PSl
48 Jakarta
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Status Kekebalan dan Efikasi Protektif dari Vaksin Subunit Protein Rekon1binan NS I-Dengue 1 (Strain Indonesia, Bekasi 2003915846) pada Mencit (Balb/c)
\
.
Whinie Lestari & Tim
KEMENTERIAN KESEHATAN RI, JAKARTA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
2012
.
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Status Kekebalan dan Efikasi Protektif dari Vaksin Subunit Protein Rekombinan NS I-Dengue 1 (Strain Indonesia, Bekasi 2003915846) pada Mencit (Balb/c)
Whinie Lestari & Tim
KEMENTERIAN KESEHATAN RI, JAKARTA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
2012
SUSUNAN T IM PENELITI l\ o
I
NAMA
KEAHLIAN/
KEDUDUKAN
KESARJt\l'AAN
DALAM TIM
Ka Puslitbang B iom edis
N a rasum ber
& Teknologi Dasar
penelitian
Prof Dr. J\gus
Virologi Dengue
N arasum ber
Sjarurahman Ph.D ' )
(Mikrobiologi
Dr. Tjahjani
Soediro PhD
5
Narnsu mb er
Virologi
protein rckombinan NS I
Dr. drh. Joko Pa mungka s ,
Narasumber
8
hev•an
untuk pcnanganan
Bol?,or)
coba dan uji challenQ.c
Dr. C.S. Whinic Lestari
Biomedik
Ketua Pelaksana/
Drh. Rita Mariela Dcwi
Peneliti Muda Biomedik
Pencliti Madya
Dr. Drh. Diah lskandriati
Bcrt ang g ung jawab alas
scmua kcgiatan penclitian Bertanggung jawab atas vaksinasi hewan coba
Peneliti Madya
Animal mode1
Bertanggungjawab atas uji challenge
Drh. Imelda, M.Sc (Pusat
Animal model
Peneliti
Studi Prim ata 8ogor)
9
Mcmbcrikan bimbingan
MSc (Pusat Studi Primata,
M.Kes 7
kekebalan pasca vaksimisi Mcmbcri.kan bi mb ing an di bidang vaksinasi dengan
FK U I)
M.Kcs 6
Memberikan bimbingan untuk evaluasi status
FK UT)
Mirawati
(Mikrobiologi 4
Memberikan birnbingan kerjasama dan kegiatan
Kesehatan 2
UR.l\IAN T U G A S
Dr.
Reni Herman
Bertanggung jawab atas oemeliharaan hewan coba
Virologi
Peneliti Pertam a
M.Biomed
Be 1tan ggu ngjaw ab atas penentuan titer virus untuk uji challenge
JO
111 12 13
Budi Nuratmi BSc Siti f'v1ariyani AMAK
Riomedik
l'eneliti Madya Pem banlu
Anal is
Peneliti
15 16 17
Membantu pclaksanaan pemcriksaan ELISA
Driya Shintia Dcwi
Pembantu
Membantu pelaksanaan
Aditianti, S.Si
Peneliti
pemcriksaan uji Complement
Anisa Yunita, A.tvlAK
Pcm ban tu
Membantu pclaksanaan
fixation test. Pcneliti
vaksinasi
Teti Fitriani, AMD
PcmbanLU
Membantu pclaksanaan u_1i
P encli ti
challcn�c
Masnur Siringo-ringo
Pembanlu
Membantu mcngolah data
I
14
Re1tanggung jawab untuk cvaluasi status kekcbalan
Peneliti lrnu Rahman Hambrah Sri \�/uryani
SL It\ SLT1\
Pe111bann1
Bertanggung jawab atas
Peneliti
ad111inistrasi penelitian
Pembantu
Be1tanggung jawab atas
Peneliti
administrasi penel ! tian
3
� � .,.,.I
Hll"'t
KEMENTERIAN KESEHATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
lalan Percetakan Negara No. 23 Jakarta 10560 Kotak Pos 1226 Jakarta 10012
Telepon (021) 42881758, 42881763, 42881762, 42881745 (021) 42881754 Fax
KEPU TU SAN KEPALA PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN NOMOR: HK.03.05/llln50/2012 T E N TA N G
PEMBENTUKAN TIM PELAKSANA PENELITIAN TAHUN 2012 KEPALA PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN MENIMBANG
MENGINGAT
: a.
bahwa untuk melaksanakan kegiatan penelitian pada Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, perlu ditunjuk Tim Pelaksana Penelitian Tahun 2012;
b.
bahwa berdasarkan pertimbangan huruf a tersebut diatas, maka dipandang perlu menetapkan Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan tentang Pembentukan Tim Pelaksana Penelitian Tahun 2012 sejumlah tujuh belas penelitian;
1.
Undang-Undang Nomor 23 Tahun 1992 tentang Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia tahun 1992 Nomor 100, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 3495);
2.
Undang-undang Nomor 14 Tahun 2001 tentang Paten (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2002 Norn or 109, Tambahan Lembaran negara Republik Indonesia Nomor 4130);
3.
Peraturan Pemerintah RI No. 39 Tahun 1995 tentang Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Lembaran . Negara Tahun 1995 Nornor 67, Tambahan Lembaran Negara Nomor 3609);
4.
Peraturan Pemerintah Nomor 20 Tahun 2005 tentang Alih Tehnologi Kekayaan lntelektual serta hasil Penelitian dan Perigembangan oleh Perguruan Tinggi dan Lembaga Penelitian dan Pengembangan (Lembaran Negara Tahun 2005 Nomor 43, Tambahan Lembaran Negara Nomor 4497);
5.
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 791/Menkes/SKNll/1999 tentang Koordinasi Penyelenggaraan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan;
6. i
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1179A/Menkes/SK/X/1999 tentang Kebijakan Nasional Penelitian dan Pengembangan Kesehatan; Peraturan Presiden Nomor 47 Tahun 2009 tentang Pembentukan dan Organisasi Kementerian Negara.
MEMPERHATIKAN
7.
Peraturan Menteri Kesehatan No. 1144/Menkes/PerNlll/2010 Organisasi dan Tata Kerja Kementerian Kesehatan;
8.
Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No.HK.03.05/4/11675/ 2011 tanggal 30 Desember 2011 tentang Penetapan Kuasa Pengguna Anggaran, Pejabat Pembuat Komitmen, Pejabat Penguji dan Penandatanganan SPM, Bendahara Pengeluaran dan Bendahara Penerimaan pada Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan di Jakarta tahun anggaran 2012;
1.
Oaftar lsian Pelaksanaan Anggaran (OIPA) Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan tahun 2012 dengan No.0683/024-11.1.01 /00/2012, tanggal 9 Desember 2011; 1
tentang
"
·�+ Ill .,
f;.
I
KEMENTERIAN .KESEHATAN RI BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN � ()
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
"'If' H\l
Telepon (021) 42881758, 42881763, 42881762, 42881745 (021)42881754 Fax
Jalan Percetakan Negara No. 23 Jakarta 10560 KotakPos 1226Jakarta 10012 ·
MEMUTUSK AN MENETAPKAN KESATU
dis
dan
Teknologi
Dasar
Penelitian Biome 1) Membentuk Tim Pelaksana lampiran keputusan ini; imana tercantum dalam aga seb 2 201 Kesehatan Tahun
ogi Dasar at Biomedis dan Teknol ana Penetitian pada Pus aks Pel Tim diberikan ada at Kep dap 2) Anggaran 2012, ang Kesehatan Tahun Kesehatan, Sadan Litb ini; n 2 Keputusan na tersebut dalarn lampira honorarium sebagaima tugas sebagai beri\
KEOUA
keputusan ini;
Penelitian , Laporan Pelaksanaan n Kemajuan Pene:litian Teknologi dan Menyerahkan Lapora Pusat Siomedis elitian kepada Kepala dan Laporan Akhir Pen Oasar Kesehatan. Pusat wab kepada Kepala ya, Tim bertanggungja asn tug kan ana laks Dalam me n laporan serta wa)lb menyampaika gi Dasar Kesehatan Siomedis dan Teknolo iatan; i pertanggungjawaban keg akhir penelitian sebaga un 2012 Pelaksana Penelitian Tah iatan serta honor Tim Dasar Siaya pelaksanaan keg gi nolo Tek medis dan garan DIPA. Pusat Sio dibebankan pada ang 2; Kesehatan Tahun 201 ber 2012 i sarnpai dengan Oesem laku sejak bulan Januar Keputusan ini rnulai ber dalam yata terdapat kekeliruan bila dikemudian hari tern apa uan ent ket gan den a. han sebagaimana mestiny an perbaikan dan peruba penetapan ini akan diadak
2)
KETIGA
KEEMPAT
KELIMA
Tembusan Yth: 1. Sekretaris Jenderal Kemenkes RI; 2. lnspektur Jenderal Kemenkes RI 3. Ketua Badan Pemeriksa Keuangan;
dan Pembangunan; Kepala Sadan Pengawasan Keuangan ngan Kesehatan: emba Peng dan litian 5. Kepala Sadan Pene ngan Kesehatan; 6. Sekretaris Badan Penelitian dan Pengemba a; 7. Kanwil Ditjen Anggaran Kemenkeu RI DKI Jakart Kesehatan; g Litban 8. Para Kepala Pusat di Lingkungan Sadan logi Dasar Kesehatan; Tekno dan dis Siome t 9. Kepala B�gian Tata Us aha Pusa . . Dasar Kesehatan; logi Tekno dan dis Biome Pusat 10. Kepala B�dang Slomed1s! dis dan Teknologi Oasar Kese·tlatan 11. Kepala 81dang Tekno!og1 Oasar Kesehatan, Pusat Siome Oasar Kesehatan; ogi 12. Ben aharawan Pengeluaran Pusat Siomedis dan Teknol . kutan untuk dilaksanakan. 3. 4.
1
�
Mas1ng-mas1ng yang bersang
2
KEMENTERIAN.KESEHATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN Jalan Percetakan Negara No. 23 Jakarta 10560 Kotak Pos 1226 Jakarta 10012
Telepon (021)42881758, 42881763, 42881762, 42881745 (021)42881754 Fax Lampiran 1 Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar
Kesehatan
Nomor Tanggal
:
HK.03.05/111/750/2012 6 Februari 2012
SUSUNAN TIM PELAKSANA PENELITIAN T AHUN 2012 STATUS KEKEBALAN DAN EFIKASI PROTEKTlF DARI VAKSIN SUB UNIT PROTEIN REKOMBINAN NS-1 DENGUE (STRAIN INDONESIA, BEKASI 2003915846) PADA MENCIT (BALB/C)
1.
dr. CS. Whinie Lestari, M.Kes
Peneliti Muda/Ketua Pelaksana
2.
drh. Rita Marleta Oewi, M.Kes
Peneliti Madya
3.
Dr. drh. Diah lskandriati
Peneliti Madya
4.
Budi Nuratmi, B,Sc
Peneliti Madya
5.
dr. Reni Herman, M.Biomed
Peneliti Pertama
6.
drh. Imelda, M.Sc
Peneliti Non Fungsionat
7.
Siti Mariyani, AMAK
Pembantu Peneliti
8.
Oriya Syinta Aditinati, S.Si
Pembantu Peneliti
9.
Anisa Yunita, AMAK
Pembantu Peneliti
10.
Teti Fitriani, AMO
Pembantu Peneliti
11.
Masnur Siringo-ringo
Pembantu Peneliti
12.
Budi Rahayu
Pembantu Peneliti
13.
Hambrah Sri Wuryani
Pembantu Peneliti
24
� �>-1 H\l'?$
KEMENTERIAN .KESEHATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN Telepon (021)42881758, 42881763, 4288I762, 42881745
Jalan Percetakan Negara No. 23 Jakarta 10560 KotakPos 1226 Jakarta 10012
Fax
(021)42881754
Lampiran 2 Keputusan Kepala Dasar Kesehatan
.
Biomedis
dan
Teknologi
HK.03.05/111/750/2012 6 Februari 2012
Nomor Tanggal
JUDUL PENELITIAN
Pusat
I VAKSIN . EFIKASI PROTEKTIF DAR STATUS KEKEBALAN DAN (STRAIN OMBINAN NS·1 DENGUE SUB UNIT PROTEIN REK C) LB/ (BA 5846) PADA MENCIT INDONESIA, BEKASI 200391
UN 2012 AKSANA PENELITIAN TAH JUMLAH HONOR TIM PEL
1.
Peneliti muda
jam, per-minggu =Rp. Jumlah honor yang diterima persebesar
40.000
2.
Peneliti Madya
jam, per-mlnggu =Rp. Jumlah honor yang diterima persebesar
.50.000
3.
Peneliti Pertama
per-minggu Jumlah honor yang diterima per-jam, sebesar
=Rp.
35.000
4.
Peneliti Non Fungsional
per-minggu Jumlah honor yang diterima per-jam, sebesar
=Rp.
30.000
5.
Pembantu Peneliti
per-minggu Jumlah honor yang diterima per-jam, sebesar
=Rp.
20.000
�
'
\
'. I '....
'" ;•._,
.
p
...·.·� / .,�, /,
',PW'i Sampurno, M.Si., Apt
'· � ·ond ti -.<� r§
Nlf':·., 9132·1119 198803 1oo 1
25
RIN GK.ASAN EKSEKUTIF Penyakit demam berdarah dengue (DBD) sampai saat ini masih merupakan masalah kesehatan m asyarakat di Indonesia dan rnerupakan salah satu program prioritas
utama di bidang keschatan. Hingga saat ini belum ada vaksin dengue yang terseclia di pasaran,
yang
ada
hanya
kandidat
vaksin
dengue
schingga
masih
di butuhkan
pen ge mb an gan vaksin yang aman dan halal. Studi awal pengembangan vaksin menggunakan virus DEN inaktif menghasilkan hilan gn ya
imunogenisitas
virus
sebagian
karena
proses
inaktivasi.
Selanjutnya
dikembangkan live attenuated vaccine yar.g dapat memicu kekebalan protektif tinggi, namun menimbulkan komplikasi klinis yang tidak diharapkan. Sehi ngga pengembangan vaksin saat ini ke arah sub unit protein rekombinan dan DNA rekombinan.
Tahun 2009 dan 2010 telah dilakukan pencl itian pengembangan vaksin Dengue den gan teknologi sub unit protein rckom bi nan yang berasal dari protein Non Struktural J virus Dl�N l strain Indonesia (Bekasi 2003915846) dengan sistem ekpresi di Pichia pastoris. Telah dihasilkan construct dari plasmid pPICZ alpha B di E.coli Top I OF yang mengeksp rcsikan protein rckornbinan DEN-l -NS 1. Kemudian tel ah diproduksi protein
rekombinan DEN -1-NS 1 dengan berat molekul 120 kDa yang menggunakan sistem ekspresi sekresi dari sel inang Pichia pastoris. Protein rekombinan yang dihasi lkan telah
diverifikasi dengan PCR, sekuensing, SDS PAGE, ELISA dan Western Blott dan masih menunjukkan respon imunogcnisitas se pcq i bentuk \Vild typenya. Pcnelitian lanjutan bertujuan
untuk mengetahui
status kckebalan dan cfikasi
protcktif subunit
vaksin
rekombinan NS 1-DEN-1 pada hevvan coba mencit Balb/c.
Hasil status kekebalan pada mencit I3alb/c yang telah divaksinasi dengan protein rekombinan rNS I. dibcri adjuvan Freund dan aluminium hidroksida dengan rata-rata titer
antibodi (OD 450 nm) be11urut-turut scbagai bcrikut OJ25; 0.292; OJOl. Pemberian vaksinasi dilakukan sebanyak
3
kali
dengan interval
I
m i nggu dan dosis protein
rekombinan rNS l 50 ug/ml. Hasil ini menunjukkan telah terjadi peningkatan titer antibodi dibandingkan dcngan
kelompok kontrol
yang divaksin dengan PBS (titer
antibodi: 0,062) dan plasmid pPlCZaB (titer antibodi: 0.057).
Rata- rata titer antibocli lebih tinggi pada pemherian vaksin
clengan acljuvant
dibandingkan tanpa adjuvant. Pemberian vaksin protein rekombinan dengan adjuvant Freund hasilnya lebih tinggi dari pada adjuvant Aluminium hidroksicla karcna acljuvant Freund merupakan adjuvant yang scsuaj untuk mcncit Ralb/c. Namun pemberian dengan adjuvant Alum juga menunjukkan titer antibodi yang lebih tinggi dibandingkan vaksin yang tanpa adjuvant dan adjuvant alum merupabn acljuvant yang sesuai untuk manusia. Sehingga dapat dipertimbangkan untuk pembcrian vaksin protein rekornbinan rNS l juga dapat diberikan tambahan adjuvant J\lurn untuk menghasilkan respon kekcbalan yang lebih optimal. Hasil kelompok
uji challenge tidak mencit
Balb/C.
diternukan kelumpuhan
Hasil
ini
mcnunjukkan
susceptible jika dilakukan pada mencit umur diatas
dan
bahv.·'a
kematian mencit
pada
seluruh
Balb/c
kurang
6 minggu. Sehingga kckcbalan
protektif diukur dengan titer antibodi pasca uji challenge. Rata-rata titer antibo
2
ABSTRAK
Virus dengue yang ditularkan melalui gigitan nyamuk dapat menyebabkan penyakit dernam dengue/demam berdarah deng ue/dengue shock syndrome, sehingga menjadi prioritas utama
untuk
pengendaliannya.
Vaksinasi
merupakan
salah
satu
alternatif
strategi
pengendalian yang efektif. Beberapa penelitian telah mengidentifikasi bahwa protein non struktural 1 (NS 1) merupakan antigen yang menjanjikan untuk pengembangan vaksin dengue. Penelitian ini menggunakan protein rekombinan NS I DEN-1 strain Indonesia yang diekspresikan
pada
Pichia pastoris.
Vaksinasi
dilakukan
intramuscular, kemudian dilanjutkan dengan uji challenge
pada
mencit
Balb/c
secara
dengan virus DEN-I secara
intravena. Hasilnya rnenunjukkan bahwa vaksin subunit protein rekornbinan NS 1 DEN-1 dapat memberikan reaksi irnunogenisitas dan respon irnun terhadap infeksi virus Dengue liar.
DAtTAR ISi
Hal. RINGKA.SAN EKSEKUTTF SUSUNAN TIM PENEUTI I. II.
llf. rv.
V.
LATAR BELAKANG RUM USAN MASALAH TUJUAN I. Tujuan Umum 2. Tujuan K.husus
...... . .. . . ..... ... ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . ..... . . . . ....... . . . .......
6
8 8 8
MANFAAT
METODE I. Kerangk a Pikir 2. Tempat dan Waktu Pe nelitian 3. Desain Peneli tian 4. Je nis Penelitian 5. Populasi dan Sampel Populasi Sampel 6. Uji Laboratorium
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......
9 9
... . . .. . ......... ..... . . .....
9 10 10 10 10 10 10
HASIL PENFUTJAN
17
DAFTA R KEPUSTAKAAN
21
LAMPIRAN •
Persetujuan Etik Komisi Etik Pene litian Ke sehatan Badan Litbangkes
2
DAFTARGAMBAR Gambar 1. Protein
structural dan non structural virus Dengue (Whitehead et al, 2007)
Gambar 2. Struktur virus
dengue (Zang W et al, 2003)
Gambar 3. Anestesi mencit
.4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Balb/c secara intra peritoneal dengan Ketamin dan Xylazine
sebelum pengambilan darah .
Ga'Ilbar 4.
....
...........................
.
............... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..
.
...
.......
17
Pengambilan darah sinus retro orbital ............................................................. 18
Gambar 5. Uji challenge
dengan injeksi intravena pada vena cauda dengan konsentrasi 5 titer virus Dengue serotype l sebesar 7 ,5 x 10 PFU ...................................... 19
DAFTAR TABEL Tabel 1. Distribusi serotipe Dengue pada tersangka penderita DBD anak & dewasa di RS OKI (Th 2009)
...
..
.................
.
.......
.
..........................................
.
..........
.. .. ..
.....
.5 .
DAFTARGRAFIK Grafik 1. Rata-rata titer Antibodi pasca vaksinasi untuk menunjukkan status kekebalan terhadap Dengue serotipe I dengan metode ELISA ............................................ 19 Grafik 2. Pengukuran ELISA : rata-rata titer antibodi terhadap virus Dengue pasca uji Challenge
..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
I.
LATAR BELAKANG
Penyakit demarn berclarah dengue kesehatan masyarakat di keschatan.
Sampai
saat
vector masih belum
Indonesia
ini
(0 80)
anti virus dengue bclum
obat
dibutuhkan pengembangan
merupakan masalah
prioritas di bidang
ada clan program
KL8 080. Vaksinasi al,
pengendalian paling efektif (Mustafa et
pasaran,
ini masih
clan mcrupakan salah satu program
berhasil mencegah
dengue yang terscdia d i
sampai saat
pcngcndalian
merupakan
s t rnk
gi
200 8 ). Hingga saat i n i belum ada vaksin
yang ada hanya kandidat vaksin dengue schi ngga masih
vaksin yang aman clan halal.
Virus Dengue ditularkan ke manusia melalui gigitan nyamuk
yang
telah terinfeksi
terutama jenis nyamuk Aedes aegypti clan Aedes albopictus ( Gu b ler, 1998). Virus Dengue tcrmasuk dalam genus Fla viv i rus. fami li Flaviviridac. terdiri dari
4
D EN-2 .
rncm i l i k i
DEN-3.
positive sense
cla n DEN-4). Flavi v i rus merupakan virus yang
Rl\iA
untai tunggal,
dengan
kopi dari dua g l ikoprotein, mempunyai satu open reoding pulyprotein. Amino terminal dari
genorn
tcrcliri clari
struktural clan 7 protein non struktural ( F l amand
!
..
-- 1 �. ...
•.
Gambar l. Protein structural clan Yirion DENY
bcrbcntuk
Virion
(liha1 gambar 2.). envelope (E) clan
RNA
tcrdiri
NS 1. NS21\.
NS2b.
7 p rotein
kb, dike l i l i ngi oleh J 80
fume
3.400 asarTi
et al, \ 999,
yang dikode sebuah
amino, d.ikocle
3 protein
Mukhopadhyay ct aL
virus Dengue (Whitehead et envelop
protein
genome. Tiga structural
poliprotein dan diikuti oleh adalah
rncmpunyai
dari 3
.
em'elop<:'.
2005).
·:
non structural
spherical.
Il
panjang genom
scrotipc (Dl-:N-L
al. 2007)
clan berdiarnctcr kira-kira 50 nm
structural (capsid (C). pro tei n
c
rn rn brn n
(1\.1).
berasal clari bagian >!-terminal
non structural. Protein non struktural virus dengue
NS3. NS4;\. NS4H clan NS5. (Linclcnbach
& Rice.
2001).
4
1 ,-�3 Caps id
�.:�-ilk<' of
Of(l,l'l;.:-,1liu11
st1rrace rlirriers
Gambar 2. Struktur virus dengue (Zang \Vet al, 2003). Penyebab dominan DBD di Indonesia adalah virus Dengue serotipc 3 (DENV-3) geno tip lokal (Suwandono et al. 2004). Virus DENY-3
diduga sebagai pcnyebab
manifestasi kasus Demam Dengue berat yaitu Demam Berdarah Dengue atau Dengue
Shock Syndrome clan merupakan serotipe yang paling luas distribusinya disusul DENY2, DENY-I clan DENV-4 (Corwin. ct al 2001 ). Hasil studi cpidemiologi molekuler pada 3l1 pendcrita suspect Dcmam Bcrdarah Dengue di 3
RS OKI Jakarta th 2009 (Whinic, dkk) dengan pcmeriksaan PCR
men unj uk kan serotype terbanyak adalah DEN 1 (21%) kemudian DEN 3 ( 12.5%) (Tabel
I). Hasil ini menunjukkan adanya perubahan serotype Dengue yang menonjol, hasil penelitian tahun sebclumnya lcbih banyak didominasi oleh Dengue scrotypc 3 clan 2 tctapi pada tahun 2009 di OKI Jakarta lcbih banyak Dengue scrolypc 1 . Tabel I. Distribusi serotipc Dengue pada tersangka penclcrita DHD anak & dcwasa di RS
OKI (Th 2009)
I lasil PCR Negative
-- ----
Rurnah Sakit Bucli Asih. Koja. larakan
f--- -Anak(101)
-
43 (43%)
1 01 (48(Yo)
61(46%)
DEN 1
22 (22%)
43 (20%)
6.5(21 %)
DEN 2
9 (9%)
24(11%)
DEN 3
1.5 ( 1 5%)
24 (11%)
DEN4
l
Mix (DEN 11-DEN 2)
1 Mix (DEN 2+DEN 3)
I (I 1%)
13 (6%)
I(!%) -
1 (0.5%)
4(2%)
-
N(311L _ _
Dewasa (210) --
--·
-
3 3( 1 1%2 39(12.5%)
�
24(8 %_ ) '
5(2%) 1(0.3%)
5
Analisis phylogenetic (Dep. Mikrobiologi UJ) menunjukkan bal1\va strain DENY Indonesia berbeda
dengan
genotype di
negara
lain
(Asia
Tenggara) sehingga
kemungkinan untuk menimbulkan respon imunologi spcsifi.k cliperlukan pengembangan strain lokal Indonesia. Stucli awal pengembangan vaksin rne'.1ggunakan virus DE:t\ inaktif menghasilkan hilangnya imunogenisitas virus sebagian karena proses inaktivasi (Schlesinger R'vV. 1977). Selanjutnya dikembangkan live attenuated vaccine yang dapat mcmicu kekebalan
protektif tinggi, namun menimbulkan komplikasi klinis yang tidak cliharapkan (Edelman R,
et al J 994). Live attenuated vaccine ternyata juga berisiko menimbulkan replikasi
virus yang dapat menyebabkan virus bermutasi kembali menjadi patogen & memicu respon imun yang rncrugikan (Shekhar, 2007). Sehingga pcngcmbangan vaksin saat ini ke arah sub unit protein rekombinan dan DNA rekombinan vaksin. Tetapi pcngembangan vaksin DNA rekombinan dikhawatirkan bisa mengakibatkan perubahan yang bersifat onkogen dan sukar untuk dihilangkan karena DNA vaksin terintegrasi ke chromosome host. Tahun 2009 dan 20 1 0 telah dilakukan penelitian pengcrnbangan vaksin Dengue dengan teknologi sub unit protein rekombinan yang berasal dari protein Non Struktural 1 virus DEN I strain Indonesia (Bekasi 200391 5846) dengan sistem ekpresi di Pichia pastoris. Pemilihan gen Non Struktural 1 pacla sludi ini scbagai pcngganli gen s1ruktural bertujuan untuk mcnghindari risiko anti-virion antibody perantara antibody-dependent enhancement (ADE) yang bisa mengakibatkan manifestasi Dengue Haemorrhagic rever berat/ Dengue Shock Syndrorn. Protein NS l tidak tergahung dalam virion sehingga tidak menimbulkan virus enhancing antibody (Wu S.F. ct a\ :2003). Protein Non Struktural l terdiri dari 1 056 basa. 352 asam amino clcngan bcral molckul 40-46 kD. antigen pengikm komplemen yang dapat larut. NS I ditemukan bersirkulasi di serum pasien terinfeksi ,·irus dengue. menunjukkan bahwa sekresi NS l nerupakan hal penting pada infeksi Flavivirus di tubuh manusia. (\Vu S.F ct al. 2003). Protein NS 1 juga adalah target pcrrting clari antibodi terhaclap DENY (Flamand ct aL 1999, Wang ct ::ii. 2009) Glikoprotein NS 1 ada di seluruh Flavivirus dan berperan pcnting untuk replikasi & viabilitas virus (flamancl et al, 1999, V./ang et al. 2009).
6
NSl diekspresikan pada perrnukaan vims yang menginfeksi sel sehingga dapat menjadi target Tc cells spesifik virus melalui compelement-mediated pathway (Schlesinger.J..J et al., 1987)
dan antibody dependent cell cytotoxicity (/\DCC) (Schlcsingcr.J.J ct al.. 1 993).
NS I digunakan scbagai antigen yang pcnting bagi pcngcrnbangan vaksin dengue clan juga sebagai reagen untuk diagnosis cepat dengue (Zhou ct al. 2006). Fpitop NS I virus Dengue yang bersifat imunogenik yang
herperan
sebagai
target antibody untuk
pcngembangan vaksin maupun rapid test cliagnostik y8itu: 1. ELKCGSGIF terlctak pacla asam amino kc 1 2-20 (Khan i\M ct al. 2006) 2. VHTWTEQYK terletak pada asam amino ke 25-33 (Andre\v Kl falconar. 2007 & 2008) 3. Vl fTWTEQYKFQ terlctak pacla asam amino ke 25-35 (Khan AM et al. 2006) 4. EHKYSWKS tcrlctak pada asam amino ke 110-1 1 7 (Wu I IC et al. 2001 ). 5.
HKYSWK terletak pada asam amino ke 1 1 1 - 1 1 6 (Yao et al, 1995)
6. HTLWSNGVL.ES terletak pada asam amino ke 229-239 (Khan Atvl et al, 2006) 7. GPWllLGKLE terlctak pada asam amino kc 226-274 (Khan /\1\.1 et aL 2006) 8. RGPSLRTfT terlctak pada asam amino kc 294-302 (Khan /\M ct al. 2006)
9. Epitop LD2
.
24A,
LXl. 24C. dan r:LK-typc motif (Roehrig. 1997. Falconar ct al
2007).
Studi pengembangan vaksin protein rekombinan NS I pada beberapa penelitian menunjukkan
bahwa NS I sangat
imunogenik
serta dapat menimbulkan antibodi protektif
clcngan aktivasi komplcmen untuk membunuh target sci yang tcrinfcksi
(Chaturvccli
ct al.
2005. Costa et al. 2006). Protein NS 1 cfcktif tanpa rnenirnbulkan risiko lcnomena
antibody dependent enhancemenl nctralisir terhadap protein NSl dapat
mcngincluksi
(A DE)
struktural
yang
mungkin
discbabkan reaksi antibodi non
E virus (Wu et al. 2003. Costa et
kckcbalan sclulcr dan
hurnornl
jangka panjang
al. 2006). (\l'v u
ct
Protein
al. 200:1.
Costa ct al. 2006). Sistem ckspresi yang dipilib pada penelitian ini menggunakan sci eukarotik di Pichia pastoris. Pi ch ia pastoris adalah spesies yea.st methylotropic. famili saccharomyces yang merupakan sci inang cksprcsi dcngan level cksprcsi protein yang 1inggi. lcbih ccpal. tidak rnahal serta lebih rnudah dibandingkan sisLcrn cksprcc;i cukmiotik lainn) a.
7
Plasm i d yang digunak an sebagai vektor e k spresi a dalah pPICZalphaB yang mem iliki
signal alpha fac tor sehingga dapat m e m berikan sistern ck spresi herupa sekresi yang mem udahkan
saat purifikasi. Sclain itu juga P. pastoris mc rupak an organisme non
patogen, pro te in rckom bin an yang dic k sprc sikm1 bcbas py rogen ( tidak scperti cksprcsi di E.coli), bebas toksin,dan bebas vim/ inclusions (tidak sepe rti ekspresi d i tissue culture). ti dak bersinggungan/ m engandung korn ponen he\.VHn (tidak sep ert i ekspresi di cell culture) sehingga aman & h alal untuk digunakan kc m anusia (Etcmad 8. ct al 2008). B asil penclitian tahun 2009-2 0 1 1 tclah dihasilkan con struct dari pl asm id rckombinan pPICZ alpha B d i E .c o li Top I Of yang m engeksp resikan protein rekomhin an NS 1 -DEN 1 . Kemu dian telah diproduksi protein rekomhinan DEl\-1 -NS I dengan berat molekul 120 kDa yang mc rupakan h om odimer 1nenggunakan sistcm ckspresi sckrcsi dari sci 111ang
Pichia pastoris. Protein rckom bin an yang dihasil k an Lelah cliverifi kasi clcngan PCR. sekuensing, SDS PAGE clan E L I SA d an masih menun jukkan respon imun ogen isitas seperti bentuk vvi l d typenya. Protein rekombinan NS I - DE N I yang dihasi l k an dapat dikembangk an unt uk kit diagn o stik dan v ak sin. Pacla pc nelitian ini cliarahkan untuk pengcmbangan kandidat vaksin schin gga masih diperl ukan pcnclitian lcbi h lanjut unl uk menget ahui status keke balan clan efikasi protek t if dari subuni t v aksin protein rekombinan NSI -DEN J .
RUMUSAN MASALAH
Penyakit dem a m berdarah dengue ( DBD) sampai saat ini rnasih rne rupakari masalah kesehatan m asyarakat di I n donesia dan merupakan salah satu prngrnm prioritas utama di bidang keschatan. Il ingga saat ini bcl urn tcrscclia obat anti \· iru s tcrhadap v irus den gue dan program pc11 gen dalian vektor sccara luas bclurn bc rhasil untuk mcnccgah K LB. Vaksinasi
tamp akny a
adalah
alte rnatif
yang:
pa lin g
porensia l
sehagai
strategi
pengendalian yang pa l ing efektif. S am pa i saat ini belurn ada vaksin Dengue y ang tersedia d i pasaran clan han y a ada kandiclat vak sin schi ngga masih di butuhkan pe ngcmbangan vaksin yang aman clan hal al. S a al ini pc ngcmbangan \'aksin k.c arnh suh unit protein rekom h inan dan DNA v ak sin. Tetapi DNA v aksin mem iliki kcterhatasan adanya risiko onkogen yang sukar untuk dihilan gkan kare n a DNA vaksin terintegrasi ke chromosome host.
8
>
--
-
-
-
-
Studi awal pengernbangan vaksin menggunakan virus DEN inaktif hilangnya i munogenisitas virus sebagian karena proses inaktivasi
rn eng h asi l kan
(Sch l esi nge r R \V,
I 977). Selanjutnya dikc mbangkan l i v e attenuated vaccine yang dapat memicu kckcbalan protek t i f tinggi. namun m en im b ul kan k om pl i kasi k l i n i s yang tidak di harapkan (Edel man R, et a l I994). Live attenuated vaccine ternyata juga herisiko menimbulkan replikasi virus yang dapat menyebabkan virus bermurnsi kemhali menj acl i patogen & mem ic u
respon i m u n yang merugikan (Shekhar. 2007). Saal ini pcngcm ba ngan vaksin ke arab sub unit protein rckombinan dan DN,i\ vaksin.
rctapi D�J\ vaksin memiliki kctcrbatasan
adanya risiko onkogen yang sukar untuk dihi lang.kan karena DN A vak s in terintegrasi ke chromosome host.
Hasil studi cpidcmiologi molekuler pacla 3 1 1 penderita suspect Demam Bcrdarah Dengue d i
3
RS
DK I
Jakarta th
2009
( \\ihinic. dkk) clcngan
p e mcri ksaan
PCR
menunjukkan serotype terhanyak adalah DEN I ( 2 1 °/o) kemudian DEN 3 ( 1 2 .5%) Hasil ini menunjukkan adanya perubahan serotype Dengue yang rnenonjol, hasil p enel i t i an tahun sebclumnya lcbih banyak didomi nasi olch Dengue scrotype 3 da n 2 telapi pacla tahun 2009 d i O K I Jakarta lebih banyak Dengue scrotype 1 . Kc rn u cl i an clilanjulkan penelitian pengembangan vak s i n cliawali untuk Dengue serotype 1 m e n gguna kan strain Indonesia, yang nantinya dikernbangkan menjadi vaksin tetravalen. Tahun 2009 clan 2 0 1 0 tclah clilakukvn pcnclitian pcng crn banga n vaksin
Dengue
dcngan teknologi sub u n i t protein rckombinan yang hcrasal clari protein Non Struklural l virus DEN I strai n Indonesia ( I3 ekasi 2003 9 1 5 8 ..J. 6 ) dengan sistem ekspresi di P i c h i a pastoris. Telah
protein
DEN- 1 -N S 1
rckombinan
clari
scl
J ) H \ - 1 -NS I
inang
Pichia
dan
pastoris.
tclnh Protein
cl i prod u k s i
protein
rckombinan
yang
clihasilkan telah cliverifikasi cl en gan PCR. sekuensing. SDS P,.\()[ dan ELISA. ternyata masih
menunjukkan respon
imunogenisiws sereni
bentuk
wild t ypenya.
Penelitian
lanjutan d i l akukan untuk rncngctnhui status kck�bal<:rn dan dikasi protckti r d ari subunit vaksin rckombinan N S l - D E N - 1 pacla hew a n cob0 rnencil.
9
TU.JUAN
II.
I. Tujuan Urnum:
cklil' clari vaksin subunit protein rckombinan M cngc tahui status kckebalan clan c fikasi prot cit n Indo nesi a (Hekasi 2003 9158 46) pada mcn 1 - Dcnguc 1 yang bcrasal dari strai
NS
Balb/c. 2. Tujuan khusus:
a.
Mcn guku r liter antibodi N S l -spcsific lg G pasc rekombinan NS 1 -DEN
h.
Ill.
1
a vaksinasi subu nit protein
dengan clan tanpa adjuvanl.
nit protein rekombinan Men ilai efikasi protektif pasca vaksinasi subu NS I -DE N ldari hasil uji chadenge. MANFAi\T
k pcngembangan prototype kandidat a. Memberikan inforrnasi bagi ilmu clasar untu vaksin dengue strain Indonesia yang aman
&
halal.
n Indonesia deng an teknologi subunit b. Menyediakan kand idat vaksin dengue strai in di industri protein rckom.bin an bagi pcngcrnbangan vaks t dima nfaatkan bagi pcny cdiaan vaksin c. Dalam jang ka panjang, hasilnya dapa pencegahan Demam Berdarah di deng ue strain I ndonesia untuk program masyarakat.
JO
IV. I.
M ETODE Kerangka P i k i r
Pengenda l i a n Demam Dengue/ Demam Bcrdarah Dengue
Kontrol
vektor
Therapy rehidrasi
Inactivated vaccine & live
I attenuated
vacci nc
Pengemhangan vaksin
cairan
Recomb1nant
DNA
l i v e ancn uat ed
vaccine
1
Subunit protein rekombinan
vaccine (chimeric. )
vaccine
Const ru ct
DEN
1
plasm id rckombinan N S l -
l (Strain Indonesia. Bekasi
2003 9 1 5846)
I
i
Protein Rekombinan
Efikasi protektif pasca vaksinasi (Lanpa & dengan adj uvan t ) pada
vaksinasi (tanpa &
pada
111 c ncit Balb/C:
mcncil Balb/C
2.
Tcmpat clan Wak tu Pc nc l i t i a n
a. Pe n i l a i an status pasca
kekebalan
dengan
m
en g: u k ur titer untihodi NS 1 -spesifi c lg
vaksinasi subunit pro te i n rekombinan N S I-DEN
adjuvant antibody dilakukan d i Teknologi b.
I
I
\
I
Status kekebalan pasca dengan ad j uv ant )
NS I - DEN
Dasar
Laboratoriurn
lmunologi.
dengan Pusat
G
dan tanpa
Biomcdis clan
Kcschatan.
Penyiapan titer ,·irus De ng ue dcngan Plague Assay untuk u_j i challenge vaksinasi d i l akukan di Laborato rium Imunologi. Pusat
pasca
l3 io m edis dan Teknologi
Dasar Kcsl:hatan.
Il
c.
Vaksinasi dan uji challenge pada mencit 13alb/c rn e rupa kan pene litian kerjasama
yang dilakukan di Pusat Studi Primata, IPB-Bogor (PT 13imana lndomedical). Selama vaksinasi dan uj i c halle ng e
.
pem c l i haraan dan pc rla k uan hcwan coba
mcrnenuhi standar animal walfarc clcngan pcngawasan rutin doktcr hcwan di PT Birnana
l ndomedical.
Penclitian
ini
merupakan
penc l itian
ke1jasama
yang
melibatkan j u ga peneliti-pencliti di he\van coba rodent (PT. Bimana ln
yang merupakan bagian dari PSSP-!PB Rogor. Perlakuan hc\van coba yang mcli puti
tindakan
yang bcrisi fat invasive bc ru pa sun ti kan
untuk i mun isasi.
pengambilan darah d i sinus retro-orbital. penyuntikan untuk uj i c ha llenge dilakukan o le h peneliti-peneliti terlatih yang telah mempunyai sertifikat untuk penanganan hcwan coba rodent di PSSP-IPB Bogor. Sedangkan pengamatan sclama vaksinasi dan uj i challenge clilakukan olch pcneliti Pusat Biorncdis & Teknologi Dasar Kesehatan d i d ampingi o leh pene liti clari PSSP-IPB Bogor bagian he,van coba rodent.
Waktu: penelitian di laksanakan se lam a l 0 bulan clari bu Ian M aret sarnpai Dcscmber 2012.
3. Desain Pcnelitian lksain pcnelitian aclalab studi ekspcrimental
4.
Populasi clan Sampel
Populasi adalah scluruh mcncit 8
specific pathogen ji-ee (SP!')
.
.lumlah sample yang dibutuhkan a da lah 50 menci t
mendapatkan perlakuan sesuai standar dengan u11i111al
m:l{ore.
Setiap pe r la kuan
tcrdiri clari l 0 rncncit yaitu vaksinasi clcngan sub unit protein rckombinan N S 1 -DFN l dc n gan adj u v an t alum clan frcuncl aclj u vanl clan tanpa ml_j uvant. Kclom pok control
adalah y ang divaksin dengan plasmid pPIC Zalphal3 clan tanpa Yaksinasi.
12
5.
Jenis Pene l i t i a n
Jenis
p cneli t ian
aclalah
UJ l
prekli:i i k
clengan
eksperi mental
laboratorrium
rneng g u nakan model hewan coba mencit Balb/c.
6.
U j i Laboratorium
a.
Vaksinasi mencit Balb/c
a. 1 .
Pcn yi apan protein rckornbinan N S I- DEN 1 clan fo rrnulasi dcngan aclj uvanl
Clone
nomer
54
mengckspresikan
n -van b
protein
rckombinan
NS 1 - Di:-:N I
cliekspresikan ses u a i protocol untuk produksi dalam skala bes ar cli media BM!'.,1Y dengan induksi methanol 1 %. Larutan
supernatant
kcmudian
di konscntrasi
clcn gan
konsentrat d i p uri ri k asi dcngan metal chelating affinity
ultrafiltrasi. l lasil
rnetode
chromatographic ( \!L'\C'\)
column. Formulasi complete Freund a
dalam Phosphat Buffer Saline (PBS) yang berisi 50 ug protein rekombinan dan
adj uvant sampai volunK akhir 200 ul pe r rncncit. Formulasi dcn gan adjuvant aluminium hydroxide gel dil aku kan dcngan mcmbl1at larutan 1: l (adjuvant: protein rekombinan dalarn P B S )
sampai volume akh i r 200 u l .
a.2. Mcneil jantan Balb/c umur 4-6 rn i nggu dengan bcrat badan
kurang lcbih J 0- 1 5
gram yang rncmcnuhi standar S P F dii nj ck s i i ntramuscular pada
in .
kaki
belakang
d iformulasi
clcngan ko n sentr as ! 50 ug protein rekombinan NS I -DEN 1 yang
dengan
dcngan 50 ug
ti bi al i s anterior
adjirrant
freuncl complete dan
a l um . Kelompok
kontrol dii nj eks i
pPIC/.
diimunisasi. �v1cncit di irnunisasi scbanyak > dos is yang dibcrikan rn i ng gu . Pengamhllan
clcngan in ten al 1
darnh seha nya k I OU ul dila kukan padCl :-.in us retrourbital
sebclum clan I m i n g:gu sctelah imunisasi dosis tcrnkhir. Set i ar per lakuan pada mencit sesuai standar
uni11wl 1rel/arc.
b. Penyiapan titer Y i rus Dengue serotype - Penyiapan
I untuk u j i
challenge
sel C6/36 un tu k recovery (pemulihan)
13
Sel dari stok ( liq. Nitrogen) inkubasi pada water bath ( 3 7°C) selam a 3 - 5 rnenit. Sebelum c air semua p indahkan kedalam tabun g sentrifos 15 m l yang berisi 3 ml MEM . S entrifus 1500 rpm selam a 1 0 menit. B uang supernatant. tambahkan M�M
ml
d en gan F BS 1 0% m ix hingga mcnjadi hornogcn. M asukkan ke d alam fl ask
yang sudah ada 4 m l MEM fBS l 0 %, inkubasi pacla sub u 28°C - Penyiapan sel
C6/36 untuk pemeliharaan
Ganti medium sehari s etclah recovery. Ganti medium s et iap 2-3 hari atau kctika p l l m ed i um rn ulai turun , at au ketika ada vakuolisasi clan m ed ium tc rlihat kotor. Gunakan
medium yang h angat. - Penyiapan sel C6/36 untuk P asase Scl monolaycr. buang medium sis akan± 1 - 2 m l. Dcngan m c nggu nakan cell scraper. usap bag ia n pcrrnukaan flask y ang ditum buhi sel agar sci tc rlepas. M ix supernat ant sel agar gumpalan sel terlepas. Bagi sup ernat ant sel pada bcberapa flask y ang sudah diisi 5 ml M E tvl FBS 2 %. lnkubasi pada suhu 28°C. - T ahap inok ulasi virus ( Y amada et al. 2002) Sci rnonolay c r
C6/36, buang medi um. Tambahkan 500 ,Ld supern at ant virus Dengue
I . l n ku bas i pada s u hu 28°C, agit asi setiap 3 0 rn enit sclam a l - 2 jam . Tambahkan 5
m l M EM rBS 2<x). I n ku b as i pada 28°C selam a 7 hari.
Supernatan virus d i d alarn
m edia diarn bil kern uclian discntrifuge 2000 rpm sclama 5 mcnit. Bagi supernatant sci p ad a bebcrapa c ryo v ial (1 m l per c ryovi al). - Tahap p reservasi clan p enghitungan t iter virus Sel rnonolaycr BHK 2 l . bua ng medium. Tamhahkan 5
m l PBS (tanpa Cn d an !Vig) pH
7.4 untu k mcrnbi las sci dan mcnghilangkan FBS yang d ap at mcngharnbat
kcija
Trypsin. Buang. PBS. tarn b ahka n 1 ml l ry p si n F! Y I /\ i 11ku bas i pada 37"'C sclama 5 "
me11 it. Tamba h k an � m l Tv1 E.tvt rBS 2cYo untuk rnenghe ntika11 aktivitas Trypsin. l'vlix supernat
6 (scbanyak 1x l 0
prr
rn1),
Bagi kc dalain plate 6 well
inkubasi seJama l hari di 3 7''C clengan C02 5% hingga 75%i
monolayer. lnfeksikan clengan serial rengcnceran I 0 kali supernatan v irus ( m ulai dari
1 l 0 dengan perbandingan 25 ul supernatan \'i rus
t
225 ul medium rv! CM + fBS 2%)
sa1 n p a i pcngcnccran l 06 ( M c todc Yamada ct al. 2000).
14
Ambil masing-masing 1 00 ul dari setiap pcngenceran ke sel BHK yang sudah disiapkan untuk menghitung virus dengan plaque (dibuat duplo). Sctelah 2 jam tambahkan medium semi solid U vlEl\1 1 FBS2% + methyl cellulosa 1 % ) . lnkubasi 37°C dengan 5% C02 sclama 7 hari.
Kcmudian sci d i fiksasi dengan formalin 1 0%
dan div.,.arnai dengan gentian violet. Kemudian dilakukan penghitungan plaque. c.Uji challenge Dua minggu setelah dosis kedua_ 5 kelompok mencit sesuai kelompok imini sasi d i
atas. d i i njeksi iv dengan dosis 5x I O(' plaque-forming unit dari virus DEN-I strain Indonesia.
Setclah
di
challenge,
diamati
sctiap
hari
untuk
n1orbiclitas
clan
mortalitasnya sclmna 3 minggu. tvlorbiditas ditcntukan clengan jumlah rncncit yang mcngalami kelumpuhan kaki belakang
cl. Pcngukuran titer antibocli NS 1 -spesi fie lg C dcngan metodc r:l .J S ,-\
(sesuai
prosed u r Costa et al, 2006) Serum yang di peroleh dengan pengambilan dari sinus retro-orbital pada mencit yang diimunisasi dianalisa untuk mengukur aclanya antibody NS I spesifik. Konsentrasi serum anti NS I ditentukan dengan pengenceran sampai optimum dalarn PBS yang berisi I 0% BS/\. 0.05% t\vccn-20.
Plate !-:: LI S!\ microtiter 96 well clilapisi clcngan
protein NS l rekombinan. Protein rekomhinan NS I dengan konscntrasi 0 , 1 ug dalam 1 00 ul PBS di lapisi pada setiap \Vei l dan d i i nkubasi semalam. Setelah itu di lakukan blocking untuk mcnccgah ikatan non spesi fik dcngan menginkubasi sclarna 1 jam dengan lc1rutan 5% skim m i l k clal<1rn 200 ul PRS untuk sctiap \Veil. Serial dilusi clari sample serum sebanyak 50 ul ditambahkan di setiap well dan di inkubasi sernalam pada suhu 4°( ·. Kemudian sample di.:uci dengan larutan PBS/T\\ecn 20. ikatan protein clidctcksi dengan I !RP-conjugated gout anti-mouse lgCI. Pcrubahan warna
dihasilkan dcngan pcnambahan 2.2'-azino-bis (cthylbcnzthia?oline sulfonic acid). Kernudian absorbansi pacla 450 nm diukur dengan mesin ELISA re<1der. Sebagai comrol cligunakan serum dari mencit yang t i dak diimunisasi.
15
BAGAN ALUR KER.lA PENELlTIAN Penyiapan prote i n rckombinan NS I -DEN 1 & fonnulasi
Pcnyiapan titer virus DEN- I untuk uji
clcngan adj uvant
c h a l l enge:
1 . Penyiapan sel C6/36
untuk recovery (pemulihan)
�el I: JO ck0r mencit
BaJb!C :-nur 4-6 winggu 1RB-:I 0-15
�r)
Kcl 2 : J O
Kcl 3 : J O
Kel 4: 1 0
ckor mcnc it
ckor mcrn: i t
ekor rncncit
ckor rnencit
Balb/C
Balb/C
11alb/C
B a l b/C
Kel 5: 1 0
umur 4-6
u m u r 1\-6
Ullllll'
mmggu
rnmggu
m1nggu (RB= 1 0- 1 5
( l m= I 0- 1 5
gr)
gr)
gr)
( 8 l3= 1 0- J 5
( B B= I 0- 1 5 gr)
4-6
u m u r 4-6 m 111ggu
2 . Peny ia pa n sel C6/36 untuk pemeliharnan
3 . Pcnyiapan sci C6/36
untuk passase
4. Tahap inoku lasi virus
5 . Tahap prese rva s i
dan penghitungan titer v 1 rus
Pengam bilan darah sinus retroorhital 1 00 ul sebelurn vaksinasi
Vak s i nasi
ill ug protein
rekombinan NSl/DEN 1 per dosis
3
dosis clcngan i n terval l rninggu
50 ug p rot e i n rekom hi n an
NS 1 /Dl:N I
+
5 0 ug
50 ug
protein
plasm id
NS l/DFN I
per dosis
( I : I ) per
compktc ( I : I )
pPIC7ul3
rekombi nan
rreurid
per dosis
� Alumn
dos is
Pcngam bi lan clarah sinus rctroorbital I 00 ul 1 minggu pasca \ aksi nasi clan yang t i cl a k d i \ a k s i nasi
Scluruh
rnc n c i t
d i i njcksi I V . 5 x 1 0
6
PFU virus D F \J - 1 strain Indonesia
Pcngarnatan kelumpuhan kaki bclakang dan kcrmuian sclam0 3 rninggu
16
V.
HAS IL PENEL IT IAN
Penelitian telah mendapatkan persetujuan Ethical Appmva/ dari Komisi Etik Pcncl itian Kesehatan, Badan Litbangkes, dcngan no mer KE 01 06/ r:C/989/20 1 2 tanggal 6 Juni 201 2. Penyiapan vaksin protein rekombinan rNS I
yang akan
digunakan untuk vaksinasi dalam 1 batch (satu kali rembuatan untuk seluruh dosis vaksin yang akan digunakan) dilaksanakan di laboratorium imunologi Pusat 13iomedis clan Teknologi Dasar Keschatan. Pcnyiapan dan karantina hcwan coba mcncit Halb/c scbelum cksperimental clilakukan di laboratorium hewan rodent PSSP- I PB Bogor (PT Bimana lndornedical). Mencit yang digunakan untuk eksperirnental berumur 6 mtnggu. Sebelum vaksinasi, dilakukan pengambilan darah untuk memperoleh data clasar. Pengam bilan darah pada sinus retro orbital dilakukan sesuai standar animal
we(lare dengan terlcbih dahulu melakukan anestesi. Anestcsi clilakukan mcnggunakan ketamin dengan dosis 1 20 mg/kg BB di tam bah xylazine dosis 1 0 mg/kg BI3.
Gambar I : A nestcsi mencit Balb/c secarn intra peritoneal deng.an Ketamin dan Xyla1.inc si.:bclun1 pcngam bilan clarah.
17
I
Garnbar 2. Pengambilan darah sinus retro orb ita l .
Pem bcri an vaksinasi d i l akukan scbanyak 3 kal i dengan interval I rninggu dan dosis pro te i n rekombinan rNSI 50 ug/ml tanpa aclj uvant clan dengan adj uvan t Aluminium hidroksida dan Freund . I lasil status kekcbalan pacla mcncit Balb/e yang tc;lah cli vak s inasi dengan protein rekombinan rNS L di ber i adj uvan aluminium hidroksida clan freund dengan rata-rata titer antihodi (OD 450 nm) herturut-turut sehagai berikut 0 . 1 2 5 ; 0292; 0.30 1 . l lasi l i n i mcnunjukkan tclah tc1:j<..cli pcningkatan titer antibodi dibanclingkan clengan kelompok kontrol yang divaksin dengan PBS ( t i ter antibodi: 0.062) cla n plasmid pPICZu.B
( t it er antibodi: 0,057) (grafik 1 . ). Rata- rnta titer anti bocli lebih tinggi pada
P.ern ber i an vaksin d e ngan adj uvant dibanclingkan tanpa adjuvant (grafik l ). Pemberian vaksin protein rckorn bi nan clcngan
adj uv n nt
Freund hasilnya lcbi h t i ng.g.i dari pada
adj uvanl Aluminium. h i droksida karcna aclj uvant J.'rcund rn e rupakan adjuvant yang scsuai untuk mencit Balb/c. Namun pemberi a n dengan ad j uv ant Alum juga menuniukkan t i ter antibodi yang lebih tinggi dib<mclingkan vaksin yang tanpa ad_iuvant dan adj uv ant alum mcrupakan ad_i u\·ant yang sesuai unlllk rnanusia
Schingga untuk pcmberi a n v ak s i n
prote i n rckombinan rNS 1 juga dapal dipcrtirnbangkan tarn bahan aclj uvant 1\lum untuk menghas i l kan
rcspon kekebalan yang lebih optimal.
18
0.350
0.292
0.300
0.301 -
-
0.250
0.200 -
0 . 1 50
0. 1 2 5
0 . 1 00
0.062
0.057
0.000
D
D
0. 050
o Rata-rata titer
D
Ab
Dengue
serotipe l
de n gan
Uji challenge di l a k ukan pad a mcncit 8alb/c ketiga deng an konsentrasi
t i te r
u l secarc.1 intravena. Saa t
uj i
450
nm)
-
Grafik 1 . Rata- rata t i te r Antibodi pasca vaksinasi kekebalan terhadap
(00.
u
n tu k rnenunjukkan
sc tc l ah 1
rninggu
virus Dengue serotype l sebesar 7.5
challenge, mencit
challenge. mencit diancstesi dengan ketamin dan
status
metode E LISA .
sudah berumur 9
pasca x
lo
'
vaksinasi dosis
PflJ dalam I 00
rn111ggu. Sebelum uj i
xyla7.inc.
,,,;: •
. #'
..
· � - ·
Ciambar
J.
konsentrasi
lij i
c h a l l e nge
dcngan
injcksi
intrm cna
ti te r vi rus Dengue s e rot yp e I sehesar 7.5 x 1 0
'
pada
vcna
cauda
dengan
Pl-U.
19
Hasil
uji
challenge
tidak
clitemukan
kelumpuhan
dan
kematian
pada
seluruh
kelompok mencit Balb/C. Penelitian Wu ct al, 2003 mcnunjukkan bahwa suscept i b i l i tas
dipengaruhi
oleh umur. schi ngga
uji
c h a l l enge scbaiknya clilakukan pada rnencit umur
kurang dari 6 rninggu. 1-IasiJ pen clitian ini menunjukkan bahwa mcncit Rai ble kurang susceptible karena d i l akukan pada mencir umur diatas 6 minggu yaitu umur
9 minggu.
Sehingga kekebalan protektif cliukur dengan titer antibodi pasca uji chal lenge. Rata-ratn titer antibodi pasca
uji
challenge clcngan wi ld type virusnya mcnunjukkan kenaikan yang
lcbih tinggi dibandi ngkan dcngan pasca vaksin yaitu benurut-turut clcngan vaksin protein rekombinan rNS I , dengan adjuvant A l u m clan freund sebagai berikut: 0, 1 64 ; OJ J 2 ;
0.5 06 (grafik 2.). Hasil ini menunjukkan bahwa vaksinasi dengan protein rekombinan clapat membcrikan rcspon kekcbalan protckli f tcrhadap infeksi vi rus Dengue liar. 0.60
0. 506
0.50 0.40
0.20 0. 10 0.00
LL
0.312
0.30
0.135
0.08
0 . 1 64
n
n '--'0 __.__._ __.___ ___._ __... , R:> 0
«
o Rata-rata titer
(OD. nm)
Ab
450
.:<J
O /I '., ? v
rf:·:·
.(":""
Grafik 2 . Pengukuran E L J S A : rata-rata titer antibodi terhadar
virus
Dengue pasca u p
Challenge.
20
V I I I . PERSETUJUAN ATASAN
Jakarta, 1 4 Januari 20 1 3 DISETUJUI Kabid Biomedis
Dr. Roselinda, M. Kes
Ketua Pelaksana
dr. C.S. Whinie Lestari, M.Kes
, JP . 1 958070 1 1 987012001
NIP. 1 9 6912061 999032001
K.etua Panitia Pembina l l miah
f;,K_epala Pusat Biomedis dan
Dr. Drg. D. A. Magdarina, M.Sc NIP. 1 9 50 1 2061 98402200 1
Daftar Kepustakaan
Chambers TJ. Hahn CS. G a l l e r R. Rice CM. flavivirus genome orga n i zat i o n. expression and repl ication. /\nn R e v .\1 icrobiol 1 9 90:44:649-88. Corwin, /\.L. Larasati. R . P . Bangs M.J. Hang rvu. \V uryadi S. ;\�joso
Listyaningsih
[, Hartati
S. Namursa
S. Sukri N.
R. Anwar Z, Chandra S. Loho 13. Ahmad H.
Campbell JR. Porter KR. Epidemic transmission in Southern Sumatra. Indonesia. Trans R. Soc. Trop. Med Hyg 9 5 : 257-265. 20 0 1 .
Costa Sl\,1 . freire M S . Alves A l vlB . DN!\ vaccine against the non-structural l protein (NS 1 ) of dengue 2 virus. Vaccine 2006:24: 4562-4564.
Edelman
R,
Tacket CO. \\iasserman SS. Vaughn D\�i. C c k e l s K H . Dubois DR. et a l . A
l i v e attenuated clcnguc- 1 vaccine candidate (45/\/,5) passaged in primary dog kidney cell culture is attenuated and immunogenic for human. J I n fect
Dis 1 9 94 : 1 70(6): 1 448-55
Etcmad B. Batra G. Raut R. Dahiya S. Khanarn S. S w a m i nathan S. Khanna N . 1\11 envelope
dorirnin
I I I-based
chimeric
antigen
produced
in
Pichia
pastoris
elicits
ncutralil'.ing antibodies against a l l four dengue virus scrotypc. /\rn. J. Trop. !Vi e d . I lyg. 2008;79(3): 353-363 falconar A K I. Antibody responses are generated to irnmunodominant ELK/K L E -Type motifs on the nonstructural- glycoprotcin during l i ve dengue virus infections in mice and human: i m p l i cations f(1r diagnosis, pathogenesis . and vaccine design . C l i n.
Vaccine
lmmunol 1 4(5): 493-504. 2007. Falconar A K I . Monoclonal antibodies that �>ind to common cpitopcs o n the dengue virus type 2 nonstructura l - I and envelope glycoproteins display \,veak neutralizing activity and di fferentiated responses to virulcr'lt strains: i m p l ications f'or pathogenesis and vaccines. C l i n Vaccine Jmmunol 1 5 (3):5..+9-6 l . 2008. r:lamand M. !VI egret F, t'vlathicu M. Lepault J. Rey LA. Lkubel \/. Dengue ''irus rype I
nonstructural glycoprotcin NS l is sccrctecl from rnarnmalian c e l l s as a soluble he:\arncr i n
a glyco sylation-dependent fashion. J. V i r o l : 6 1 0.+-61 1 0 . 1 999.
Gubler D.1. Dengue and dc11guc hemorrhagic fever. C l in M i c robiol Re,· 1 998: 1 1 :480-96.
Khan A M . Miotto 0. Ileiny AT. Salmon J. Srini,,asan K N . Nascimento EJM. lvlarques JrETA. Brusic V . Tan T W . August JT.. A systematic b i o i n forrnatics approach
lor
selection of epitope-based vaccine targets. C e l l l m m u n o l 244(2): 1 4 1 -4 7. 2006.
21
Lindenbach BD and Rice CM. flaviv i ruses and their replication. I n F ields V i rology. fourth Ed i t ion , Edited by David M Knipe ang Peter \1 Hov,dy. Published by Lipp inco tt
200 I .
\Vil Iiams and W i l k i n s , Phi ladelphia.
Monath T P. Dengue and yellow fever-challenges lor the development and use of vaccines. N En gl J M ed ,
35 7(22): 2222-2225. �007.
Roehrig J.T. Jrnmunochemistry of dengue vinises. In Dengue and dengue haemorrhagic fever. Division o f vector-borne i n fectious d i seases CDC and prevention CS department of health and human services. P.
1 99-2 1 0. 1 997
Schlesinger R W . Dengue v i r uses. Virol Monogr
1 97 7 : 1 6 : 1 - 1 3 2
Schlesinger JJ, Brandriss M W and Walsh .EE. Protection of mice against dengue enceph a l i t i s by
J .G e n . V i ro l . ,
i m rnun i 7.ati on with the dengue
2 vi ru s 2 virus non-structural pro te i n N S I .
68:853-7. 1 987.
Schlesinger JJ , fol tzer [vJ and Chapman S. The f c portion of antibody to ye l lov..: fever virus NS Virology.
1 is a d ete rm inan t o f protect i o n against yellow fever encepha l i t i s j n mice. 1 9 2 : 1 32-4 1 . 1 993.
SU\vandono,
A. Listiyaningsih. E. Vasudevan. S. et a l . Genetic Changes i n the Pre membran (prM) and J-:nvclopc (E) Genes o f I ndoncsian Dengue 3 V i ruses lsolatecl from Outbreak o f Jncreasing Severity. A Poster Presentation. ASTMH Meeting. 7- 1 0 November 2004. Miami. 2004.
Taj ima S, Takasaki type
T,
Kurane I . Characterization of
A sn 1 30-to-Ala mutant of dengue
1 virus NS 1 protein. Virus Gene 4: 323-9. 2008.
Yao / J . Kao f\'1 C. Loh KC.
C hu ng
\ 1 '1C. i\ scrotypc-spcc i fi c
c pit opc
of dengue virus 1
iden tifi ed hy phage d i s played random pepliJc l i brary. f[l'vlS lvl icrohiol Leet
1 27( 1 -2):93-
8. 1 995. \:Vu I fC. Huang YL. Chao
r 1 . .Ian JT. I luang J L . Chiang I I Y . Ki ng CC. Shaio MF.
ldenrification of 13-cc ll c·pitope of dengue virus type I and i t s ap pl icat ion in d i a gnosis of patients . .I.
C l i n.
rvt icrobiol.
200 1 .
t:ang vV. Chipman PR. Con e r J. Johnson PR. /hang Y . f\1ukhopadhyay
S.
8akcr TS.
Strauss .JI1. Rossmann 1'v1G , Kuhn RJ. Visualization of membrane protein donrnins by cryo-clectron microscopy or dengue virus. N a t Stn1ct B io l : I O ( l l
):907- 1 2 . 2003.
l.hou H v1 Tang YX. Fang DY. l.hou JJ . Liang Y. Guo I I Y . Jiang LF. Secreted expression .
.
and puri!ication of dengue 2 virus full-length non-structural glycorrotein NS I in Pichia pastoris. Virus Genes
33:27-32. 2006.
22
KEMENTERIAN KESEHATAN BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jalan Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10 560 Kotak Pos 1226 Telepon : (021) 4261088 Faksimile: (02 1 ) 4243933 E-mail:
[email protected] .id, Website: http://www .litbang.depkes.go.id
(ETHICAL APPROVA L ) KE.01 . rk /EC/ i89 /20 1 2
PERSETUJUAN ETIK Nomor :
Yang bertanda tangan di bawah ini, Ketua Korni;;i ctik Peneiitian Kesehatan Sadan Litbang Kesehatan,
setelah dilaksanakan
pembahasan dan
penilaian,
dengan
ini
memutuskan
protokol penelitian yang berjudul :
"Status Kekeba/an dan Efikasi Pro tektif dari Vaksin Subunit Protein Rekombinan NS 1-Dengue 1 (Strain .Indonesia, Bekasi 200391 5846) pada Mencit (Balblc) "
yang
mengi kutsertakan
hewa.n
percobaan
sebagai
subyek
penelitian,
dengan
Ketua
Pelaksana I Peneliti Utama :
dr. C. S. Whinie Lestari, M.Kes. dapat disetujui pelaksanaannya. Persetujuan ini berlaku sejak tanggal ditetapkan sampai dengan batas waktu pelaksanaan penelitian seperti tertera dalam protokol. Pada akhir penelitian,
laporan pelaksanaan penelitian harus diserahkan kepada
KEPK
BPPK. Jika ada perubahan protokol dan I atau perpanjangan penelitian, harus mengajukan kembali permohonan kajian etik penelitian (amandemen protoko l) .
Jakarta,
, (
6
j'-'.nf
°201-i.
