LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Pengaruh Konsentrasi 25-HydroxyVitamip D Serum terhadap Ekspresi Ben dan Produksi Catheliddin LL-37 pada Monosit Manusia yang Dipapar DNA M.tuberculosis
Nama Peny usun La poran : 1. lilik Zuhriyah 2.
Satuman
3.
Siswanto
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya JI. Vete�an 1 Malang
2011
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Pengaruh Konsentrasi 25-Hydroxyvitamin D Serum terhadap Ekspresi Gen dan Produksi Cathelicidin LL-37 pada Monosit Manusia yang Dipapar DNA M.tuberculosis
Nama Penyusun Laporan : 1. Lilik Zuhriyah 2. Satuman 3. Siswanto
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Jl. Veteran 1 Malang
2011
DAFTAR lSI
BAS I 1 1 . PENDAHULUAN . 1 0 0 1 . 1 . Latar Belakang 1 1 .2. Rumusan Masalah 6 7 BAB II 2. TINJAUAN P USTAKA. oo . 7 7 2. 1 0 Tuberkulosisoo .. ..... .... . .. .. .. ........ 2.1.1. Epidemiologi tuberkulosis .. .. .. .. . . . . . 7 8 201.2. Aspek klinis dan patologis tuberculosis. 0 11 2020 Vitamin D Metabolisme dan pengaturan kadar vitamin D dalam tubuh. 1 1 22 1 13 Vitamin D sebagai imunomodulator 2.2.2. Mekanisme molekuler : genomik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.203. 2.2.4. Peran 1 ,25- Dihydroxyvitamin D3 terhadap tuberkulosis . . . . . . . 15 2.30 Cathelicidinooo.. . . . . . . . . ........... 18 2.3 . 1 . Biologi cathelicidin 18 2.3.2. Tempat ekspresi cathelicidin LL-37 (Site of expression) 21 Fungsi antimikrobial cathelicidin LL-37 21 2.3.30 Cathelicidin LL-37 dan TB 00 24 2.3.4. Cathelicidin LL-37 dengan penyakit 0. 25 203050 2.4. Penelitian klinis tentang kaitan vitamin D dan TB 26 BAS I l l 29 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 29 Tujuan umum 3.101. . 29 3.1.2. Tujuan khusus .. . .. .. 29 3.2. Manfaat. 30 BAB IV 31 4 METODE PENELITIAN.oo 31 4 1 Desain penelitian 31 4.2. Subyek penelitian 31 4.3. Jumlah ulangan 32 33 4.40 Lokasi penelitian 4.50 Varia bel penelitian . . 33 4.6o lnstrumen Pengumpulan Data I Metode Pemerikasaan . . . . 00.. . . . . . . . . . . . 33 4.7. Analisis Data 36 BAS V 38 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 38 Produksi cathelicidin LL-37 di monosit . . . . . . . . .40 41 Ekspresi mRNA cathelicidin LL-37 di monosit KESIMPULAN DAN SARAN 46 DAFTAR PUSTAKA . 47 o o o o o o o o o o o o o o O O O O O O O O O o o o . . o o
.........
0
. ...
0 . 0
.
0 .0
.
. o . o o o o o o
o o o
o o o
. . .
......
.
. . . . .
.
o o o o o o
o o o o o o o o o o o o o o o
.
...
. . .
0 0 0 .0 . 00 0 0 0 . . . . . . . . . 0 .0 .0
. .
.
. . .
.........
.
.
. .. .
o . o o o o o o o o o o o o · · · o o o o o o o o o o o o .
.0
. . . .. .
o o o o o o o o o
.........
.
..
.
.
.
. .
. . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
0 0 . . 0 0 0 0 0 0 0 0 •... 0
.
. .
.
. .
0
0
. .
. . . . . .
0 0
. . 0
. . 0
.
.
.
. .
.
0 0
.. . . . .
...
. .
.
.
0 . 0 0 0 0 0
0
0
00 . . . . . . . . . . . 00 00 . . 0
. o o o o o o o o o o o . . . . . . o
.
o o o o . o o o .
0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0
0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 . . . . . . . . . . . . .
0 0
. . . . .
· · · · ··
. . . . .o o . . . . . . . . . .
0 0 . . . 0 0 . . . . . . . . . . . . . . 00
0 .
o o o o o o o o · · · ·
o . . . . . . . . . . . . . . o o o o o o o o · · · · · · o o o o o o o o o o o o o o o o o o o ........ oooooooooo
00
. . o o
0
..
. . . . . . . . . . . . . 0 0
0 0 0
. . .
. . .
0 . .
0 0 0
0 0 . . . 0
.
0 0
.
. . .
. . . . . .
0 0
. 0 0
. . .
0
.
0.
0 . . .
. . . 0 0 . . . .
. . .
.
......
.oo
..................... oo......
.............................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .. ...
o o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...........................
. . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
..
.
0
. 0
.
.
..
0
. . . .
0
.
.
.
. 0
00 0
0
.. 0
0 0 0
.. 0
...
o o o o o o o o o
o o o o o o .
. o . . o o • o · · · · · · ·
· o o . o o o · · · · · · · ·
· · ·
.
0 0 . . 0 0 0
0 0 0
. .... .
..... .
0 0 0
.....
......
o . . . . . . . . . . . . . o .
. .
0 0
.
. .
0
.
. . ......
. . 00
0 0 0
0
..
. . . .
..
0
0
. . . . 0 0
.
. . . . . . . . .
0 0
0 0 0
. . 0
. 0 0
. . .
. . . .
..
. . .
. .
. . .
· o · · · · · · · · · ·
. . . .
...
. .
. 0 .
.
.
. .
. . . . . . . . . . . . . . . 00
0
. .
.
0 0 0
0 0
.
. . . . . .
0 0 .
..
0
0
. .
00
. .
00
.
.
..
. .
. . .
.
o o o
. . . .
o o · . . .
.....
..
.
.
. . .
. . . .
.
.
.
. oo
. . . . . .
..
00
0
....
.
.
00
00
.
.
0 0
0
.
.
0
.
. 0
. . . . . .
0 0 0 0 . . . . .
..
.
· · ·
· · · · · · · ·
o o o o ·
• • • • •
. . .
0 0
0
. . .
0 0 .
. . .. .. .. .
.
.
. 00
00
.
0
. .
0
.
. . .
..
00
0 .
. . .
. . . . . 0
. . . . . .
..
0 0 0
.
. .
0
. . . . .
. . .
.
.
0 0
. . .
. . .
. . . . . . . . . . . . .
0 0
. . . . . oo
.
. . . . .
. . 0 0
oo
. . . . oo
..
.
o o o o . . . o
o. 0
o . . . . o 00
0 0 . . . . . 0 0 . . .
. 00
..
0 . . 0
0 0 0
0 0 . . . . . . o o . . . .
..
.. o o
.
00 . . 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......
oo
. . .
. .
.
. . . 0 0. . 0 0 00.
. . . . . . . . . o o · · · · · · · o o . . o . · o · · · ·
0 0 .
o o . . o o . . . . o o . . o
0 0 .
. . .
o o . . . . . . . . . . . oo
0 0 . . 0 0
. . . . . . . . . . . . . . .
...
..
0 0 0 0
o . . . . . . . . . . . . o o
00 0
o o o o o ............... o
o o o o o o o · o · · · · o · · · · · · o · o · · · ·
.oo
. 0 .
. . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 0 0 . 0 0 00 .. 0 0 . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . oo
. . . o.
o
0 0 . . . . . . . . . 0
. . . . . 0 . . . . . .
.
.
.
o o . . . . . . . . o o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
. . .
0 0.
.. o o · · · · · · · · · · . . . . . . o o o o o o o o o .. oo . . . . . oo . . o o o o o o . . . oo .. o o o o · · · . . . . . . o
0
.
. . . .
. . . . . 0
0 0 0
o o . . . . . . . . o o
. . . . o o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
oo . . . .
0
.
· · · · · · · o ·
. . .
.
. . . . . . . 0 0
. .
.
00
. .
. . .
.
· · ·
. . .
..
· · · · · · o o · · · · · · ·
0 0 0 0 0
. . .
. . 0 0 . 0 0
. . .. . .
. . . .
• • •
00
.
. o o
0 0 0 0 0 0
. o o
· · · · ·
• • •
• • •
. . . 0 0 0 0 . . . . 0 0
. . .
00 .
0 0 . . . 0 . . 0
. o o
. 00
. . .
.
. 0 0
. .
0 0
...
o o . o o .
..
. . . . . . . . . . .
. 0 0 . 0 0
. .
.
.
. 0 0 0
.
.....
o o .
.
.
DAFTAR GAMBAR
Kronologis setelah M.tubercu/osis masuk kedalam paru ......
10
Gambar 2.
Metabolisme vitamin D
13
Gambar 3.
Mekanisme genomik 1 ,25-dihydroxyvitamin 0
Gambar 1
............... ......... ......... . . . . . . ......... .
(Mendoza and white, 2007) ................................. ......... Gambar 4.
15
.
Pengaruh 1 ,25-dihydroxyvitamin 03 terhadap jumlah M.tubercu/osis (Liu eta/., 2006) ......................................
Gam bar 5.
16
Pengaruh pemberian 1 ,25-dihydroxyvitamin 03 terhadap 17
Cathelicidin m RNA (Liu eta/., 2006) .............................. . Gambar 6.
Konsentrasi 25-hydroxyvitamin D di serum pada kelompok dan Causasian ......................................
18
Gambar 7.
Gene dan stuktur protein cathelicidin .............................. .
20
Gambar 8.
Pengaruh pemberian Cathelicidin terhadap viabilitas
Afrika Amerika
24
M.tuberculosis (Liu eta!., 2006) ...................................... .. Gambar 9.
Kerangka konsep yang menjelaskan pengaruh kadar vitamin D (25-hydroxivitamin D) serum pada sel monosit I makrofag
yang berikatan dengan ligannya ( DNA M. tuberculosis) terhadap pembentukan eathelieidin LL-37 ................................ . Gambar 10.
27
Hasil imunosikimia pada sampel dengan kadar vitamin D serum 16,7 ng/ml yang tidak distimulasi dengan DNA M.tuberculosis (A) dan yang distimulasi dengan DNA M.tuberculosis
Gambar 1 1 .
(B) .................. ........................ ....
39
..
Hasil imunosikimia pada sampel dengan kadar vitamin 0 serum 15,7 ng/ml yang tidak distimulasi dengan DNA M.tuberculosis (A) dan yang distimulasi dengan DNA M.tubercu/osis
Gambar 12.
(B)
.
...
. . .
. ... . .
. . .
39
.. ... . .................... ... .
.
.
.
Hasil imunosikimia pada sam pel dengan kadar vitamin 0 serum 33,3 n g/ml yang
tidak
distimulasi dengan
DNA M.tuberculosis (A) dan yang distimulasi dengan DNA M.tubercu/osis
(B) ...............................................
42
Gambar 13.
Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA eathelieidin LL-37 ......
Gambar 14.
Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA eathelicidin LL-37 pada monosit sesudah di stimulasi DNA M.tuberculosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 20ng/ml (Kode 3-8) ....................... . Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA eathelieidin LL-37 antara sesudah di stimulasi DNA M.tubereulosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 1 6,7ng/ml (Kode 1-6) ......................................... Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA eathelieidin LL-37 antara sesudah di stimulasi DNA M.tubereulosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 33,8ng/ml (Kode 11-17) .....................................
Gambar 15.
Gambar 16.
40
.
43
44
44
.
Gambar 17. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37 antara sesudah di sti mu las i DNA M.tuberculosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 33,30ng/ml (Kode 14 20) ... . . .. . .. ........ -
.
.
.
. . . .
. . . . .
. .
.
45
DAJFTAR TABEL
-� .....
Aktivitas biologik LL-37 ( Tomasinsig and Zanetti, 2005)
.............
24
BASI
PENDAHULUAN
".1.
Latar belakang
Tuberkulosis merupakan masalah kesehatan masyarakat yang penting dunia, dari laporan WHO menunjukkan sepertiga penduduk dunia telah �nfeksi bakteri tuberkulosis dan jumlah terbesar kasus TB terjadi di Asia Tenggara yaitu 33% dari seluruh tuberkulosis dunia (PDPI,2006). Indonesia merupakan negara ketiga di dunia dalam urutan jumlah oenderita tuberkulosis setelah India (30%) dan Cina (15%) dengan persentase sebanyak 1 0% dari total penderita tuberkulosis di dunia (Pardosi, 2007). Tahun 1995 hasil SuNei Kesehatan Rumah Tangga menunjukkan penyakit
tuberkulosis merupakan penyebab kematian nomor tiga setelah
oenyakit kardiovaskuler dan penyakit saluran pernafasan pada semua kelompok usia. Tahun 2004 dari hasil suNey prevalensi tuberkulosis di Indonesia menunjukkan prevalensi tuberkulosis dengan Bakteri Tahan Asam (BTA) positif secara nasional 1 1 0 per 1 00.000 penduduk dan angka ini oeNariasi antar propinsi ( Departemen Kesehatan Rl, 2008). Sejak tahun 1995 program nasional penanggulangan tuberkulosis mulai menerapkan strategi DOTS ( Directly Observed Treatment of Shortcourse ) yang dilaksanakan di puskesmas secara bertahap. Tahun 2005 program ini telah menjangkau 98% puskesmas, sementara rumah sakit dan BP4/RSP
1
:aru
sekitar 30%, tetapi hasilnya masih dirasa kurang memuaskan
:lapartemen Kesehatan Rl, 2008) Departemen Kesehatan Rl (2008) menyatakan
bahwa
kegagalan
:l:fogram pemberantasan tuberkulosis diakibatkan oleh tidak memadainya omitmen politik dan pendanaan, tidak memadainya organisasi pelayanan ruberkulosis, tidak memadainya tatalaksana kasus dan salah persepsi whadap manfaat dan efektivitas imunisasi BCG sebagai faktor untuk -nencegah penyakit tuberkulosis. Sampai saat ini program imunisasi BCG masih tetap dilaksanakan oengan tujuan untuk mencegah terkena tuberkulosis. Beberapa hasil oenelitian menunjukkan bahwa imunisasi BCG tidak efektif untuk mencegah LUberkulosis paru tetapi sangat penting dan efektif untuk mencegah £erjadinya tuberkulosis berat (Smith, 1986). Salah satu pilihan yang perlu dipertimbangkan untuk meng atasi oermasalahan di atas dalam upaya meningkatkan daya cegah terhadap tuberkulosis adalah pemberian vitamin D. Alasan pemberian vitamin D untuk meningkatkan daya cegah terhadap tuberkulosis didasarkan bahwa: Vitamin D berfungsi sebagai imunomodulator bekerja di imunitas oawaan (innate immunity) Penelitian in vitro dihydroxyvitamin menekan
03
dan
terlibat pada aktivasi sel makrofag.
menunjukkan metabolit aktif vitamin D yaitu 1 ,25yang ada di di dalam sel bisa membantu makrofag
pertumbuhan
M.
tuberculosis
melalui
pening katan
kadar
cathelicidin LL-37 dalam sel (Liu et a/., 2006). Cathelicidin adalah anti 2
mikrobial protein yang sangat poten yang bisa membunuh kuman gram negatif dan positif. Cathelicidin terdapat dalam tubuh manusia dalam bentuk Human LL-37 peptida atau h-CAP 1 8 yang berperan pacta innate immunity (Tomasinsig, 2005). Cathelicidin LL-37 di ekspresikan di sel neutropil, sel monosit, sel Natural Kill er dan sel mastosit
(Sorensen et a/., 1997b
&
Argerberth et a/., 2000). Holoprotein cathelicidin LL-37 di temukan di fagosom dari sel yang teraktivasi (Sorensen eta/, 1 997b) Beberapa penelitian epidemiologi yang telah dilakukan bahwa vitamin
0
mendukung
bisa mencegah seseorang untuk terkena tuberkulosis.
Penelitian epidemiologi dilaksakan oleh Lumsden et a/ (2007) menghasilkan perbedaan kadar 25-hydroxy vitamin tuberkulosis
dan
kontak
sehat
tuberkulosis rerata kadar vitamin dengan kadar vitamin p<0,0001(95%
Cl
0
0
0
yang bermakna antara penderita
(healthy
contacts).
Pada
penderita
di serum sebesar 20,1 nmol/1 dibanding
pada kontak sehat sebesar 30,84 nmol/1 dengan
7 , 1 4-14,34)..
Hasil
penelitian
epidemiologi
lain
menunjukkan pada populasi kulit hitam mempunyai prevalensi tuberkulosis lebih tinggi dari kulit putih. Hal ini dapat dijelaskan pada populasi kulit hitam sering didapat defisiensi vitamain D. Liu et a/ (2006) pada
penelitiannya
menunjukkan kadar vitamin D serum orang Afrika Amerika lebih rendah dari orang Caucasian. Kelemahan hasil penelitian di atas adalah sulit mengambil kesimpulan apakah rendahnya kadar vitamin 0 di serum menyebabkan mudah terkena tuberkulosis atau sebaliknya karena menderita tuberkulosis maka kadar vitamin
0
akan menurun.
3
Penelitian
pendahuluan
menunjukkan pemberian vitamin
dilakukan oleh Siswanto et a/ (2009) 03
dengan dosis 8001U/hari selama 2 bulan
dapat mempercepat konversi sputum dan perbaikan gambaran radiologi secara
bermakna
pada
penderita
tuberkulosis
yang
mendapatkan
pengobatan anti tuberkulosis standart. Hasil ini menunjukkan bahwa vitamin 0
mempunyai peran yang penting di dalam mematikan atau menghambat
pertumbuhan
M.
tuberculosis.
Para pakar menentukan hydroxyvitamin
0
defisiensi vitamin
0
adalah kadar 25-
di serum kurang atau sama dengan 20 ng per milliliter.
Kadar 21 - 29 ng per milliliter disebut relative insufficiency , sedang kadar 30ng per milliliter atau lebih disebut sufficient atau normal ( Holick, 2007
&
Mendoza and White, 2007). Hasil penelitian epidemiologi tentang prevalensi defisiensi vitamin menunjukkan prevalensi defisiensi vitamin
0
0
di masyarakat masih tinggi.
Penelitian dilakukan pada remaja Hispanic dan kulit hitam di dapat prevalensi defisiensi vitamin
0
dengan kadar 25-hydroxyvitamin
0
kurang dari 20ng per
mililiter sebesar 52% (Gordon et a/., 2004). Penelitian lain dilakukan di Amerika Serikat pada akhir musim dingin yang dilakukan pada orang sehat seperti anak sekolah, dokter dan mahasiwa kedokteran di Rumah Sakit Boston menemukan prevalen defisiensi vitamin
0
sebesar 32% (Nesby et a/.,
2002). Penelitian yang di lakukan oleh Siswanto et a/ (2009) pada penderita TB yang datang di Rumah Sakit dr.Saiful Anwar Malang menunjukkan rerata kadar 25-hydroxyvitamin
03
sebesar 1 8, 1 1 ± 9,53 ng/mililiter. 4
Berbeda dengan penelitian yang sudah dilakukan sebelumnya dimana pemberian 1 ,25-dihydroxyvitamin 03 pada medium untuk kultur makrofag dilakukan secara invitro, pada penelitian ini perbedaan. kadar vitamin D oerdasarkan asal donor monosit yaitu monosit yang berasal dari donor dengan defisiensi vitamin D dan monosit yang berasal dari donor dengan kadar vitamin D normal. Penelitian ini menggunakan monosit kemudian di papar dengan DNA M.tubercu/osis untuk menilai perbedaan ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan produksi cathelicidin LL-37 antara monosit yang berasal dari donor defisiensi vitamin D dan yang normal. Alasan menggunakan
monosit
dalam
penelitian
ini
adalah
dari
penelitian
sebelumnya yang bertujuan untuk melihat ekspresi mRNA VDR setelah pemberian stimulasi terhadap TLR2/1 oleh ligannya menunjukkan respon monosit lebih baik dari makrofag (Liu et at., 2006). Alasan lain menggunakan monosit adalah lama melakukan kultur monosit untuk dapat diberi perlakuan hanya perlu waktu 24 jam sehingga diharapkan tidak mengganggu kadar 25hydroxyvitamin 03 di dalam sel. Pemaparan pada penelitian ini menggunakan DNA M.tubercutosis berdasarkan pertimbangan dari hasil penelitian Santiago et at (2008) yang bertujuan untuk melihat peningkatan produksi cathelicidin LL-37 setelah distimulasi dengan berbagai ligan dari TLR
.
Hasil menunjukkan stimulasi
dengan DNA M.tubercutosis dapat meningkatkan produksi cathelicidin LL-37 secara bermakna baik dalam waktu 1 jam dan 18 jam setelah stimulasi. Berpijak pada masalah :-:rJ.Jjuan untuk mengetahui
diatas maka
dilakukan
penelitian
yang
pengaruh konsentrasi 25-hydroxyvitamin D 5
serum terhadap ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan produksi cathelicidin LL-37 di monosit yang di papar dengan DNA
M.
tuberculosis
1.2. Rumusan masalah
Apakah konsentrasi 25-hydroxyvitamin D serum berpengaruh terhadap ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan produksi cathelicidin LL-37 pada monosit manusia yang di papar dengan
M.
tuberculosis.
6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
-
•
Tuberkulosis
- � .1. Epidemiologi tuberkulosis
Situasi TB global menunjukkan terdapat sekitar 9.2 juta kasus baru TB �n kira-kira 1 .7 juta kematian karena TB pada tahun 2006.
Perkiraan
-.siden nya adalah 9.2 juta kasus baru TB pada tahun 2006. Diperkirakan 1 , 7 .. 13
orang (25/1 00.000) meninggal karen a TB pada tahun 2006, termasuk
--ereka yang juga memperoleh infeksi HIV ( Sub Direktorat TB Dep Kes Rl =.an WHO, 2008) India, Cina dan Indonesia berkontribusi lebih dari 50% dari seluruh ·.asus TB yang terjadi di 22 negara dengan beban berat TB: Indonesia -,enempati peringkat ke-3 setelah India dan Cina. Situasi TB di Indonesia di tunjukkan dari laporan Sub Direktotat TB Depertemen Kesehatan Rl dan WHO (2008).
Setiap hari sekitar 300 orang
meninggal karen a TB, lebih dari 100,000 orang meninggal setiap tahun dan ebih dari setengah juta pasien TB baru di Indonesia setiap tahun. Data ndikator TB 2006 menunjukkan populasi penduduk lndonesi sebesar 222.735.700
jiwa
dengan
insiden
TB
(semua
kasus/1 00.000
pendudukltahun) sebesar 234. lnsiden (BTA+ baru/1 00.000 penduduk/tahun) sebesar 1 05. Data prevalen TB 253/100.000 pendudukltahun dan angka kematian sebesar 38/100.000 penduduk/tahun ( Sub Direktorat TB Depkes Rl dan WHO, 2008) 7
2..1.2. Aspek klinis dan patologis tuberkulosis.
Cara masuk
M.
tuberculosis didalam tubuh melewati saluran nafas
saat bernafas ( droplet nuclei). Droplet dengan ukuran lebill besar dari 2 1-1m iidak bisa masuk ke dalam saluran nafas bawah karena ditahan oleh oertahanan fisik (physical barriers) dari nasopharynx dan saluran nafas atas. Mikroba dengan ukuran lebih kecil dari 2 1-Jm akan masuk kedalam paru . Ada tiga stadium yang akan terjadi setelah mikobakterium masuk ke paru Ferraz et a/., 2006) Tuberkulosis primer Tuberkulosis primer biasanya terjadi pada masa kanak kanak setelah Kontak dengan M.tuberculosis. Melalui respon imun yang sangat baik semua oakteri
didalam
makrofag dicerna, dimatikan dan
keadaan
ini yang
menjadikan tes PPD menjadi negatif. Situasi ini dipengaruhi oleh faktor kapasitas atau kemampuan melakukan fagositosis yang merupakan bagian dari mekanisme respon imun dan virulensi dari mikobakterium. Sehingga pada stadi um ini sering tidak ada gejala dan akan sembuh sendiri (Self limited disease).
Tuberkulosis Iaten Mikobakterium yang
lolos
dari
kematian
oleh makrofag
akan
berkembang biak dan tumbuh secara cepat dan menyebabkan kerusakan makrofag (Schluger and Rom,
1998). Selanjutnya monosit darah dan sel
inflamasi yang lain akan datang ke paru yang terinfeksi. Monosit tersebut akan
berdiferensiasi
menjadi
makrofag
yang
siap
untuk
melakukan 8
�gositosis kembali terhadap mikrobakterium tetapi tidak menghancurkannya. :lada stadium ini terjadi pertumbuhan mikrobakterium secara logaritmik , dan 'Tlakrofag terkumpul, kemudian terjadi kerusakan jaringao meskipun kecil. 3akteri disini bisa hidup sampai ber bulan bulan bahkan sampai bertahun zahun tanpa pertumbuhan (Non -replicative persistence) (Small and Fujiwara 2001 ). Manifestasi pada infeksi latent ini hanya ditemukan tuberkulin skin tes yang positif.
Pada infeksi latent ini di mungkinkan bila respons imun
penderita kuat. Pada keadaan status imun yang menurun maka penyakit bisa timbul lagi (Ferraz et at., 2006) Tuberkulosis skunder Setelah tuberkulosis Iaten penyakit dapat berkembang menjadi tuberkulosis skunder. Tuberkulosis skunder dimulai dari proses inflamasi eksudatif dengan ciri ciri pnemoni. Pada stadium ini muncul gejala gejala klasik seperti: batuk, panas, keluar keringat pada malam hari, nafsu makan menurun dan menurunnya berat badan. Pada stadium ini dapat terjadi pengkejuan dan terjadi kavitas dan proses ini sering terjadi di lobus atas (Apex).
Pembentukan kavitas dapat menyebabkan kejadian ruptur dekat
bronkus dan diikuti penyebaran basil melalui saluran pernafasan (Crevel et a/, 2002 & Raja, 2004). Bila proses infeksi berlanjut maka prognosisnya
jelek. Pada keadaan tertentu penyakit bisa berkembang menjadi kronis dengan cara pembentukan jaringan fibrosis. Pada keadaan ini penderita bisa hidup sampai bertahun tahun tetapi sering disertai serangan akut secara periodik yaitu terjadinya batuk darah, pada situasi seperti ini sering fatal (Small and Fujiwara , 2001 ).
9
Inhalation
M.tuberculosis
I
l Immediate killing of
l Primary Complex (Purified Protein Derivate +)
M. Teberculosis
(Purified
I
PrntP.inDP.rivntP. -)
I
I Stabilization (latency)
Localized Disease (primary TB}
l Stabilization (Latency)
1
f
l Dissemination
1 Acute disease
5
Reactivation (post primary TB}
Gambar.1. Kronologis setelah M.tuberculosis masuk kedalam paru.
Ada beberapa kemungkinan setelah bakteri masuk ke paru. Mikobakteria langsung dimatikan oleh makrofag alveoli, disini tidak terjadi infeksi dan tes kulit PPD (Purified Protein Derivate) negatif. Kemungkinan lain mikobakteria tidak terbunuh, pada keadaan ini akan lerbentuk primair komplek yang mengandung infiltrat dan terjadi pembesaran kelenjar mpha. Disini kalsifikasi akan terlihat di foto rongten dan tes PPD positif sebagai tanda adanya respon dari sel T. Sebagian kecil yang lain penyakit akan tumbuh menjadi tuberkulosis primer . Pada keadaan status imun yang jelek bisa juga terjadi penyebaran ruberkulosis dari primer komplek dan juga terjadi reaktivasi tuberkulosis ( post primary tuberculosis dari tuberkulosis Iaten ).
10
2.2. Vitamin D 2.2.1. Metabolisme dan pengaturan kadar vitamin D dalam tubuh.
Man usia mendapatkan vitamin 0 melalui dua cara ·yaitu dari asupan rnakan ( diet) dan keterpaparan dengan sinar matahari. Diet tinggi minyak an dapat mencegah defesiensi vitamin D (Bouillon, 2001). Pembentukan "'tamin D3 ( cholecalciferol) terjadi di sel kulit yang disebut keratinocytes. Radiasi sinar ultraviolet B dengan panjang gelombang 290-3 1 5 nm menembus kulit dan merubah 7-dehydrocholesterol yang terdapat di kulit menjadi previtamin D3. kemudian secara cepat dirubah lagi menjadi vitamin 03
( Holick, 2007). Pening katan kadar vitamin D3 atau previtamin D3 yang
berlebihan akan di hancurkan lagi oleh radiasi sinar ultraviolet B. Mekanisme mi sangat penting untuk mengatur keseimbangan kadar vitamin D ( Gambar 3). Vitamin D2 ( ergocalciferol) didapat melalui makanan. Ke dua bentuk vitamin diatas masuk ke sirkulasi dan menuju ke liver. Didalam liver terjadi metabolisme dengan bantuan enzym dirubah menjadi 25-hydroxyvitamin vitamin ini akan kembali
0,
ke sirkulasi. Saat ini sudah diketahui bahwa
kemampuan merubah vitamin D menjadi 25-hydroxyvitamin
0
tidak hanya di
liver tetapi juga bisa di kulit. 25-hydroxyvitamin D juga dipakai untuk menentukan status defisiensi vitamin D. Para pakar menentukan defisiensi vitamin D adalah kadar 25-hyd roxyvitamin D kurang atau sama dengan 20 ng per milliliter. Kadar 21 - 29 ng per milliliter disebut relative insufficiency, sedang kadar 30ng per milliliter atau lebih disebut sufficient ( Holick, 2007 ; Mendoza and White, 2007).
11
25-hydroxyvitamin D didalam ginjal dimetabolisme menjadi bentuk :.
•
1,25 -dihydroxyvitamin D dengan bantuan enzym 25-hydroxyvitamin D
'"""- hydroxylase (Cyp27 B1) (Holick, 2006). Produksi 1 ,25.-dihydroxyvitamin : calam ginjal diatur oleh kadar hormon parathyroid plasma, kadar calcium ...a
phosphor dalam serum (
Bouillon, 2001
&
Holick, 2006).
1 ,25
:._:;yydroxyvitamin D mempunyai peran yang sangat penting dalam absorbsi asium di usus maupun di ginjal serta absobsi phosphor di usus. Pada saat ini juga sudah diketahui bahwa jaringan lain termasuk kulit :.a..'l
sel di sistim imun juga mampu merubah 25-hydroxyvitamin D menjadi
:a tuk
aktif vitamin D yaitu 1 ,25-dihydroxyvitamin D dengan enzym Cyp2781
.'endoza and White, 2007). 1 , 25-dihydroxyvitamin D juga memicu (induces) ekspresi enzim 25�roxyvitamin
D-24-hydroxylase
(
CYP24),
merupakan
enzim
yang
:;erperan melakukan katabolisme terhadap 25-hydroxyvitamin D dan 1 ,25"hydroxyvitamin D menjadi bentuk yang tidak aktif yaitu asam calcitroic s.:.tatu bentuk yang larut dalam air
DeLuca, 2004
&
Holick, 2006
ekanisme ini (negative feedback) sangat penting untuk mengendalikan ag ar kadar vitamin D tidak menjadi terlalu tinggi dalam sirkulasi.
12
7�Dehyd f'oc hol e i.t;£OI
SoJ i'; uva
;;1 .-tio" udi.
(2 9(i::=.3'iS nrn)
S kin
l
25(0H)D (Me�;jor �;lrc;.ul�t.i"B n'lll!t-obc>llttr)
�
Gambar 2. Metabolisme vitam in D. r;amin D yang berasal dari kulit dan diet di metabolis di hati menjadi 25-hydroxyvitamin D. 25-hydroxyvitamin
D
masuk ke sirkulasi dan ke ginjal, di ginjal dengan bantuan enzim
CYP2781 di rubah menjadi 1 ,25-dihydroxyvitamin D yang merupakan bentuk aktif vitamin D. 3entuk aktif vitamin D ini kadarnya di kontrol secara ketat oleh kadar hormon parathyroid di :xasma, kadar calsium dan phosphor dalam serum. ( Holick, 2007)
2.2.2.
Vitamin D sebagai imunomodulator Konsep mengapa vitamin D bisa disebut sebagai imunomodu/ator
karena alasan sebagai berikut ( Adams et a/., 2007) : :::�ertama bila d iaktivasi oleh mitogen atau antigen spesifik, maka limposit dan makrofag I monosit akan mengekspresikan gene vitamin .<edua
bila
dirangsang
dengan
LPS
atau
D
receptor (VDR) .
interferon-gamma
maka
makrofag/monosit memiliki kemampuan untuk mensintesa dan melepaskan 13
---: ·vitamin D (1,25-dihyd roxyvitamin 03) ke dalam per-i celluler space, --:a
""letabolit ini merupakan ligan yang mengaktivasi VDR.
1ekanisme molekuler: genomik Titamin D ( 1 ,25-dihydroxyvitamin 03) mempunyai sifat lipopilik =�a -
dengan mudah bisa menembus membran sel dan masuk ke inti
::JSSO et a/., 2005). Vitamin D di target sel
==:::::"""
---..:ra
akan berikatan dengan
vitamin 03 (VDR) (Haussler et a/., 1998 ). Saat berikatan dengan (vitamin
D),
VDR
mengalami
perubahan
conformasional,
-·�n penggabungan (heterodimerisation) dengan retinoid X receptor ( nan membentuk RXR-VDR-Ligand complex. Selanjutnya RXR-VDR -::=-c complex berikatan dengan vitamin VDRE yang terletak d i promoter oari target genes. lnteraksi antara RXR-VDR-Ligand complex dengan : =..=
merangsang
��esi
di
proses transkripsi, selanjutnya akan diikuti proses
sitoplasma sehingga terjadi proses pembentukan protein
:sJ7ed protein).
Salah satu protein akhir yang terbentuk dari rangkaian
-.:.- diatas adalah cathelicidin LL-37 (Gambar 10). Dari penjelasan diatas � disimpulkan -
-an
bahwa
1 ,2 5-dihydroxyvitamin 03 merupakan
suatu
odulator yang poten/kuat.
14
Gambar 3. Mekanisme genomik 1,25-dihydroxyvitamin D (Mendoza and white, 2007). .!itamin D bersifat lipopilik sehingga dengan mudah menembus membran sel dan masuk ke -rti. Di dalam inti vitamin D (ligan) berikatan dengan vitamin D reseptor(VD R). VDR yang �h berikatan dengan vitamin D kemudian berikatan dengan RXR dan membentuk RXR IOR-Ligan kompleks dan berikatan lagi dengan VDRE yang terletak di promoter region di target gen. lnteraksi antara RXR-VDR-Ligan kompleks dengan VDRE menyebabkan :erjadinya proses trankripsi yang selanjutnya diikuti proses translasi di sitoplasma dan menghasilkan protein.
2.2.4. Peran 1,25- Dihydroxyvitamin 03 terhadap tuberkulosis.
liu et a/ (2006) dalam penelitiannya melihat pengaruh pemberian 1 , 25dihydroxyvitamin 03
terhadap jumlah
M.tuberculosi s yang hidup (viable
bacilli) secara invitro pad a makrofag yang telah di in feksi M. tuberculosis .
Pengukuran terhadap jumlah basil yang hidup dengan menggunakan CFU assay. Hasilnya menunjukkan terjadi penurunan yang bermakna (p < 0.01) terhadap jumlah basil yang hid up. (Gam bar 1 1 ) 15
Gam bar 4. Pengaruh 1 ,25-dihydroxyvitamin 03 terhadap jumlah eta/.,
M.tubercu/osis
(Liu
2006). Makrofag manusia yang di infeksi dengan M.tuberculosis virulen.
Penambahan 1 ,25-dihydroxyvitamin 03 dapa menurunkan viabilitas M.tubercu/osis (p<0,01).
Penelitian lain dilakukan untuk menentukan fungsi dari VDR. Penelitian dilakukan dengan cara memberikan 1,25-dihydroxyvitamin
03
pada monosit
11anusia dan induksi terhadap downstream dari target gen yaitu mRNA cathelicidin diukur dengan menggunakan q PCR. Hasil menunjukkan peningkatan ekspresi mRNA cathelicidin dipengaruhi oleh dosis 1,25dihydroxyvitamin D (Gambar 12)
16
t.HM
3ii=Jbar 5. Pengaruh pemberian 1,25-dihydroxyvitamin D3 terhadap Cathelicidin m RNA (Liu et al., 2006). Peningkatan cathelicidin mRNA dipengaruhi oleh dosis 1 ,25-dihydroxyvitamin D3
Dari hasil penelitian diatas penulis menyimpulkan (hipotesis) bahwa ;,-,ampuan 1 :ubercu/osis
1 ,25-dihydroxyvitamin melalui
kemampuan
03
dalam
vitamin
menurunkan
D
dalam
jumlah
meningkatkan
elicidin mRNA serta diharapkan akan meningkatkan protein cathelicidin
::a·
_-37. Penelitian epidemiologi dilaksanakan oleh Lumsden et at (2007) -.enghasilkan perbedaan kadar 25-hydroxyvitamin
0
yang bermakna antara
:enderita TB dan kontak sehat (healthy contacts). Pada penderita TB rata =.:a
kadar vitamin
-::am in ·.:.
0
di serum sebesar 20,1 nmol/1 dibanding dengan kadar
D pada kontak sebesar 30,84 nmol/1 dengan p<0,0001(95% Cl 7, 14-
34) .. Hasil penelitian epidemiologi lain menunjukkan pada populasi kulit
-':am mempunyai prevalensi TB lebih tinggi dari kulit putih. Hal ini dapat .:--;elaskan pada populasi kulit hitam sering didapat defisiensi vitamain ::i a/
D.
Liu
(2006) pada penelitiannya menunjukkan kadar vitamin D serum orang 17
Afrika Amerika lebih rendah dari orang Caucasian (Gambar 14). Oari hasil oenelitian di atas sulit diambil kesimpulan apakah rendahnya kadar vitamin di
0
serum menyebabkan mudah terkena TB atau sebaliknya.karena menderita
TB
maka kadar vitamin
>
'12:1:1
0
akan menurun
s.n.Jftl!l :zII'Ja($ I .... ...
11QO
�
•
80
•
5l
......
•
··=·
40 20 Ill
.
.. .. ...
... . ..
•ltoc .:AZr.. A.Jwl.ljW.
Q.au.c-.
Gambar 6. Konsentrasi 25-hydroxyvttamin 0 di serum pada kelompok Afrika Amerika dan Causasian. Konsentrasi 25-hydroxyvitamin D orang Caucasian lebih tinggi s€cara bermakna d ibanding dengan orang Afrika Amerika (Liu eta/., 2006)
2.3. Cathelicidin 2.3.1. Biologi cathelicidin Cathelicidin adalah endogenous antimicrobial peptide dengan jumlah asam amino kecil ( 12-1 00 asam am ino), bersifat cationic, dan memiliki aktivitas antimikrobial dengan spektrum
luas meliputi gram positif, gram
negative, jamur dan virus tertentu ( Zanetti et a/ , 2002
&
Nizet and Gallo,
2003). Manusia dan tikus mempunyai satu macam cathelicidin ( single gene product), sedang pada binatang tertentu mempunyai bermacam macam 18
:::aLhelicidin (multiple gene product) (Ramanathan et a/., 2002). Semua jenis :amelicidin di produksi sebagai prekusor yang mengandung N-terminal sgnal peptide atau "cathelin like domain" atau "proscquence domain" dan C �inal mature peptide (Zaiou and Gallo, 2002). Fungsi dari proscquence oom ain
belum
banyak diketahui,
sedang
C-terminal
mature
peptide
-empunyai fungsi sebagai anti mikrobial yang sangat poten dan mempunyai soektrum luas,
protein ini disebut "cathelicidin".
C-terminal peptides
""'empunyai aktivitas antibiotik setelah dipisahkan dari holoprotein. Selain -r;empunyai aktivitas antibiotik cathelicidin juga punya aktivitas biologi yang ran
yang berperan dalam sistim imun. Terdapat tiga kelompok besar C
'erminal mature peptide yaitu
:
1. amphipathic alpha-helix contoh LL-37 di
1anusia, 2. kelompok lain dibentuk dengan ikatan di sulfida yaitu {3-sheet suucture contoh protegrin di babi, 3. kelompok terakhir di perkaya dengan satu
atau dua asam amino ( proline atau arginine) contoh Bac7 yang
:erdapat di sapi/lembu (Gennaro and Zanetti, 2000). Gene cathelicidin terdiri dari empat exon dan tiga intron. Tiga exon �rtama menjadi signal
sequence yang terdiri dari 30 asam amino dan
catheline prodomain yang terdiri dari 94-144 asam amino. Exon yang
eempat meng kode C-terminal antimicrobial peptide yang terdiri dari12-100 asam amino yang terakhir ini di sebut cathelicidin. Enzim elastase dan proteinase-3 berfungsi untuk memisahkan mature C-terminal antimicrobial peptide dari catheline prodomai.n yang merupakan molekul precursor
yang tidak aktif (Gambar 7) 19
CATHELICIDIN
4 HIGHLY CONSERVED
GENE: EltONS
VARIABLE
A..__ ---. '1 .. ___,
r __ El.J'STASii OR PROT£1NAS£-3
-30AA
9<1-144AA
•
'12·100AA
FULL-LENGTH CATHELJCIO"IN
SlGNAL PI!,.TIO�
PRECURSOR CATHEUN PROlii:QUENCE DOMAIN
MI\TVRI: AMP
� 1!\. ) �
AMPHIPAT ALPHA·HEUX (e.g. LL-37)
l- . ?
.
BETA•SHEET
)
ENRICHED 11'1 SPECIFIC 1\,A, UKE PRO/"/•RCS
(e.g.BAc7)
STRUCTURE
(C.J:". PROTEGRIN)
Gambar 7. Gene dan stuktur protein cathelicidin. Cathelicidin gene mengandung empat exon dan tiga intron. Tiga exon pertama mengkode signal peptide dan cathelin prosequece domain, sedang exon keempat menjadi cathelicidin. Dengan bantuan elastase dan oroteinase-3 akan memisahkan mature AMP dari holoprotein dan terbentuk cathelicidin yang aktif (Nizet and Gallo, 2003).
Pada manusia cathelicidin disebut LL-37 atau hCAP 18. Nama LL-37 berasal dari urutan asam amino yang terdapat pada cathelicidin, di manusia dimulai
dari asam amino dua leusin dan jumlahnya 37. Nama hCAP18
oerasal dari cationic antimikrobial peptide dengan masa 18 kDa (Larrick et a/., 1 995) Cathelicidin bekerja di innate immune s ystem, sebab mekanisme
'llelawan mikrobial tidak melalui pengenalan atau terpapar terlebih dahulu dengan patogen. Cathelicidin punya peran yang penting dalam menghambat proliferasi mikrobial bahkan mematikan sebelum ada respon dari pertahanan imun seluler.
20
2.3.2. Tern pat ekspresi cathelicidin LL-37 (Si te of expressio n)
Cathelicidin LL-37 diproduksi di neutropil ( Sorensen et at., 1 997b) dan d i berbagai macam sel darah yang terlibat di imun respo ris seperti Sel NK, sel T, Sel
8,
monosit ( Agerberth et at., 2000) dan sel mast ( Di Nardo
et at.,
2003). Gen cathelicidin LL-37 di ekspresikan sangat luas seperti berikut di kulit, epitel squamous jalan nafas, mulut, lidah, esophagus, usus, cervix, dan vagina ( Hase et at., 2002). Selain itu juga di ekspresikan di kelenjar ludah dan kering at ( Murakami et at., 2002 a, b), dan di epididymis dan testis 'Agerberth et at., 1995
;
Maim et at., 2000). Dari data diatas sangat jelas
bahwa cathelicidin LL-37 sangat penting peranannya di innate immunity. Holoprotein cathelicidin LL-37 di dapat di fagosom ( phagocytic vacuoles) dari sel yang teraktifasi (Sorensen et a/., 1 997b) 2.3.3. Fungsi antimikrobial cathelicidin LL-37
Cathelicidin yang
matang
mempunyai efek sebagai antimikrobial
dengan spektrum yang luas melawan bakteri gram positif dan gram negatif. Cathelicidin tertentu
punya kemampuan yang sangat baik di dalam
rnematikan kuman Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis dan ::�seudomonas aeruginosa yang diperoleh dari nosocomial isolates yang
msistan terhadap pengobatan antibiotik konvensional ( Zanetti et at., 2002) dan M.tuberculosis (Liu et a t., 2006) emampuannya
melawan
jamur
(
Cathelicidin juga menunjukkan candida
albicans),
parasit
(
Cryptosporidium parvum) dan enveloped viruses (human immunodeficiency wrus) (N izet and Gallo, 2003). Kemampuan cathelicidin mematikan bakteri 21
_:::a :-.g t cepat. Mekanisme cathelicidin didalam mematikan bakteri melalui ·ercolati on dan penempelan (assembly) peptide dalam membran bakteri :.-.g
akan menyebabkan kebocoran membran (p ore formation) dan pada
- -·mya akan mengganggu intregritas membran bakteri ( Turner et a/., 1998 .:. Oren et a/., 1999
& Gutsmann
et a/ . , 2001). Mekanisme diatas berdasarkan
:zraksi elektrostatik antara cationic peptide dan anionic komponen dari l:G.i
eri. Selain berfungsi sebagai peptide yang dapat mematikan secara
�-.gsung mikrobial, cathelicidin LL-37 juga berfungsi sebagai mengikat dan -enetralisasi LPS atau komponen dari mikrobial yang berbahaya seperti :N:Iotoxin, lipoteichoic dan lipoarabinomannan dengan afinitas yang tinggi :an
mencegah terjadinya reaksi inflamasi berlebihan serta menghambat
_ai!el opment of lethal end ot oxemia ( Ciornei, 2003 & Turner et a/., 1998)).
-erikatnya LPS menyebabkan menurunnya respon seluler untuk melepaskan S!�kin TN F-a dan nitric oxide ( Hi rata et a/ . , 1994
&
Ohgami et at., 2003).
Selain mengikat langsung terhadap endotoxin cathelicidin LL-37 mempunyai ::ara lain
menurunkan efek berbahaya
dari endotoxin yaitu dengan
-enurunkan ekspresi sitokin proinflamasi dan reseptornya di makrofag (Scott stat.,
2002).
Fungsi lain cathelicidin LL-37 adalah sebagai chem oatt r actant atau ::nem otactic effects terhadap neutropil, monosit, limposit T (CD4) dan mast
Jells (Argerberth et a/., 2000
&
De Yang et a!. , 2000). Sehingga cathelicidin
�-37 bisa menarik lekosit pada tempat terjadinya infeksi (site of infecti on). -\ktivitas chemotactic ini sangat tergantung terhadap pengikatan pada formyl 22
.aptide receptor-like
1
(De Yang et a/., 2000). Aktivitas chemotactic
-::a!he licidin LL-37 mempunyai karakteristik sebagai berikut
:
1 . Dosis untuk
- eng induksi aktivitas chemotaxis lebih rendah dari dosi� yang diperlukan ruk efek antimikrobial yaitu 300-3000ng/ml untuk chemotaxis dibanding :31gan 1 O!Jg/ml untuk efek antimikrobial (De Yang et a/., 2000 ). 2. Aktivitas --emotaxis cathelicidin LL-37 menunjukkan bell-shaped dose - response =..:rve hal ini sesuai dengan typical faktor chemotactic (De Yang et a/., 1 999). 3.
Aktivitas chemotaxis cathelicidin LL-37 mempunyai selektivitas yang tinggi
;.iladap sel target hal ini menunjukkan aktivitas chemotaxis melalui -t!kanisme reseptor ( De Yang et a/., 2001).
Penemuan diatas
-umunjukkan bahwa cathelicidin LL-37 mempunyai kontribusi terhadap �pons imun dengan kemampuan yang ditunjukkan cathelicidin LL-37 untuk elakukan rekruitmen sel imun seperti monosit, neutropil, CD4 dan mast ::ells yang punya peran dalam sistim imun. Cathelicidin LL-37 juga berperan dalam memicu pelepasan histamin :Jan mobilisasi kalsium intraseluler dari mast cell ( Niyonsaba et a/., 2003). i 'ekanisme ini melalui degranulasi dari mast cell dan melepask :m inflamatory 11edi ators termasuk histamin dan akan memudahkan infiltrasi
neutropil ke
rlaerah yang mengalami inflamasi dengan cara meningkatkan permeabilitas 'laskuler. Peran jaringan
penting dan
luka
lain di
adalah mening katkan kulit
dengan
kesembuhan
meningkatkan
kerusakan
neovaskularisasi
·angiogenesis) dan reepitelisasi sehingga bisa mempercepat kesembuhan 23
:erhadap penyembuhan luka di kulit ( Gallo et a/., 2002
&
Heilborn et a/.,
�03). Tabel 1. Aktivitas biologik LL-37
'lu. -37 1
_,.,,cro blal actiVity .3nc1ng and Inactivation or LPS caemotaxls of blood cells �tion of epithelial cells Histamine release -.mast cells .:.auctiOn of anfjiOgenesls Modulation of gene
( Tomasinsig and Zanetti, 2005)
PR-3 9
B MAP 28
Ant imicrobial a ctivity C hemotaxis of neutro phlls Inhibition or NADPH oxidase activity Induction of angiogenesis Inhibition or lkBo dcg· mdatlon rn<Jucuon or S)'naecan expresSion
Antimicrobial activity LPS binding ana inocuvalion Apoptosis or nematopoietic and fibroblast-derived cells
lnhlbihon or macrophage apoptosls
eo;wesslon Re-epllhellalization or skin
2.3.4. Cathelicidin LL-37 dan TB
Liu et a/ (2006) dalam penelitian secara invitro pada sel monosit yang .Jertujuan
untuk
mengetahui
efek
langsung
cathelicidin
terhadap
.tuberculos s i . Hasil penelitian menunjukkan makin tinggi kadar cathelicidin
..,akin menurun jumlah M. tuberculosis yang hid up. Dalam penelitian ini oengukuran M.tuberculosis yang hidup menggunakan CFU assay.(Gambar
mli
O."'J
""I
� � p"U .;1� [Jo:l g"o"'rnf) < *
Gambar 8. Pengaruh pemberian Cathelicidin terhadap viabilitas
M.tuberculosis
(Liu
et
a/., 2006). Eksperimen dilakukan dengan memberikan berbagai dosis cathelicidin dan di kubasi dengan bakteri selama 3 hari.
24
Penelitian yang akan dilaksanakan peneliti mempunyai hasil akhir ::lenetapan produksi cathelicidin LL-37 dan bukan kesembuhan penderita :uberkulosis.
Kajian
diatas
menampilkan
hasil
hasil penelitian •
yang
-nenunjukkan peran cathelicidin LL-37 terhadap tuberkulosis, kajian tersebut ::.enting untuk dapat menjelaskan bahwa peningkatan produksi protein =athelicidin LL-37 akan mempengaruhi kesembuhan penderita tuberkulosis. ;asil kajian menyimpulkan (hipotesis) bahwa cathelicidin LL-37 dapat membantu kesembuhan penderita TB atau mencegah seseorang untuk tidak :erkena TB melalui mekanisme antimikrobial atau peran cathelicidin LL-37 sebagai
chemottractan.
Penelitian yang akan dilaksanakan juga akan
elengkapi penelitian yang telah di lakukan oleh Santiago
et a/
(2008), yaitu
:�angan tujuan untuk mengetahui peran vitamin D dalam meningkatkan e«spresi gen dan produksi cathelicidin LL-37. 2.3.5.
Cathelicidin
LL-37
dengan penyakit
Data penelitian menunjukkan bahwa peningkatan produksi cathelicidin U.-37 terjadi pada kulit sebagai respon terhadap infeksi lokal maupun S\Stemik.
Pada
verruca
vulgaris atau
::eningkatan ekspresi cathelicidin
condyloma
accuminata
terjadi
LL-37 di dalam epidermis, hal ini
-enunjukkan bahwa cathelicidin LL-37 mempunai peran yang penting di =spans imun terhadap infeksi papillomavirus (Conner et at., 2002). Pada �eksi yang tanpa disertai infeksi skunder terjadi peningkatan ekspresi ::athelicidin LL-37 misalnya psoriasis, sebaliknya pada atopic dermatitis yang sering disertai superinfeksi bakteri atau virus terjadi penurunan ekspresi .:a1helicidin LL-37 (Ong
et at.,
2002). Produksi carhelicidin
LL-37 juga
25
-eningkat pada kulit bayi baru lahir dibanding dengan orang dewasa, eadaan ini menunjukkan terjadinya mekanisme kompensasi di pertahanan -rJate immune sebab pada bayi baru lahir merupaka[l periode belum
lahir dengan
pnemonia juga ditemukan konsentrasi yang tinggi
::athelicidin LL-37 di broncho alveolar lavage ( Schaller et a/., 2002) - 4. Penelitian klinis tentang kaitan vitamin D dan T B
Beberapa penelitian uji klinis yang telah dilakukan untuk mengetahui ::engaruh pemberian vitamin ;ambaran :.....:Jerkulosis
radiologi
0
terhadap konversi sputum dan perbaikan
penderita
standar.
Penelitian
-anunjukkan pemberian vitamin
TB
yang
mendapat
dilaksanakan 0
pengobatan
Siswanto
anti
et at (2009)
yang menyertai pengobatan oral anti
:..._r_::)€ kulosis dapat mempercepat kesembuhan penderita tuberkulosis dengan :e.rameter konversi sputum dan gambaran radiologi. Hasil konversi sputum :s.oa kelompok yang mendapatkan vitamin
0
sebesar 67% dibanding
:.3:llg a n kelompok tanpa vitamin D sebesar 34% p=0,04 pada bulan pertama :angobatan. Perbaikan gambaran radiologis juga lebih besar pada kelompok ��
mendapat vitamin
18%, p=0,002.
_
0
dibanding dengan kelompok tanpa vitamin
0
67%
Penelitian yang sama dilakukan oleh Nursyam (2006)
-��g hasilkan kelompok yang mendapatkan vitamin D terjadi konversi r:um sebesar 100% dibanding dengan kelompok tanpa vitamin D sebesar
_ _
-= 7% 3a·
(p value 0,002) setelah mendapat pengobatan OAT selama 6 minggu.
hasil penelitian di atas juga dapat disimpulkan bahwa pemberian vitamin
: :�apat mempercepat kesembuhan penderita TB.
26
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
·:=RANGKA KONSEP
� --M . t_ ub _ _ _ rc _ _ e u /o s� --_J � �
I
-
__ I
� ��---C-at_h_e_l-i ci_d_in__LL_·3_7 I
_J +--
-� -n s_ a_ la si --_ _ � L �
VDR/RXR
Transkripsi
Transaktivasi gen cathelicidin LL-37
1,25(0H)2D
CYP27bl
Endositosiss
2S(OH)D serum
Gambar 9. Kerangka konsep yang menjelaskan pengaruh kadar vitamin D ( 25"l)'droxivitamin D) serum pada sel monosit I makrofag yang ber kata n dengan ligannya DNA M. tuberculosis) terhadap pem bentukan cathelicidin LL-37.
i
oteraksi antara PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern) dalam hal ini adalah DNA merupakan produk dari M.tuberkulosis dengan TLR 9 memicu �ningkatan ekspresi Cyp27B1 dan VDR. bersamaan dengan itu 25-hydroxyvitamin D -nasuk ke sel dengan pengaruh enzim Cyp27B1 dirubah menjadi bentuk aktif vitamin D yang disebut 1,25-dihydroxyvitamin D. 1,25-dihydroxyvitamin D berikatan dengan VDR dan RXR membentuk RXR-VDR-Ligand Complex. RXR-VDR-Ligand Complex berikatan dengan vrtamin D Responsive Element yang di promoter region di target gene dan selanjutnya diikuti ooses transkripsi, tranlasi dan terbentuk cathelicidin LL-37 yang merupakan peptida yang bersifat antimikrobial terhadap M.tuberculoss i .. 'W.tuberculo sis yang
27
HI POTESIS PENELITIAN 1. Ekspresi gen m RNA cathelicidin LL-37 pad a sel monosit yang berasal dari manusia dengan defisiensi vitamin
D
lebih rendah dari ekspresi
gen m RNA cathelicidin LL-37 pada sel monosit yang berasal dari manusia dengan kadar vitamin
D normal
setelah di papar DNA
M. tuberculosis .
. 2. Produksi protein cathelicidin LL-37 pada sel monosit yang berasal dari manusia dengan defisiensi vitamin
D
lebih rendah dari produksi
cathelicidin LL-37 pada sel monosit yang berasal dari manusia dengan kadar vitamin D normal setelah di papar dengan DNA M. tuberculosis.
28
BAB Ill
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan penelitian 3.1 . 1 . Tujuan umum
Menentukan pengaruh konsentrasi 25-hydroxyvitamin D
serum
terhadap ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan cathelicidin LL-37 pada monosit manusia yang di papar dengan DNA M.tubercu/osis. 3.1.2. Tujuan khusus
1 . Menentukan ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37, cathelicidin LL-37
dan
pada monosit manusia dengan defisiensi
vitamin D yang tidak dipapar DNA M.tuberculosis 2. Menentukan ekspresi gen mRNA cathelicidin
LL-37 dan
produksi cathelicidin LL-37 pada monosit manusia dengan defisiensi vitamin D yang dipapar DNA M. tuberculosis 3. Menentukan ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 pada monosit manusia
produksi cathelicidin LL-37 kadar
vitamin
D
normal
yang
tidak
dan
dengan
dipapar
DNA
M. tuberculosis.
4. Menentukan ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan produksi cathelicidin LL-37 pada monosit manusia
dengan
kadar vitamin D normal yang dipapar DNA M.tuberculosis 5. Menentukan pengaruh konsentrasi 25-hydroxyvitamin D serum terhadap
ekspresi
gen
mRNA
cathelicidin
LL-37
dan 29
cathelicidin LL-37 dengan
DNA
pada monosit manusia
yang di papar
M.tuberculosis.
3.2. Manfaat
1 . Bila hi potesis penelitian terbukti hasil penelitian
ini melengkapi
penelitian penelitian yang telah ada untuk memperkuat hipotesis Pemberian vitamin D pada orang dengan defisiensi vitam in D dapat menurunkan kepekaan terhadap TB (preventif).
2. Diharapkan pemberian vitamin
0
dapat menyertai imunisasi BCG
dalam upaya pencegahan tuberkulosis
30
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1. Desain penelitian
Desain penelitian yang dilaksanakan adalah penelitian eksperimental saboratorium. Terdapat empat kelompok perlakuan: Kelompok pertama :::d alah
monosit yang berasal dari darah perifer manusia dengan defisiensi
mamin D. Kelompok kedua adalah monosit yang berasal dari darah perifer 1anusia
dengan
defisiensi vitamin
D yang d i papar dengan
DNA
,f.tubercu/osis. Kelompok ketiga adalah monosit yang berasal dari darah
:.erifer manusia dengan kadar
vitamin
D normal. Kelompok keempat adalah
-:tonosit yang berasal dari darah perifer manusia dengan kadar vitamin D -ormal yang di papar dengan DNA M.tuberculosis. Keempat kelompok diikuti emudian di tentukan ekspresi gen mRNA cathelicidin LL-37 dan produksi -�otein cathelicidin
�.2.
Subyek penelitian Subyek (donor) penelitian adalah subyek dengan kadar vitamin D
--urmal dan subyek dengan defisiensi vitamin D yang di dapat di Malang. Semua subyek harus memenuhi kriteria sebagai berikut:
•
Foto dada normal
•
BTA dalam sputum negatif
•
Tidak ada kelainan fungsi hepar dengan pemeriksaan SGOT dan SGPT 31
•
Tidak ada kelainan fungsi ginjal dengan pemeriksaan BUN dan serum creatinin
•
Tidak terkena HIV dengan wawancara diberi kwesioner
•
Tidak menderita OM dengan pemeriksaan kadar gula darah
•
Tidak
sedang
mendapatkan
pengobatan
steroid
dengan
wawancara •
Telah mendapat imunisasi BCG atau mempunyai tes tuberkulin positif.
Subyek diambil darah perifernya sebesar
10
cc setelah mengisi informed
consent 4.3. Jumlah ulangan
Karena desain penelitian adalah eksperimental laboratorium maka ulangan replikasi) lebih tepat digunakan dibanding dengan jumlah sampel. Dibawah ni adalah formula penghitungan jumlah replikasi (Hanafiah, 2008)
(t-1) (r-1) � 15
·=
jumlah perlakuan dalam penelitian ini ada 4 perlakuan
r = jumlah
ulangan
Dengan menggunakan rumus diatas ditemukan jumlah ulangan (r) ...,asing masing kelompok sebesar minimal 6. Jadi diperlukan minimal sejumlah 24 well kultur monosit, dilakukan duplikasi sehingga diperlukan 48 32
;ell
kultur monosit. Masing masing kelompok akan dilihat ekspresi gen
::athelicidin LL-37, ekspresi gen VDR dan produksi NO. Untuk mendapatkan jumlah monosit yang cuku p jumlah subyek :angan kadar vitamin D normal dan subyek dengan defisiensi vitamin D -.asing masing sebanyak 3 orang. � 4. Lokasi pen elitian
Lokasi
penelitian
di Laboratorium
Mikrobiologi
dan
Laboratorium
�omedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang - 5. Variabel penelitian
1. Variabel
Bebas (Independent variable). Sebagai variabel bebas
adalah kadar vitamin D dalam serum. 2. Variabel
Tergantung
(Dependent
variable
).
Sebagai
variabel
tergantung adalah ekspresi gen m RNA cathelicidin LL-37 dan produksi protein cathelicidin LL-37 .! S. I NSTRUMEN PENGUMPULAN DATA / METODE PEMERIKSAAN
..
Kultur monosit: Darah vena dari pasien diambil dengan spuit steril dan dimasukkan ke tube vacutainer heparin. Darah dicampur dengan RPM I 1 640 (1 :2). Suspense sel dimasukkan dalam ficoll-hypaque dan diputar selama 30 menit pada 400xg. PBMC diisolasi dari interface dan dicuci dengan RPM I 1 640. 2 x 1 0 PBMC ditempatkan ke culture plate 6 well dan diinkubasi selama semalam pada suhu 37 °C. hari 33
kemudian sel nonaderen (95% PB Mn) diuji dengan pengecatan esterase (Sharma et a/, 2004). 2. Penentuan kadar vitamin D (25 hydroxivitamin D) !fi serum dengan
metode
ELISA menggunakan plate reader (Biorad) . Semua bahan
dikeluarkan dalam suhu ruang. Kalibrator, kontrol dan sampel diambil 25 �L dan dimasukkan ke dalam masing-masing tube 1 ml. Masing
masing tube ditambahkan 25-D biotin solution sebanyak 1
ml
kemudian disuspensi dengan vorteks selama 20 detik. Kalibrator, kontrol dan sampel sebanyak 200�L dimasukkan ke masing-masing well pada mikroplate yang sudah tertempel dengan antibodi (antib ody c o ated plate). Plate ditutup dengan penutup kemudian diinkubasi
selama 2 jam pada suhu 1 8-25°C. Setelah inkubasi, suspensi dibuang dan plate dicuci dengan larutan pencuci sebanyak 300�L sebanyak 3 kali. Masing-masing well ditambahkan sebanyak 200 �L Enzyme conjugate kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 18-25°C. Setelah diinkubasi plate dicuci seperti tahap sebelumnya. Substrat TMB ditambahkan 200�L dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 1 8-25°C.
3. lsolasi DNA M.tubercu/osis H37Rv:
1
x
10 9 sel M. tubercul osis
dimasukkan dalam tube 2 ml dan ditambahkan dengan 1 OO�L SE buffer. 100 � L 4 M guanidine isothiocyanate ditambahkan ke suspensi M.tubercu/osis
kemudian
dihomogenasi
dengan
cara
pipetting.
Suspense M.tubercu/osis. ditambahkan dengan 700�L klorofor dan 400�L NaCI 4M. suspense dihomogenkan dengan tangan dan diputar 34
10000 rpm selama 1 0 menit. Supernatant diambil sebanyak 5001-JL dan dipindahkan ke dalam tube 1 . 5 ml. suspense ditambahkan lagi dengan etanol
(1: 1 ) kemudian dihomogenkan
dengan tangan.
Suspense diputar dengan kecepatan 1 0000 rpm selama 2 menit. Pellet yang mengandung
DNA diambil sedangkan supernatant
dibuang. Pellet ditambahkan dengan 5001-JL ethanol 70% dan dikocok secara hati-hati. Suspense diputar dengan kecepatan 1 0000 rpm selama
1 0 me nit. Supernatant dibuang sedangan pellet (DNA)
dikeringkan dengan suhu 55 °C selama 5 menit. DNA ditambahkan dengan TE buffer sebanyak 4001-JL kemudian konsentrasi DNA dihitung. 4. Produksi protein cathelicidin LL 37: ditentukan secara semi kwantitatif dengan metode imunositokimia mengunakan anti human LL-37 monoclonal antibodi ( Santiago et a/. , 2008). Kultur monosit dicuci dengan PBS pH 7,4 tiga kali, kemudian difiksasi dengan metanol absolut 1 0 % (v/v) dalam PBS pH 7,4 selama 20 men it. Sel dicuci dengan PBS pH 7,4 sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit. Sel ditetesi dengan 0,02 % (w/v) sodium azide. Sel dicuci dengan PBS pH 7,4 tiga kali selama 5 menit. Sel ditetesi dengan larutan H202 dalam PBS selama 10 menit. Sel ditetesi dengan blocking serum 5 % FBS yang mengandung Triton-X 0,25 % selama 1 jam. Sel dicuci dengan PBS. lnkubasi antibodi primer dalam serum 1 : 200 (Anti human Cathelicidin) selama 24 jam. Sel disimpan pada suhu 4 oC. Sel
dikeluarkan pada suhu ruang selama 1 5 menit. Sel dicuci dengan PBS 35
3 kali selama masing-masing sekunder
5
menit. Sel diinkubasi dengan antibodi
1 : 400 (Anti Mouse lgG) selama 1 jam pada suhu ruang.
Sel dicuci dengan PBS 3 kali selama masing-masiag ditetesi dengan SA-HRP selama
dengan
menit. Sel
40 menit kemudian dicuci dengan
PBS 3 kali selama masing-masing kromogen DAB (3,3
5
5
menit. Sel ditetesi dengan
Diaminobenzedine tetrahydrocloride). Sel ditetesi
counterstains dengan mayer hematoxilen selama 10 men it.
Sel dicuci dengan air kran kemudian dicuci dengan aquades selama
1 0 me nit. Sel dibiarkan pad a suhu kamar. Jaringan diletakkan pad a object glass dan ditetesi dengan entellan (perekat) dan diamati dibawah mikroskop dan menghitung
5.
Kultur
percentage of positive cells.
M.tuberculosis. M.tuberculosis H37Rv disimpan dalam medium
Lowenstein-Jensen dalam suhu 4°C, diambil dan dikultur/d itumbuhkan di agar Middlebrook 7H9 broth dengan suhu 37°C selama 3 s-d minggu
dan
dipindahkan
konsentrasi/kepadatan
kemedium
cair
4
dengan
2X1 05 bacterial/ml (Sharma et al., 2004)
4.7. ANALISIS DATA
Analisis data untuk mengetahui perbedaan mRNA cathelicidin
terhadap ekspresi gen
LL-37 dan produksi protein cathelicidin LL-37
monosit normal dan penderita defisiensi vitamin D baik yang :)NA
pada
yang dipapar
M.tuberculosis maupun tidak dipapar DNA M. tuberculosis digunakan
uji independent t test
dengan tingkat kemaknaan
a =
0,05. Korelasi antara
ekspresi mRNA VDR dengan produksi cathelicidin LL-37 menggunakan uji .i{Orelasi Pearson
36
..::Jur penelitian
SUBYEK P E N E LITIAN
MEMENUHI KRITERIA INKULSI
Monosit berasal dari subyek dengan
dari subyek dengan -
kadar Vitamin D normal (kadar 25 -
0 (kadar 25 -
hydroxyvita min D � 30 ng/mln
-"·� ::J < 20 ng/ml
n=3 Kultur 24 jam
Monosit
dipapar
DNA
Monosit tidak dipapar
M.tb
DNA
M.tb
n=G
n=G
• Ekspresi mRNA
•
Ekspresi mRNA
n=G
•
Produksi protein
Chatelicidin LL-37
•
Produksi protein
Chatelicidin LL-37
Ekspresi mRNA cathelicidin
cathelicidin
cathelicidin •
Monosit dipapar DNA
M.tb
•
Produksi protein
Chatelicidin LL-3 7
ANALISA DATA 37
BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Didapatkan 1 2 subyek penelitian untuk dilakukan perneriksaan darah �an foto thorax. Dari 12 subyek penelitian satu orang dikeluarkan karena saat kultur tidak didapatkan
PBMC. Ada
11
subyek penelitian dengan
stribusi kadar vitamin D serum sebagai berikut : 3 subyek penelitian :lefisiensi vitamin D, 4 subyek penelitian dengan kadar vitamin D normal, 1 subyek
penelitian
dengan
kadar vitamin
D insufisiensi
dan
3
subyek
�nelitian belum ada status vita m i n D. Sebelas subyek penelitian dilakukan _?emeriksaan imunositokimia dan �erata kadar vitamin
0
RT PCR.
dari 1 2 sam pel penelitian 24,34±
aenunjukkan bahwa rerata kadar vitamin D
6,1
ng/ml hasil i n i
serum pada orang yang tidak
:Efkena tuberkulosis masih rendah dan tergolong insufisiensi. Meskipun hasil -zrata kadar vitamin D tergolong insufisiensi, tetapi masih lebih tinggi dari �rata kadar vitamin D di serum pada penderita tuberkulosis. Penelitian yang :.lakukan pad a penderita tuberkulosis dengan
BTA+
di Rumah Sa kit dr.
Saiful Anwar Malang menunjukkan rerata kadar vitamin 0 serum
18, 1 1 ±
;.53 ng/mililiter (Siswanto dkk, 2009). Perbedaan kadar vitamin 0 serum :mtara
penderita
tuberkulosis
remukan oleh Lumsden
dan
orang
sehat
(healthy c ontact) juga
et a/ (2007). Hasil menunjukkan kadar vitamin D
::lada orang sehat sebesar
30,84 nmol/1 dibanding dengan kadar vita min D
:Jada penderita tuberkulosis sebesar
20,1 nmol/1 (p= 0,0001 ). Fakta diatas
sbih meyakinkan bahwa rendahnya kadar vitamin D merupakan salah satu "aktor
yang
memudahkan
seseorang
terkena
penyakit
tuberkulosis, 38
meskipun belum tentu benar, sebab pengumpulan data kadar vitamin 0
dan
penentuan seseorang terkena tuberkulosis dilakukan bersamaan sehingga sulit diketahui mana yang lebih dahulu antara defisiensi vitamin 0 dan seseorang terkena tuberkulosis.
Gambar 10. Hasil imunosikimia pada sampel dengan kadar vitamin D serum 16,7 nglml yang tidak distimulasi dengan DNA M.tubercu/oss i (A) dan yang distimulasi dengan DNA M.tubercu/osis (B). Pengecatan imunositokimia menunjukkan hasil negative.
Gambar 1 1 . Hasil imunosikimia pada sampel dengan kadar vitamin D serum 15,7 nglml J-ang tidak distimulasi dengan DNA M.tubercu/osis (A) dan yang distimulasi dengan !JNA M.tubercu/osis (B). Pengecatan imunositokimia menunjukkan hasil negative.
39
Gambar 12. Hasil imunosikimia pada sampel dengan kadar vitamin D serum 33,3 ng/ml yang tidak distimulasi dengan DNA M.tubercufosis (A) dan yang distimulasi dengan DNA M.tubercu/osis (8). Pengecatan imunositokimia menunjukkan hasil negative .
Produksi cathelicidin LL-37 di monosit
Ada beberapa penelitian yang dilakukan untuk melihat produksi cathelicidin LL-37 didalam sel monosit Penelitian yang dilakukan oleh Liu et a! (2007) menunjukkan adanya protein cathelicidin LL-37 di human monocytic cell line
THP 1
dengan
menggunakan intracellular flow cytometry. Penelitian lain yang dilakukan oleh Liu et a/ (2006) di monosit juga menunjukkan keberadaan cathelicidin di dalam sel monosit. Oari hasil temuan diatas peneliti melakukan penelitian untuk melihat keberadaan cathelicidin di dalam sel monosit pada orang dengan defisiensi vitamin
0
dan kadar vitamin
0
normal. Pengenalan
terhadap keberadaan cathelicidin LL-37 pada penelitian ini menggunakan teknik
imunositokimia
dengan
pertimbangan
keberadaan
alat
ini
di
laboratorium serta ada peneliti yang menggunakan cara ini untuk mendetelksi adanya protein cathelicidin di dalam sel meskipun tidak di monosit melainkan di makrofag. 40
Hasil penelitian menunjukkan dari 3 subyek penelitian yang defisiensi vitamin D 3 subyek penelitian dengan kadar vitamin D normal menunjukkan hasil imunositokimia negatif. Hasil ini sama dengan penelitian yang dilakukan oleh Santiago et a/ (2008) yang mengi nfeksi monosit dengan M.tuberculosis dan penentuan keberadaan protein cathelicidin LL-37 juga menggunakan imunositokimia. Selain menginfeksi monosit dalam penelitian ini juga dilakukan pada makrofag alveoli dan hasil menunjukkan banyak sel makrofag
alveoli
yang
positif
dengan
pengecatan
imunositokimia.
Disimpulkan monosit tidak mampu atau kurang mampu untuk memproduksi cathelicidin hal ini dapat dihubungkan dengan fungsi monosit pada respon imun. Dimana sebagai fagositosis profesional adalah makrofag sedang monosit belum berfungsi sebagai sel fagositosis sehingga tidak memerlukan banyak cathelicidin di dalam sel dan produksi cathelicidin akan meningkat setelah monosit berdiferensiasi menjadi makrofag. Hal penting lain dari kejadian diatas adalah intracelluler flow cytometry lebih sensitif dalam hal mengetahui keberadaan cathelicidin di dalam sel, mengingat keberadaan cathelicidin LL-37 bisa di deteksi di monosit dengan menggunakan teknik intracelluler flow cytometry. Ekspresi mRNA cathelicidin LL-37 di monosit
Real time PCR di pakai untuk menentukan ekspresi mRNA cathelicidin LL-37. Hasil sementara penelitian menunjukkan bahwa dua sampel dengan defesiensi vitamin D dengan kadar vitamin D masing masing 16, 7ng/ml dan 20ng/ml terekspresi lebih rendah dari dua sampel dengan kadar vitamin D masing masing 33,8ng/ml dan 33,3ng/ml pada kelompok yang distimulasi 41
dengan DNA M.tuberculosis. (Gambar 4). Hasil ini ditunjukkan dari mulai terdeteksinya eDNA cathelicidin dimana pada subyek dengan kadar vitamin D normal terdeteksi lebih awal yaitu pada siklus ke16 dan· 19 dan percepatan grafik naiknya lebih cepat (warna biru dan hijau) dibanding dengan yang defisiensi ( warna merah dan ungu ) yang terdeteksi pada siklus ke 19 dan 20 dan kenaikan grafik pertambahannya tidak setajam kelompok yang normal. Hasil diatas masih bersifat kwalitatif dan masih menunggu hasil kwantitatif yang saat ini sedang dikerjakan. Hasil penelitian diatas sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh liu et a/ (2006) yang menunjukkan pemberian vitamin D secara exogenous pada kultur monosit dapat meningkatkan ekspresi m RNA cathelicidin LL-37. Pada penelitian ini vitamin D tidak diberikan dari luar tetapi vitamin D didasarkan dari kadar vitamin D dalam serum. Ampllfloatlon CurvGc 0.76
0£6
Gam bar 13. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37. Subyek garis vitamin D 33,30ng/ml) terdeteksi paling cepat diikuti warna hijau ( Vit D
warna biru (Kadar
33,80ng/ml), warna merah (20ng/ml) dan warna ungu (16,7ng/ml)
42
Stimulasi dengan DNA M.tuberculosis dapat meningkatkan ekspresi mRNA cathelicidin LL-37. Hal ini ditunjukkan dari hasil penelitian pada sampel dengan defisiensi vitamin D dengan kadaf 20ng/ml (gambar 5) sampel dengan kadar vitamin D 33,8ng/ml (gambar 7) dan sampel dengan kadar vitamin D 33,30 (gambar 8) dari ketiga sampel ini menunjukkan ekspresi m.RNA lebih tinggi pada sampel yang mendapatkan stimuli DNA
M.tuberculosis. Hanya sampel dengan kadar vitamin D 16,7 (gambar 6) yang menunjukkan sampel tanpa stimuli mempunyai ekspresi m RNA cathelicidin LL-37 lebih tinggi dibanding yang mendapatkan stimuli. Secara keseluruhan kesimpulan sementara menunjukkan pemberian stimulasi dengan
DNA
M. tuberculosis dapat meningkatkan ekspresi mRNA cathelicidin LL-37. Ampllfloation
Curves
0.76 0.71
o.ss
0.61
li 3
4 5 6 7 8 9 10f1 121314151S1718t92D2122232425262728293031J23334353637383940
Cycles
Gambar 14. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37 pada monosit sesudah di stimulasi DNA M.tuberculosis {merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 20ng/ml (Kode 3..S)
43
A•plifloatlon Curves 0.76
0.71
0.660,61
C).§ i
!e i
� �
0.51 0.46
0.41 0.36 0.31 0.26 0.21 0.1
1
:2
3 4 5 s 1 e 9 1 o tn213Hts1s171et92021 22232 425262726293031323334353637383940
Cycles
Gambar 15. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37 antara sesudah di stlmulasi DNA M.tuberculosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 16,7ng/ml (Kode 1-6))
AmpiiHcatJon
Curves
0.78 0.710.66 0.61 0 .56
i
!!! lit
:::. .,
i I 2
. ...
0.51 0.46 0.41
0.360.31 0.250.21-
0.16 0.11
O.Q1-
1 2 3 4 5 6 1 e e tot112t31415161718192021 2223242526272B29303132333435JS37383940
Cy.IH
Gambar 16. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37 antara sesudah di stimulasi DNA M.tuberculosls (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 33,8ng/ml (Kode 1 1 -17))
44
A•plifieat;on Curves
0.76
O.SB
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 171819202122232•252B272B2930313233343536373839CO
<:y
Gambar 17. Jumlah siklus mulai terdeteksi eDNA cathelicidin LL-37 antara sesudah di stimulasi DNA M.tuberculosis (merah) dan sebelum (biru) pada subyek dengan kadar vitamin 33,30ng/ml (Kode 14-20)
45
Kesimpulan
1 . Monosit yang berasal dari donor kadar vitamin D normal mempunyai ekspresi mRNA cathelicidin LL-37 lebih tinggi dari fnonosit
yang
berasal dari donor dengan defisiensi vitamin D 2. Ekspresi mRNA cathelicidin LL-37 dari monosit yang di stimulasi dengan DNA M.tuberculosis lebih tinggi dari monosit yang tidak di stimulasi dengan DNA M.tuberculosis. 3. Tidak ada produksi protein cathelicidin LL-37 baik pada monosit yang berasal dari donor dengan kadar vitamin D normal maupun defisiensi vitamin D Saran
Pada penelitian selanjutnya penentuan produksi cathelicidin LL-37 sebaiknya menggunakan lntraceluler Flow Cytometry
46
DAFTA R KEPUSTAKAAN
Adams J, Liu P, Geffen D, Rene C, Modlin R, Martin H .2007. Vitamin D in Defense of The Human
Immune Response. Annals of the
New York Academy of Science.
Skeletal Biology and Medicine.
New York.2007: 1 - 1 8. Agerberth B, Gunne H, Oderberg J, Kogner P,Boman HG, Gudmundsson, GH. 1995. FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine free and expressed in bone marrow and testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 195-199. Bouillon R.(2001 ). Vitamin D: from photosynthesis, metabolism, and action to clinical applications. In: DeGroot LJ, Jameson JL, eds. Endocrinology. Philadelphia: W.B.Saunders, 1 009- 1028. Ciornei CD, Egesten A, Bodelsson M. 2003. Effects of human cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 on lipopolysaccharide-induced nitric oxide release from rat aorta in vitro. Acta Anaesthesiol Scand. 47: 21 3-220. Conner K, Nern K, Rudisill J, O'Grady T, Gallo RL.2002. The antimicrobial peptide LL-37 is expressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris. J Am Acad Dermatol. 47: 347-350. Crevel RV; Otten hoff THM; Van der Meer JWM, 2002. Innate Immunity to Mycobacterium Tuberculosis. Clinical Microbiology Review, Netherlands. 1 5,2: 294 - 309. Deluca HF. 2004. Overview of general physiologic features and functions of vitamin D. Am J Clin Nutr 80. Suppl: 1689S-1696S. De Yang, Chertov
0,
Bykovskaia SN, Chen Q, Bufflo MJ, Shogan J,
Anderson M, Schroder JM, Wang JM, Howard OMZ, Oppenheim JJ. 1999. �-defensins : linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science. 286: 525-528. De Yang, Chen Q, Schmidt AP, Anderson GM, Wang JM, Wooters J, Oppenheim JJ, Chertov 0. 2000. LL-37, the neutrophil granule and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide 47
receptorlike 1 (FPRL 1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells. J. Exp. Med. 192:
1069-1074.
De Yang, Chertov 0, Oppenheim JJ. 2001. Participation of mammalian defensins and cathelicidins in antimicrobial immunity : receptors and activities of human defencins and cathelicidin. J. Leukocyte Biology. 69: 691 -697. Departemen Kesehatan Rl. 2008. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis. Edisi 2. Cetakan kedua Di Nardo A, Vitiello A, Gallo RL. 2003. Cutting edge: mast cell antimicrobial activity is mediated by expression of cathelicidin antimicrobial peptide. J. lmmunol. 170:2274-2278. Dorschner RA, Lin KH, Murakami M , Gallo RL.2003. Neonatal skin in mice and humans expresses increased levels of antimicrobial peptides: innate immunity during development of the adaptive response. Pediatr Res. 53: 566-572. Dusso AS, Brown AJ, Slatopolsky E. 2005. Vitamin D. Am J Physiol 289: F8-F28. Ferraz JC, Melo FBS, Albuquerque MFPM, Montenegro SML, Abath FGC. 2006. Immune factors and immunoregulation in tuberculosis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 39: 1 387-1 397 Gallo RL, Murakami M, Ohtake T, Zaiou M. 2002. Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial peptides. J Allergy Clin lmmunol. 1 1 0: 823-8313. Gennaro R, Zanetti M. 2000. Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers. 55: 31- 49. Gordon CM, DePeter KC, Feldman HA, Grace E, Emans SJ.2004. Prevalence of vitamin D deficiency among healthy adolescents. Arch Pediatr Adolesc Med.158:531-537. Gutsmann T, Hagge SO, Larrick JW, Seydel U, Wiese A (2001) 48
Interaction of CAP1 8-derived peptides with membranes made from endotoxins or hospholipids. Biophys J. 80: 2935-2945. Hanafiah
KA.
2008. Rancangan Percobaan. Teori dan aplikasi. Divisi Buku
Perguruan Tinggi. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta. Hal: 8-9. Hase K. Eckmann L, Leopard JD, Varki N , Kagnoff MF. 2002. Cell differentiation is a key determinant of cathelicidin LL-37/human cationic
antimicrobial
protein
18
expression
by
human
colonepithelium. I nfect. lmmun. 70: 953-963. Haussler MR. Whitfield GK, Haussler CA, Hsieh JC, Thompson PO, Selznick SH, Dominguez CE
&
Jurutka PW. 1998. The nuclear
vitamin D receptor: biological and molecular regulatory properties revealed. J Bone Miner Res 13: 325-349. Heilborn JD, Nilsson MF, Kratz G, Weber G, Sorensen O, Borregaard N, Stahle-Backdahl M. 2003. The cathelicidin antimicrobial peptide LL37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120: 379-389. Hirata M, Shimomura . Yoshida M, Morgan JG, Palings
I,
Wilson D et al.
1 994. Characterization of a rabbit cationic protein (CAP18) with lipopolysaccharide-inhibitory activity. Infect. lmmun.
62:
1421-1426.
Holick MF. (2006) Resurrection of vitamin D deficiency and rickets. J Clin Invest. 1 1 6: 2062-2072. Holick MF. 2007. Vitamin D Deficiency. New England Journal of Medicine 357: 266-281 Larrick JW, Hirata M, Balint RF, Lee J, Zhong J, Wright SC. 1995. Human CAP18: a novel antimicrobial lipopolysaccharide-binding protein. Infect lmmun. 63: 1291-1297 Liu PT. Stenger S, Li H, Wenzel L, Tan BH, Krutzik S et al. 2006. Toll Like Receptor Triggering of a Vitamin D-Mediated Human Antimicrobial Response.Sciencexpress. 24:1770-1773. Lumsden AS, Lapthorn G, Swaminathan R, Milburn HJ .2007. Reactivation of tuberculosis and vitamin D deficiency : the contribution of diet and exposure to sunlight. Thorax. BMJ and 49
British Thoracic Society ( Abstract) Maim J, Sorensen
0,
Persson T, Frahm-Nilsson M,Johansson B, Bjartell A,
Lilja H. Stahle-BackdahiM, Borregaard N.,
Egesten A. 2000. The
human cationic antimicrobial protein (hCAP-18) is expressed in the epithelium of human epididymis, is present in seminal plasma at high concentrations, and is attached to spermatozoa. Infect. lmmun. 68: 4297-4302. Mendoza LT, White JH. 2007. Sunshine Vitamin. Scientific American 62-72. Murakami M, Ohtake T, Dorschner RA., Schittek B, Garbe C,
Gallo R
L.
2002a. Cathelicidin anti-microbial peptide expression in sweat, an innate defense system for the skin. J. Invest. Dermatol. 1 19: 10901095. Murakami M, Ohtake T, Dorschner RA,
GalloRL. (2002b). Cathelicidin
antimicrobial peptides are expressed in salivary glands and saliva. J. Dent. Res.81: 845-850. Nesby-O'Dell S, Scanlon KS, Cogswell ME, Gillespie C, Hollis BW, Looker AC et a/., 2002. Hypovitaminosis D prevalence and determinants among African American and white women of reproductive age: Third National Health and Nutrition Examination Survey, 19881994. Am J Clin Nutr. 76:187-192. Niyonsaba F, Hirata M, Ogawa H, Nagaoka I. 2003. Epithelial cell-derived antibacterial peptides human beta-defensins and cathelicidin: multifunctional activities on mast cells. Curr. Drug Targets lnflamm. Allergy. 2: 224-231. Nizet V, Gallo RL.2003. Cathelicidins and Innate Defense Against Invasive Bacterial Infection. Scand J Infect Dis. 35 : 670-676. Nursyam EW, Z. Am in Z , Rumen de CM. 2006. The effect of vitamin D as supplementary treatment in patients with moderately advanced pulmonary tuberculous lesion. Acta Med lndones. 38: 3-5. Ohgami K, llieva IB, Shiratori K, lsogai E, Yoshida K, Kotake S et al. 2003. so
Effect of human cationic antimicrobial protein 1 8 Peptide on endotoxin induced uveitis in rats. Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. Ong PY, Ohtake T, Brandt C, Strickland
I,
44:
4412-4418.
Boguniewicz M,Ganz T, et al.2002.
Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. N Engl J Med. 347, 1 1 51-1 160. Oren
Z,
Lerman JC, Gudmundsson GH, Agerberth B, Shai Y. 1999.
Structure and organization of the human antimicrobial peptide LL37 in phospholipid membranes: relevance to the molecular basis for its non-cell-selective activity. Biochem J. 341: 501-51 3 1 3 Perhimpunan Dokter Paru Indonesia (PDPI). Tuberkulosis : Pedoman Diagnosis dan Penatalaksanaan di Indonesia. lndah Offset Citra Grafika, Jakarta; 2006: 5 - 40. Raja
A
2004.1mmunology of tuberculosis in Indian J Med Res. 120 : 2 1 3 -
232. Ramanathan B, Davis EG, Ross CR, Blecha F.2002. Cathelicidins: microbicidal activity, mechanisms of action, and roles in innate immunity. Microbes Infect. 4: 361- 372. Santiago BR, Hernandez-Panda R, Carranza C, Juarrez E, Contreras JL, Aguilar-Leon D et a/. 2008. Expression of Cathelicidin LL-37 during M. tuberculosis infection in Human Alveolar acrophages, Monocytes, Neutrophils and Ephithelial Cells. Infection and Immunity. 76(8):935-941. Schaller-Bals S, Schulze A, Bals R 2002. Increased levels of antimicrobial peptides in tracheal aspirates of newborn infants during infection. Am J Respir Crit Care Med. 165: 992-995. Schluger NW, Rom WN. 1998. The Host Immune Response to Tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 157: 679 - 691 . Scott MG, Davidson OJ, Gold MR, Bowdish D, Hancock RE.(2002) The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses. J lmmunol. 169: 3883-3891 . Siswanto, Sumarno, Jane Y, Widayanti OA.2009. Pengobatan suportif vitamin D mempercepat konversi sputum dan perbaikan 51
gambaran radiologis penderita tuberkulosis. (Sedang dalam proses publikasi ) Small PM, Fujiwara Pl. 2001 . Management of tuberculosis in the United States. N Engl J Med. 345: 1 89-200. Smith PG. 1986. Case-control studies on the efficacy of BCG against tuberculosis. Proc 26th worrld conggres of the International Union Against Tuberculosis. Singapore 4-7 November. lnpress. Sorensen
0,
Arnljots K, Cowland JB, Bainton OF, Borregaard N. 1 997b. The
human
antibacterial
cathelicidin,
hCAP-18,
is
synthesized
in
myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood 90 : 2796-2803. Sub Direktorat TB Departemen Kesehatan Rl dan WHO. 2008. Lembar Fakta Tuberkulosis. Tomasinsig L, Zanetti M. 2005. The Cathelicidins - Structure, Function and Evolution. Current Protein and Peptide Science. 6: 23-34 Turner J , Cho Y, Dinh NN, Waring AJ, Lehrer R l . 1 998. Activities of LL-37, a cathelin-associated antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrob Agents Chemother. 42: 2206-22141 Zanetti M , Gennaro R, Skerlavaj 8, Tomasinsig L, Circe R. Cathelicidin
peptides
as
candidates
for
a
2002. novel
class
of
antimicrobials. Curr. Pharm. Des. 8: 779-793. Zaiou M, Gallo RL.2002. Cathelicidins, essential gene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med. 80, 549- 561 .
52
