LAPORAN KEMAJUAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA
CA-NEURO (Centella asiatica Extract Phytosome as Neuroprotector): OPTIMALISASI HERBAL DELIVERY SYSTEM EKSTRAK PEGAGAN SEBAGAI MODULATOR NEUREGULIN-1 (NRG-1) PADA OLIGODENDROSIT TIKUS MODEL TRAUMATIC BRAIN INJURY (TBI) MENGGUNAKAN TEKNOLOGI PHYTOSOME
BIDANG KEGIATAN : PKM - PENELITIAN
Diusulkan oleh: Putri Fitri Alfiantya
115070107111061
Angkatan 2011
Oktavia Rahayu Adianingsih
105070500111029
Angkatan 2010
Zulkarnaen
105070500111023
Angkatan 2010
Alif Fariz Jazmi
125070107111051
Angkatan 2012
Sitti Ayu Hemas Nurarifah
125070100111093
Angkatan 2012
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014
i
ii
RINGKASAN
Sistem saraf pusat merupakan pusat kendali tubuh mulai dari mengendalikan dan menanggapi perubahan lingkungan sampai mengatur semua proses vital tubuh. Pada tingkat dasar, fungsi sistem saraf sebagai pengirim sinyal dari satu lokasi tubuh ke lokasi yang lainnya. Sistem saraf mayoritas terdiri dari neuron dan glia, neuron berfungsi mengirimkan informasi ke seluruh tubuh dalam bentuk sinyal listrik di sepanjang akson. Oligodendrosit yang merupakan salah satu jenis glia pada sistem saraf pusat berfungsi menghasilkan membran kaya lipid yang disebut mielin yang membungkus akson sebagai isolator. Mielin dapat meningkatkan kecepatan konduksi listrik pada akson, jika terdapat kerusakan mielin atau penurunan mielin maka akan menghambat proses konduksi listrik pada akson tersebut sehingga fungsi pengendalian tubuh akan terganggu. Ada beberapa gangguan sistem saraf pusat, seperti pada penyakit Parkinson, Alzheimer, dan Traumatic Brain Injury (TBI). TBI merupakan gangguan sistem saraf pusat yang disebabkan oleh trauma kepala yang serius. Di Indonesia, tepatnya di DKI Jakarta, tercatat 53.4% korban kecelakaan mengalami cedera parah terutama pada bagian kepala. Pada TBI terjadi apoptosis oligodedrosit dan kerusakan akson yang dapat menurunkan sintesis protein neuregulin-1 (NRG-1) yang berperan dalam pembentukan mielin. Untuk itu diperlukan terapi untuk meningkatkan NRG-1 untuk mengembalikan fungsi akson. Salah satu tanaman herbal di Indonesia, yaitu Pegagan (Centella asiatica) mengandung glikosida saponin triterpenoid yang secara etnomedicine sering digunakan untuk berbagai macam pengobatan, salah satunya sebagai neuroprotektor. Namun, hingga saat ini belum ada penelitian mengenai efek neuroprotektif pegagan terhadap peningkatan ekspresi NRG-1 pada TBI, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai hal ini. Komponen fitokimia yang terkandung pada ekstrak pegagan cenderung bersifat polar sehingga diperlukan cara untuk memodifikasi kepolaran dari ekstrak dengan cara memformulasikan ekstrak dalam bentuk phytosome sebagai herbal delivery system sehingga dapat meningkatkan absorbsi dan bioavailabilitas zat aktif obat serta cocok untuk sistem penghantaran senyawa aktif dari tanaman karena dapat membawa senyawa hidrofil dan lipofil dari tanaman. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan efektivitas phytosome sebagai optimalisasi herbal delivery system ekstrak Pegagan sebagai neuroprotektor yang ditandai dengan peningkatan ekspresi NRG-1 dan perbaikan tingkat mielinasi neuron. Pegagan diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 70% selama 24 jam dengan re-maserasi 3 kali. Phytosome ekstrak pegagan diformulasikan menggunakan metode sonikasi dan dilakukan karakterisasi menggunakann spektroskopi KLT, LC/MS-MS dan SEM. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan hewan coba tikus wistar sebanyak 32 ekor. Tikus diinduksi TBI menggunakan tabung silinder besi 45 gram yang dijatuhkan ke bagian kepala. Hewan coba dibagi menjadi 8 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol negatif, kontrol positif, 3 kelompok perlakuan yang diberi ekstrak Pegagan, dan 3 kelompok perlakuan diberi phytosome ektrak Pegagan dengan dosis masing-masing kelompok adalah 90 mg/kgBB, 180 mg/kgBB, dan 360 mg/kgBB. Setelah itu dilakukan pemeriksaan histologi untuk mengukur ketebalan mielin dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan pengukuran ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dengan immunohistokimia. Kemudian data dianalisis menggunakan program IBM SPSS Statistic 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0.05) dan tingkat kepercayaan 95% menggunakan uji One-Way ANOVA. Kata kunci: TBI, neuregulin-1 (NRG-1), phytosome, mielinasi, Centella asiatica
iii
DAFTAR ISI
Halaman Sampul .................................................................................................................... i Halaman Pengesahan............................................................................................................. ii Ringkasan ............................................................................................................................... iii Daftar Isi ................................................................................................................................. iv I. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang Masalah .............................................................................................. 1 2. Rumusan Masalah ......................................................................................................... 2 3. Tujuan Penulisan .......................................................................................................... 2 4. Luaran yang Diharapkan...............................................................................................2 5. Kegunaan Program………………………………………………………….………....2 II.TINJAUAN PUSTAKA 1. Sistem Saraf ................................................................................................................... 2 2. Traumatic Brain Injury (TBI) ...................................................................................... 2 3. Neuregulin-1 (NRG-1) .................................................................................................. 3 4. Pegagan (Centella asiatica). .......................................................................................... 3 5. Phytosome ....................................................................................................................... 4 III. METODE PENELITIAN 1. Kerangka Konsep Penelitian ........................................................................................ 4 2. Rancangan Penelitian ................................................................................................... 5 3. Variabel Penelitian ........................................................................................................ 5 4. Sampel Penelitian .......................................................................................................... 5 5. Tempat Penelitian ......................................................................................................... 6 6. Definisi Operasional ...................................................................................................... 6 7. Alat dan Bahan………………………………………………………………………....6 8. Prosedur Penelitian 1.Perawatan Hewan Coba.............................................................................................. 6 2.Ekstraksi Pegagan ........................................................................................................6 3.Pembuatan Phytosome Ekstrak Pegagan .................................................................... 6 4.Induksi Traumatic Brain Injury (TBI) ........................................................................ 6 5.Pembuatan Preparat Histopatologi Jaringan Otak, Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan Pengukuran Ketebalan Mielin ................................................................... 7 6. Pemeriksaan Ekspresi Neuregulin-1 (NRG-1) .......................................................... 7 iv
9. Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data ................................................................. 7 BAB IV. HASIL YANG DICAPAI....................................................................................... 7 1. Kemajuan Pekerjaan.......................................................................................................7 1. Identifikasi Senyawa Asiatikosida dalam Ekstrak Etanol 70% Pegagan .................... 7 2. Penetapan Kadar Asiatikosida Pada Ekstrak……………………………..…………..8 3. Visualisasi Partikel Menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM)……...8 4. Pembuatan Slide Imunohistokimia ………..……………..…………………………....8 2. Ketercapaian Target Luaran………………………......................................................9 BAB V. RENCANA KEGIATAN SELANJUTNYA .......................................................... 9 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................. 9 LAMPIRAN – LAMPIRAN Lampiran 1. Penggunaan Dana ........................................................................................... vi Lampiran 2. Dokumentasi Kegiatan…………..……………...…………………………..viii
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Aktivasi NRG-1 dan sintesis mielin ................................................................... .3 Gambar 2.2 Pegagan............................................................................................................... .3 Gambar 2.3 Struktur Kimia Glikosida Saponin Triterpenoidpada Pegagan .......................... .4 Gambar 2.4.Perbedaan Struktur Liposome danPhytosome .................................................... .4 Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian.................................................................................4 Gambar 3.2 Rancangan Penelitian secara in vivo.....................................................................5 Gambar 4.1 Plat Hasil KLT pada UV 365 dan secara visual...................................................7 Gambar 4.2 Kromatogram LC dan Fragmentasi Spektra MS/MS Phytosome......................8 Gambar 4.3 Visualisasi Bentuk dan Ukuran Partikel Phytosome…………............................8 Gambar 4.4 (A)Induksi TBI(B)Pengecatan IHK untuk Pemeriksaan NRG-1(C)Slide IHK..9
v
BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah Trauma kepala sebagian besar berdampak serius pada sistem saraf pusat yang dikenal dengan istilah Traumatic Brain Injury (TBI) (Jorge et al., 2005). Menurut Brain Trauma Foundation tahun 2007, TBI paling banyak disebabkan oleh kecelakaan kendaraan bermotor, cedera ketika berolahraga, atau akibat terjatuh. Di Indonesia sendiri, tepatnya di DKI Jakarta, tercatat 53,4% korban kecelakaan mengalami cedera parah terutama pada bagian kepala (Riyadina et al., 2009). Penatalaksanaan pasca TBI sangatlah komplek, yang meliputi rehabilitasi kognitif, emosional, dan sosial (Block and West, 2013). Penurunan kognitif, sosial, dan emosional dapat dikaitkan dengan inflamasi saraf persisten dan cedera penumbra pada keadaan pasca TBI (Tobinick et al.,2012). Gangguan perilaku akibat TBI disebabkan oleh cedera akson sehingga terjadi kerusakan mielin dan atau hilangnya oligodendrosit yang dapat menghambat transduksi sinyal dan mengurangi integritas akson, apoptosis oligodendrosit, dan peningkatan jumlah sel progenitor oligodendrosit. Kerusakan akson menyebabkan penurunan sintesis protein neuregulin-1 (NRG-1) yang berperan dalam pembentukan mielin oleh oligodendrosit sehingga pada kondisi TBI tidak terjadi pembentukan mielin (Calaora et al., 2001). Modulasi NRG-1 pada TBI akan menurunkan gangguan fungsi akibat kerusakan mielin dan dapat menjadi sasaran terapi baru untuk TBI (Flygt J., 2013). Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman yang sangat sering ditemui di semua wilayah di Indonesia. Secara etnomedicine, Pegagan sering digunakan untuk pengobatan berbagai macam penyakit, terutama sebagai wound healing dan neuroprotektor dengan kandungan fitokimia glikosida triterpenoid saponin, yaitu asiaticoside, asiatic acid, madecassoside dan madecasic acid (Alfarra and Omar, 2013). Namun, komponen fitokimia tersebut cenderung bersifat polar sehingga diperlukan cara untuk memodifikasi kepolaran dari ekstrak dengan cara memformulasikan ekstrak dalam bentuk phytosome. Phytosome adalah teknologi terbaru dalam formulasi obat herbal yang dikembangkan untuk memperbaiki farmakokinetika bahan aktif obat herbal yang merupakan pengembangan dari produk herbal konvensional dengan mengikat komponen ekstrak tanaman herbal dengan fosfatidilkolin sehingga dapat dihasilkan produk yang mempunyai tingkat absorbsi yang lebih baik daripada ekstrak herbal konvensional (Sharma and Roy, 2010). Hingga saat ini, belum ada penelitian mengenai efek neuroprotektif Pegagan terhadap peningkatan ekspresi NRG-1 pada TBI sehingga kami mencoba memberikan alternatif pendekatan terapi TBI yang efektif dengan membuat suatu rancangan formulasi sediaan 1
phytosome ekstrak Pegagan dalam upaya modifikasi herbal delivery system sebagai modulator neuregulin-1 (NRG-1) dalam proses mielinasi neuron. 1.2 Rumusan Masalah Rumusan masalah penelitian adalah apakah pemberian phytosome ekstrak pegagan (Centella asiatica) mampu meningkatkan ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan memperbaiki tingkat mielinasi pada model tikus Traumatic Brain Injury (TBI). 1.3 Tujuan Program Tujuan Umum Membuktikan efektivitas phytosome dalam optimalisasi herbal delivery system ekstrak Pegagan (Centella asiatica) sebagai neuroprotektor yang ditandai dengan peningkatan ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan perbaikan tingkat mielinasi neuron. Tujuan Khusus Mengetahui pengaruh pemberian phytosome ekstrak pegagan (Centella asiatica) terhadap peningkatan ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan peningkatan tingkat mielinasi oligodendrosit pada model tikus TBI. 1.4 Luaran yang Diharapkan Luaran yang diharapkan berupa publikasi dan HKI. 1.5 Kegunaan Program Dapat dijadikan sebagai dasar teori tentang potensi phytosome ekstrak Pegagan sebagai modulator NRG-1 dalam proses mielinasi neuron dan kegunaan teknologi phytosome sebagai optimasi herbal delivery system untuk meningkatkan efek terapeutik dari sediaan obat. BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Sistem Saraf Pada tingkat yang paling dasar, fungsi sistem saraf adalah untuk mengirim sinyal dari satu lokasi tubuh ke lokasi lainnya. Sistem saraf terdiri dari neuron dan glia. Neuron mengirimkan informasi ke seluruh tubuh dalam bentuk sinyal listrik di sepanjang akson (badan sel) dan pelepasan neurotransmiter pada sinapsis. Pada sistem saraf pusat, jenis sel glia utama adalah astrosit dan oligodendrosit. Oligodendrosit menghasilkan mielin, yaitu membran kaya lipid yang membungkus akson dan berfungsi sebagai isolator listrik. Mielin mengurangi kapasitansi melintasi membran dan meningkatkan hambatan listrik sehingga meningkatkan kecepatan konduksi listrik pada akson (Darbas, 2004). 2.2 Traumatic Brain Injury (TBI) TBI sering didefinisikan sebagai perubahan fungsi otak. yang bermanifestasi sebagai kebingungan, tingkat kesadaran yang berubah, kejang, koma, dan / atau deficit sensoris fokal atau motoris neurologis diakibatkan tekanan benda tumpul atau penetrasi benda tajam masuk 2
ke dalam kepala (Bruns and Hauser, 2003). Mekanisme utama dari TBI diklasifikasikan sebagai kerusakan otak fokal atau kerusakan otak difus yang dapat mengakibatkan cedera aksonal atau pembengkakan otak (Nortje, 2004). 2.3 Neuregulin-1 (NRG-1) NRG merupakan protein signaling akson yang merupakan ligan dari reseptor tirosin kinase ErBb yang berada pada oligodendrosit (Douglas, 2002). NRG-1 mengatur berbagai aspek perkembangan oligodendrosit termasuk kelangsungan hidup dan migrasi prekursor oligodendrosit serta fungsinya dalam proses mielinasi, yaitu mengontrol ketebalan selubung mielin yang berkaitan dengan ukuran akson (Michailoc et al., 2004). Hilangnya NRG-1 menyebabkan remielinasi terganggu pada saraf yang mengalami kerusakan akibat cedera atau trauma. NRG-1 merupakan faktor penting dalam perbaikan fungsional saraf pada fase awal kerusakan saraf (Fricker et al., 2013). NRG-1 akan mengaktifkan beberapa kaskade second messenger antara lain: phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), MAPK pathways, focal adhesi kinase, dan Ca2+ (Taveggia et al., 2010). Aktivasi berurutan PI3K–AKT/PKB (AKT1)mTOR kinase menyebabkan aktivasi gen mielin yang terkait Gambar 2.1 Aktivasi NRG-1 dan sintesis mielin (Klaus, 2010)
dalam inti sel oligodendrosit (Simon and Lyon, 2013).
2.4 Pegagan (Centella asiatica) Taksonomi dari Pegagan (Centella asiatica) antara lain (Ross, 2005): Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermathophyta
Subdivision
: Angiospermae
Class
: Dicotyledonae
Ordo
: Umbilales
Family
: Umbilaferae (Apiaceaea)
Genus
: Centella
Species
: Centella asiatica (L) Urban
Gambar 2.2 Pegagan
(Ross, 2005). Pegagan mengandung asiaticoside, thankuniside, isothankuside, madecassoside,
brahmoside, brahmic acid, madasiatic acid, hydrocotyline, mesoinositol, centellose, carotenoids, garam mineral, zat pahit vellarine, dan zat samak (Kristina dkk, 2009). Pegagan mampu melindungi kerusakan neuron melalui mekanisme antiinflamasi dan antioksidan dengan meregulasi kadar kalsium intrasel untuk memicu terjadinya mielinasi (Husnul,2009). 3
Gambar 2.3 Struktur Kimia Glikosida Saponin Triterpenoidpada Pegagan(WHO, 1999).
2.5 Phytosome Phytosome merupakan suatu teknologi yang dikembangkan dari pembuatan obat dan nutraceutical, untuk menggabungkan ekstrak dari tanaman yang larut didalam fitokonstituen ke dalam fosfolipid untuk membentuk kompleks molekul lipid (Jain et al., 2010). Keuntungan dari phytosome antara lain dapat Keuntungan dari phytosome antara lain dapat meningkatkan kelarutan dari senyawa fitokonstituen dalam maupundapat secara topikal, dan dalam lemak lemak baik dan secara secara oral signifikan meningkatkan secara signifikan dapat meningkatkan manfaat manfaat terapeutiknya. Selain itu juga dapat terapeutiknya. Selain itu juga dapat meningkatkan meningkatkan absorbsi aktifikatan dan dimana ikatan absorbsi senyawa aktif senyawa dan dimana kimia antara fosfatidilkolin fitokonstituen menunjukkan stabilitas kimia antaradan fosfatidilkolin dan fitokonstituen Gambar 2.4.Perbedaan Struktur yang baik (Sharma and Roy, 2010). menunjukkan stabilitas yang baik (Sharma and Roy, LiposomedanPhytosome(Acharya et al., 2011).
2010).
BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Kerangka Konsep Penelitian Traumatic Brain Injury
Ekstrak dan phytosome Pegagan
Kerusakan saraf
Asiaticoside, madecacosside
Peningkatan ekspresi NRG-1 Influx Ca2+ oligodendrosit
modulasi
Antiapoptosis, peningkatan GSH, mencegah kerusakan mitokondria
Aktivasi PI3K–AKT/PKB (AKT1)- mTOR kinase Sintesis Mielin Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian
Saat terjadi trauma akan terjadi peningkatan ekspresi NRG-1 pada neuron akibat gaya mekanik maupun gangguan supply darah dan oksigen. Ekstrak Pegagan akan meningkatkan ekspresi NRG-1 yang akan memicu kaskade intraseluler untuk mengaktifkan protein regulatory gene yang berakhir pada sintesis serabut mielin. NRG-1 akan berikatan dengan reseptor ErbB pada oligodendrosit.
4
3.2 Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni (true experimental design) di laboratorium secara in vivo menggunakan rancangan Randomized Post Test Only Controlled Group Design. Desain penelitiannya adalah sebagai berikut: TikusRattus norvegicus Wistar jantan, usia4-5 bulan berat badan 300-400 g
Kontrol (-)
Kontrol (+) Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
Perlakuan 4 Perlakuan 5 Perlakuan 6
Induksi Traumatic Brain Injury(TBI) P1 90 mg/kgBB
P2 180 mg/kgBB
P3 360 mg/kgBB
Setelah 2 jam
E1 90 mg/kgBB
E2 180 mg/kgBB
E3360 mg/kgBB
Pembedahan otak pada hari ke-7 (n=2)
Ketebalan mielin
Ekspresi NRG-1
Gambar 3.2 Rancangan Penelitian Keterangan: 1.
Kontrol negatif (n=4): tikus sehat tanpa diberikan perlakuan apapun.
2.
Kontrol positif (n=4) : tikusdiinduksi TBI tanpa diberikan ekstrak dan atau phytosome
3.
Perlakuan 1 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 90 mg/kgBB.
4.
Perlakuan 2 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 180mg/kgBB.
5.
Perlakuan 3 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 360 mg/kgBB.
6.
Perlakuan 4(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 90 mg/kgBB.
7.
Perlakuan 5(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 180mg/kgBB.
8.
Perlakuan 6(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 360 mg/kgBB.
Pemberian ekstrak dan atau phytosome dilakukan 2 jam setelah induksi TBI. Ekspresi NRG-1
diketahui
melalui
pemeriksaan
imunohistokimia
sedangkan
pemeriksaan
histopatologis untuk melihat gambaran ketebalan mielin (Svenningsen and Dahlin, 2013). 3.3 Variabel Penelitian Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak dan phytosome ekstrak Pegagan sedangkan variabel terikat adalah ekspresi NRG-1 dan ketebalan mielin neuron. 3.4 Sampel Penelitian Berdasarkan rumus Federer, jumlah sampel tiap perlakuan minimal 4 ekor tikusn jadi jumlah total tikus yang dibutuhkan sejumlah 32 ekor menggunakan simple random sampling.
5
3.5 Tempat Penelitian Tempat penelitian yang digunakan adalah Lab. Biokimia FKUB, Lab. Patologi Anatomi FKUB, Farmasetika FKUB, Farmakokinetika FKUB, Farmakologi FKUB, dan LSIH UB. 3.6 Definisi Operasional. 1. Phytosome
adalah
gabungan
ekstrak
dari
tanaman
yang
larut
didalam
fitokonstituen dan fosfolipid untuk membentuk kompleks molekul lipid. 2. NRG-1 adalah growth factor yang mempengaruhi proses mielinasi oleh oligodendrosit. 3. Mielinasi adalah proses pembentukan selubung mielin neuron oleh oligodendrosit. 3.7 Alat dan Bahan Bahan penelitian, yaitu ekstrak Pegagan dan phytosome ekstrak Pegagan, Povidon Iodin 10% 50cc, NaCl fisiologis, dan jaringan otak tikus untuk pemeriksaan histopatologis. Alat penelitian adalah sebagai berikut: kandang; tempat minum, dan makanan tikus; peralatan anestesi intraperitoneal; peralatan induksi TBI; timbangan; spuit; pipet hisap; pipet tetes; mikropipet 10-100 µl dan 200-1000 µl dan tipnya; serta imunohistokimia kit. 3.8 Prosedur Penelitian 3.8.1 Perawatan Tikus Tikus ditimbang dan dilakukan adaptasi selama satu minggu di dalam kandang berukuran 30 x 20 cm, tiap kandang berisi 4 ekor tikus. Tikus diberi makan 1 kali sehari. 3.8.2 Ekstraksi Pegagan Setiap 400 mg serbuk kering tanaman ditambahkan 500 ml etanol teknis dan dicampur dalam maserator dengan penggojokan pelan selama 30 menit pada awal perendaman. Campuran disimpan selama 1 hari. Setelah itu filtrat disaring dan pelarut diuapkan dengan rotary evaporator (suhu 800C) (Adianingsih et al., 2013; Pramono dan Ajiastuti, 2004). 3.8.3 Pembuatan Phytosome Pembuatan phytosome melalui metode sonikasi dengan mencampur lecithin, etanol 70%, ekstrak Pegagan, PEG dan natrium cholat, lalu distirer 3 jam dengan magnetig stirer 2000 rpm. Pelarut diuapkan lalu dihidrasi dengan aqua bebas CO2 kemudian disonikasi. Lalu dilakukan karakterisasi menggunakan spektroskopi KLT, LC-MS/MS, dan SEM. 3.8.4 Induksi Traumatic Brain Injury (TBI) Tikus dianestesi kemudian bulu kepala dicukur dan dibersihkan dengan alkohol 70%. Kemudian kulit kepala dibuka. Silinder besi seberat 45 gram (diameter 4mm) dijatuhkan dengan sudut 90º dari ketinggian 100 cm sebanyak 1 kali. Setelah itu kulit kepala tikus dijahit kembali. 2 jam setelah induksi, 3 kelompok perlakuan diberi ekstrak Pegagan dan 3 kelompok perlakuan diberi phytosome ektrak Pegagan intraperitoneum. Setelah 1 minggu pascatrauma diperiksa histopatologi jaringan otak dan imunohistokimia ekspresi NRG-1. 6
3.8.5 Pembuatan Preparat Histopatologi Jaringan Otak, Pewarnaan HematoksilinEosin (HE) dan Pengukuran Ketebalan Mielin Jaringan otak difiksasi mengunakan formalin 10% selama 24 jam, dicuci dengan air kran mengalir atau alkohol 90%, dan dilakukan tahap dehidrasi. Setelah itu, dilakukan tahap pembeningan (clearing), pembenaman (impregnation), pengecoran (blocking), dan pewarnaan HE. Pengamatan dilakukan menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA pembesaran 20x obyektif pada delapan titik tiap slide. 3.8.6 Pemeriksaan Ekspresi Neuregulin-1 (NRG-1) Sampel yang sudah diblok dengan parafin di deparafinisasi terlebih dahulu. Setelah disimpan selama 24 jam dilakukan pengecatan IHK dengan cara sebagai berikut: sampel dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 2x5 menit, tetesi larutan H2O2 selama 30 menit, cuci dengan PBS sebanyak 3x 5 menit, lakukan blocking protein dengan serum 1% selama 20 menit, cuci dengan PBS 3x 5 menit, inkubasi dengan antibodi primer dalam serum 1:500 selama 2 jam pada suhu ruang, cuci dengan PBS 3x 5 menit, inkubasi dengan antibodi sekunder 1:500 selama 1 jam pada suhu ruang, cuci dengan PBS 3x 5 menit, tetesi polimer selama 40 menit, cuci dengan PBS 2x 5 menit, cuci dengan aquadest sebanyak satu kali, tetesi dengan Diamono Benzidine (DAB) dan dibiarkan selama 20 menit, cuci dengan aquadest, tetesi dengan mayer hematoxilen selama 5 menit, tambahkan aquadest, diamkan selama 10 menit, cuci dengan aquadest mengalir, keringkan selama 3 jam, tetesi dengan entelan, dan terakhir tutup dengan coverslip (Fatmawati et al., 2010). Slide hasil pengecatan diperiksa menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA. Kemudian dilakukan pemeriksaan ekspresi NRG-1 dengan pembesaran 20x obyektif dengan 20 lapang pandang pada tiap slide. 3.9 Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data Hasil pengukuran ketebalan mielin dan ekspresi NRG-1 dianalisa menggunakan program IBM SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). BAB IV. HASIL YANG DICAPAI 4.1. Kemajuan Pekerjaan 4.1.1. Identifikasi Senyawa Asiatikosida dalam Ekstrak Etanol 70% Pegagan Identifikasi
kimia
dilakukan
untuk
uji
kualitatif ekstrak sebelum dilakukan uji kuantitatif, identifikasi dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi
Lapis
Tipis
(KLT).
Uji
KLT (A) (B) Gambar 4.1 Plat Hasil KLT (A) pada UV 365 nm (B) visual
7
menggunakan larutan standar asiatikosida 1 mg /1 ml metanol dan ekstrak pegagan 30 mg/3 ml metanol, menggunakan eluen dengan perbandingan pelarut kloroform:asam asetat glacial:metanol:air (60:32:12:8), perhitungan konstanta dielektrik campuran eluen adalah 13.575 < 15 menunjukkan campuran eluen bersifat non polar, penampak noda anisaldehid asam sulfat (anisaldehid 0.5 ml, asam asetat glacial 10 ml, metanol 85 ml, dan asam sulfur 5 ml), dan fase diam plat KLT. 4.1.2 Penetapan Kadar Asiatikosida Pada Ekstrak Penetapan kadar asiatikosida menggunakan metode LC–MS/MS tervalidasi. Kadar asiatikosida ekstrak etanol 70% pegagan yang didapatkan adalah 0.232 %.
Gambar 4.2. Kromatogram LC dan Fragmentasi Spektra MS/MS Phytosome
4.1.3 Visualisasi Partikel Menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM)
Gambar 4.3. Visualisasi Bentuk dan Ukuran Partikel Phytosome
. Dari hasil analisis SEM didapatkan rentang diameter phytosome antara 1,39-2,06 μm. 4.1.4. Induksi TBI dan Pembuatan Slide Imunohistokimia Tikus diinduksi TBI menggunakan tabung silinder besi 45 gram yang dijatuhkan ke bagian kepala. Setelah perlakuan selama satu minggu, dilakukan pemeriksaan histologi otak untuk mengukur ketebalan mielin dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan pengukuran ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dengan immunohistokimia. 8
(A)
(B)
(C)
Gambar 4.4. (A) Induksi TBI (B) Pengecatan IHK untuk Pemeriksaan NRG-1 (C) Slide IHK
4.2. Ketercapaian Target Luaran No.
Keterangan
Proporsi
Ketercapaian
No.
Keterangan
Proporsi
Ketercapaian
1
Mengurus ethical clearance
3%
3%
9
Induksi TBI
6%
6%
2
Perijinan laboratorium
2%
2%
10
Pemberian Ekstrak/Phytosome
3%
3%
3
Persiapan alat dan bahan
7%
7%
11
Pembedahan
20%
20%
4
Aklimatisasi tikus
8%
8%
12
Pembuatan slide preparat
3%
3%
5
Ekstraksi Pegagan
8%
8%
13
Pemeriksaan histologis
6%
0%
6
Karakterisasi ekstrak
5%
5%
14
Pemeriksaan ekspresi NRG-1
6%
6%
7
Pembuatan phytosome
6%
6%
15
Analisa Data
5%
0%
8
Karakterisasi phytosome
7%
7%
16
Penyusunan laporan akhir
5%
0%
100%
84%
Total
Perkembangan Penelitian
Total Penelitian Kegiatan terlaksana 0%
50%
100%
84%
BAB V. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA Saat ini sedang dalam proses penghitungan ekspresi NRG-1 dan pembuatan slide histologi jaringan otak dengan pewarnaan HE. Rencana tahap berikutnya yang akan dikerjakan: 1. Pemeriksaan histologis myelin. 2. Analisa data. 3. Penyusunan laporan akhir dan pembuatan artikel ilmiah untuk paten. DAFTAR PUSTAKA A. Darbas.2004. Cell autonomy of the mouse claw paw mutation. Dev Biol 272, 470. Adianingsih O.R., Sulistiyani P.., Zulkarnaen., Alfiantya P.F., Agustin E.N.S. 2013. Characterization and Effect of Lotion Containing Centella asiatica ExtractPhospholipid for Irritant Contact Dermatitis. Unpublished. Malang: UB. Alfarra, Helmi Yousif and Omar, Muhammad Nor. 2013. Centella asiatica : from folk remedy to the medical biotechnology. International Journal of Bioscience.Vol.3, No. 6, p.49-67. Åsa Fex Svennigsen and Lars B. Dahlin. 2013. Repair of the Peripheral Nerve— Remyelination that Works. Brain Sci 3, 1182-1197; doi:10.3390/brainsci3031182. Block, Cady K.West, Sarah E. 2013. Psychotherapeutic treatment of survivors of traumatic brain injury: Review of the literature and special considerations. 9
Brain Trauma Foundation. 2007. TBI Statistics. Online. https://www.braintrauma.org/tbifaqs/tbi-statistics/. Diakses pada 20 Oktober 2013. Bruns J, Hauser WA. 2003. The epidemiology of traumatic brain injury: A review. Epilepsia. (Suppl. 10):2–10. C. Werner and K. Engelhard. 2013. Pathophysiology of traumatic brain injury.Oxford Journals Medicine BJA.Volume 99, Issue 1 Pp. 4-9. Center of Disease Control and Prevention.Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths.Online. 20 Oktober 2013. Dahlan, M. Sopiyudin. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans. Hal. 4-26. Edward Tobinick, Nancy M. Kim, Gary Reyzin, Helen Rodriguez-Romanacce, Venita DePuy. 2012. Selective TNF Inhibition for Chronic Stroke and Traumatic Brain Injury An Observational Study Involving 629 Consecutive Patients. Fatmawati, Heni dkk.2010. Pengaruh Likopen terhadap Penurunan Aktivitas Nuclear Factor kappa Beta (NF-kB) dan Ekspresi Intracelular Cell Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) pada Kultur HUVECs yang Dipapar Leptin. Jurnal ILMU DASAR,Vol.11 No.2:143. Flygt J, Djupsjö A, Lenne F, Marklund N.2013.Myelin loss and oligodendrocyte pathology in white matter tracts following traumatic brain injury in the rat.Epub. Fricker F.R, et al. 2013. Axonal Neuregulin 1 is a Rate Limiting but not Essential Factor for Nerve Remyelination. Brain: A Journal of Neurology. 136; 2279–2297. George M., Joseph L and Ramaswamy. 2009. Anti-allergic, Anti-pruritic and Antiinflammatory Activities of Centella Asiatica Extracts. Afr J. Traditional, Vol.6(4):554 Jain N., Gupta BP., Thakur N., Jain R., Banweer J., Jain DK., Jain S. 2010. Phytosome: A Novel Drug Delivery System for Herbal Medicine. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, Vol.2(4): 224-228. Jorge RE, Starkstein SE, Arndt S, Moser D, Crespo-Facorro B, Robinson RG. 2005. Alcohol misuse and mood disorders following traumatic brain injury. Archives of GeneralPsychiatry;62:742–749. Khotimah, Husnul, Riawan W., Kalsum U. 2009.Efek Neuroprotektif Ekstrak Pegagan (Centella asiatica) terhadap BDNF (Brain-Derived Neurotropic Factor), TNFaR, NFkB dan Apoptosis pada Kultur Sel Saraf yang Diinduksi LPS. UB. Kristina NN, Kusumah ED, Lailani PK. 2009. Analisis Fitokimia dan Penampilan Polapita Protein Tanaman Pegagan (Centella asiatica) Hasil Konversi In Vitro. Bul. Littro, Vol 20 (1):11-20. Nortje J, Menon DK. 2004. Traumatic brain injury: physiology, mechanisms, and outcome. Curr Opin Neurol.17:711-8 Pramono S dan Ajiastuti D. 2004. Standarisasi Ekstrak Herba Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) berdasarkan Kadar Asiatikosida secara KLT-Densitometri. Majalah Farmasi Indonesia, Vol. 15 (3): 118-123. Riyadina, Woro dkk. 2009. Pola dan Determinan Sosiodemografi Cedera Akibat Kecelakaan Lalu Lintas di Indonesia.Online.http://indonesia.digitaljournals.org/index.php/idnmed. Diakses pada 20 Oktober 2013. Ross, I.A. 2005. Medicinal Plants of the Worlds Volume 3: Chemical Constituents, Traditional and modern Medicinal Uses. Totowa : Humana Press Inc. Sharma S and Roy RK. 2010. Phytosome: an Emerging Technology. International Journal of Pharma Research and Technology, Vol.2(s):1-7. Simon M and Lyons DA. 2013. Axonal selection and myelin sheath generation in the central nervous system. Cell Biology,25:512-51. Taveggia, C., Feltri, M. L. & Wrabetz, L. 2010. Signals to promote myelin formation and repair.Nature Rev. Neurol. 6, 276–287. 10
LAMPIRAN 1. Penggunaan Dana Periode Bulan Februari 2014 Tanggal
Uraian Kegiatan
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
31-10-2013
Fotokopi + jilid proposal
12.000,00
03-01-2014
Toples
24.000,00
Etanol 70%
110.000,00
24-01-2014
Fotokopi + jilid mika
12-02-2014
Etanol 70%
13-02-2013
Es batu
4.000,00
14-02-2013
Es batu
2.500,00
17-02-2014
Es batu
4.000,00
Es batu
4.000,00
26-02-2014
25.500,00 130.000,00
Pembelian buku logbook
30.000,00
Dana talangan rektorat
2.500.000,00
Es batu
7.000,00 Total
Saldo Februari 2014
2.500.000,00
353.000,00
2.147.000,00
Periode Bulan Maret 2014 Tanggal
Uraian Kegiatan
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
01-03-2014
Saldo Februari 2014
06-03-2014
Simplisia serbuk Pegagan
90.000,00
16-03-2014
Handscoen
45.000,00
Masker tali
33.000,00
Alkohol swab
17.000,00
17-03-2014
2.147.000,00
Gunting
3.000,00
Lakban bening
8.500,00
Sekam kayu
15.000,00
18-03-2014
Tempat minum mencit
62.500,00
19-03-2014
Sekam kayu
15.000,00
Pars Tikus Aquabidest 2L Aquadest Etanol 70% 1 L
7.000,00 1.225.000,00 50.000,00 2.500,00 125.000,00
vi
Pipet tetes
4.000,00
Botol penicillin 6 buah
6.000,00
Botol obat 7 ml
1.000,00 Total
Saldo Maret 2014
2.147.000,00
1.709.500,00
437.500,00
Periode Bulan April 2014 Tanggal
Uraian Kegiatan
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
01-04-2014
Saldo Maret 2014
437.500,00
02-04-2014
Tepung 2 kg
10-04-2014
Jilid mika proposal
4.000,00
Tepung
9.700,00
11-04-2014
Fotokopi proposal
3.600,00
14-04-2014
Plain catgut 2-0
19.400,00
10.500,00
Spuit 1 cc 3 buah
16-04-2014
3.000,00
Sekam kayu
15.000,00
Jarum pentul
2.000,00
Catgut plain 3/0 2 pak
11.000,00
Spuit 3 cc 5 buah
5.000,00
Pot kuning 5 buah
10.000,00
Needle 5 buah
20-04-2014
23-04-2014
3.000,00
Terigu 2 kg
13.000,00
Handscoen
46.000,00
Tepumg terigu 2 kg
20.800,00
Fotokopi
4.500,00
Sekam kayu
15.000,00
LC-MS
2.050.000,00
24-04-2014
Fotokopi
1.600,00
28-04-2014
Needle 1 kotak
40.000,00
Spuit 1 cc 14 buah
14.000,00
Iuran anggota
1.863.600,00 Total
2.301.100,00
Saldo Periode April 2014
2.301.100,00
0
Periode Bulan Mei 2014 Tanggal 01-05-2014
Uraian Kegiatan Saldo April 2014
Debet (Rp)
Kredit (Rp) 0
vii
Pembayaran SEM 02-05-2014
250.000,00
Glukosa 5%
7.000,00
Handscoon
46.000,00
03-05-2014
Tepung 1 kg
10.300,00
04-05-2014
Povidon Iodine 60ml
4.500,00
Kasa OM
8.500,00
20-05-2014
Tikus 20 ekor
525.000,00
Urunan anggota
960.400,00
26-05-2014
Alkohol swab
17.000,00
28-05-2014
Xyla 3 ml
30.000,00
Plain catgut 1 buah
5.500,00
Gentamycin 0,1%
2.500,00
Alkohol 70% 30-05-2014
31-05-2014
20.300,00
Spuit 1 ml 10 buah
7.000,00
Plain catgut 3 buah
16.500,00
Tepung
10.300,00 Total
960.400,00
Saldo Periode Mei 2014
960.400,00 0
Periode Bulan Juni 2014 Tanggal
Uraian Kegiatan
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
01-06-2014
Saldo Mei 2014
02-06-2014
Masker
30.000,00
Handschoen
46.000,00
Masker Glukosa 5% 2 buah
03-06-2014
3.000,00 14.000,00
Spuit 3 cc 5 buah
5.000,00
Botol organ 5 buah
5.000,00
Xyla 5 ml
50.000,00
Catgut 3 buah
16.500,00
Handschoen
46.000,00
Spuit 1 cc 25 buah
25.000,00
Fee laboran untuk sonde 06-06-2014
0
100.000,00
Xyla 5 ml @ Rp 10.000,00
50.000,00
Pot 10 buah @ Rp 1.000,00
10.000,00
Glukosa 5%
6.500,00
viii
23-06-2014
Pars Tikus 57,6 kg @Rp 8.450,00
486.720,00
Sekam 10 pak @Rp 15.600,00
156.000,00
Fee tempat hewan coba 2 bulan @Rp
100.000,00
50.000,00 Injeksi hewan coba 22x @ Rp 1.000,00
26-06-2014
22.000,00
KCl 7 gram @Rp 800,00
5.600,00
Di-natrium hydrogen 2,4 mg @Rp 3.225,00
7.740,00
Di-natrium hydrogen 1,2 mg @Rp 1.100,00
1.320,00
Kalium dihidrogen 0,7 gram @Rp 4.100,00
2.870,00
Aquadest steril 0,1 L @ Rp 16.000,00
1.600,00
Coverglass Duran
28.000,00
Immunohistokimia kit 27-06-2014
2.887.500,00
Iuran Anggota
4.106.350,00 Total
4.106.350,00
Saldo Periode Juni 2014
0
Total Penggunaan Anggaran Feb-Juni 2014 Rp 9.430.350,00 (85,7%) 2.
Dokumentasi Kegiatan
Rapat perdana
Ekstraksi Pegagan
Survey ke laboratorium
Penyiapan bahan untuk
farmakognosi & fitoterapi
ekstraksi
Homogenasi menggunakan
Pengeringan pelarut
magnetic stirrer
menggunakan rotavapor
ix
Penghilangan kandungan air
Karakterisasi menggunakan
menggunakan vacum drying
Preparasi larutan standar
Karakterisasi menggunakan
Karakterisasi menggunakan
LC-MS/MS
SEM
Penggantian sekam tikus
Pembedahan
KLT
Pemberian makan tikus
Tikus aktif pasca induksi Induksi TBI
TBI
Deparafinisasi
IHK
x
Induksi TBI didampingi oleh dosen pembimbing
Otak dalam Formalin Presentasi monev fakultas I
xi
