisan senyawa biologi ke dalam sinyal yang dapat diukur secara analitik. Suatu biosensor DNA (atau genosensor) menggunakan suatu DNA yang diamobilisasi sebagai elemen yang dikenal (probe). Biosensor secara elektrokimia mengandalkan konversi pengenalan pasangan basa ke dalam suatu signal elektrik. Kelompok penelitian kami telah berhasil mengembangkan metode biosensor DNA secara voltammetri untuk menentukan beberapa urutan spesifik DNA Pada penelitian ini kami melakukan pengembangan teknologi biosensing ini untuk mendeteksi patogenik Mycobacterium tuberculosis, penginfeksi penyakit tuberkulosis (TB), menggunakan elektrode emas termodifikasi. Dalam penelitian ini telah dilakukan isolasi DNA dan PCR terhadap isolat, disain DNA probe dari gen insersi IS6110 M. tuberculosis, studi modifikasi elektrode emas secara self assembly monolayer menggunakan senyawa thiol dan karakterisasinya secara elektrokimia. Reaksi hibridisasi pada permukaan elektrode diamati dari sinyal guanin pada potensial +0,21 V. Nilai sensitivitas yang diperoleh sebesar 0,52, dan batas deteksi 3,47 µg mL-1.
4
PRAKATA
Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya kepada kami tim peneliti untuk melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan Laporan Akhir Tahun ke-1 Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi tahun 2014 yang berjudul ‖Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis Secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode‖. Pada kesempatan ini perkenankanlah peneliti mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas dana yang telah disediakan sehingga penelitian ini dapat terlaksana. 2. Universitas Padjadjaran dan Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Unpad atas pengelolaan administrasi yang baik bagi proyek penelitian ini. 3. Dekan Fakultas MIPA, Ketua Jurusan Kimia, serta kepala Laboratorium Penelitian Jurusan Kimia, yang telah menyediakan fasilitas bagi peneliti untuk melaksanakan penelitian ini. 4. Semua pihak yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian ini. Akhir kata dengan penuh harapan dan rasa optimis, mudah-mudahan hasil penelitian ini dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan di bidang kimia analitik khususnya dalam kajian biosensor DNA secara elektrokimia.
Bandung, Oktober 2014
Penulis
5
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL .......................................................................................... 1 HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ 2 RINGKASAN ......................................................................................................... 3 PRAKATA .............................................................................................................. 4 DAFTAR ISI .......................................................................................................... 5 DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. 6 DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... 7 BAB 1. PENDAHULUAN .................................................................................... 8 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 10 BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ............................................ 20 BAB 4. METODE PENELITIAN ......................................................................... 22 BAB 5. HASIL YANG DICAPAI ........................................................................
27
BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA ...............................................
31
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................................
32
DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................
33
LAMPIRAN
6
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1
Gambar SEM M.tuberculosis, Mag 15549X. CDC (Todar, 2013) ................11
Gambar 2.2 Skema umum biosensor DNA. DNA target ditangkap pada lapisan pengenalan dan menghasilkan sinyal hibridisasi yang ditransduksi ke dalam sinyal listrik yang berguna untuk pembacaan dan analisis (Drummond et al., 2003) ............13 Gambar 2.3. Skema tahap analisis lucutan adsorptif DNA. Tahap pertama: adsorpsi/akumulasi asam nukleat pada permukaan elektrode, tahap kedua: pelucutan secara elektrokimia asam nukleat yang terakumulasi (Rivas et al., 2005)…………...15 Gambar 2.4 Beberapa strategi pendekatan amobilisasi oligonukleotida sebagai probe untuk pengembangan biosensor hibridisasi berdasarkan DNA ...................................16 Gambar 2.5 Elektrode screen printed ....................................................................................17 Gambar 4.1 Bagan alir penelitian ..........................................................................................19 Gambar 5.1 Isolat DNA ............................................................................ ............................20 Gambar 5.2 Elektroforegram hasil PCR .................................................................................21 Gambar 5.3 Urutan DNA probe dipilih dalam amplikon PCR 192 pb gen M. tuberculosis ...................................................................................................26 Gambar 5.4 Elektrode emas..................................................................................................27 Gambar 5.5. Formation of the thiol-based monolayer ongold surface for DNA immobilization and hybridization (Silva et al., 2010)......................................28 Gambar 5.6. Voltammogram siklis. Keterangan: merah dan biru : Au bare, , orange : Au- modifikasi (cysteamin – glutaraldehid)…………………………………..29 Gambar 5.7. Voltamogram pulsa diferensial larutan blanko, ssDNA probe, ssDNA target,hibridisasi ssDNA probe- ssDNA target, pada Au - SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1………………………………………………………….30 Gambar 5.8. Voltammogram DPV sinyal guanin menggunakan Au – SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. (a) Au - SAM (b) Au - SAM - ssDNA probe- non DNA komplementer; (c) Au - SAM - ssDNA probe- komplementer ssDNA. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1........31
7
Gambar 5.9. Kalibrasi arus puncak vs konsentrasi ssDNA target. Digunakan konsentrasi ssDNA Target 0, 5, 10, 15, 20 μgmL-1 secara DPV dengan Au - SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1, (n=3)............................................................32 Gambar 5.10. Voltammogram DPV variasi konsentrasi DNA target pada Au – SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1……………………………....33
8
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Evaluasi Capaian Luaran Kegiatan ...................................................................40 Lampiran 2. Foto-foto Kegiatan ..........................................................................................42 Lampiran 3. Biodata Personalia Penelitianbiodata Ketua Dan Anggota Peneliti…………...43 Lampiran 4. Seminar/Publikasi……………………………………………………………..58
9
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) adalah bakteri patogenik
yang
menyebabkan penyakit penyakit tuberculosis (TB) – salah satu yang dapat menyebabkan kematian dari penyakit infeksi. Akhir-akhir ini sekitar satu dari tiga populasi manusia terinfeksi TB yang mendunia. Infeksi TB merupakan masalah kesehatan masyarakat yang serius karena dapat bersamaan/bergabung dengan komplikasi infeksi sindrom defisiensi imun. Diagnosis dan penanganan yang cepat dari infektor merupakan hal yang penting untuk pengendalian yang efektif penyakit ini, karena satu pasien diketahui dapat menularkan penyakit terhadap ratarata12-15 orang per tahun melalui infeksi pernafasan (WHO, 2004). Treat Asia Report (2009) menyatakan Indonesia merupakan negara dengan tingkat penderita TB terbanyak ketiga setelah India dan Cina, dengan setengah juta kasus. Dalam pengelolaan kasus TB, selain diperlukan metode pengobatan yang tepat dan penemuan obat baru yang mencegah terjadinya resistensi juga diperlukan metode diagnostik yang akurat, tepat dan cepat. Pendeteksian yang sensitif terhadap M. tuberculosis meliputi diagnosis klinis, analisis air dan lingkungan, makanan dan biodefense menjadi hal yang sangat penting. Selanjutnya menjadi sangat penting untuk proteksi kesehatan masyarakat untuk mendeteksi, mengidentifikasi, dan mengkuantitasi M. tuberculosis. Metodologi pengujian yang paling umum adalah berbasis kultur mikroba (Torres-Chavolla and Alocilja, 2009). Biasanya metode ini meliputi kultur sel, penghitungan sel, pengayaan sel, membutuhkan waktu yang relatif lama terutama untuk bakteri yang pertumbuhannnya lambat seperti M.tuberculosis. Oleh sebab itu, metode yang lebih cepat dan sensitif terus dikembangkan untuk pendeteksian TB. Hingga saat ini, beberapa metode telah dikembangkan untuk deteksi M.tuberculosis yang cepat, di antaranya polymerase chain reaction (PCR) (Thomson et al, 2005; Choi et al, 1996; Durmaz et al, 1997), aglutinasi lateks (Krambovitis et al, 1984), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Tamminen et al, 2004; Nassau et al, 1976; Delacourt et al, 1993), deteksi radiometrik (Middlebrook et al, 1977), genprobe amplified M. Tuberculosis direct test (AMTDT) (Gamboa et al, 1997), TB rapid cultivation detection technique, seperti MB/Bact system, BactecMGIT 960 system (Liu et al, 2001; Cambau et al, 1999) dan flowcitometri (Qin et al, 2008). Metodemetode tersebut lebih sensitif dan cepat dibanding metode kultur bakteri, akan tetapi kebanyakan metode tersebut memerlukan instrumen laboratorium yang kompleks dan keahlian staf yang
10
kualifikasinya tinggi. Oleh karena itu telah dikembangkan pula metode biosensing untuk pendeteksian M. tuberculosis sehingga dapat efektif untuk pencegahan infeksi TB (Griffiths and Hall, 1993; Owen, 1994), dengan spektrum matriks analit yang kompleks (saliva, serum, dan urin) (Turner, 1986). Berdasarkan penemuan terbaru dan pengetahuan mendalam mengenai gen spesifik pada Mycobacterium tuberculosis, dikembangkan berbagai sistem amplifikasi gen dan gen probe yang dapat digunakan sebagai konfirmasi identitas isolat, deteksi langsung spesimen klinis berdasarkan urutan gen spesifik, dan juga deteksi molekular terhadap resistensi obat. Salah satu metode diagnostik Mycobacterium tuberculosis yang paling luas digunakan adalah deteksi terhadap insersi IS 6110. Kelompok penelitian kami telah mengembangkan biosensor berbasis DNA menggunakan elektrode berbasis grafit untuk kuantitasi mutasi DNA (Hartati dkk., 2009) dan pendeteksian bakteri patogen S. typhi dalam sampel darah. Dalam penelitian ini telah dikembangkan pengembangan biosensor berbasis DNA ini untuk mendeteksi M. tuberculosis dalam gen insersi IS6110 menggunakan elektrode baik berbasis logam yaitu emas yang dimodifikasi, untuk mendapatkan sensitivitas yang lebih baik. Selain itu akan dicoba menggunakan screen printed carbon electrode (SPCE) sehingga dapat dirancang atau diaplikasikan menjadi suatu ‗kit‘ atau ‗lab on chip‘ yang sederhana. 1.2 Tujuan Khusus Tujuan khusus dalam penelitian tahun ke-1 ini adalah untuk menghasilkan teknologi biosensing berdasarkan urutan spesifik DNA M. tubercolusis secara elektrokimia, menggunakan elektrode berbasis logam yang dimodifikasi, sehingga dapat diperoleh suatu metode pendeteksian yang cepat, akurat, dan sensitif
terhadap bakteri patogen tersebut. Studi
penggunaan SPCE akan dicoba juga untuk memperoleh suatu kit yang sederhana, untuk tahun ke-2. 1.3 Luaran yang ditargetkan a. Pada tahun pertama diharapkan mendapatkan kondisi yang cocok untuk analisis menggunakan biosensor, dimulai dari preparasi sampel bakteri, amplifikasi, pemilihan elektrode dan studi modifikasinya, serta pengujian parameter-parameter analitiknya.
11
b. Pada tahun kedua diharapkan apat dikembangkan terhadap pembuatan lab on chip, sehingga dihasilkan suatu kit biosensor DNA untuk deteksi M tuberculosis. Hasil penelitian ini akan dipublikasikan pada jurnal internasional atau jurnal nasional terakreditasi.
12
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri M. tubercolusis Bakteri Mycobacterium tuberculosis adalah patogenik penyebab penyakit Tuberkulosis atau TB. Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo Actinomycetales. kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M. tuberculosis merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai. M.tuberculosis berbentuk batang, berukuran panjang 5µ dan lebar 3µ (Gambar 2.1), tidak membentuk spora, dan termasuk bakteri aerob. Mycobacteria dapat diberi pewarnaan seperti bakteri lainnya, misalnya dengan Pewarnaan Gram. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan, suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga (Todar, 2013).
Gambar 2.1 Gambar SEM M.tuberculosis, Mag 15549X. CDC (Todar, 2013).
13
Pada tahun 1992 WHO telah mencanangkan penyakit tuberkulosis sebagai Global Emergency. Laporan WHO tahun 2004 menyatakan bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru tuberkulosis pada tahun 2002, sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan menurut regional WHO jumlah terbesar kasus ini terjadi di Asia Tenggara yaitu 33% dari seluruh kasus di dunia. Indonesia berada dalam peringkat ketiga terburuk di dunia untuk jumlah penderita TB. Setiap tahun muncul 500 ribu kasus baru dan lebih dari 140 ribu lainnya meninggal. Seratus tahun yang lalu, satu dari lima kematian di Amerika Serikat disebabkan oleh tuberkulosis. Tuberkulosis masih merupakan penyakit infeksi saluran napas yang tersering di Indonesia. Keterlambatan dalam menegakkan diagnosa dan ketidakpatuhan dalam menjalani pengobatan mempunyai dampak yang besar karena pasien Tuberkulosis akan menularkan penyakitnya pada lingkungan,sehingga jumlah penderita semakin bertambah. Pengobatan Tuberkulosis berlangsung cukup lama yaitu setidaknya 6 bulan pengobatan dan selanjutnya dievaluasi oleh dokter apakah perlu dilanjutkan atau berhenti, karena pengobatan yang cukup lama seringkali membuat pasien putus berobat atau menjalankan pengobatan secara tidak teratur, kedua hal ini ini fatal akibatnya yaitu pengobatan tidak berhasil dan kuman menjadi kebal disebut MDR (multi drugs resistance), kasus ini memerlukan biaya berlipat dan lebih sulit dalam pengobatannya sehingga diharapkan pasien disiplin dalam berobat setiap waktu demi pengentasan tuberkulosis di Indonesia (Wikipedia, 2013). 2.2 Biosensor DNA Sensor kimia adalah suatu piranti yang dapat mentransformasi informasi kimia ke dalam suatu sinyal analitik yang dapat diukur. Sensor kimia biasanya terdiri dari dua komponen dasar yang dihubungkan secara berurutan: suatu sistem pengenal kimia dan transduser fisika. Biosensor adalah sensor kimia di mana sistem pengenalannya memanfaatkan mekanisme reaksi biokimia (Turner et al., 1987). Biosensor mengombinasikan spesifisitas mekanisme pengenalan secara biologi dengan teknik transduksi fisika, yang dapat berdasarkan pada prinsip sensing elektrokimia, mekanika, termal, atau optis. Peranan penting sensor adalah memiliki cetakan yang cocok yang mampu memfasilitasi pembentukan kompleks probe-target dalam cara tertentu hingga peristiwa pengikatan dapat menghasilkan sinyal untuk pembacaan pada perangkat elektroniknya.
14
Perangkat biosensor paling tidak harus mengandung molekul yang memungkinkan terjadinya pertemuan antarpermukaan, dan suatu transduser sinyal kontinu yang berbanding lurus dengan jumlah molekul yang terikat atau bereaksi pada permukaan sensor, yang dapat dihubungkan dengan alat pembacaan. DNA pada khususnya cocok untuk aplikasi biosensor ini, karena interaksi pasangan basa di antara urutan komplementernya yang spesifik dan kuat (Drummond et al., 2003, Ulker, 2005). Suatu ssDNA diamobilisasi pada permukaan lapisan transduser, selanjutnya akan terjadi interaksi pasangan basa dengan DNA target pada permukaannya (hibridisasi). Bagaimana proses hibridisasi ini dilaporkan atau dianalisis akhirnya bergantung pada metode transduksi sinyal yang digunakan apakah melalui optis, mekanis, atau elektrokimia. Amobilisasi probe pada permukaan dapat dilakukan secara pengikatan kovalen maupun nonkovalen. Macam-macam pengikatan probe secara kovalen telah banyak dikembangkan pada permukaan elektrode emas (Kelley et al., 1998). Gaya adsorpsi (Wang et al., 1997; Wang et al., 1998), interaksi hidrofobik basa-basa dengan permukaan raksa (Cai et al., 1997), pengikatan elektrostatis DNA dengan permukaan positif elektrode karbon (Wang et al., 1996; Wang et al., 1997) adalah beberapa metode yang digunakan untuk pengikatan probe nonkovalen. Terjadinya hibridisasi dapat dideteksi menggunakan indikator redoks yang berinteraksi dengan dsDNA, seperti suatu interkalator dan pengikatan dalam minor-groove (Hashimoto et al., 1994) atau yang berikatan kovalen dengan DNA (Ihara et al., 1997), atau secara langsung mengukur sinyal oksidasi guanin yang terdapat dalam struktur DNA (label-free electrochemical detection) (Kara et al., 2002; Napier et al., 1997). Model amobilisasi pada permukaan transduser dalam biosensor dan hibridisasinya dengan urutan DNA target ditunjukkan pada Gambar 2.3 berikut:
15
Gambar 2.2 Skema umum biosensor DNA. DNA target ditangkap pada lapisan pengenalan dan menghasilkan sinyal hibridisasi yang ditransduksi ke dalam sinyal listrik yang berguna untuk pembacaan dan analisis (Drummond et al., 2003). Biosensor DNA secara Elektrokimia Dalam biosensor DNA elektrokimia, suatu urutan pendek (20-40 mer) oligonukleotida sintetis (probe) diamobilisasi pada permukaan elektrode untuk membuat lapisan pengenal. Elektrode yang mengandung probe teramobilisasi kemudian dicelupkan ke dalam suatu larutan sampel hasil amplifikasi PCR yang mengandung oligonukleotida target yang akan diuji. Ketika urutan target berpasangan secara tepat dengan probe, terbentuk hibrid pada permukaan elektrode. Terjadinya hibridisasi spesifik antara DNA probe dan target komplementernya dideteksi menggunakan transduser elektrokimia di bawah kondisi pH, kekuatan ion, dan temperatur tertentu (Thevenot et al., 1999). Beberapa teknik elektrokimia sebagai teknik yang cocok dalam pendeteksian hibridisasi dan adanya kerusakan DNA telah banyak dipublikasikan. Hibridisasi dapat dideteksi dengan kompleks logam aktif-redoks yang berasosiasi secara selektif dan reversibel dengan DNA rantai ganda yang diamobilisasi. Metode elektrokimia cocok digunakan untuk diagnosis berdasarkan DNA. Karena reaksi elektrokimia memberikan sinyal listrik langsung, di sini tidak dibutuhkan peralatan transduksi sinyalnya. Lebih jauh, karena urutan DNA probe dapat teramobilisasi dengan cepat untuk bermacam-macam substrat elektrodenya, pendeteksian dapat dihasilkan dengan penganalisis elektrokimia yang tidak mahal. Tentu saja, sistem portabel untuk pengujian klinis dan pendeteksian lingkungan saat ini sedang dikembangkan. Strategi sinyal elektrokimia yang sensitif ini, didasarkan pada proses oksidasi basa DNA baik secara langsung ataupun
16
katalitik, yang diikatkan pada permukaan elektrode oleh interaksi spesifik DNA probe-target dan maupun dengan reaksi transfer muatan yang dimediakan oleh pasangan basa DNA (Drummond et al., 2003). Berbagai teknik elektrokimia dapat dikembangkan sebagai proses transduksi, untuk mendeteksi terjadinya hibridisasi. Pada tahun 1980-an, teknik lucutan (stripping) dalam elektrokimia telah didemonstrasikan untuk penentuan logam-logam, yang selanjutnya diterapkan juga untuk analisis asam nukleat (Palecek, 2002). Skema tahapan analisis stripping ini ditunjukkan pada Gambar 2.4. Tahap pertama dari teknik lucutan terdiri dari prakonsentrasi asam nukleat dengan cara adsorpsi pada permukaan elektrode. Tahap kedua adalah berdasarkan penentuan elektrokimia (oksidasi dan reduksi) asam nukleat yang diprakonsentrasi. Tahap ini dilakukan dalam larutan mengandung elektrolit yang bebas asam nukleat dengan sebelumnya dilakukan pembilasan elektrode dengan larutan bufer untuk menghilangkan molekul yang teradsorpsi lemah atau nonadsorpsi. Teknik ini disebut lucutan adsorptif. Peningkatan sensitivitas yang tinggi diperoleh dari konsekuensi prakonsentrasi asam nukleat selama tahap adsorpsi, menghasilkan peningkatan besar dalam limit deteksi (atau mempertinggi sensitivitas), suatu parameter yang diperlukan dalam kuantifikasi DNA (Rivas et al., 2005).
Gambar 2.3
Skema tahap analisis lucutan adsorptif DNA. Tahap pertama: adsorpsi/akumulasi asam nukleat pada permukaan elektrode, tahap kedua: pelucutan secara elektrokimia asam nukleat yang terakumulasi (Rivas et al., 2005).
Kelompok Palecek (Jelen et al., 1997) mendemonstrasikan untuk pertama kali penggunaan teknik voltammetri lucutan adsorptif untuk mendeteksi kerusakan DNA yang diinduksi oleh deaminasi dan depurinasi DNA. Wang et al. (1995) mendemonstrasikan keuntungan menggunakan teknik analisis lucutan kronopotensiometri arus konstan untuk mempelajari oksidasi asam nukleat, pertama pada elektrode karbon dan selanjutnya pada elektrode raksa (Palecek et al., 1997; Wang et al., 1997). Penggunaan software khusus memungkinkan untuk
17
memperoleh sinyal turunan (dt/dE vs E) sebagai sinyal analitik sebagai pengganti aslinya (E vs t), untuk meningkatkan sensitivitas. Penggunaan koreksi mode baseline yang menyimpang juga memungkinkan untuk memperoleh puncak yang sangat baik bahkan untuk proses yang mendekati oksidasi pelarut dan sinyal voltammetri yang kurang baik. Modifikasi elektrode banyak dilakukan untuk meningkatkan sensitivitas pengukuran dalam beberapa pengembangan biosensor, termasuk biosensor DNA. Beberapa teknik modifikasi elektrode dikaitkan dengan kepentingan amobilisasi DNA probe sebagai pengenal urutan DNA pasangannya, ditunjukkan pada Gambar 2.4. Elektrode grafit screen-printed (Gambar 2.5) juga telah digunakan untuk mengakumulasi asam nukleat dan perilakunya mirip dengan yang diamati pada elektrode pasta karbon (Wang et al., 1996; Marrazza et al., 1999).
Gambar 2.4 Beberapa strategi pendekatan amobilisasi oligonukleotida sebagai probe untuk pengembangan biosensor hibridisasi berdasarkan DNA. A. Self-assembling pada oligonukleotida bertiolasi atau oligonukleotida reguler pada permukaan emas; B. Amobilisasi oligonukleotida terbiotinilasi pada permukaan yang dimodifikasi avidin; C. Ikatan kovalen oligonukleotida pada permukaan derivatisasi; D. Akumulasi adsortif oligonukleotida pada permukaan elektrode; E. Amobilisasi melalui matriks polimer (Rivas et al., 2005).
18
Gambar 2.5 Elektrode screen printed
2.3 Peta Jalan Penelitian
TAHUN 1
TAHUN 2
• Isolasi DNA kultur bakteri M. tuberculosis •Disain urutan DNA probe •PCR •Preparasi dan karakterisasi elektrode •Penentuan parameter analitk
•Perbandingan dengan metode lain (elektroforesis) •Pengujian elektrode SPCE •Disain kit/miniatur biosensor DNA •Pengujian parameter analitik
Teknologi biosensing DNA untuk deteksi M.tuberculosis
19
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1 Tujuan Khusus Penelitian 1). Pengembangan metode analisis yang cocok untuk penggunaan rutin untuk pendeteksian bakteri patogen M.tuberculosis dalam sampel darah dengan lebih cepat dan ekonomis, juga mengeliminasi teknik elektroforesis yang menggunakan bahan berbahaya (karsinogenik). 2). Menstandarisasi dan membandingkannya dengan metode lain seperti elektroforesis atau serologi, memvalidasi metode. 3). Mengembangkan teknologi lab on chip.
3.2 Urgensi (keutamaan) Penelitian Indonesia, sebagai salah satu negara yang sedang ber-kembang, mempunyai berbagai macam masalah kesehatan, antara lain penyakit-penyakit infeksi yang mengenai jaringan paruparu yang disebabkan oleh M.tuberculosis. Penyakit Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit tertua yang pernah dialami manusia dan masih menjadi salah satu penyakit menular pembunuh terbesar didunia, meskipun telah ditemukan vaksin dan antibiotik. Karena itu penemuan vaksin dan obat baru menjadi sangat penting untuk mencegah epidemi TB yang dapat membunuh dua juta orang setiap tahun di seluruh dunia. Secara rasional, untuk mengembangkan agen anti-TB baru, menjadi penting untuk mempelajari genetika dan fisiologi Mycobacterium tuberculosis dan mikobakteria terkait. Sama pentingnya juga untuk memahami interaksi inang dengan M. tuberculosis
untuk mempelajari bagaimana interaksi bakteri ini menghindari
pertahanan tubuh dan kemudian dapat menyebabkan penyakit. Beberapa studi mengidentifikasi bahwa beberapa gen M. tuberculosis paling berpotensi sebagai penyebab virulensi. Dengan mempelajari beberapa gen dan protein yang dikode oleh gen tersebut dapat memberikan target baru untuk pengembangan vaksin dan obat baru, serta pengembangan metode diagnostik yang lebih sensitif (Smith, 2003). Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang dikembangkan oleh kelompok biosensor elektrokimia Jurusan Kimia Unpad. Dalam rangka pengembangan biosensor elektrokimia untuk uji-uji berbasis interaksi basa-basa komplementer DNA, maka dibutuhkan
20
urutan DNA probe yang sangat spesifik agar hanya mengenali urutan target yang dikehendaki. Disain urutan DNA probe ini dirancang sedemikian rupa agar tidak menempel dengan urutan DNA yang lain, sehingga diuji selektivitasnya menggunakan urutan-urutan yang lain. Biosensor ini dapat menggunakan elektrode grafit/emas, untuk deteksi penyakit infeksi. Elektrodeelektrode itu dimodifikasi untuk mendapatkan sensitivitas yang tinggi. Deteksi dini bahkan sebelum antibodi dalam tubuh banyak terbentuk dapat terdeteksi dari urutan penginfeksi. Pengembangan metode biosensor berbasis interaksi urutan basa DNA meliputi pemilihan elektrode yang cocok, pemilihan metode untuk ammobilisasi DNA probe ke elektrode dan metode pendeteksiannya. Metode-metode ini perlu dikaji dan diuji supaya bisa diaplikasikan ke sampel nyata.
21
BAB 4. METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.1. Untuk mencapai tujuan penelitian, maka rangkaian penelitian meliputi enam tahap yang dibagi dalam dua tahun penelitian. Penelitian Tahun ke-1 1. Isolasi DNA, PCR 2. Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode: amobilisasi DNA probe dan hibridisasi probe- target. 3. Standarisasi biosensor DNA. Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium penelitian Jurusan Kimia FMIPA Unpad. Penelitian Tahun ke-2 4. Studi aplikasi SPCE. 5. Standarisasi biosensor dengan SPCE untuk tujuan pembuatan kit biosensor DNA. 6. Aplikasi biosensor terhadap sampel nyata. Penelitian akan dilakukan di Laboratorium penelitian Jurusan Kimia FMIPA Unpad.
Luaran per Tahun Hasil penelitian tahun pertama diharapkan dapat menghasilkan standarisasi metode biosensor DNA untuk deteksi M.tuberculosis, dan artikel ilmiah yang dapat dipublikasikan di jurnal nasional. Luaran tahun kedua diharapkan dihasilkan metode dan kit pengujian biosensor DNA yang teruji untuk deteksi M.tuberculosis, dan artikel ilmiah yang dapat dipublikasikan di jurnal internasional.
22
4.2 Diagram Alir Penelitian Modifikasi Elektrode Tahun ke-1 Perancangan urutan DNA probe, di dan standarisasi biosensor DNA, Persiapan sampel dan penerapan metode PCR-biosensor DNA terhadap M.tuberculosis
-
Studi amobilisasi DNA probe pada permukaan elektrode Hibridisasikan dengan urutan DNA target standar Studi sinyal guanin probe-target Studi selektivitas
Kinerja elektrode yang dioptimasi: batas deteksi, linieritas, keterulangan, akurasi
Kultur M.tuberculosis -
Lisis, isolasi DNA PCR
Amplikon PCR -
Hibridisasi probe- amplikon PCR Analisis data
Metode biosensor DNA M.tuberculosis
Tahun Ke-2 Studi aplikasi SPCE, standarisasi untuk tujuan pembuatan kit biosensor, aplikasi terhadap sampel nyata
Aplikasi menggunakan SPCE
-
Aplikasi terhadap standar Aplikasi terhadap sampel nyata Standarisasi metode Uji statistik
Kit biosensor DNA teruji untuk M.tuberculosis Gambar 4.1. Bagan rencana penelitian
23
Indikator Capaian yang Terukur Indikator capaian yang terukur adalah data yang diperoleh serta analisisnya, pelaksanaan seminar, dan publikasi.
4.3 Metode Penelitian Bahan Penelitian Bahan Kimia Oligonukleotida sintetis 23-mer (target dan probe komplemennya). Probe tersubstitusi inosin mengikuti urutan target. Semua larutan stok DNA (100 mg/L) dibuat dengan air steril deionisasi, dan dijaga tetap dingin. Larutan probe yang lebih encer dibuat menggunakan bufer asetat 0,50 M yang mengandung: 20 mM NaCl, pH 4.80 (ABS). Larutan target yang lebih encer akan dibuat menggunakan bufer fosfat 50 mM yang mengandung 20 mM NaCl, pH 7,4 (PBS). Dua pasang primer M.tuberculosis, Reagen lisis, Taq polimerase, dll. Bahan kimia lain dengan grade analitik.
Tahapan Penelitian Penelitian terdiri dari 4 tahap, yaitu : 1). Persiapan sampel dan penerapan metode PCR-biosensor DNA terhadap sampel. Penyiapan sampel bakteri M.tuberculosis dilakukan isolasi DNA genomik dari biakan M.tuberculosis menggunakan reagen lisis sel. Untuk sampel darah meliputi pemisahan plasma dan sel darah merah, dilanjutkan dengan lisis sel menggunakan reagen lisis untuk mengisolasi DNA. Penerapan metode PCR-biosensor DNA dilakukan seperti terhadap senyawa standar, akan tetapi produk PCR harus didenaturasi beberapa detik sebelum dihibridisasikan dengan DNA probe. Isolasi DNA a. Isolasi DNA dari kultur cair Bakteri M. tuberculosis ditumbuhkan dalam media cair Sauton 5 mL pada 37°C selama 4 minggu, kemudian dilakukan sentrifugasi pada 10.000 x g selama 10 menit, diambil pelet selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
24
b. Isolasi DNA dari sampel sputum dan cairan pleura Sebanyak 200 μL sampel didekontaminasi dengan metode N-asetil L-Sistein (NALC)NaOH, dilanjutkan dengan setrifugasi pada 8.000 rpm selama 15 menit, diambil pelet selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
PCR dan Elektroforesis PCR dilakukan dengan menggunakan FastStart PCR 2x Master Mix Roche, dengan menambahkan air bebas nuclease, primer spesifik dan hasil isolat DNA. Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah : F:GAACTGGGCTTCGACATGAT (20bp) R:ATCAGGTGGGCTACCAAATG (20bp) Primer ini mengamplifikasi urutan insersi pada gen IS6110 (Bhacmann et al, 2008; Raza et al., 2009). Kondisi PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi pada 95ºC selama 5 menit, diikuti oleh 35 siklus denaturasi pada 95ºC selama 1 menit, annealing pada 55ºC selama 1 menit, dan perpanjangan pada 72ºC selama 1 menit, dan terakhir perpanjangan akhir pada 72ºC selama 10 menit. Elektroforesis dilakukan dengan agarosa 1.5%, Sybergreen staining, buffer TAE (tris, asetat, EDTA) dan dijalankan pada 80 Volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi diatas UN transiluminator.
3). Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode: amobilisasi DNA probe dan hibridisasi probe- target. Dengan menggunakan software DNA star, urutan DNA probe dirancang pada daerah gen insersi IS6110 spesifik M.tuberculosis.
4). Modifikasi elektrode emas-thiol dengan metode self assembly monolayer, dan studi voltammetri. a.
Pretreatment dan Modifikasi Elektrode Emas Elektrode emas digosok dengan alumina slurry pada microcloth selama 5 menit, dibilas
dengan akuabides lalu disonikasi dalam etanol dan air masing-masing selama 2 menit. Setelah dibersihkan, elektrode emas direndam dalam larutan piranha (H2SO4/H2O2, 1:3, v/v) selama 10 menit pada suhu ruang. Elektrode emas dicelupkan ke dalam larutan 0,1 M buffer fosfat pH 7,0,
25
kemudian diberi potensial 0,2 - 1,5 V sebanyak 10 siklus pada laju pemindaian 50 mV.s-1. Setelah itu elektrode direndam dengan akuabides selama 10 menit dan disinari dengan sinar UV selama 15 menit. Elektrode emas yang telah di-pretreatment direndam dalam 25 mM larutan etanolik Cys selama 2 jam pada suhu ruang untuk memungkinkan interaksi antara emas dan gugus tiol (Au/Cys). Setelah itu elektrode dicuci dengan akuabides, dan diinkubasi dalam larutan Glu (2,5% Glu dalam 0,1 M bufer fosfat pH 7,0 pada suhu 4°C selama 50 menit. Setelah itu elektrode dicuci dengan akuabides steril. b.
Amobilisasi dan Hibridisasi DNA dengan Menggunakan Elektrode Emas termodifikasi Tiol Elektrode emas termodifikasi gugus tiol (Au/Cys/Glu) diinkubasi dengan larutan ssDNA
probe (0,1 M buffer fosfat pH 7,0 pada 10 μg/ml) selama 1 jam pada suhu ruang. Kemudian elektrode dicuci selama 2 x 2 menit dengan buffer fosfat untuk menghilangkan ssDNA probe yang tidak terikat. Kemudian dikarakterisasi secara voltammetri siklik dalam larutan 0,1 M buffer fosfat pH 7,0. Elektrode Au/Cys/Glu yang sudah termodifikasi oleh ssDNA probe diinkubasi pada larutan yang mengandung ssDNA target komplemen / non-komplemen sehingga terbentuk dsDNA pada permukaan elektrode emas termodifikasi. Setelah itu elektrode emas dicuci dua kali dengan larutan buffer fosfat pH 7,0 untuk menghilangkan DNA target yang tidak terhibridisasi.
26
BAB 5. HASIL YANG DICAPAI
5.1 Isolasi DNA dan PCR Isolat DNA (Gambar 5.1) diperoleh dari isolasi kultur cair bakteri M. tuberculosis yang ditumbuhkan dalam media cair Sauton, sentrifugasi, diambil pelet selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.Sedangkan Isolasi DNA dari sampel sputum dan cairan pleura dilakukan dengan metode N-asetil L-Sistein (NALC)-NaOH, dilanjutkan dengan setrifugasi, diambil pelet selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
Gambar 5.1 Isolat DNA
Tahapan PCR dilakukan dengan menggunakan FastStart PCR 2x Master Mix Roche, dengan menambahkan air bebas nuclease, primer spesifik dan hasil isolat DNA. Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah : F:GAACTGGGCTTCGACATGAT (20bp) R:ATCAGGTGGGCTACCAAATG (20bp) Primer ini mengamplifikasi urutan insersi pada gen IS6110 (Bhacmann et al, 2008; Raza et al., 2009). Dari analisis dengan Blast diperoleh informasi bahwa urutan primer ini terdapat pada hypothetical protein CFBR 0529 dari genom Mycobacterium tuberculosis. Urutan ini lestari pada beberapa strain M. tuberculosis, M. bovis dan M. africanum. Panjang amplikon yang dihasilkan adalah 192 pb. Gambar 5.2 menunjukan elektroforegram hasil elektroforesis amplikon PCR bakteri M. tuberculosis H37Rv dari ATCC, dan isolat DNA dari penderita TB.
sampel sputum dan cairan pleura
27
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
13
14 15
Gambar 5.2 Elektroforegram hasil PCR. Keterangan: Lajur 1-6 Sampel, 7. Marker, 8. ddH2O, 9-14 Sampel, 15 Kontrol positif dari isolat M. tuberculosis. Kondisi PCR: denaturasi 1 T= 95 oC selama 5 menit, denaturasi 2 T= 95 oC selama 30 menit, Tm 58 oC 1 menit, ekstensi T- 72 oC 1 menit diulang 34 siklus. 5.2 Disain Probe Probe merupakan oligonukleotida pendek sepanjang 20-25 mer yang digunakan pada biosensor DNA secara voltammetri sebagai lapisan pengenal yang dapat berhibridisasi dengan DNA target sintesis maupun target sampel. Urutan DNA probe sepanjang 20 mer didesain spesifik berdasarkan urutan fragmen DNA gen IS6110 M. tuberculosis hasil amplifikasi dari metode PCR. Desain urutan probe yang bagus memiliki nilai identities sebesar 100% artinya probe komplemen dengan urutan DNA target sintesis ataupun dengan amplikon PCR. Selain itu, probe harus memiliki persen homologi nol yang berarti probe berikatan spesifik pada daerah tertentu dari urutan amplikon PCR dan probe tidak menempel didaerah urutan yang lain. Dengan demikian, untuk mengetahui bahwa probe yang dirancang telah memenuhi syarat-syarat tersebut maka digunakan software NCBI (www.ncbi.nlm.gov.nih) Local Alignment Search Tool®) (Gambar 5.3).
melalui metode BLAST® (Basic
28
5‘-GAACTGGGCT TCGACATGAT GACGATCGAC GTCGATGTCG CGGCGTCGAC GGGCAATCCA GGGCTGCGAG CTGAGTTTGG CGATCGGTTG CCGGTGGTCC TGCTGGACGG CCGCGAGCAC AGCTACTGGG AGGTCGACGA GCACCGGCTG CGTGCGGATA TAGCCCGCAG CACATTTGGT AGCCCACCTG AT-3‘ Gambar 5.3. Urutan DNA probe dipilih dalam amplikon PCR 192 pb gen M. tuberculosis 5.3 Studi modifikasi elektrode Elektrode emas yang digunakan berdiameter 0,5 mm dan panjang 1,5 cm, dihubungkan dengan kawat tembaga, seperti ditunjukkan pada Gambar 5.4.
Gambar 5.4 Elektrode emas Elektrode emas dimodifikasi menggunakan cysteamin dan glutaraldehida, untuk membentuk self assembly monolayer. Pretretment permukaan emas sebelum derivatisasi dengan tiol dimulai dengan tahap penghalusan menggunalkan Al2O3, diikuti dengan treatment drastis yaitu menggunakan larutan oksidatif, larutan Piranha (suatu campuran asam sulfat pekat dan larutan hidrogen peroksida 70:30 V/V) yang dididihkan pada temperatur ruang. Tahap ketiga adalah regenerasi dengan siklus potensial dengan mencelupkan elektrode dalam larutan asam sulfat hingga profil yang diharapkan tercapai. Amobilisasi urutan probe dilakukan juga secara self assembling senyawa yang bertiolasi yaitu cysteamin, sebagai suatu platform untuk selanjutnya bergabung dengan oligonukleotida, secara interaksi elektrostatik atau ikatan kovalen. Terakhir adalah dilakukan melalui tiolasi senyawa yang mengandung gugus fungsi hidroksil, amino, atau karboksil yang akan berikatan kovalen dengan asam nukleat, dalam hal ini digunakan glutaraldehida (Gambar 5.5).
29
Gambar 5.5. Formation of the thiol-based monolayer ongold surface for DNA immobilization and hybridization (Silva et al., 2010). Karakterisasi elektrode setelah modifikasi dilakukan secara voltammetri sklis (Gambar 5.6). Dari voltammogram yang ditunjukkan pada Gambar 5.5, elektrode emas yang telah dimodifikasi thiol secara SAM memberikan arus puncak yang paling tinggi untuk rekasi reduksioksidasi Fe2+, dibandingkan dengan elektrode yang tanpa modifikasi.
Gambar 5.6. Voltammogram siklis. Keterangan: merah dan biru : Au bare, , orange : Aumodifikasi (cysteamin – glutaraldehid)
30
Elektrode emas di-pretreatmen untuk menghilangkan pengotor pada permukaannya, mengikuti metode yeng dikemukakan Silva et.al. Permukaan yang tidak terkontaminasi penting untuk chemisorpsi yang baik dari gugus thiol dan permukaan emas. Metode SAM menyebabkan terbentuknya ikatan antara thiol di permukaan emas dengan DNA probe yang terikat pada ligan aldehid. DNA target kemudian akan berhibridisasi pada DNA probe tanpa guanin, dan terdeteksi dari sinyal guanin DNA target. Modifikasi elektrode dapat dilakukan dengan dua cara: adsorpsi thiol pada permukaan emas diikuti oleh adsorpsi reseptor spesifik pada monolayer thiol monolayer, atau adsorpsi thiol difungsikan pada permukaan emas, dimana thiol berperan sebagai reseptor. Dalam kedua kasus, kinerja modifikasi tergantung pada kualitas permukaan emas. Jika permukaan emas sangat halus, derajat sampulnya lebih tinggi, monolayer diperoleh terbentuk dengan baik, dan elektrode memiliki kinerja analitis yang baik.
5.4 Studi Voltammetri Dalam deteksi secara elektrokimia bebas label, peristiwa hibridisasi menghasilkan perubahan sinyal listrik . Teknik deteksi ini menghilangkan penggunaan indikator dan langkahlangkah tambahan lainnya. Dalam deteksi bebas label ini, dapat dilakukan dengan memonitor perubahan aktivitas redoks intrinsik dari target asam nukleat. Di antara empat asam basa nukleat, basa Guanin merupakan basa yang paling mudah teroksidasi dan yang paling cocok untuk deteksi hibridisasi tanpa label/indikator. Untuk menghilangkan sinyal Guanin di urutan probe, guanin pada urutan probe disubstitusi dengan Inosin yang dapat berkomplemen dengan sitosin dan memiliki sinyal oksidasi yang rendah, sehingga sinyal oksidasi hanya datang dari Guanin dari urutan DNA target yang berhibridisasi dengan DNA probe. Gambar 5.7 menunjukkan voltamogram differensial pulsa untuk elektrode emas dengan blanko,( Au - SAM ), Au - SAM – DNA target, Au - SAM -probe DNA dan Au - SAM – hibrid ssDNA probe- ssDNA target.
31
Gambar 5.7. Voltamogram pulsa diferensial larutan blanko, ssDNA probe, ssDNA target, hibridisasi ssDNA probe- ssDNA target, pada Au - SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 5.6, tidak ada arus puncak oksidasi guanin yang dapat diamati pada 0,1 M larutan PB (blanko), dan begitu pula halnya untuk ssDNA probe karena substitusi guanin dengan inosin. Voltamogram dari target ssDNA dan hibrid ssDNA probe-target menunjukkan sinyal pada 0,21 V dan arus puncak yang 11,7 dan 3,65 μA, masingmasing. Hibrid dsDNA memberikan puncak oksidasi lebih rendah dari ssDNA karena basa nitrogen di dsDNA tampaknya disembunyikan ke dalam struktur heliks dari dsDNA dan kekakuan struktur membuat basa nitrogen jauh dari permukaan elektroda, oleh karena itu proses oksidasi adalah diblokir. Sinyal target ssDNA lebih tinggi karena fleksibilitas guanin pada permukaan elektroda. 5.5 Spesifisitas DNA probe Spesifisitas DNA probe untuk deteksi M. tuberkulosis dengan menggunakan biosensor Au - SAM diuji dengan menganalisis sinyal oksidasi dari campuran hibrid DNA probe- target dan DNA probe- non komplementer pada Au - SAM. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 5.8.
32
Gambar 5.8. Voltammogram DPV sinyal guanin menggunakan Au – SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. (a) Au - SAM (b) Au - SAM - ssDNA probe- non DNA komplementer; (c) Au - SAM - ssDNA probe- komplementer ssDNA. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.7, tidak ada puncak arus yang dapat diamati pada 0,21 V untuk hibrid ssDNA - non komplementer, karena hibridisasi antara ssDNA probe dan ssDNA non komplementer tidak terjadi. Sedangkan hibrid probe- target terdeteksi pada 0,21 V. Oleh karena itu, urutan DNA probe yang dirancang dalam biosensor DNA secara elektrokimia ini memiliki spesifisitas yang baik untuk urutan oligonukleotida spesifik
5.6 Kurva Kalibrasi Kurva kalibrasi diperoleh dengan hibridisasi 10 mg mL-1 ssDNA probe dengan 0, 5,10,15 dan 20 mg mL-1 ssDNA target. Masing-masing konsentrasi diukur tiga kali untuk mendapatkan standar deviasi pengukuran. Kurva kalibrasi ditunjukkan pada Gambar 5.9. Arus puncak yang dihasilkan oleh masing-masing konsentrasi bervariasi, dan ada hubungan linear antara peningkatan konsentrasi terhadap tinggi arus puncak. Gambar voltammogram ditunjukkan pada Gambar 5.9.
33
Gambar 5.9. Kalibrasi arus puncak vs konsentrasi ssDNA target. Digunakan konsentrasi ssDNA Target 0, 5, 10, 15, 20 μgmL-1 secara DPV dengan Au - SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1, (n=3). Seperti yang terlihat pada Gambar 5.9, dan voltammogram Gambar 5.10, linieritas sinyal antara 0 dan 20 mg mL-1 belum memberikan nilai yang baik dengan koefisien korelasi 0,986. Persamaan regresinya adalah y = 0,489 x + 0,383. Kita harus menghitung interval kepercayaan untuk untuk menguji kesalahan sistematis dalam pengukuran dan dalam interval kepercayaan 95 % nilai intersep adalah dari -0,90359 sampai 1,67016, menunjukkan bahwa persamaan melalui titik nol, sehingga persamaan regresi memiliki penyesuaian untuk Y = 0,5152 X. Batas deteksi dan batas kuantifikasi nilai dihitung menggunakan persamaan: Y LOD = yb + 3 Sb dan YLOQ = yb + 10 Sb. Nilai batas deteksi diperoleh 3,47 μg mL-1 dan nilai batas kuantifikasi adalah 11,56 µg mL-1.
34
Gambar 5.10. Voltammogram DPV variasi konsentrasi DNA target pada Au - SAM dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1.
35
BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Tahun ke-1
No
KEGIATAN
1. 2.
Isolasi DNA, PCR Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode: amobilisasi DNA probe dan hibridisasi probe- target Standarisasi metode biosensor DNA Penyusunan publikasi nasional untuk tahun pertama Pembuatan laporan tahunan
3. 4. 5.
BULAN 1 2 3 4 5 6 7 8
Tahun ke-2
No
KEGIATAN
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Aplikasi menggunakan SPCE Standarisasi penggunaan SPCE Aplikasi terhadap sampel nyata Uji statistik Penyusunan publikasi internasional Pembuatan laporan tahunan
BULAN 1 2 3 4 5 6
7
8
36
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan - Primer PCR menghasilkan pita amplikon yang sesuai dilihat dari elektroforegram. - Modifikasi elektrode memberikan profil voltammogram siklik yang sama setelah pengujian menggunakan Fe2+. - Reaksi hibridisasi pada permukaan elektrode diamati dari sinyal guanin pada potensial +0,21 V. Nilai sensitivitas yang diperoleh sebesar 0,52, dan batas deteksi 3,47 µg mL-1.
7.2 Saran - Data validasi belum lengkap untuk menguji selektivitas dari urutan DNA probe yang didisain.
37
DAFTAR PUSTAKA Brabec, V and G. Dryhurst. 1978. Electrochemical oxidation of polyadenylic acid at graphite electrodes. J. Electroanal. Chem. 91: 219–229. Cai, X., G. Rivas, H. Shiraischi. 1997. Electrochemical analysis of formation of polynucleotide complexes in solution and at electrode surfaces. Anal. Chim. Acta. 344: 64-76. Cambau, E, C. Wichlacz, C. Truffot-Pernot, and V. Jarlier, ―Evaluation of the new MB Redox system for detection of growth of mycobacteria,‖ Journal of Clinical Microbiology, vol. 37, no. 6, pp. 2013–2015, 1999. Chaudhry, R., B V Laxmi, N. Nisar, K. Ray, D. Kumar. (1997). Standardisation of polymerase chain reaction for the detection of Salmonella typhi in typhoid fever. J. Clin Pathol . 50:437-439. Choi, Y.J, Y. Hu, and A. Mahmood, ―Clinical significance of a polymerase chain reaction assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis,‖ American Journal of Clinical Pathology, vol. 105, no. 2, pp. 200–204, 1996. Delacourt, C, J. Gobin, J. L. Gaillard, J. De Blic, M. Veron, and P. Scheinmann, ―Value of ELISA using antigen 60 for the diagnosis of tuberculosis in children,‖ Chest, vol. 104, no. 2, pp. 393–398, 1993. Drummond, T. G., M. G. Hill, J. K. Barton. 2003. Electrochemical DNA sensors. Review Nature Biotechnology. Nature Publisihing Group. 21, 1192 -1199. Durmaz, R, A. Aydin, B. Durmaz, N. E. Aydin, B. S. Akbas¸ak, and S. G¨unal, ―Sensitivity of two-stage PCR amplification for detection ofMycobacterium tuberculosis in paraffinembedded tissues,‖ Journal of Microbiological Methods, vol. 29, no. 2, pp. 69–75, 1997. Gamboa, F, J. M. Manterola, J. Lonca et al., ―Detection and identification of mycobacteria by amplification of RNA and DNA in pretreated blood and bone marrow aspirates by a simple lysis method,‖ Journal of Clinical Microbiology, vol. 35, no. 8, pp. 2124–2128, 1997. Griffiths, D, and G. Hall, ―Biosensors—what real progress is being made?‖ Trends in Biotechnology, vol. 11, no. 4, pp. 122– 130, 1993. Hartati, Y.W., (2009). Biosensor Voltammetri untuk deteksi urutan spesifik dan mutasi basa tunggal pada fragmen DNA. Disertasi: Unpad Hashimoto, K., K. Ito, Y. Ishimori. 1994. Novel DNA sensor for electrochemical gene detection. Anal. Chim. Acta 286: 219-224. Kai, E., S. Sawata, K. Ikebukuro, T. Lida, T. Honda, I. Karube, (1999). Detection of PCR Products in Solution Using Surface Plasmon Resonance. Anal. Chem. 71, 796-802 Kara, P., K. Kerman, D. Ozkan, B. Meric, A. Erdem, P.E. Nielsen, M. Ozsoz. 2002. Label-free and label-based electrochemical detection of hybridization by using methylene blue and peptide nucleic acid probes at chitosan modified carbon paste electrodes. Electroanalysis 14: 1685-1690. Krambovitis,E, M. B.Mcillmurray, P. E. Lock,W. Hendrickse, and H. Holzel, ―Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by latex particle agglutination,‖ Lancet II, p. 538, 1984. Liu, Z, H, X. D. Shi, and X. Y. Wu, ―The method of Mycobacterium tuberculosis rapid cultivation fluorescence detection,‖ Chinese Journal of Clinical Laboratory Science, vol. 19, p. 347, 2001. Loewy, Z.G., R. Pottathilin, P. Singh, B.P. Sharma, P. Tyle. 1993. Antibody, Biosensor and Nucleic Acid Technologies. Van Nostrand Reinhold, New York.
38
Lucarelli, F.,Giovanna Marrazza, Anthony P. F. Turner, and M. Mascini. (2004).Carbon and gold electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridization sensors. Biosensors and Bioelektronics. 19: 515-530. Meric, B., K. Kerman, D. Ozkan, P. Kara, S. Erensoy, U.S Akarca, M. Mascini, M. Ozsoz. 2002. Electrochemical DNA biosensor for the detection of TT and hepatitis B virus from PCR amplified real samples by using methylene blue. Talanta 56: 837- 846. Middlebrook, W. D. Tigertt, and Z. Reggiardo, ―Automatable radiometric detection of grwoth of Mycobacterium tuberculosis in selective media,‖ American Review of Respiratory Disease, vol. 115, no. 6, pp. 1066–1069, 1977. Nassau, E, E. R. Parsons, and G. D. Johnson, ―The detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis by microplate enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),‖ Tubercle, vol. 57, no. 1, pp. 67–70, 1976. Nath, G., P. Maurya, A.K. Gulati, T. B. Singh,R. Srivastava, K. Kumar, S. K.Tripathi, (2010), Comparison of V1 serology and nested PCR in diagnosis of chronic typhoid carriers in two different study populations in typhoid endemic area of India. Southeast Asian J. Trop Med Public health.41: 3 Newton, C.R and A. Graham. 1994. PCR Inroduction to Biotechniques. Oxford: BIOS Scientific Publishers. Owen, V M, ―Market requirements for advanced biosensors in healthcare,‖ Biosensors and Bioelectronics, vol. 9, no. 6, pp. 29–35, 1994. Palecek, E. 1983. Dalam: Milazzo, G (ed) Topics in bioelectrochemistry and bioenergetics. London: Wiley. Prakash, P., O. P. Mishra, A. K Singh, A.K. Gulati, G. Nath. (2005). Evaluation of Nested PCR in Diagnosis of Typhoid Fever. J. Clin Microbiol. 43:1 Qin, D L, X. X. He, K. M. Wang, and W. H. Tan, ―Using fluorescent nanoparticles and SYBR Green I based twocolor flow cytometry to determine Mycobacterium tuberculosis avoiding false positives,‖ Biosensors and Bioelectronics, vol. 24, no. 4, pp. 626–631, 2008. Rivas, G., M.L. Pedano, N. Ferreyra. 2005. Electrochemical biosensor for sequence-specific DNA detection. Anal. Letters 38: 2653–2703. Silva, M.M.S., I. T. Cavalanti, M. F. Barroso, M. G. F. Sales & R. F. Dutra. 2010. Gold electrode modified by self assembled monolayers of thiol to determine DNA sequences hybridization. Journal Chem Science. 122: 911-917 Song, Y. 2008. Experimental and theoretical study of DNA oxidation. Nature Precedings : hdl:10101/npre.2008.1797.1 Tamminen, M, T. Joutsjoki, M. Sj¨oblom et al., ―Screening of lactic acid bacteria fromfermented vegetables by carbohydrate profiling and PCR-ELISA,‖ Letters in AppliedMicrobiology, vol. 39, no. 5, pp. 439–444, 2004. Thevenot, D. R., K. Toth, R.A. Durst, G.S. Wilson. 1999. Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification. Pure Appl. Chem. 71: 2333-2348. Thomson, LM, H. Traore, H. Yesilkaya et al., ―An extremely rapid and simple DNA-release method for detection of M.tuberculosis from clinical specimens,‖ Journal of MicrobiologicalMethods, vol. 63, no. 1, pp. 95–98, 2005. Torres-Chavolla, E and E. C. Alocilja, ―Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens,‖ Biosensors andBioelectronics, vol. 24, no. 11, pp. 3175–3182, 2009. Turner,A P F, M. F. Cardosi,G. Ramsay, B.H. Schneider, and A. Swain, ―Biosensors for use in the food industry: a new rapid bioactivity monitor,‖ in Biotechnology in the Food Industry, pp. 97–116, Online Publications, Pinner, UK, 1986.
39
Wang, J., X. Cai, G. Rivas, H. Shiraishi, P.A.M. Farias and N. Dontha. (1996). DNA Electrochemical Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related to the Human Immunodeficiency Virus. Anal. Chem. 68 : 2629. Wang, J., G. Rivas, X. Cai. 1997. Screen-printed electrochemical hybridization biosensor for the detection of DNA sequences from the Escherichia coli pathogen. Electroanalysis 9: 395398. Wang, J., J.R. Fernandes, L.T. Kubato. 1998. Polishable and Renewable DNA Hybridization Biosensors. Anal. Chem. 70: 3699-3702. World Health Organization, Global TB Control Report, World Health Organization, Geneva, Switzerland, 2003. Zhou, L., X. He, D. He, K. Wang & D. Qin. 2011. Biosensing technologies for Mycobacterium tuberculosis detection: status and new development. Clinical and Development Immunology.10: 1-8.
40
LAMPIRAN 1. EVALUASI CAPAIAN LUARAN KEGIATAN Ketua
: Yeni Wahyuni Hartati
Perguruan Tinggi
: Universitas Padjadjaran
Judul
: Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis Secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode
Waktu Kegiatan : tahun ke 1 dari rencana 2 tahun Luaran yang direncanakan dan capaian tertulis dalam proposal awal: No
Luaran yang Direncanakan
Capaian In progress
2
Artikel jurnal nasional terakreditasi/Jurnal Internasional Seminar internasional
3
………
………
1
diterima
dst. CAPAIAN (Lampirkan bukti-bukti luaran dari kegiatan dengan judul yang tertulis di atas, bukan dari kegiatan penelitian/pengabdian dengan judul lain sebelumnya) 1. PUBLIKASI ILMIAH Keterangan Artikel Jurnal Ke-1* Nama jurnal yang dituju
Journal of Electrochemical Science
Klasifikasi jurnal
Jurnal Nasional Terkareditasi/Jurnal Internasional 1.2
Impact factor jurnal Judul artikel
- Draf artikel - Sudah dikirim ke jurnal - Sedang ditelaah - Sedang direvisi - Revisi sudah dikirim ulang - Sudah diterima - Sudah terbit
An Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of Mycobacterium tuberculosis using Gold Electrode Modified by Self-Assembled Monolayer of Thiol
V
41
* Jika masih ada artikel ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan. 2. BUKU AJAR Buku ke-1 Judul: Penulis: Penerbit: Jika masih ada buku ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan. 3. PEMBICARA PADA PERTEMUAN ILMIAH (SEMINAR/SIMPOSIUM) Nasional
Tempat Pelaksanaan
Internasional Label Free Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of Mycobacterium tuberculosis using Gold Modified by on SelfThirdElectrode International Seminar Assembled Monolayer of Thiol Chemistry of Universitas Padjadjaran Unpad, Bandung
Waktu Pelaksanaan
20-21 November 2014
Judul Makalah
Nama Pertemuan Ilmiah
- Draf makalah - Sudah dikirim
V
- Sedang direview
V
- Sudah dilaksanakan Jika masih ada pertemuan ilmiah ke 2 dan seterusnyauraikan pada lembar tambahan. 4. SEBAGAI PEMBICARA KUNCI (KEYNOTE SPEAKER) Nasional - Bukti undangan dari Panitia - Judul makalah - Penulis - Penyelenggara - Waktu Pelaksanaan - Tempat Pelaksanaan - Draf makalah - Sudah dikirim - Sedang direview
Internasional
42
- Sudah dilaksanakan Jika masih ada undangan ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan 5. UNDANGAN SEBAGAI VISITING SCIENTIST PADA PERGURUAN TINGGI LAIN Nasional
Internasional
- Bukti undangan - Perguruan tinggi pengundang - Lama kegiatan - Kegiatan penting yang dilakukan Jika masih ada undangan ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan. 6. CAPAIAN LUARAN LAINNYA HKI TEKNOLOGI TEPAT GUNA
-
REKAYASA SOSIAL
-
JEJARING KERJA SAMA PENGHARGAAN
-
LAINNYA (Tuliskan) Jika luaran yang direncanakan tidak tercapai, uraikan alasannya: Bandung, Oktober 2014 Ketua Peneliti,
Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si
43
LAMPIRAN 2. FOTO-FOTO PENELITIAN
44
45
LAMPIRAN 3. BIODATA PERSONALIA PENELITIANBIODATA KETUA DAN ANGGOTA PENELITI KETUA PENELITI: A. 1 2 3
A. Identitas Diri Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional
Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si
P
Lektor Kepala -
5
Jabatan Struktural NIP/NIK/No. Identitas lainnya NIDN
6
Tempat dan Tanggal Lahir
Garut, 24 September 1971
7
Alamat Rumah
Jl. Merkuri Utara No. 8 Margahayu Raya Bandung
8
Nomor Telepon/Faks
022-7561080
9
Nomor HP
10
Alamat Kantor
08122132349 Jurs Kimia Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21 Jatinangor
11
Nomor Telepon/Faks
022-7794391
12
Alamat e-mail Lulusan yang telah dihasilkan
yw_hartati @unpad.ac.id
4
13
19710924 199802 2 001 0024097101
S1=10, S2=1, S3= 1. Kimia Dasar 2. Analisis Kimia
14
Mata Kuliah yang diampu
3. Teknik Pengukuran Kimia 4. Kapita Selekta Kimia Analitik 4. Analisis Instrumental dan Biosensor
B.
Riwayat Pendidikan
2.1 Program:
S-1
S-2
S-3
2.2 Nama PT
Universitas Padjadjaran
Institut Teknologi Bandung
Universitas Padjadjaran
2.3 Bidang Ilmu
Kimia/MIPA
Biokimia/MIPA
Kimia
46
2.4 Tahun Masuk
1990
1996
2005
2.5. Tahun Lulus
1996
1999
2009
2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi
Penentuan Rotenon dalam Biji Tephrosia vogelii secara Kromatografi Lapis Tipis -Densitometri
Studi Struktur Fungsi Gen Sup-45 Saccharomyces cerevisiae Sensitif Paromomisin
Biosensor Voltammetri Untuk Penentuan Urutan Spesifik dan Mutasi Basa Tunggal pada fragmen DNA
2.7. Nama Pembimbing/ Promotor
Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro
Prof. Dr. Akhmaloka, Dr. Muliawati Sindumartha
Prof. Dr. Muljadji Agma, Prof. Dr. Siti Rochani, Prof. Dr. Husein H. Bahti
C. Pengalaman Penelitian 5 Tahun Terakhir
No 1
2
3
Tahun 2014
Judul Penelitian Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode(Tahun I)
2012-2013
Pengembangan Biosensor DNA Tanpa Indikator Eksternal untuk Deteksi Bakteri Patogen dalam Sampel Darah
2009-2010
Pengembangan Biosensor DNA Tanpa Indikator Eksternal untuk Deteksi Mutasi Titik (Point Mutation) DNA Mitokondria pada Pasien Diabetes Mellitus Tipe 2
Pendanaan Jumlah (Juta Sumber Rp) PUPT 80,5
Hibah Bersaing
37,5+59,5
(Peneliti Utama)
Hibah Bersaing (Peneliti Utama)
50 45
47
D.
No 1
Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat
Tahun 2008
Judul Penelitian Sosialisasi Pembuatan Sabun Mandi Cair Dengan Lendir Lidah Buaya (Aloe vera Linn)
Pendanaan Sumber Jumlah (Juta) BLU Unpad 3
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal No Tahun 1 2014
2
2013
3
2012
4
2009
Judul Artikel Ilmiah Determination of uric acid level by polyaniline and poly (allylamine): Based biosensor Sensitive Detection of Mitochondrial DNA A3243G tRNALeu Mutation via an Electrochemical Biosensor Using Meldola’s Blue as a Hybridization Indicator Pengembangan Elektrode Grafit Pensil untuk Penentuan Kromium(VI) secara Voltammetri Stripping Adsorptif Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara Voltammetri
Volume/Nomor 2014 Jan-Mar; 5(1): 13–16
Nama Jurnal J. Adv. Pharm Technol. Res.
Vol 3(3A): 2027
Advance in Analytical chemistry
Volume 3
Jurnal Sains dan Teknologi Kimia
Vol 11 No 3
Bionatura
48
F.
Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan/Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
No 1 2
3
4
Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar
Judul Artikel Ilmiah
Waktu dan Tempat
Seminar nasional Unpak- Studi biosensor DNA dalam deteksi Unpad Urutan flagellin Salmonella typhi dari International Conference Study Of Nested PCR-Voltammetric DNA amplikon PCR sampel darah Biosensor Related To Flagellin Gene Fragment Of Pathogenic Salmonella Typhi
28 Juni 2013, Universitas Pakuan, Bogor 2012, Malang
The third International Single base mismatch detection on the Conference on mtDNA A3243G mutation using Mathematics and electrochemical DNA biosensor based Natural Sciences 2010, based on target guanine signal ITB Seminar Nasional XIII Penentuan Kandungan Basa Guanin dan Jaringan Kerjasama Adenin dalam Urutan DNA secara Kimia Indonesia, Voltammetri Menggunakan Elektrode Yogyakarta, 15 Juli 2010 Grafit Pensil
2010, ITB
2010, Yogyakarta
G. Pengalaman Penulisan Buku No Tahun
Judul Buku
1
Biosensor Elektrokimia Untuk Deteksi Urutan Spesifik DNA ISBN 978-979-3985-84-8
2010
Jumlah Halaman 158
Penerbit Unpad Press
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir No. 1
2
Judul/Tema HKI Disertasi: Biosensor Voltammetri Untuk Penentuan Urutan Spesifik dan Mutasi Basa Tunggal pada fragmen DNA Buku: Biosensor Elektrokimia untuk Deteksi Urutan Spesifik DNA
Tahun
Jenis
Nomor P/ID
2012
Hak 063/STBKHC Cipta /HKI/X/2012
2013
Hak Cipta
062853
49
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi. Bandung, Oktober 2014
Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si
50
Anggota Peneliti 1: A. Identitas Diri 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional Jabatan Struktural NIP/NIK/ Identitaslain NIDN Tempat dan tanggal lahir Alamat Rumah
8. 9.
Nomor Telepon/ Faks/ Hp Alamat Kantor
10. 11. 12.
Nomor Telepon/ Faks Alamat e-mail Lulusan yang telah dihasilkan
13.
Mata kuliah yang diampu
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (Perempuan) Lektor 19710425 200501 2 001 00225047105 Batang Buo, 25 April 1971 Komp. Anggrek Residence B12A, Jl Rumah Sakit, Ujung Berung, Bandung. 081573019025 Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor, 45363 022-7794391/ 022-7794391
[email protected] S1 = 17 orang S2 = 0 S3 = 0 1. Biokimia I 2. Biokimia II 3. Bioteknologi 4. Teknik Penelitian Biokimia 5. Bioinformatika
B. Riwayat Pendidikan S-1 Nama Perguruan Unand Tinggi Bidang Ilmu Kimia Tahun Masuk-Lulus 1990-1995 JudulSkripsi/Thesis/ Analisis parameter Disertasi pembentuk kerak serta kualitas air untuk injeksi uap di stasiun pengumpul pusat I, III dan V, PT. Caltex Pacific Indonesia,Duri. Nama Pembimbing/ Dr. Admin Alief Promotor
S-2 ITB
S-3 Unpad
Biokimia 1996-1998 Varian normal fragmen 0,4 kB daerah D-loop DNA mitokondria manusia Indonesia
Biokimia 2006-2011 Pengaruh kombinasi manipulasi genetik terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera R64 dalam Pichia pastoris Prof. O. Suprijana Prof. Soetijoso Soemitro Dr. Dessy Natalia
Dr. Achmad Saifuddin Noer
51
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir No
Tahun
Judul Penelitian
1.
2009
2.
2010
3.
2011
Koekspresi Protein Disulfida Isomerase (PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris Koekspresi Protein Disulfida Isomerase (PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris Koekspresi Protein Disulfida Isomerase (PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris Identifikasi populasi bakteri dalam spons pencuci piring dengan metoda PCRRFLP Pengembangan biosensor DNA secara elektrokimia tanpa indicator eksternal untuk deteksi bakteri patogen dalam sampel darah Pengembangan vaksin influenza universal berbasis epitop
4.
2012
5.
2012
6.
2012
7.
2013
8.
2013
Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris Terhadap Tingkat Sekresi Amilase Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris rekombinan Pengembangan produksi thrombin rekombinan sebagai komponen lem fibrin pengganti jahitan pada bedah mata
Pendanaan Sumber Jumlah (Juta Rp) PHB Dikti 22,5,Tahun 1 (ketua) PHB Dikti 35,Tahun 2 (ketua) PHB Dikti 35,5,Tahun 3 (ketua) BOPTN 30,0,(ketua) PHB Dikti (Anggota)
45,0,-
Insentif Riset SINas (Anggota) PUPT (Ketua)
300,0,-
Unggulan Stranas (Anggota)
800,0,-
53,6,-
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber Jml (Juta Rp) 1
2008
Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya minat baca dalam sarana dan prasarana taman bacaan kampung Rancakemit, kecamatan Solokan Jeruk, Kabupaten Bandung
LPPM Unpad
5,-
52
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir No.
Judul Artikel Ilmiah
1
Phylogenetics analysis of marine and coastal species using 18S rRNA sequence Deteksi urutan pendek DNA Salmonella Typhi berdasarkan sinyal guanin target secara voltammetri Pengaruh konsentrasi penginduksi metanol serta sumber karbon sorbitol dan manitol terhadap produksi -amilase Saccharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Chemical Modification of Saccharomycopsis fibuligera R64αAmylase to Improve its Stability Against Thermal, Chelator, and Proteolytic Inactivation
2
3
4.
Volume/ Nomor/Tahun Volume 11, no.2, 2009 Volume 11, no.3, 2009
Nama Jurnal
13, 2, 58-64, 2011
Jurnal Kimia Terapan Indonesia
170:44–57, 2013 DOI 10.1007/s12010013-0164-8
Applied Biochemistry and Biotechnology
Bionatura Bionatura
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
1
Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar International Seminar on Chemistry
2
International Seminar on Chemistry
3
Seminar hasil penelitian unggulan Unpad kelompok Ilmu Alam
Judul Artikel Ilmiah Enhancement of Saccharomycopsis fibuligera Amylase Secretion in Pichia pastoris by Co-expression of Protein Disulfida Isomerase Signal Peptide Modification of amylase Gene (ALPI) and construction of pPICZA-MSALPI plasmid for improving secretory production of a-amilase in Pichia pastoris Ekspresi dan sekresi -amilase Saccharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris rekombinan menggunakan dua jenis peptida sinyal
Waktu dan Tempat November 2011, Kimia Unpad, Bandung
November 2008, Kimia Unpad, Bandung
22 Oktober 2010, Unpad, Bandung
53
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir No
Judul Buku
1
Tahun
Jumlah Penerbit Halaman 176 Unpad Press
Produksi protein rekombinan dalam 2010 sistem ekspresi P. pastoris (ISBN 978-602-8743-23-5) 2 Bioteknologi molekul, konsep dan 2010 93 aplikasi. ISBN: 978-602-8323-46-8. H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 -– 10 Tahun Terakhir No.
Judul/Tema HKI
Tahun
Widya Padjadjaran Jenis
Nomor
1
P/ID
2
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi. Bandung, 26 Oktober 2014 Pengusul,
SHABARNI GAFFAR
54
Anggota Peneliti 2: A.
Identitas Diri
1
Nama Lengkap (dengan gelar)
Santhy Wyantuti, M.Si
2
Jabatan Fungsional
Lektor
3
Jabatan Struktural
-
4
NIP/NIK/No. Identitas lainnya
19731026 199903 2 001
5
NIDN
0026107301
6
Tempat dan Tanggal Lahir
Jakarta, 26 Oktober 1973
7
Alamat Rumah
Griya Cinunuk Indah B1/4 Bandung
8
Nomor Telepon/Faks
022-7561080
9
Nomor HP
08122344274
10
Alamat Kantor
Jurusan Kimia Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21 Jatinangor
11
Nomor Telepon/Faks
022-7794391
12
Alamat e-mail
[email protected]
13
Lulusan yang telah dihasilkan
S1= 3 orang, S2=-, S3= -
14
Mata Kuliah yang diampu
-
B.
P
Riwayat Pendidikan
2.1 Program:
S-1
S-2
S-3
2.2 Nama PT
Universitas Padjadjaran
Universitas Padjadjaran
Universitas Padjadjaran
2.3 Bidang Ilmu
Kimia/MIPA
Kimia Analitik/MIPA
Kimia
2.4 Tahun Masuk
1992
2002
2010
2.5. Tahun Lulus
1997
2006
-
2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi
Hidrolisis Trigliserida yang Mengandung Asam Lemak Omega 3
Pengembangan metode anodik striping voltammetri
-
55
2.7. Nama Pembimbing/ Promotor
EPA dan DHA dari Minyak Ikan Lemuru dengan Bantuan Enzim Lipase Aspergillus niger
untuk penentuan ziram dengan HMDE
Prof. Dr. O. Suprijana, M. Sc.
Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro, Prof. Dr. Siti Rochani.
Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro, Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si., Dr. Eng. Camellia Panatarani, M. Si.
C. Pengalaman Penelitian 5 Tahun Terakhir Pendanaan Jumlah (Juta Rp)
No
Tahun
Judul Penelitian
Sumber
1
2008
Karakterisasi zeolit alam asal Cikalong Tasikmalaya
6,125
2
2008
Konversi Ba2Bi4Ti5O18 menjadi bentuk asamnya dan aplikasinya sebagai katalis
Litmud (Peneliti Utama) DIPA (Peneliti Utama)
3
2012
Pengembangan biosensor DNA secara elektrokimia tanpa indikator eksternal untuk deteksi patogen dalam sampel darah
Hibah Bersaing (Anggota)
37,5
4
2012
Pembuatan elektrode nanopartikel emas berbasis grafit untuk biosensor DNA
Hikom (Peneliti Utama)
22,5
6,125
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan No
Tahun
Judul Penelitian
Sumber
Jumlah (Juta)
1
2008
Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya minat baca dalam sarana dan prasarana taman bacaan
BLU Unpad
3
56 kampung Rancakemit kecamatan Solokan Jeruk kabupaten Bandung
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal No
Tahun
Judul Artikel Ilmiah
Volume/Nomor
Nama Jurnal
1
2009
Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara Voltammetri
Vol 11 No 3
Bionatura
2
2012
Pengembangan Elektrode Grafit Pensil untuk Penentuan Kromium(VI) secara Voltammetri Stripping Adsorptif
Volume 3
Jurnal Sains dan Teknologi Kimia
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir No
Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar
Judul Artikel Ilmiah
Waktu dan Tempat
2
The development of differential pulse anodic 2008, Unpad stripping voltammetry method to determine of ziram (fungicide dithiocarbamate) with hanging drop electrode The third International mercury Single Base Mismatch Detection on the mtDNA 2010, ITB Conference on A3243G Mutation using Electrochemical DNA Mathematics and Biosensor Based on Target Guanine Signal. Natural Sciences 2010
3
Seminar Nasional
1
International Seminar on Chemistry, 2008 UNPAD
Kimia Analitik dan 4
5
International Instrumentasi Conference of the Indonesian Chemical Society Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia 2012
Biosensor Voltammetri untuk Deteksi Urutan Spesifik DNA dari Amplikon PCR
2012, Jakarta
A Study of Gold Nanoparticles Modified Pencil 2012, Malang Graphite Electrode for the Determination of Cr(III) Pengembangan Elektrode Grafit Pensil untuk Penentuan Kromium(III) secara Voltammetri stripping Anodik
2012, Unsoed
57
G. Pengalaman Penulisan Buku No -
Tahun
Jumlah Halaman
Judul Buku
-
-
Penerbit
-
-
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 10 Tahun Terakhir –
No.
Judul/Tema HKI
Tahun
Jenis
-
-
-
-
Nomor P/ID -
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Bandung, 30 April 2013
Santhy Wyantuti, M.Si
58
LAMPIRAN 4. Seminar/Publikasi
59 The International Seminar on Chemistry (ISC) of Universitas Padjadjaran, 2014
Label Free Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of Mycobacterium tuberculosis using Gold Electrode Modified by Self-Assembled Monolayer of Thiol Ratna Nurmalasari, Yohan, Shabarni Gaffar, Yeni W. Hartati*
Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Science, Padjadjaran University, 45363 Jatinangor, Sumedang, West Java, Indonesia Email:
[email protected]
Abstract Tuberculosis (TB), an infectious disease affects millions of humans worldwide and is caused by the Mycobacterium tuberculosis complex. A label free electrochemical DNA biosensor for the detection of M. tuberculosis using gold electrode modified by self-assembled monolayer of thiol is presented in this paper. Single-stranded DNA probe was immobilized on the surface of self assembled monolayer gold electrode with the help of cysteamine and glutaraldehyde, which was further used to hybridize with the target sequence and non-complementary target sequence. The hybridization reaction on the gold electrode surface was detected by monitoring a guanine oxidation signal at potential 0,2 V.
Keywords: DNA Biosensor; gold electrode; guanine oxidation; Mycobacterium tuberculosis; Self-assembled monolayer.
