LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Mutasi Gen KRAS Sebagai Biomarker Prognosis Pada Penderita Tumor Kolorektal Dengan Riwayat Kanker Pada Keluarga Dan Korelasi Klinisnya
Nama penyusun l a pora n
:
I. Mutlihatul Muniroh, dr. MSi.Med
2. Abdul Mughni. dr. 'V1S1 Med, Sp B 3. Henn awan Istiadi.
dr
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS DIPONEGORO TAHlJN 2011
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Mutasi Gen KRAS Sebagai Biomarker Prognosis Pad a .Penderita Tumor Kolorektal Dengan Riwayat Kanker Pada Keluarga Dan Korelasi Klinisnya
Nama penyusun laporan:
1. Muflihatul Muniroh, dr, MSi.Med 2. Abdul Mughni, dr, MSi.Med, Sp.B 3. Hermawan lstiadi, dr
FAKUL TAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS DIPONEGORO TAHUN2011 i
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Mutasi Gen KRAS Sebagai Biomarker Prognosis Pada Penderita Tumor Kolorektal Dengan Riwayat Kanker Pada Keluarga Dan Korelasi Klinisnya Nama Penyusun Laporait :
1. Muflihatul Muniroh, dr, MSi.Med 2. Abdul Mughni, dr, MSi.Me� Sp.B 3.
Hermawan Istiadi, dr
·
lnstansi Pelaksana Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro
Dinyatakan telah melalui Proses Pembinaan Penyusunan Laporan Akhir,
dan telah diperbailci sesuai hasil pembinaan yang dilakukan pada hari Senin-Rabu, 12-14 Desember 2011 Ketua Pelaksana
Muflihatul Muniroh, dr, MSi.Med
�. 198302182009122004
Menyetujui: Dekan Fakultas Kedokteran
--
11
SURATKEPUTUSAN PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan berdasar Surat Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Nomor : HK.03.05/1/393/2011 tentang Penetapan Tim Pelaksana Riset Pembinaan Ilmu Pengetahuan Kedokteran Tahun 2011.
Sumber dana penelitian ini adalah dari DIPA Sekretariat Badan Litbangkes Nomor:
0682/024.11.1.01100/2011.
..
lll
KATAPENGANTAR
Terima kasih kepada Allah SWT, Risbin Iptekdok 2011, Balitbangkes Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Konsultan penelitian kami (Prof. dr. Sultana
MH Faradz,
PhD, dr.
Johnny
Biomedical
Research
Sjoeib,
SpB,
KBD),
laboratorium
Center
for
(CEBIOR), laboratorium Biotek BPPT, serta sernua pihak yang telah rnembantu terselenggaranya pe n elitian i ni . Penelitian ini didanai oleh Risbin lptekdok 2011.
Semarang, 14 Februari 2012
Penyusun Laporan
..
lV
11
:---
-
RINGKASAN EKSEKUTIF
Total 33 subyek penelitian pas1en kanker kolorektal RSUP Dr Kariadi Semarang
telah didapatkan.
Karakteristik
klinis dari
rhasing-masing
sampel
didapatkan dari basil penelusuran rekam medis dan wawancara langsung. Dari 33 sampel pasien kanker kolorektal, jenis kelamin paling banyak ditemukan adalah laki laki (66.7%). Usia saat terdiagnosis kanker kolorektal terbanyak terdiagnosis diatas usia. 50 tahun (57.6%). Stadium kanker terbanyak ditemukan pada stadium lanjut (Dukes C dan D) yaitu 66.7%, dimana pasien kanker kolorektal pada stadium Dukes D semuanya mengalami metastasis ke hepar. Riwayat kanker dalam keluarga hanya terdapat 2 orang dari total 33 pasien. Lokasi tumor terbanyak terdapat pada distal dari fleksura lienalis, yaitu sebanyak 78.8%. Tipe diferensiasi sel tumor berdasarkan basil pemeriksaan histopatologi terbanyak adalah tipe kanker berdeferensiasi baik
(51.5%). Sedangkan keadaan pasien saat ini, sebanyak 51.5% hidup dengan tanpa rekurensi, 30.3% hidup dengan rekurensi dan 18.2% meninggal Dari total 33 sampel yang didapatkan, 24 sampel telah dilakukan analisis mutasi pada exon 1 dan 4 sa:npel pada exon 2 gen KRAS. Hasil analisis mutasi menggunakan DNA sekuensing didapatkan h_asit 100% wild type pada ex on 1 gen
KRAS pada 24 sampel, dan I 00% wild type pada e�on 2 gcn KRAS pada 4 sampel. Hasil negatif pada semua sampel tersebut tidak berarti menyingkirkan status mutant typ� gen Kras pada sampel, tetapi masih dimungkinkan adanya mutasi pada
ekson lain mengingat gen Kras terdiri dari 6 ekson yang dapat menjadi kandidat mutasi.
ABST.RA-K
Latar Belak ang: Kanke r Kolorektal adalah salah satu jenis keganasan terpenting pada negara berkembang. Gen K-ras mempakan kelompok oncogen yang berlokasi pada kromosom 12p � 2 dan. memiliki peranan penting I?ada jalur signal Ras/MAPK. mutasi gen K-ras ditemukan pada 43% penderita kanker kolorektal, dimana mutasi seri ng terj adi pada codon 12 dan 1 3 dari exon 1 dan codon 61 pada exon 2. Penderita dengan mutasi i ni dapat meningkat resiko kekambuhan. atau bahkan kematian. penderita dengan gen K-rqs normal memiliki respon yang baik terh adap terapi anti EGFR, dan sebaliknya penderita dengan mutasi tidak memiliki respon terhadap anti EGFR dan mempunyai prognosis yang bumk. Sampai saat ini belum ada data mutasi gen Kras dan hubungannya terh adap riwayat kanker di keluarga pada penderita
tumor kolorektal di Indonesia.
Ma terial dan metode: 33 sampel jaringan kanker kolorektal dan darah vena dikumpulkan dari 33 individu dengan kanker kolo re k tal dari periode April 20 1 1 sampai dengan September 2011. Ekstraksi DNA kemudian dilakukan terhadap semua sampel. DNA yang memiliki konsentrasi yang optimal dilakukan PCR untuk amplifikasi gen KRAS exon 1 dan exon 2. Analisis mutasi dilakukan dengan DNA sekuensing terhadap semua sampel yang berhasil diamplifikasi, dilanjutkan dengan analisis meriggunakan BLAST untuk mengetahui adanya mutasi. .
.
-
-
Basil : D ari 33 sampel yang didapatkan, 26 sampel berhasil diamplifikasi. Dari 26 sampel yang berhasil teramplifikasi, telah dilakukan analisis mutasi pada exon 1 sebanyak 26 sampel dan pad a ex on 2 sebanyak 4 san1pel. Hasil yang didapatkan ·
1 00% wild type pada semua sampel pada exon 1 dan exon 2 baik pada sampel ..
j ari ng an kanker kolorektal maupun darah vena. Hasil negatif pada semua sampel tersebut t i dak berarti menyingkirkan st atus mutant
type gen
KRAS pada sampel,
tetapi masih dimungkinkan adanya mutasi pada ekson lain mengingat gen KRAS . terdiri dari 6 e kso n yang dapat menjadi kandidat mutasi.
Kata kunci: Kanker kolorektal, mutasi gen KRAS, exon 1, exon 2
Vl
__
BA-FTAR ANGGOTA TIM PENELITI
1 . Muflihatul Muniroh, dr, MSi.Med 2.
Abdul Mughni, dr, MSi.Med, Sp.B
3.
Hermawan Istiadi, dr
Vll
DAFTAR ISf
1. Latar Belakang.......................................... .......
l
2. Tujuan dan Manfaat... ....... ... ... .... .............. �·· ... .
3
3.
Metode..........................................................
4
4. Basil.............................................................
8
5. Pembahasan . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . ..
24
6. Diskusi, Kesimpulan dan Saran.............................
26
7. Ucapan Terima Kasih... . .. . . . . .. . . . ... . . . . ... . . . .. .. . . . .......
27
8. Daftar Pustaka............................................... ..
28
9. Lampiran........ . . . . . . . . .. . .. .. .. . . . . . . . . . .. . . . .. . .. . . . . . . . .. ..
30
.
Vlll
EJL
.
DAFTAR TABEL DAN GAMBAR
I . Tabel 1 ...................... .............. ................... ...........................
8
2. Tabel 2 .................................................................................
9
3. Tabel 3 ....................................................... ..........................
11
4. Gambar 1 .............................................................................
12
5. Gambar 2 .............................................................................
13
6. Gaxnbar 3 .- . ..... .... .... ..... . .. ........ ... .. ... .. . . . . ... . .. .. . . .... . .. .. .. .. .... .....
13
7. Gambar 4 ............. ........................ ........................................
14
8. Gambar 5 ..................................................... ........................
14
9: Garnbar 6 ...... .......................................................................
15
10. Gambar 7 ........................... ................... ...............................
15
ll. Gambar8 ............................................... ..............................
16
12. Gambar 9 .............. ..................................................... ..........
16
1 3. Ga111bar 1 0 ................................. ..........................................
17
14. Gambar 1 1 ........................................................ ....................
17
15. Gambar 1 2 ............................................................................
17
1 6. Gambarl 3 ............................................................... .............
18
17. Gambar 14 .. . . ... .. .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. .. . .. . . . .. . . . . .. . .. .. .... . .. .. . . . . .. . .... ..
18
18. Gambar 1 5 ............. :.. :........................ �... �. �.........................
18
19. G
19
20. Gambar 1 7 ........ .... . ...... ........................................................
19
2 1 . Gambar 1 8 ............................................ ................. ..............
19
22. Gambar 19 ................................ .................. ................ .........
20
23. Gambar 20 .................................. ............................. ............
20
24. Gambar2 1 .................................. ............................. ............
21
25. Gambar 22 .................................. .........................................
21
26. Gambar23 ......................... :.... ... . . .. .............. ....... ... ..............
22
27. Gambar24 ................................. . ............................... ...........
22
28. Gaxnbar 25 .......... ........................................... ......................
22
29. Gambar 26 ................... . ....... ... . .. .. ...... ... .. .. .. . .. ... ... ........... .....
23
.
.
'
ix
_
DAFI AR LAMPlRAN
1.
Lampiran 1 .................. ................................. ......
.
2. Larnpiran 2 ........... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . ...... .
.. .. .).)
3. Lamp iran 3 . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . ..... .
34
4.
42
.
Lampi ran 4
. . . . . . . . . . . . . . . ................ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
X
iiiiidiii� �=-i
.
---
30
�- -
LATAR BELAKANG
Kanker Kolorektal adalah salah satu jenis keganasan terbanyak di dunia dan merupakan penyebab kematian terbesar ketiga karena kanker. pada dunia barat dan merupakan keganasan terpenting pada negara berkembang. Berdasarkan data Cancer Statistic 2009, kanker kolorektal merupakan kanker terbesar ketiga setelah kanker prostat (pria) atau kanker payudara (wanita) dan kanker paru & bronkus. Faktor predisposisi mencakup colitis ulserativa, colitis granulomatosa, polip adenomatosa, berbagai sindroma poliposis dan riwayat penyakit tersebut pada anggota keluarga penderita. Saat ini keganasan kolorektal menjadi masalah penting pada Negara Asia, karena karakteristik pasien kanker kolorektal yang biasanya didiagnosis pada usia di atas 60 tahun, tetapi pada decade terakhir insidennya meningkat cepat di Negara Asia termasuk Indonesia dengan peningkatan jumlah pasien pada usia muda <50 tahun (Yee Y.K et al. 2009). Penelitian Abdullah di Jakarta pada tahun 2009 melaporkan bahwa pasien yang didiagnosis pada usia kurang dari 45 tahun sebanyak 47.85% kasus. Prevalensi kanker kolorektal di Indonesia terus meningkat setiap tahunnya, meskipun belum ada data yang jelas. Data dari Kementrian Kesehatan pada tahun 2009 menyebutkan sebesar 1.8 tiap 100.000 orang (Kanker usus artikel, 2009). Data RSDK dalam 2 talmn terakhir menyebutkan .bahwa tercatat 250 -pasien-kanker kolorektal yang menjalani kolorektomi, dimana diagnosis terbanyak pada stadium Dukes' C. Ada beberapa pasien dengan riwayat kanker di keluarga tapi belum terdata secara jelas dan spesifik. Analisis data terbaru tentang profil mutasi gen yang berperan pada penderita kanker kolorektal di Indonesia, Jawa Tengah khususnya merupakan hal yang sangat penting. Gen KRAS merupakan kelompok oncogen yang berlokasi pada kromosom .
12p12 dan memiliki peranan penting pada jalur signal Ras/MAPK. Beberapa studi sebelurnnya sudah melaporkan bahwa mutasi gen
KRAS
ditemukan pada
43%
penderita kanker kolorektal, dimana mutasi terjadi pada codon 12 dan 13 dari exon l dan codon 61 pada exon 2. Penderita dengan mutasi ini dapat meningkat resiko kekambuhan
atau bahkan kematian.
Banyak
melaporkan bahwa penderita dengan gen
penelitian terbaru
saat ini
yang
KRAS nonnal memiliki respon yang baik
terhadap terapi anti EGFR, dan sebaliknya penderita dengan mutasi tidak memiliki respon terhadap anti EGFR dan mempunyai prognosis yang buruk. Studi di Malaysia pada tahun 2009 melaporkan ada hubungan antara kejadian mutasi gen KRAS dengan usia muda dan riwayat kanker pada keluarga penderita. Sampai saat ini belum ada data mutasi gen KRAS dan hubungannya terhadap riwayat kanker di keluarga pada penderita tumor kolorektal di Indonesia. Data ini berperan penting dalam mencari factor resiko terjadinya mutasi gen KRAS dan juga rnembantu klinisi sebagai data skrining. awal dalam menentukan jenis kemoterapi yang tepat dan efisien pada masing-rnasing penderita kanker kolorektal di Indonesia. Data hasil analisis mutasi gen KRA S pada jaringan tumor akan dihubungkan den&atl data riwayat kanker di keluarga penderita yang didapatkan dari hasil anamnesis pada penderita di RS Dr Kariadi Semarang sebagai rurnah sakit rujukan di Jawa Tengah.
2
TUJUAN DAN MANFAAT
Tuju a n Penelitia n Tuju a n u mu m : Mengetahui pola mutasi gen
KRAS pada penderita tumor kolorektal di Semarang
. Tujua n khusus : Untuk mengetahui adanya hubungan antara mutasi gen
KRAS dengan tumor
kolorektal. Untuk mengetahui adanya korelasi antara mutas1 gen
KRAS pada penderita tumor
kolorektal dengan atau tanpa riwayat tumor di keluarga, dan jalur mekanismenya Untuk mengetahui hubungan antara mutasi gen
KRAS dengan respon terapi yang
diberikan pada penderita tumor kolorektal. Untuk mendapatkan
biomarker prognosis pada penderita tumor kolorektal
dengan riwayat tumor di kelua rga untuk menuntun penanganan secara cepat dan tepat.
M a nf a a t penelitian : Dari penelitian ini dapat menjel�skan hubu ngan antara mutasi gen Kras dengan klinis penderita tumor kolorektal di Semarang, serta cliliarapkan dapat menjadi �
·
biomarker prognosis pada penderita tumor kolorektal stadium awal dengan riwayat kanker di keluarga sehingga dapat menuntun penanganan secara cepat, tepat dan efisien.
3
METOD£
Populasi d an S ampel Populasi teijangkau dari penelitian ini adalah pasien kanker �olorektal yang datang ke poli Bedah Digestif RS dr Kariadi Semarang. Sampel dipilih berdasarkan teknik
purposive sampling dengan kriteria inlusi sebagai berikut : 1.
Pasien kanker kolorektal yang menjalani operasi kolorektomi
2.
Jaringan tumor dilakukan pemeriksaan histopatologi
3.
Terdata sebagai pasien RS dr Kariadi Semarang
4.
Bersedia mengikuti penelitian yang dibuktikan dengan informed consent
Serta kriteria eksklusi: Jaringan tumor tidak available untuk dilakukan pemeriksaan molekuler.
Jurnlah sampel yang dibutuhkan dalam penelitian ini, berdasarkan perhitungan besar sampel adalah sebagai berikut :
za
P
Q d N
=
=
=
=
=
nilai kemaknaan
===
1 ,96
Prevalensi mutasi gen K-ras pada kanker kolo(ektal 1-P
=
1-0 ,4
=
X
0,4 (10%)
0'6
Angka absolute
(l . 96iX 0.1 (0.1)2
=
=
0, l
(0 .9)
=
92
Diharapkan dalam 2 tahun periode penelitian, dapat tercapai jumlah sampel sebanyak
:
92 sampel. Dengan target pencapaian jumlah sampel di tahun pertama
sebanyak : 40 sampel.
4
Ala t da n Baha n
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1.
Lembar rekam medis yang didesain khusus oleh peneliti,
2.
Peralatan untuk pengambilan sarnpel jaringan,
3.
Waterbath untuk ekstraksi DNA,
4
.
.
•
Mesin PCR untuk amplifikasi gen
5.
Elektroforesis untuk running gel
6.
Alat sequensing DNA
7.
Komputer untuk menyimpan dan mengolah data.
Bahan yang digunakan adalah 1 . Media dan suplemen untuk media jaringan, 2. Reagen untuk ekstraksi DNA,.
3. Primer PCR
Prosedur Peng u mpulan Da ta 1.
Pasien yang datang ke poliklinik/dirawat di bangsal Ilmu Penyakit D alam sub Hemato-onkologi dan atau llmu Bedah Digestif RS Dr Kariadi dengan kelainan tumor kolorektal yang menjalani operasi kolorektomi, -dilakukan wawancara dengan menggunakan data lengkap pasien,
formulir
catatan medis khusus yang kami buat meliputi
informasi
tentang riwayat keluarga yang terkena kanker,
serta infonnasi lainnya. 2. Data pemeriksaan penunjang pasien, didapatkan dari penelusuran rekam medis dari pasien. 3. Pasien yang memenuhi kriteria diberikan informed consent dan surat pemyataan
persetujuan mengikuti penelitian 4. Perigambilan sampel berupa jaringan tumor dan darah vena dilakukan di ruang
operasi bedah sentral RS Dr Kariadi bersamaan dengan operasi kolorektomi. Ekstraksi DNA dari darah vena dilakukan dengan menggunakan metode out.
salting
Sedangkan jaringan tumor, sebanyak 25 mgr jaringan dimasukkan ke tube
steril dalam suhu dingin dan segera dilakukan ekstraksi DNA atau disimpan di 5
freezer -800C atau dimasukkan dalam tabung formalin jika akan menunda ekstraksi DNA. 5.
Ekstraksi DNA dari 25 mg jaringan tumor dilakukan menggunakan kit DNA QIAamp, dengan prosedur sebagai berikut: - J aringan tumor diberi 180 IlL Buffer A TL dan dihancur�an menggunak.an alat
penghancur. - Setelah ditambahkan enzim Proteinase K, sampel akan diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 560C. - 200 f.LL Buffer AL ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 700C - Sampel akan dicuci dengan larutan ethanol absolute, Buffer AWl dan AW2 - Buffer AE sebanyak 200 IlL akan ditambahkan sebagai pelarut DNA
6. Prosedur PCR untuk gen Kras Untuk mengamplifikasi gen Kras digunakan 2 set primer, yaitu : 1. 1 Set untuk amplifikasi exon 1 (Han SW dkk, 2006) yaitu : F:.5'GGTGGAGTATITGATAGTGTA-3', R: 5'GGTCCTGCACCAGTAATATGCA-3' dengan besar produk 241 bp. 2. 1 Set lainnya untuk amplifikasi exon 2 (Quiros RM dkk, 2005), ya_itu : F: 5 'TCAAG "" TCCTTTGCCCATTTT -3' R: 5'TGCATGGCATTAGCAAAGAC-3' dengan besar produk : 3 7 5 bp. PCR dilakukan dengan total volume 25 I-ll yang terdiri dari 2 Ill (1 00 ngi11L) DNA dari tiap pasien, 1 Jll primer forward (0.4 J.1M), 1 111 primer reverse (0.4
-:.tM), 12.5 1-11 DreamTaq PCR master mix (Fermentas), dan 8,5 J.1l dH20. Amplifikasi primer dilakukan dengan prosedur sebagai berikut : denaturasi awal ° selama 4 menit pada suhu 95 C, kemudian dilanjutkan 30 detik pada suhu 95°C, ° untuk masing masing primer set dilakukan annealing reaction pada 52.1 C ° selama 35 detik, dan elongasi pada suhu 72 C selama 30 detik secara berurutan ° dalam 40 siklus, diikuti elongasi akhir pada 72 C selama 7 menit. Amplifikasi menggunakan GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem, Foster City, USA). Hasil amplifikasi kemudian dianalisa dengan agarose gel elektroforesis 6
(2%) yang mengandung ethidium bromide 1% untuk mengetahui hasil PCR. Produk
?CR
Sampel
yang
didapatkan
dilanjutkan
dengan
pemeriksaan
sekuensing untuk menganalisis ada tidaknya mutasi gen KRAS serta jenis mutasi yang terjadi.
7.
Sekuensing hasil PCR gen Kras Sekuensing dilakukan dengan menggunakan BigDye Terminator vl.l Cycle Sequ�ncing Kit (Applied Biosystems) untuk mengatur reaksi sekuens dan GeVPCR DNA Fragment Extraction Kit (Geneaid) untuk memurnikan produk PCR serta ABI PRISM
3 1 00 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) untuk
sekuensing. Hasil sekuensing kemudian dianalisa dengan program programme Sequence Scanner vLO (Applied Biosystems). Urituk menentukan status mutasi dari sekuen, dilakukan analisis dengan menggunakan program
Basic Lacal
Alignment Search Tool (BLAST) dari NCBI dan secara · manual dengan menggunakan referensi sekuens dari G enbank database NCBI dengan kode referensi sekuens : NG
007524.1. Sekuensing dilakukan di BPPT.
_
Analisis J)ata Data yang diperoleh kemudian dianalisa dengan menggunakan program SPSS
17 for windows.· Data ditampilkan dalam bentuk diagram dan tabel
kemudian dilakukan interpretasi dari hasil yang didapat sehingga mendapatkan suatu kesimpulan mengenai pola mutasi gen Kras pada penderila tumor·kolorektal di Semarang. Data yang ·dianalisis meliputi hubungan antara mutasi gen Kras dengan kejadian tumor kolorektal, dan perbedaan pola mutasi gen Kras pada pende1ita dengan atau tanpa riwayat kanker di keluarga menggunakan uji statistik Chi-Square. Diharapkan hasil yang didapatkan dapat menjadi acua.1 biomarker terhadap resiko keganasan pada tumor kclorektal stadium awal yang memiliki keluarga yang mengidap kanker sehingga dapat memberikan penanganan secara cepat dan tepat.
7
HASIL
1.
P engu mpulan Sa mpel Pengumpulan sampel dari jaringan dan darah vena dari pas1en subyek
penelitian telah dilakukan dari ruang operasi RSUP Dr Kariadi. Dari total 33 sampel yang terdata, jaringan yang be rhasil dikumpulkan adalah sebanyak 26 sampel dan
·darah vena pasien yang berhasil dikumpulkan adalah sebanyak 25 sampel. Jaringan dan darah vena yang terkumpul kemudian dilakukan ekstraksi
DNA
mengunakan kit
ekstraksi DNA (Qiagen) un tuk ja ring an serta metodesalting out untuk darah vena.
Tabel l. Hasil Ekstraksi DNA Jaringa n
No
Kode Sa mp el
K onsentrasi
A260
A280
( ng/J.tl)
260/280 (Ke murnia n)
1
COO IT
163.51
3.27
2.037
1.61
2
C002T
29.32
0.586
0.3
1 .95
3
C003T
90.37
1.807
1.009
1.79
4
C004T
114.3
2.286
1.301
1.76
5
C005T
106.48
2.13
1.323
1.61
6
COOtiT
26.17
0.525
0.275 .
7
C007T
35.78
0.716
0.369
1.94
8
C008T
19.3
0.386
0.165
2.34
9
C009T
33.18
0.664
0.294
2.25
10
COlOT
61.08
1.222
0.706
1.73
11
COl IT
331.92
6.638
3.93 2
1.69·
12
C012T
26.72
·0.534
0.297
1.8
13
C013T
144.93
2.899
1.641
1.77
14
C014T
115.21
2.304
1.345
1.71
15
C015T
52.73
1.055
0.623
1.69
16
C016T
942.02
18.84
I 0.195
1.85
17
C017T
16.08
0.322
0.172
1.87
18
C018T
68.45
1.369
0.809
1.69
.
. 1.91
8
I�"
C019T
124.95
2.499
1.395
1.79
20
C022T
80.5
1.61
0.86
1.87
21
C023T
11.42
0.228
0.143
1.6
22
C024T
194.28
3.886
2.149
1.81
23
C025T
8.62
. 0.172
0.119
1.45
24
C027T
75.55
1.511
0.837
1.8
25
C028T
172.08
3.442
1.82
1 .89
26
C029T
225.61
4.512
2.635
1 .71
ekstraksi
dari jaringan, yang
19
Dari
data
konsentrasi
DNA basil
telab
diawetkan di dalam larutan formalin setelah operasi kolorektomi, didapatkan basil yang bervariasi (Tabel I). Terdapat 11 (42.3%) sampel yang memiliki konsentrasi DNA diatas I00 ng/Jll dengan nilai tertnggi 942.02 ng/Jll pada sampel CO16T, dan 1 5 (57.7%) sampel yang memiliki konsentrasi DNA dibawab 100 ng/Jll dengan nilai terendah 8.62 ng/Jll pada sampel C025T. Kemurnian
(purity) dari DNA sampel juga
bervariasi. 12 (46.15%) Sampel memiliki kemurnian DNA yang optimal, yaitu diantara rentang 1.80 s/d 2.3, sedangkan 14 (53.85%) sampel memiliki tingkat kemumian DNA yang rendah (<1.80).
Tabel 2. Hasil Ekstraksi DNA Dara h
No
K od e Samp el
K ons en tr asi
A260
A 280
260/280 · (K emur nian)
( n g/f.J l ) 1
COOIB
1331.38
26.628
14.362
1.85
2
C002B
1858.00
37.160
20.075
1.85
C003B
1158.54
23.1 7 1
12.423
1.87
C004B
910.06'
18.201
9.704
1.88
5
C005B
950.48
19.010
10.124
1.88
6
C006B
870.40
17.408
9.247
1.88
7
C007B
661.44
13.229
6.989
1.89
8
C009B
1691.83
33.837
18.603
1.82
9
CO l l B
452.89
9.058
5.033
1.80
10
COBB
1273.63
25.473
13.853
1.84
3 4
.
.
9
11
C014B
520.68
10.414
5.825
1.81
12
C016B
1242.27
24.845
13.541
1.83
13
C017B
188.83
3.777
2.014
1.88
14
C019B
1779.96
35.599
19.309
1.84
15
C022B
794.88
15.898
8.664
16
C023B
183.89
3.678
1.995
1.85
17
C025B
590.33
11.807
6.669
1.81
18
C027B
1991.00
39.820
21.775
1.83
19
C028B
1161.80
23.236
12.705
1.83
20
C029B
7.95
0.159
0.104
1.53
21
C030B
2351.59
47.032
26.034
1.81
22
C031B
896.46
17.929
9.809
1.83
23
C032B
110.13
2.203
1.194
1.85
24
C033B
102.61
2.052
1.138
1.81
25
C034B
1303.24
26.065
14.187
1.84
•
1.83
Sedangkan dari ekstraksi DNA darah, didapatkan hasi1 semua sampel memiliki konsentrasi DNA yang optimal yaitu diatas 100 ng/J.ll dan kemumian DNA yang optimal, yaitu diantara rentang 1.80 s/d 2.3, kec�ali 1 s�el (C029B) yang memiliki konsentrasi DNA rendah (7.95 ng/J.ll) dan kemumian DNA yang rendah {1.53) (Tab el 2).
2.
P en gu mpula n Data Klinis Sa mp el Sebanyak 33 data klinis pasien kanker kolorektal RSUP
D r Kariadi
Sernarang berhasil didapatkan. Dari table 3 di atas dapat diketahui deskripsi profil klinis ·dari pasien. Dari 33 sampel pasien kanker kolorektal, jenis kelamin paling ·banyak ditemukan adalah laki-laki (66.7%). Usia saat terdiagnosis kanker kolorektal
hamper berimbang dimana yang terdiagnosis di.atas usia 50 tahun sedikit lebih banyak jurnlahnya (57.6%). Stadium kanker terbanyak ditemukan pada stadium lanjut (Dukes C dan D) sebanyak 66. 7%, dimana pasien kanker kolorektal pada stadium Dukt!s D semuanya rnengalami metastasis ke hepar. Riwayat kanker dalam keluarga hanya terdapat 2 orang dari total 33 pasien. Lokasi tumor terbanyak terdapat pada distal dari fleksura lienalis, yaitu sebanyak 78.8%. Tipe diferensiasi sel 10
tumor berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi terbanyak adalah tipe kanker berdeferensiasi baik
{51.5%). Sedangkan keadaan pasien saat ini, sebanyak 51.5%
hidup dengan tanpa rekurensi,
30.3% hidup dengan rekurensi dan 18.2% meninggal.
Tab el3.K a rak teristik Klinis sa mp el
Karakteristik Klinis
Ju ml a h ( n
=
33)
Jenis kelamin Laki-laki
22(66.7%)
Perempuan
11(33.3%)
Usia saat didiagnosis
>50 tahun
1 9(57.6%)
<50 tahun
1 4 (42.4%)
Stadium a Stadium awal (Dukes A dan B)
1 0(30.3%)
Stadium lanjut (Dukes
22(66.7%)
C dan D)
Riwayat l<:anker dalam keluarga Ya
2(6.1%)
Tidak
3 1 (93.9%)
Lokasi tumor Proksimal dari fleksura lienalis
7(21.2%)-
Distal dari flesura lienalis
2 6 C?8.8%)
-
Tipe diferensiasi sel tumor b
,.
Berdeferensiasi baik
17(51 .5%)
Berdderensiasi sedang
5 (1 5.2%)
Berdeferensiasi buruk
5 (1 5.2%)
GSIT
2(6.1%)
MALT
1(3%)
Keadaan pasien saat ini Hidup dengan tanpa rekurensi
17(51.5%)
Hidup dengan rekurensi
1 0(30.3%)
Meninggal
6(18.2%)
11
a
:
drui 33 pasien yang didata, terdapat 1 pasien yang tidak dilakukan pemeriksaan penunjang
tambahan
untuk
;nenentukan . stadiumnya, karena
pasien
harus
menjalani operasi kolorektomi cito, dan pasien meninggal.
b
_l
: dari 33 pasien yang didata, terdapat 2 pasien yang tidak di akukan pemeriksaan histopatologi untuk menentukan tipe diferensiasi tumor, karena pasien harus menjalani operasi kolorektomi cito, dan pasien meninggal dan I pasien hanya dilakukan pemeriksaan kolonoskopi.
3. PCR G en
�ras samp el
Karena
DNA
dari
jaringan
sebagian
tidak
memiliki
konsentrasi
dan
kemurnian DNA yang optimal untuk PCR, DNA yang digunakan untuk amplifikasi gen Kras menggunakan DNA yang berasal dari darah. Sebanyak 24 sampel berhasil dilakukan amplifikasi gen Kras menggunakan 2 set primer untuk exon 1 dan exon 2, dengan profil PCR sesuai dengan yang telah dijelaskan d i bab sebelumnya.
3. 1 . Am�_> lif ik asi GenKras
Exo n 1
Gan.t b ar L Amplifik asi G enKras ex on 1 samp el COOlB dan C002B. Keterangan : (A) Marker 100 bp, (B dan C) sampel COO 1 B, (0 dan E) sampei C002B.
12
G a mbar 2. Amplifikasi Ge n Kras exo n 1 sa mpel C003B, C004B, COOSB, C006B, C007B, C009B, COll B, COBB, C014B, C016B, C017B, C019B, C022B, C023B, C025B, C027B. Keterangan
:
(A) marker 100 bp, (B) sampel C003B, (C) sampel
C004B, (D) sampel C005B, (E) sampel C006B, (F) sampel C007B, (G) sampel C009B, (H) sampel COli B, (I) sampel C013B, (J) sampel. C014B, (K) sampel C016B, (L) sampel C017B, (M) sampel C019B, (N) sampel C022B, (0) sampel C023B, (P) sampel C025B, (Q) sampel C027B.
Ga mbar.3. Amplifikasi G en Kras exon 1 samp el C028T, C030T, C031B, C032B, C033B, C034B. Keterangan: (A) marker 100 bp, (B) sampel C028T (Jaringan), (C) sampel C030T (Jaringan), (D) sampel C031 B, (E) sampel C032B, (F) sampel C033B, (G)-sampel C034B.
,.
13
3. 2. Amplif1kasi GenKras Ex on 2 Gambar 4. Amplif ikasi Gen Kras ex on 2 sampel COOlB dan C002B. (A) Marker 100 bp, (B dan C) sampel COOIB, (D dan E) sampel C002B.
Gambar 5. A mplifikasi Ge nKras e xo n 2 sampel C003B, C004B, COOSB, C006B, C007B, C009B, COllB, C013B. Keterangan : {A) marker 100 bp, (B) sampel C003B, (C) sampel C004B, (D) sampel COOSB, (E) sampel C006B, (F) sampel C007B, (G) sampel C009B, (H) sampel COll B, (I) sampel COBB.
..
14
Ga mbar 6. Amplifikasi Gen Kra s exon 2 sa mp el C014B, C016B, C019B, C022B, C025B, C027B, C028T, C030T, C031B, C034B. Keterangan:
(B) sampel C014B, (C) sampel C016B, sampel C025B, (G) sampel C027B,
(A) marker 100 bp,
(D) sampel C019B, (E) sampel C022B, (F)
(H) sampel C028T, (I) sampel C030T, (J)
sampel C031B, (K) sampel C034B.
Ga mbar 7. Amplit1kasi Gen Kras exon 2 sa mp el C017B, C023B, C030B, C031B, C032B;C033B. Keterangan:
C023B,
(A) Marker 100 bp, (B) sampel C017B, (C) sampel
(D) sampel C030B, (E) sampel C031 B, (F) sampel C032B dan (G) sampel
C033B
15
4. Sekuensing Gen KRAS Exon 1 dan Exon 2 4. 1. Sekuensing Gen KRAS Exon 1 Sebanyak 24 sampel setelah d.ilakukan PCR, dilakukan pemurnian produk PCR, cycle sequencing, dilanjutkan dengan sekuensing. Gambar 8. Basil sekuensing sampel COOlB (Kiri) dan C002B (Kanan) ....,. , .. ... lio ·-
..
..
.,...
'
�-�"t..,;io.>o·
•••u. • Uthn•utu ... �J.•·•t• ... t.. ,.uu•.11h . ... . , .. ... �· " .. . .. ,, .. ,,. �,.
..... .••.
. -
....
A�Ar� ........
... ...._.... _ ...._, .,_
� �·� � iH••hh!flfrJJH� •
::..�... ,. ..
"._
.
� H'"..ttf ��·!!''M-'t
;,_•�· �
...
•..
• . . .• ,.
w
;,
�-"'
. ... . , ,_. • h' ' ,,� . ... .;.:,•(.-. <W.O.� � ' �·
.-..>
4
.
fo.
t M HuUt ll• t-',iiUutt •,� .nu tu t i U H tt.tt '
'
�
_.
.,o•
.. I
...
l
.....
•l '�•'
"'
"
.
� · .. ·�· ..4-l
... t u ,, u . . .• · •·•'• •urt.t•Jtq.'ueu•••tU••• · htuttuut .
.. -1-
t •
����. ��lL-t��... w--.� ....».i. ...,1.\,;.,.. �-,.�· tf!H't
•tlfltf"littltUUnttfntiUUtHUUt '" t• •
'
' >
t'''
�•. '-·.._.'I
�
UU�J !
1!1!1ll!l
!�f�._,��
t t i �UIUU �
.
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel COO1B (Kiri) dan C002B (Kanan).
Gambar 9. Basil sekuensing sampel C0038 (Kiri) dan C004B (Kanan) ,... . _.._ ,. , ..,
_,.. ....,. �
,
-· ..."
�14l'r��� f ��.--�-a:.. �·�.���hf.-*
..."""' �"'"" �..
·� ••
�
..
...�
P. t fAW' • tlttu•ittlll l · t- b t tttUUUfHH t'l t • • •tt; attUrfAUt•tttt..�tHtltUlUto ,� .. .- ••• � �
t�J•• !..,. ·�..-�- ...��··! 't• !,.""....., ......... ...�... ....�
....... --·---•• ' ":. ••••
····-""•
. •. .
•
r!•
.
...�
t
�
- .. ·
....-, __....,..,_,.,.......,_..�t·
,� . ..� ·� � 4li.. �""\�'., � � .... : . ... .. .� � ." ..::. . • :
�� �·!tAif�oiU� :» :.·� · � ·�M' Ut�..t��h��- I��.!-'·� ��"!'·�h �·!'!"0IHtU1�--···
-
-������;_��t1J.oM1���'\., � ...�UIUU U.Ht-tiUU.UUIHt .,.. ,,.
•
I
• "
..
••
'""
o ftltl h •o 4
H
•
•u•n•J-tn••••-UUt' !'!'�hd-• :
·�·!�" .
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C003B (Kiri) dan ..
C004B (Kanan).
16
Gambar 10. Hasil sekuensing sampel COOSB (Kiri) dan C006B (Kanan)
.
.
..... ..... ...
,.. .....
. �.. ¥>Ffi
tlt , tt-.ftt4�.. t .. H t •••• Hflflftr •tUthhtU•�tl i'��UU
l:t ,..,.. ,.,._......_ ••• �• • � � '< ,,.,
"
�
'
.
J.
o
�··
J
'
I
!t
�'a� •
--� ' -�� c-�-�
-·· •
'
<:;
)llflf· ...
� ·� ,� � � � � �-� � � � � � � � � � � -� -� -� � �� -
�,-� r.: ·;4, � .��\(., � �,i1\!M. �t11�! ··�·��••I
:
'
�·�""�·.tl1'.o."""
-..ut ....a.... tn._•..,, ...... "ntttkttttun•"u·ua uu� •
' � .. •� •
.. �.. w ... ... ,\.,... .-., � . � � � � .. t•fti�Wlt!jU ��U !�t !!6��1•tltJ��� .t�-�·I J� uua : �J IU �II!�·�!�
:·
..._ ,_ .,..,.
•C.,..
11'!'i--A11!;.�.,t .......
tt ltl-ltlfiJUtu••·••••ttthl-tiiMIItUtttUUt•n••MtU" 1111,htuuununtt. ' ; t � �_,-,.,..,u.. "' ., .,., •• • ' ''
.....
..__
· � ·� � � � + f ' � ' � · · � � a � � ' � � � � � � -� � � ' � .A « � , � � r; � � � � � � �� ·� i - ·� -� · � · ·� - � � � �� " � � · � � · �r· ·�
Ht tttJUUJUUitltUUt. ttUio• tl tUt'.. "' \ l' ' •' I
'
-�
.... . .. ..
ll ttfUY.UtUUt U ..tUUIUt�• . ,Uflh••• ti t
.
•"""
..
'fl"
•.
. .....
"'
.•
. .. . .
.
.. ..
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C005B dan C006B.
Gambar 11. Hasil sekuensing sampel C007B (Kiri) dan C009B (Kanan)
A��
' '" '7
r
'
: :·:; ....,..,_ ,
.. 8 """'!WW+--t"-
1-
·
••
���ttillt
�..
··
_
'
...... t .fo:.o· �
tU....Uftfh tfll1Ultttfttltft : I tt " t ltUUt!lt'AI IItnhH . ' . '�. . ' ..""
..
-
·�·
..
.. 1
.
..
1
1'1 ·
-�'k•••
�
�;
l·�·-
#•I
U!l!J.ItU!!.I fHU�t! l�U!t!�
'!H �•, ,
!���!1UhtH
1
• •t
1
'·
t' l�·
J
t �
�
.
.
.
'\>•
.
-
' � ·,_ �-.--r 4t'.•l\ """ � ?� _ , _. A �.\.. ..t ·f 14 1,.. J ;!' 1 �·, � or .... .. .\, .- .. _ ,•, ...,. J,\ f .r ,i�. �1 ,(¥ '· •) ._� · ....,. ·+·1 � ( ;� �-� I ," ·.
���f-\\��"- �A�.f�,...�*'�·,._,.���{J. t.,..... �� , . 1��·
""' :���� � ·,., � - .. �
<
"' � � � - Lo,. �-. r �·�r . s -.. -4·--J� ·�t'�I" t � hU! t•!*'' •' �; � ..�tI.�tfl � � HfttH�tU� � f!U��·�th•t&.tu �UUUUU !�••
�.""'
HUUU.tUMhHUtfUIUfi,UjHUtluU•U•t � t,,fi .Uttti•• Uitt U•1fJifUifJ .,It -�'
r
•
.., ��-.-,.-.,...� ...�·· -:t"'�\���r �-�l��J�._ • '
• • ...�.au < .•
....-.... .. � .. ._
iJtt•• f't �IHWp:t,l,.ftfUi .,.. , .. tit ., , r vttt•..,.,.. .. h n
... ....""f'o:
..
.
!�ltiUf�Utlftt. !l �ltllt!!�!�, ..,U�tlf.f!� ' '!�U�!!f!f � �·•
fH� · :�•
·� -
.�
: M,I.\� � , . .'•• '; 1' , 1' ·"" "'-.. � . , ._., 1,, , . ,w ,n , ,l, .,,,·� � � • � •
!'Jfkt��
,.,h.�.�····� ·-·
.•... t
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C005B dan C006B.
Gambar 12. Hasil sekuensing sampel COBB (Kiri) dan C013B (Kanan)
A��
�·--Hr�·• ""'�• ••••*·
·:·:·· ·
.. �m..
:to·JO:r..,.� ......."'� .....,.. .... • t.tlttlll l tL(!tf.t,!� f ... ��·�iriJI ?'••Mt.I.H.n•Jl� •
...
_
..
..
... ... ,.
�
...
NJ.J ,...... t•a-tftM'I-t mf.-U U tn.QU'l llt t n ·•• n lll ttl WU tJ. tnftlt .D .. J ..., nU•iNt:tt
f>
Ai=e��IS
._.,.,.�,,-f'II.�U· ·••'f'ltrJ"'l
.,..•••
... -
�
"l- [
. ...
�
'
:. .. >
,.
•
I.
•'""�-·
•
..
... .
, ., .. ..
�
,
'
��.-;.•
'1-�·
...
IUhUtttttUH;ft•httUtJftUHftHtUtU••nUMll·t•UtiJftl'•U�;.tUftc,tUIUott ,._.,.
10.·
....
.
�..
�
�
�L-,...�-,...�·�.w.:� ...,. ii'i.rJt .·�� ii���A
•
;·_. ·.. � �.... \ .,. • ., ._ ., ,.. , "' �· \ .. """ "! "' '.... _ ., � '""" "'" "'"" ,_. ;... ,._ ..; ... . . ... . .., ., . ,. "'_ . .. ..: ,.. •. , ...._ ,. 1., '�' .. "'""' .., """ ' ;;:. " � . . ·.
.
'1!" ""'' ._.._,...,..
:�: ;' •t •ttt.tthtSUt,�tt4t !����!'!�t1 � lff ! liUtUUt �t f � ffl
..
Jo.� · � t..,_
•!'4-
•�..
I
ol
�-�
-�4!a�;,��:.,.!� �}J;'A'�� •ttuuuuutununuunu., •llttt I<
-. •
•1
' ,,
I'
� •• f9'
�
•
. �
I,
)
,
. , u•u•n h t UJ"u•
·:.·
�· •
'
-·
. _. .\ , , ." .. .,. ��
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel CO 1 1B dan CO 13 B.
17
I ·�
Ut f.tt.t."' .,. •
Gambar 13. Hasil sekuensing sampel C014B (Kiri) dan C016B (Kanan) . ...
���111M
...".'"'¥'-'-.8:....... _,,.... .., I f
�- ......�, .. -�.... • .,._ ,.. ll t.t ..... l t1'tt1i9l... lll• .l t Utt•h�l ��� f.MltUI-f4ttU ,., • ' ' t '' :.!- �- + '\. I l L .o
-
z:
..."'-'-, ......,.-....� ..,.. � ·....� .. ._. A � �� � . . �.: :. . ... .
.,..."1..��,. ...."' ...
...
-.
.. lt'llf'·•
� � � � � · + • � � � · � � � . � � � � � � . � � � � � � .. J'U*JUBf:MM.-......-IbtJ .. U . ... IN .tt ...flltU ,.l... l ..-.ntut•Utt11t t U U Uitt: -t ....�jo>. "'.... •� .. • ,._.... • • • '"' ' ,... '
i
4
.
.
.,.. llllll
�...... ...... .. ���· . !!·��·-�·--�����!'!
.... ....
tlt tUtttffUtMftf.._. • I•UUJUAittN ltt •tn t•-.Ut i.. U t tttU.. t tt.. nU tt U 1 1I i J 1' ..,. t �. , •"'" ,_ t' 1-'•ol• •
.... J'( 4(JIIr' , , ,_ .
.... ....-.: .. -�
11'. �-
'
I<
... .
-
--��;,.-J�� J;d'J;(���� ���i tUUIU +ttt.� J ··�� UJttttf� � _. f tt ! !t !�ltf �
....
....I ...
·��!!!
-:;_
;11
..
_ I
1
-t4;..,;,_,� · ���!-..�. : .'...J:.� \ � t;:� .� ... ·.� · �..... Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C014B dan C016B.
Gambar_ 14. Hasil sekuensing sampel C017B (Kiri) dan C019B (Kanan) .. ....
"'�.-;,1. :""1M �...,.,_...,. ... .. . hUtl. uU:Ut4lUUUHU$UUIQ..I..,UU:UrUUtU • • � ..... ' • •...\o • �,.. • • • • l• .
...�··--·- -
..
A!,�
if'" .,;•,-.,_�
,. .
• ,
. ., w•, t J! d �� �4 ""' ,f.�, .
..:..., �· Sd t ..,• ..; • •
ttU)a. t1t1lUUUt,lltUtUl'ttiUtltUU• .tnt• • ' .........,. • ' .>1 ... .. -...4
� l,l··�
, ,·t .. .
..Ilt � Pt•.._ ,._4' 1MIW*fl•IHJ
•.
'-&
..
'
..._..
v ";.\"
•
J.. . ��� - � � � � ,. � '
•
*'"� " "!:�.-.�···� !"�fiUtt•_.tt,.. ttnt"'"•,...,. ! ��! "�'••'ff•M•w ••� �
UUUU,UUUUif UU.t U.tU tttflttHU UtltUUUUittlflltUUUIIt .. Util tll ... . .' .. � . . . •.� . . .. � ... ' ...·.
� ··, ·
. ... . ..- IMII .U......
,.., ,..
;
... _l_ .. / · ·) · · ··
. ......... u.u•..
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel CO 17B dan CO 19B.
Gambar 15. Hasil sekuensing sampel C022B (Kiri) dan C023B (Kanan)
A%�._
...
M «'ooltt l ...ljJ'-.·�· �
"
,·:::
.. .,.,. , "�"':
"
IUt • •tt•• ••uc r tMttu••n• � _. ., ,.,. ,. ""'t4f.tt.UfUt:t I < !• to' I """ ' ' •� � I>
.. �� "' 1\'t �.� · ·»t "d. �· ttu•tt •u•,.. ._. ........ .,. 1 .-tt•tttntahJtUif•h •u,_. ,,•• ,., ,, ••u_.••• • n-t•�•••• t.· •.• " 'I>., '\' •� .;. 4 • • • • � .•• � •
A% �-. ......... ..
•· ,�.....
· · !t-'1�.�,., ... ... . !......uu...htttt t1·· � �nut.ht11UI1• u. u�tutu•auu t
... . :;
-�� ��....�·:"'<···��� ... � � . � ...
_.t.t}t.Jn•t:lttti.,,••.._ .l,t ,.. 6.tt:l14 .. tt»..f tUl14•t•uru•UlUt ••• •JtUUfttl• J 'T' ' 1 , ' ' l • • · IJ," ( '
*'
:.... P �-h ··� ,j t l·� -A. -� .. ..,� ._ _ � t�·',t' l ._� } ;t:• ' t� ··�" ! '*· 1 •�:.n � k ·•� -·W44 •"' i' .. ·-� ... " 4 ' !'tl � l' .JttfUfU.UtUUH f UI'tUlu•. H ��. � ! ? • • , ....
·t--Utih:� it .\
• �-
'
;
. '.'\ � · & ',�_,._ ·' ·1 '..'l ,. � } ,\ ' ,·. • .,_ � ..
•• , .Uhhhfft 1
at
• ••
••
••
... . ..
..
:.i: � � �� �.-:; :� � .J.w.. ::< ) ..
� fi! tilfJ� -:-t.··�� .
• !UbJ:-"!fPU1! U ',.� ·�
�
��� t ."� �� • •• ..
�
..
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C022B dan C023B.
18
...
Gambar 16. Hasil sekuensing sampel C025B (Kiri) dan C027B (Kanan)
� =-
�:
..
,_�.,::
...
-·
A�� ..... ,.,.....,.,,,...........".,.''•-.�•et uft.t��••n•• •tt•"'" ..
..,•.,.. •.•,,.,,.••ttft:u ......,., .., ,..�u ••� l
•
�
•
l
•
"
�
J.\ •
tt .,._�... ....,.,.,•••�.-u•••••u ..
-:s,·· � � ..:;...... � � :...� . .. ·..;... . ';w. ,;.;,.,. '� � .. ,., '..,lf ..._., .... ?). +c ._ � W"ilf. � � j.
... ...
,.... � �·....� .. � bf;i � 1.>i .. � .... .... � ... ... � �� ......,. :.
� '."''.-.'�'uat un••� ··�u" •t••u'u • unuuu!• t•u•, 4"'u••t•-c. · �
�
t
,..,-
_
l
,.. � ��� � -
� � �.:...�-.. ... ...
* · :. � � .... � .. � ;.,.,..,..q .... _ .,._ ...
r
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C025B dan C027B.
Gambar 17. Hasil sekuensing sampel C028T (Kiri) dan C030T (Kanan) " .... " ,._ .
1'\,lfoJ yJ if u -.,. )t.J ·�
;-. _._ •...,•., !T-t(-.;« f
...., t.:';=.
... .ot\_"fft�..,.,�"'lA"" 1' .,_ tJl; ��.:2 "t lklooo, .,..,..... . ..� .. , - u .... • ue J ..tU Httnut t fl tlfltltJt " • •••UUt tttta nu••• - · , ' •
'�
-,--'•
"'
�'�I.!
' ..
"' �-.
..,.._,. PJ � ..... ·I
•;, '. I' ' ;
...
..
.111.. ;;:., ......
�.-��·-p ,:.� . ,.llo..,•li�o. ..�;d,.�__,;.��f�}�
tDt't.tt1t4tf11 flfffy Htlt.htltU U.JUfi.._1itUttltt•••ut:tll,llil-tt..... r�JJUlft.t:ff:.ft �·- .,.. � .,. ·
:.-��·r -.'If.•-'
..
·-·
.
., ' �� ��
(,1
.
�,
_..,
· �··
·•
·� � � � � �� � � � �:r . !..;, �·�� � ••� . k. � .
u••u.tnntrfttnrnu•ut-uuJu.._ ;I
...
'
..
. .............�"··
• • u••
··-
··-·
..,.; ._, _ ),•I � .... ,..,. , ..,t
..
.-..1to6f'tffJll J fJt'Mtc•'""''*"("''" •
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C028T dan C030T.
Gambar 18. Hasil sekuensing sampel C031B (Kiri) dan C032B (Kanan)
k%�� . ..,. I IJ f f .,., IJ I!I-tUdttlJUtttti U:II ... IIUIJ tt •Hittf•t I 1-titQf ! \'� I •'"'• ,., •.:.. u 1 ,.. �
� -
.....
· •• ••
..,._...., ...._..._ ...-.u.at�.Jl �•••n,,.._..,.....I.N1n•• ..•
..
.
....;
--
..
;
I IIUUttf UftJJh tH.t•ttaIUIU UtUt.llltlJtlll t f441UI U'ltitldU:I< U K Ufi Utfl • i
-• •
...
..
.._
..._ <.•
I
._,
>
4&\ • I
..
. .. ...
•••.-..uu,.-....._ ,.._.u••l•fiitHII etUflt1!1.-htitt•u-ta ..._.,.._...,.,.,tta.u ...•
.;
•
.... f ....
�
.,.
�
••
�-
...
•
'
-
""];·� . ; ��: \ \( '< � .. � � \� �'... ...,•�-'·-,, • '� ..
".. ... ' ,.
l.. ---·.-.�-
lttfiiUttttUHHllttllft Unt .. • •UI J �
.
.. ..... .. .. ..........
. ... ... . .. . ., ,.,.
tttUNtttttf•t.-ltttU•t�-.·•lf,lftM •
.'II
loll
...
t:� �
•
•
u••�•-•••"•• (
.•
..
·•
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C031B dan C032B. 19
...... ' ..
Gambar 19. Hasil sekuensing sampel C033B (Kiri) dan C034B (Kanan) if ,.,.,.,....,.
• ••
.... .... ... .
... ... 1<.-
,...ll•t .. J,t;,!_u...� h.,.Jfl•t._.�,_.,u,.•4tt.nt•ftfl �
*-••·•uae .,. ""'' l..,...-...., ,hUtJ• ··•••�• .. ... ...__
... ...
..
. • � , �--- �
� � "M �.,;. -� --... � 4 i , � N ,i :... .. � ...
f'flo ·
..__........,ffU_..,._,..� �� ,;·t)llfrHIIt.WI!MIItiU.t.-f..ft .f t tUU.. ·...-et•• ••• t •. . .t.. � '
...,
... ..
...
P tthtlt;tt"'u' ntttt� • "••.,.,.,• • �• ntttv. t4 �
"
..( �-
¥
... Ho(tfittlu.._
�
.. .. .. '
�
) ,. l
..
.
lldlllllll*thtoltot•••�tua-u•u•·•••"""'•tt••••hjllt'*lllm•• .
r. � � �YM< 1 �� - .: 4-�� � � ��� , 4�� i � 'lo ... . .. .. .r .;; ;/, ;.; � · '..
-'
..
....
..� W ' �< I · .. .. '1' .,. ..� , _ .;.,: ;:.:.; ;.;:;. .._ , .... _ . ..:.. _. ..:. :;.;.:.. ••fJtt l,fflltlt4,"1 .......................
I h Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C033B dan C034B.
4. 2. Sekuensing Gen KRAS Exon 2 Dari 24 sampel yang telah dilakukan ampliflkasi (PCR), barn 4 sampel yang telah berhasil dilakukan sekuensing.
Gambar 20. Basil sekuensing sampel C017B (Kiri) dan C023B (Kanan) . . �...
..
..
, • 1Bi fttl ffttl'ltl�ht ft .... .... ...
....,. lfUt l-tftlt�:•t,. .,. ·'
1· < " '
\,..
,
••
�
�-·�JIIr' ;n.. "'"' _., . ,._ . .,.. ,� ...
""-VJI� t;"- ,,.�11' �·-"
i
...;.
..
,t.t UI . tCittf.UU it taiUlUlltld.t:tl t:U J Uft l :t(ltNI . lttt•.Uhll•l •...••• •.t••Ut• .j.-"
,;11
... "
� �•
'
"..0' 1.I.
�
.I
" ',
i l tf.htiUtt:tt1(tJfJfClft4.tt1Ht"u••••h•..,... , ._.,;.._...llU•Ilt: t'a..t•••fwt•••• luh ' .,,. ... . "'"' 1- ..
�
�
, . ...,. .. , . .. ntthan, ....hHttth u .. .. . . t+ .. •P• u ..- u .• • "I\.;t '"" • ••-·'�;,•.• • '' ;. ;,;,... \,. . -�
•.
.,...
,.
Kesimpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C017B
dan C023B gagal
menampakk:an hasil sekuensing.
20
Gambar 21. Hasil sekuensing sampel C030B (Kiri) dan C031B (Kanan)
�r�=.
..
.,..t_1! , .) 1 ,o\......t...
. . .......
,.
... . ..
U IIIIIIIUI I lllllll tlll 111 -'1Itoll k "!lllttUtlttI tiM Ill II MilliltIt lllllttl lUitl •• �-· y � ' �; � �· . .
-
1�'t.,i'
-�· ,., .' ' '
.
'•t I· 1 1 . 'I t � -
IJIIIPIIll f iiUitftll ltoi OIIIII�lii111U l iJIUUIIIUIIf1tltUIII!IItf
..., ....
·'
....
�
...
�
. ........... �·--·�... ..-.........-. ... ,, �····· " · "...
••· UI JU•t t..WU.Q J U,U'Jlltti •t•n•Uhlt t.., .. ... .. •t
...._. ,.,.,. .,, i1, ttt !Wtt•••• · ':" ll ltttttut.-"u-•ll•ttan•••ttlfttt ..... • • t I. ... .
•
-�t..r o o t hil ff tm••hlt ll l lltJ tlltftUI t I Utt f • t l.. »t . llt'l#lllt•• .... � ' .." ,j ' it.• .. � .. . .. .
...
Kesirnpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C030B dan C031 B.
4. 3. Sekuensing Gen KRASDNA Jaringan Tumor Dari 24 sampel, terdapat 10 sampel jaringan yang memiliki konsentasi DNA yang tinggi dan berhasil diamplifikasi. 10 Sampel tersebut kemudian dilakukan sekuensing pada exon
I dan exon 2. Sekuensing pada exon 2 tidak berhasil
dilakukan, sehingga hanya terdapat 10 sampel DNA jaringan tumor kolorektal yang berhasil disekuensing, yaitu sampel : C001T, C004T, C005T, COllT, C013T, C014T, C016T, C019T, C024T dan C029T.
Gambar 22. HasH sekuensing sampel COOl T (Kiri) dan C004T (Kanan) ...
....
. , • • • :, , ... �t •••44flt•t:t••• unni..w t ,.. ..,.,••••• n'l:t - w, r <� ...- � · ·
..
�
.... .._ _
' '
)
�
1·-
•
...� ... .
...- ....
'
··- f'
; ': • . . 'r
....� .. ...;.---:. - .:. � .. - .. � ........:.. .... . � ' , \ ... .. , 'f)·· . ·· •
k...M :..1'A -
l•t tN•t-UQh"tUtitJU i lltJir•li"'*HtltfiiUI1Ui • t al II UtUOUti.U•tttht.it 'flt tt. l
.
. ,..
•.•
J
-4
..,: ...
.;
-�-..-;�..:" � � .... ._ ..._ -..., , .
•-�·
.,._
>fto'? Wt > ., .1! -t..; ; .t' IQ ' It _ tr riJI,�, - . .. , ,,•• '
-
• ,.? .. · , a...\!,·r k. e "
t �iHJt,lfttU.-1-f:HtJUttUt� '!ltt�t+t.,
, ..�:�.·� ......
iA,
u :'· '· '·'
. ... ..... ... .,.
...
.. ....
· .
114-o_.r-'M��., � I...�
ttUIUtUUtUH•UfiiHU UUtlUUHK·t.f�UUittKthJUltlttJIIttnt ltUUt
.:
• �·���
'
'' '
�, " •
't •
I
�.
'
•.
'
•
I
H tutUit ,tttMtt-ttt e t euntttt ntuu••u· �•Uh �
'
•
'
'l;
Kesirnpulan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel COOl T dan C004T.
21
t•
Gambar 23. HasiJ sekuensing sampel COOSf (Kin) dan Ctll JT (Kanan) -llolr"•ll•l• �· -�-.
.. ;J :,.. �
�""---�
" . ... .... . ,.,_..--... � u t ..h .i t. .t .i .- u ••• t JUff tttt••-· •
"
,.
+
�
:
..
.. � ..,. ..... . .. ...... ,............... � �... . ..,._,
c,;· �•, ·�
\
• f J,
,I
.. '"
� � �.o· .
. •
--------�---.--�--����,� . .. . .. -�............"
' � � � � � � � � � � -
ttttlUft,.�u• " • tlltu••urun...n-etltt
j..
•
.,
•
' � · · �
ow
��:""':.... .... .,
� -1
J,
....� � ,
tU1oUUUtlfltU.1Uttntttu•nUUtMf�t•tUJ�··• �
Kesimpulan tida.k: didapatkan mutasi pada sekuens sampel C005T dan CO l i T.
Gambar 24. Hasil sekuensing sampel C013T (Kiri) dan C014T (Kanan) · · .l'· - · · .. .--·� ,......,. ..... ·•· . ....,..... ............_.. . ... ..... . ......"....._.
· -- ......
��·�!' t �haH.,..•••I.tttttUi1Uttt61t••thu.tutt
• ��o
""
...
••t u•••• ••u••• •••tUUtl,flth t.nu•u• u,.nuuutu•••·• ttHtttutuu. 1>�
�
Jo.
v�
1-
�!;
'•
'
'
. .. . . _ .._ .. _ .. � ,... ._llllt .._._ ... ! . � ..... � .... ..,_ ...,. _ _. l
... -� .... ... .,., � �'-- ,..._. ·���......
·
,.,. , -
.... ... _ _ _ _ _ _ ,.,. _ _ � -
�--
Kesimpu lan : tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C013T dan C014T.
Gambar 25. Hasil sekuensing sampel C016T (Kiri) dan C019T (Kanan) _.., ..,
. . ....,� ... ... . ,.
,. .. .. ... .... " ' . "'
-�...
.:t lt,., ,,.Itt�! �����ltH�t U !•'H�Utt·�!1Utttt �
...
-.. �,.· - ·
". ""' ..
.it
...,_. .. . .
. . ........ .. , ...... uu
•tMt.t• •.... • , ••utn�ttHllf6
...,. _ . _ _ ..,., _ _ _ __.,. . . .· ... . .. . . . � ... ... . ..��
..
--.-.. ,_., �
-
� .,._ -·
... .._ r;. , "f.. : ·t} u � ' -,A , .... -.. \: o; l t. 1 •' ; �,, ,.. , ,�... ._.. .... ..., ._ ...,. ,. �..._�, .... ,... ,. , . uu�ut-.Uutu��t\tltUI4ltUnHittiJUtnUt� I � IU � Uu "
,
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C016T dan C019T. 22
CI29T (Kanan )
Gambar 26. Hasil sekuensing sampel 0024T ....•••"M-•• ...�..•••. a.nut•..,.••••n••n••••••, . ...._....,
'!11' ,. ..,_.....,..
"'
...
UUUIHIIUU UUJHtU tUIU..IUUtHUtiUh �thUtu. tt.: ,J, o ,.. .... ..
�
�
.
..
.
Kesimpulan tidak didapatkan mutasi pada sekuens sampel C024T dan CX>29T.
23
PEMBAHASA:-
Mutasi gen KRAS memiliki efek yang sangat � � ejadian kanker kolorektal. Sebanyak 27% dari mutasi yang ada pada kallitker � berasal dari mutasi gen KRAS (Conlin A et al, 2005). Pada penelitian lain Csda:•ha mutasi gen
KRAS terjadi pada 43% kasus kanker kolorektal (Lievre
et
al. 2006). Penelitian
sebelumnya juga menyebutkan dari 2721 kasus kankerkolorekta1, � 37)% kasus memiliki mutasi pada gen KRAS, dimana 80,8% mutasi tedetzk � kodon 12, dengan wild type GGT I Glisin dan kodon 1 3 dengan wild type GGC I Glisin
(Andreyev et al, 1 998). Pada penelitian yang lain disebutkan 46% dari kasns kanker kolorektal memiliki mutasi gen KRAS, dengan 54% dari kasus mutasi tedetak: pada kodon 12, 42% pada kodon 1 3 dan 4% pada keduanya (Bazan V et al, 2002). 37% mutasi gen KRAS terletak pada exon 1, terutama pada kodon 12 dan 1 3, dengan 55% teijadi transisi G>A, 32% terjadi tranversi G>T dan 9% transversi G>C. Mutasi
pada exon 1 terjadi pada kodon 12 (17%) dan 22% pada kodon 13 ( Brink M et al 2003). Se,dangkan pada penelitian lain disebutkan 79% mutasi gen KRAS terjadi
pada kodon 12 dan 2 1 % pad a kodon 1 3 . KRAS merupakan protein G yang berperan pada jalur signaling Ras/MAPK yang merupakan kelanjutan dari EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) dan terlibat ctalam karsinogenesis kolorektal. Kanker kolorektal metastasis dengan EGFR yang positif dan mutasi gen KRAS memiliki resistensi dan penurunan angka survival dengan kemoterapi cetuximab (Lievre A et· al, 2006). Pasien kanker kolorektal dengan wild type mutasi gen KRAS memiliki keuntungan pada kemoterapi anti EGFR, yaitu cetuximab, tetapi tidak pada pasien yang memiliki mutasi pada gen ,.
KRAS, sehingga terdapat hubungan yang bermakna antara status mutasi gen KRAS dengan efektivitas terapi cetuximab (Christos et al, 2008). Pada penelitian yang lain, 27% kasus kanker kolorektal memiliki mutasi gen KRAS dan mutasi tersebut
berkorelasi dengan resistensi kemoterapi cetuximab dan survival rate yang menurun (Lievre et al, 2008). Status mutasi gen KRAS merupakan data yang penting sebagai biomarker untuk memprediksi respon kemoterapi anti-EGFR pada pasien kanker kolorektal. Mutasi GGT menjadi GOA pada kanker kolorektal dukes B dan C memiliki resiko lebih tinggi untuk menjadi rekurens, menunjukkan bahwa analisis 24
mutasi gen KRAS memiliki peran penting untuk menent ukan prognosis pad a pasien kanker kolorekta1 stadium lanjut (Benhattar, 1993 ). Mutasi gen KRAS berkor elasi dengan peningkatan r e siko terjadinya rek u r ensi dan kematian pada semua stad ium kanker kolorektal (Andreyev, 2001). Anal isis mutasi gen KRAS menggunakan sampel darah a!<Jlir-akhir ini mulai diteliti dan dikembangkan untuk m e nghindari analisis mutasi menggunakan sampel jaringan
yang
l e bih
invasif karena
harus melalui
proses
biopsi jaringan.
Perkembangan tekriologi PCR untuk amplifikasi DNA dalarn j umlah yang minimal menggunakan sarnpel serum telah memungkinkan mengidentifikasi mutasi g e n dari pasien kanker kolorektal metastasis. Pada sebuah penelitian, dari 76 pasien kanker kolorektal metastasis, didapatkan 33 pasien (43.4%) mengalami mutasi pada jaringan tumornya dan 30 pasien (39.5%) t e rd eteksi mutasi pada darah perifernya (Yen e t al 2009). Gen KRAS me rupakan grup onkog e n yang t e rletak pada kr omosom 12p 1 2 . 1 . Gen KRAS memiliki 6 ekson. Beberapa regio yang paling berperan dalam aktivasi onkoge nik adalah kodon 1 2 dan 1 3 pada ekson 1 , kodon 59, 61 dan 63 pada e k son 2 (Carta C, 2006). Tidak ditemukannya mut asi pada analisis codon 12 dan 13 pada ekson 1 serta kodon 6 1 pada ekson 2 baik mengg unakan sampel darah maupun sampel j"aringan, tidak menyingkirkan status mutasi pada gcn KRAS, karena selain - kodon-kodon terseb�t, masih ada kod on-kodon lain d i ekson yang lain yang belum
-·
-
.
-
terdeteksi. Sehingga diperlukan ta1nbahai1 banyak set primer lain yang d apat mengkover keseluruhan ekson dari gen KRAS, sehingga dapat menggamba rkan ·
keselu ruhan status mutasi dari gen KRAS t e r sebut.
25
DISKUSI, KESIM PULAN DAN SARAN
Tidak didapatkan hasil mutasi di exon 1 gen KRAS pada 24 sampel, dan 4 sampel di exon 2 gen KRAS (1 00% wild type). Hasil negatif pada semua sampel tersebut tidak berarti menyingkirkan status mutant type gen KRAS pada sampel, tetapi masih dimungk:inkan adanya mutasi pada ekson lain mengingat gen KRAS terdiri dan 6 ekson yang dapat menjadi kandidat mutasi. Hasil 100% wild type yang didapatkan dapat juga dikarenakan DNA yang digunakan untuk PCR adalah DNA dari darah, bukan DNA dari jaringan pasien. Hambatan yang ditemui adalah sedikitnya jumlah sampel pasien kanker kolorektal yang menjalani kol_orektomi di RSUP Dr.Kariadi dan DNA hasil ekstraksi jaringan tumor yang konsentrasinya kurang optimal untuk PCR sehingga hanya 2 sampel dari jaringan yang berhasil diamplifikasi dan disekuensing sedangkan yang lainnya menggunakan DNA dari darah pasien. DNA dari jaringan pasien, untuk meningkatkan konsentasi dan kualitas ekstraksi DNA, dapat dilakukan metode ekstraksi dengan mengunakan metode konvensional dibandingk:an dengan menggunakan kit Jaringan yang diambil untuk ekstraksi DNA sebaiknya diambil dari jaringan segar setelah operasi bukan dari jaringan yang telah dilarutkan dalam fo�alin.
RENCANA PENELITIAN TAHUN KEDUA
Melanjutkan pengumpulan sampel pasien kanker kolorektal untuk menambah jumlah sampel, melakukan sekuensing pada sampel yang tersisa serta menganalisis hubungan antara status mutasi gen KRAS sampel dengan klinis pasien. •
26
UCAPAN TERil\,lA KASIH
Penelitian ini mendapat dana dari Proyek Risbin Iptekdok, Badan Litbangkes Departemen Kesehatan Republik Indonesia tahun anggaran
2.,0 1 1 . Oleh karenanya
pada kesempatan ini kami menyampaikan terima kasih kepada: Badan Litbangkes Departemen Kesehatan
Republik
Indonesia.
Ucapan
terima
kasih juga kami
sampaikan kepada Prof Sultana MH Faradz PhD, Dekan Fakultas Kedokteran UNDIP, Direktur RSUP Dr. Kariadi Semarang, Central of Biomedical Research (CEBIOR)
FK
UNDIP,
BPPT,
serta
semua
pihak
yang
telah
membantu
terlaksananya penelitian ini .
..
27
Daftar Pustaka
1. Abdullah M (2009). Peran NF-kB dan COX-2 Serta Hubungan dengan Karakteristik
Klinikopatologis.
http://www.idionline.orglkategori/info_profesi/312 2. Bazan V, Migliavacca M, Zanna I, et a1 (2002). Specific codon 13 K-ras mutations are predictive of clinical outcome in colorectal cancer patients, whereas codon 12 K-ras mutations are associated ·with mucinous histotype. Annals of Oncology 13: 1438-1446. 3 . Brink M, Goeij AFPM, Weijenberg MP, et al (2003). K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study. Carcinogenesis Vol 24 (4): 703-710. 4. Christos S. Karapetis, Shirin Khambata-Ford, Derek J. Jonker, et al (2008). K-ras Mutations and Benefit from Cetuximab in Advanced Colorectal Cancer. The New England Journal of Medicine volume 359: )757-1765. 5. Conlin A , Smith G, Carey FA, Wolf CR, Steele RJC (2005). The Prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. Gut Vol 54: 1283-1286. 6.
Jemal A, Siegel R, Ward E, et al (2009). · Cancer Statistics, 2008. CA Cancer Journal for Clinicians Vol 58: 71-96.
7.
tievre A, Bachet JB, Boige V et al (2008). KRAS Mutations As an Independenc Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab. Journal of Clinical Oncology, Vol 26, No 3: 374-379.
8.
Mora J, Puig P, Boadas J, et al (1998). K-ras gene mutations in the diagnosis of fine-needle aspirates of pancreatic masses: prospective study using two techniques with different detection limits. Clinical Chemistry Vol 44 (11): 2243-· 2248.
9. Okudela K, Woo T, Kitamura H (2010). K.RAS gene mutations in lung cancer: Particulars established and issues unresolved. Pathology International Vol 60: 651-660. 10. Sills R.C, Hong H.L, Melnick R.L, Boorman G.A and Devereux T.R (1999). High frequency of codon 61 K-ras A-7T transversions in lung and Handetian glan neoplasms of B6C3F1 mice exposed to chloroprene (2-chloro-1,328
butadiene) for 2 years, and comparisons with the structurally related chemicals isoprene and 1,3-butadiene. Carcinogenesis Vol 20 (4): 657-662. 1 1 . Spano JP, Milano G, Vignot S, and Khayat D (2008). Potential predictive markers of response to EGFR-targeted therapies in colorectal cancer. Critical reviews in Oncology/hematology Vol 66 ( 1): 2 1 -30. 12. Ulrich Cornelia M (2005). Nutrigenetics in Cancer Research-Folate Metabolism and Colorectal Cancer. The Journal ofNutrition Vol l 35: 2698-2702. 1 3 . Wistuba 1.1, Behrens C, Saavedra J.A, et al (2003). Distinct K-ras Mutation ·
Pattern Characterizes Signet Ring Cell Colorecta1 Carcinoma. Clinical Cancer Research Vol 9: 3615-3619. 14. Yee Y.K, Tan VPY, Chan P, et al (2009). Epidemiology of colorectal cancer in Asia. Journal ofGastroenterology and Hepatology Vol lO: 1440-1446. 1 5. Lievre A, Bachet JB, Le Corre D, et al (2006). KRAS mutation status
IS
predictive ofresponse to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res Vol 66: 3992-3995. 16. Andreyev HJ, Norman AR, Curmingham D, et a! (1 998). Kirsten ras mutations iri patients with colorectal cancer: the multicenter "RASCAL" study. J Natl Cancer Inst Vol 90: 675- 684. 17. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, et al (200 1). Kirsten ras mutations in . patients with color�cta1 cancer: the ?RASCAL II? study. Br J Cancer Vol 85: -
692-696. 1 8 . Benhattar J, Losi L, Chaubert P, et a! (1993).' Prognostic significance of K-ras mutations in colorectal carcinoma. Gastroenterology Vol 104: 1044-1048. 19. Yen LC, Yeh YS, Chen CW et al (2009). Detection of KRAS Oncogene in Peripheral
Blood as
a
Predictor
of the Response to Cetuximab Plus
Chemotherapy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. Clin Cancer Res Vo1 15 : 4508 - 45 1 3 . 20. Carta C, Pantaleoni F , Bocchinfuso G , Stella L, Vasta I, Sarkozy A et a! (2006). Germline missense mutations affecting KRAS Isoforrn B are associated with a severe Noonan syndrome phenotype. Am J Hum Genet Vol 79 ( 1 ) : 1 29 - 135.
29
LAMPIRAN 1
For mulr Data Klinis P a sienK a nkerKolorektal Sample
No:
CRC . . . .
CLINICAL DATA
FORM
OF COLORECTAL CANCER PATIENT
Date of Anamnesis
Name Date of Birth Age at Diagnosed Race Gender AddressfTelp
Familial Cancer History
(Relative/can::;er
typc/dx
age) Date of Diagnosis Date cf Operation Tumor Characteristics
.
- -
I
Location:
--
Dukes' stage: _
.
Differentiation
-
grade:-
Size: Mucinous: Lymphovascular invasion: Lymph nodes involved:
..
Pre-op
Treatment Data
.
chemotx (regiment/dose/time):
Concurrent chemotx (regiment/dose/time):
Adjuvant chemotx (regiment/dose/time):
Response of treatment
CR
I
PR
I
so
I
PO
CR: complete response PR: partial response SO: Stabile disease
30
PO: Follow-up
Date of Recurrence: Sites
of Metastasis:
Lung I
Liver I Brain I
Bone I
Peritoneum I Pelvis I Others Date of last review: Status: - Alive with no recurrence -
Alive with recurrence
-
Alive with disease
-
Death
.
Date of death: Cause of death:
Laboratorium Finding
Admission
Pre
Post
3
6
1y
Ops
ops
month
month
HB GD 1 GD 2 CEA Cotonoscopy
Adjuvant I Palliative Chemotheraphy
Chemo
.
regiment
"
Date
Date
start
end
t-
No
- of
cycles
Response
Duration
( CRIPRISD/PD)
response
I
DEFINITIONS
31
of
Duration of response: Time from last cycle of chemo to date of progression or recurrence Date of progression/ recurrence: Date of CT scan report or pathology/cytology report that confirms progression Date of diagnosis: date of biopsy report or failing that date of surgery
32
LAMPIRAN 2 Datasheet Primer KRAS Exon 1 dan Exon 2
--
r\:.1 t...ds ._.r ...
1-h�,-� il�t.a: 0J]j"·1
Ologonu d eotl\.l>e
Datasheet for
::'l-r:.,c-,; .:! t.'£ ..!i �( ••-_.L.:;-!:1!1
Hermawan lslladt
33
r
LAMPIRAN 3 Hasil analisis
BLAST sekuens gen KRAS exon 1
sampel
Exon 1 COOIB > 1 c l 1 44633 Length=195
Score = 361 bits (19 5) , Expect = 2e•l02 Identities = 195/195 (100% ) , Gaps = 0/195 ( 0 % )
Strand=P1us/P1us Quer:y
ATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC
10493
10552
1 1 1111111 1 1 1 1 1 11 111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj ct
1
ATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC
60
Query
1 05 53
TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA
10612
Sbjct
61
TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA
120
Query
106 1 3
ATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATC TTGTTTTAATATGCATAT
10672
I I I I I II I I I I I � I I I I I I II I I I I I I I I I I I I II I I I I I II I I I I II I II I I I I I I I I I
1 11 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj ct.
121
ATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTG TAATAT CATAT
Query
10 673
TACTGGTGCAGGACC
10687
Sbjct
181
TACTGGTGCAGGACC
195
I I I I I I I I I I I I J I I
180
Exon 1 C002B >1c11 25707 Length=191 Score =
331 bits (179) , Expe::c Identitie:3 = 187/191 (98; ) , Gaps
• Strend=Plus/P1us
= =
1e-93 0/191
(O;)
Query
10497
AGTCACATTTTCATTATTTTA T TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT
10556
Sbjct
1
AGTCACATTTTCATTATTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGft T �TATAAACGTGT
60
Query
10557
GGTAGTTGGAGCTGGTGG�GTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCA
1 0616
1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1i1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
I
1 11 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
I l l
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbjct.
61
GTTAl,ITGGAGCGGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCcTTGACAATACAGCTAATTCAGAATCA
120
ouel:y
10617
TnTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTITIAATATGCATATIACT-
10676
Sbjct.
121
TTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACT
180
Query
10677
GGTGCAGGACC
Sbjct.
1 1 1111111111 j 1 1 1 11111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
11111111111
GGTGCAGGACC
18 1
10687 191
Exou 1 C003R >1c11 27497 Length•.l89 Score • 327 bits (177 ) , Ex pect Ident.it.ies = 185/189 (98'<) ,· Gaps Scrand•P1us/P1us
• •
2�-92 0/189 (0")
Query
1 0497
AGTCACATITICATTA1TITIATTATAAGGCCTGCTGA.'�TGACTGA.A.TATAAACTIGT
10556
Sbjct.·
1
AGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACGTGT
60 10616
I l l I 1 1 1 1 1 1.1 1 1 1 .' I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 I I l l I I I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
III
Query
10557
GGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCA
Sbjct.
61
GTTAGTTGGAGCGGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTG�CAATACAGCTAATTCAGAATCA
120
Query
10617
10676
Sbjct.
I
1 1 1 1111111
1 � 1 1 1 11 1111111 1 1 1 1 11111111
l l l t l l l l l l l l l l t ll t l l
121
TTTTGTGA G CGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTC TAATATG ATATTACT I! 11111111111 I1111 1 111111I 1111111111IIIII Ill IIIII II II 1111111 TTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATT ACT
Query
10677
GGTGCAGGA
Sbjct.
18 1
GGTGCAGGA
1 1 1 111111
180
10685 189
34
T Exon 1 C004B Score � 357 bits ( 1 9 3 ) , Expect = Se-101 Identities = 193/193 ( 1 0 0 � ) , Gaps = 0/193 ( 0 � ) Strand=P1us/P1us Query
10495
$bjct
1
Query
10555
Sbjct
61
Quer.y
10615
Sbjct
121
Query
10675
Sbjct
181
ATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ATAGTCACATTTA TC TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT
10554
GTGGTAGTTGGAGCTGGTifGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAA T I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 111 I I I I I I I I GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATC T AGAAT
10614
120
CATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTG TAATAT CATATTA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CATTTTGTGGA.CGAATATGATCCAACAATAGAGGT.AAATC f I G I I II AA T A TGCATATTA
130
CTGGTGCAGGACC I I I I I l l I Ill II CTGGTGCAGGACC
60
10674
10687 193
Exon 1 COOSB Score = 361 bits (195), E>:pect: = 4<=-102 Identities = 195/195 (100�), Gaps = 0/195 Strand=P1us/P1us Query
10493
Sbjct
2
Que:t:y
10553
Sbjct
62
Quet:'J
10613
Sbjct
' 122
Que:t:y
1 0673
Sbjct
182
(O<)
ATATAGTCACATTTTCATT ATTTTT ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATJL�C 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ATATAGTCACATTTC T ATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC
61
TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11111 1111 1 1 1 1 TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA
121
ATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATAT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ATCATTTTGT�GACGAA T ATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATA TGCATAT TACTGGTGCAGGACC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TACTGGTGCAGGACC
10552
10612
1 0672
181
10687 196
E�on 1 C006B ·s cc>re � 355 bits ( 192), Expect � 2e -100 Identiti�s = 192/192 (100�) , Gaps = 0/1�2
snand=Plus;Plus
Quer:y
10497
Sbj c t
1
Query
lOSS}
Sbjct
61
Que�y
10617
Sbjct
121
Query
10677
Sbjct
181
.
(Q% )
AGTCACATTTTCATTATTTG TTATTAT�A GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT 1 1 1 1 1 1 1 1 11 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 AGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAG AT ACTGAATATAAACTTGT GGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCltAGAGTGCCTTGACGA TaCAGCTAATC T AGAATCA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 : I l l i 1 1 111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ; 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 GGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAA TCA TTTTGTGGACGAA TATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTC TAATATG ATATTACT l l l l l l l l lllllll l l l l l l l l l llilllll l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l TTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACT
10556 60 10 616
120 10676 180
GGTGCAGGACCA 10668 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111 · GGTGCAGGACCA 192
35
Exon 1 C007B Score : 344 bit:s (186), E:
10502
Sbjct:
1
Query
10562
Shjct
61
Quety
10622
Sbjct:
121
Query
1 0682
Sbjcc
181
CATTTTCATTATC TTTTATTATAAGGC TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAG 1 1 1 1 1 1 1 I 1111111111 Ill I I II 1111111 I l l I l l I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I CATITICATTATG TTTTATTATAA GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAG
10561
TTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG I l l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1.1 1 1 I I I I I I I TTGGAGCTGGTGGCGT AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG
10621
TGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCl!GilliA& ATAT CATATTACTGGTGC II Ill II I II 111111I I I II II I II 11111111 I II I I I I II Ill I II I I 1111 II II I TGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTAATATGCATATTACTGGTGC T
10681
AGGACC IIIII I AGGACC
60
120
180
10687 186
Exon 1 C009B Score = 359 bits (194) , Expect = 1e-101 Identit:ie3 = 194/194 (100%), Gaps = 0/194 (0�) St:rand=�1us/P1us Query
10495
Sbjct
1
Query
10555
Sbjct:
61
Query
10615
Sbjct
121
Que r:y
10675
Sbjcc
181
ATAGTCACATTTTCATTA111rATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATA rT AACTT I II I I I I I II I I Ill I I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ATAGTCACATTTTCATTATTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG T C AATATAAA TT GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAAT I II I I I l lI I I I I I I II I I I I I I I I I I I II I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGT AGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAAT CATTTC TGTG&A GAATA�ATCCAACAATAGAGGTAAATCIIGIIIIAATATGCATATTA I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I Ill I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 I I I I I I II I I I I CATTTGA TGTGGAC C ATA-n;ATC AACAAT1GAGGTAAATCTTG1TJTAATATGCATATTA CTGGTGCAGC GAC A 11111111111111
CTGGTGCAGGACCA
10554 60 10614
120 10674 180
10688
194
Exon 1 COllB Scot� = 359 bics (194) , Expec t = 1e-101-· Identities = 194/194 (100� ) , Gaps = O/i94 (0�) Scra nd=P 1us/P1us O>.t-ety
10494
St>jct Query
10554
Sbjcc
61
Quety
10614
Sbjct
121
Query
10674
Sbjcc
181
TATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAA.ATGACTGAATATAAACT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT TGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCT�4TTCAGAA II I l l I I I I I I II I I I I I I I I I II I I I I II 1 1 1 1 I I I I I I I I I II I I I I I I II I I I I I I I TGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAG�4 TCATITI.GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATT I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I II I I I I I I II II I I I I I 1 TCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATT ACTGGTGCAGGACC I I I I I I I l l I I II I ACTGGTGCAGGACC
10553 60 1 0613 120
10673 130
10687 194
36
Exon l C013B �=o�e • 357 bi�s (193), Lxpec� = 5e-101 Iden�i�ie5 = 193/193 (100%), Gap5 = 0/ 193 (0%) St�and=P1us/P1us Query
10495
AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTI A T A GTC ACATITIC A 1T A TrnT A 1T A T
Sb]Ct
1
ATAGTCACATITICATIATrnTATIATAC AGG CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTI
60
Query
10555
GTGGTAGTTGGAGCTGULGGCGTAGGCAAGAGTGCCTIGACGATACAGCTAATA TC GAAT
10614
Sbjct
61
GTGGTAGTTGGAGCTGGTVGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTlATTCAGAAT
lZO
Quer:-JI'
10615
CATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGIIIG IAATAT CATATIA
10674
Sbjct
121
CATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGIG IIIAATAT CATATTA
Que�y
10675
CTGGTGCAGGACC
Sbjct
181
CTGGTGCAGGACC
1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111
I II I I I I I I I I I I I I I I I Ill II I I I I I I I 1111 I I I I I I I I I I I I l l I I 1 1 1 1 I I l l I I
11111111!1111
10554
180
10687 193
Exon 1 C014B >1cll 52373 Length=l92 Score = 355 bits (192), Expect = Se- 101 Identitie� = 192/192 (100% ) , Gaps = 0/192 (0%)
St�sndzPlu3/PlU3 Query
10494
Sbjct
TATAGTCACATTTTCATTATITITATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT I I I I II I I I I I I I I I I ! I l l I I I I I I I I I I I I I l l ! I I I l l I I I I I I I I ! I I I I I I I II I TATAGTCACATTTTCATTATITTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT
60
TGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAA I 11111111111 I I I I II II I I I l lI I I I I I I Ill! I I I I I III Ill I I II I III II II I TGTGGTAGTGAGCTGGTG TG G GC TAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAA
120
10553
Query
10554
Sb)CC
61
Query
10614
'ITITGTGG A CG AA TA TG A TCC .AA I I G I I II A A TT A G C A TA TI T C A CAATAGA GGT A.U I C
10673
Sbjct
121
TCATITTGTGGACGAC ATATGATC AACAATAGAGGTAAATCTIGTITTAATATGCATATT
180
Query
l0o74
ACTGGTGCAGGA
10685
Sbjcc
181
ACTGGTGCAGGA
192
I 11111111111 I I I I 1111 I I III I I I I I l l I I I I I I I I I II I Ill I I I III III I I l l
111111111111
10613
Exon 1 C016B Sco�e =
3� bit:s
(188),
Lxpect
= 3e-98
Identities = 188/188 (100%) , Gaps = 0/188 S tre.nd=P1us/Plus
Query
iO�)
10501
ACATITTCATTATITTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTA ACATTTTCATTATITTTATTATAAGGCnGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTA
60
1056 1
GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTT
Sb jct
61
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I f I I I I I I !I I II II I I I I I I I I I II I l l I I I II I I I I i
10620
GTIGiTAGCTGGTGiTCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCii.GAATCATTTT
120
Query
10621
GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAA TCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTG
10680
Sbj ct
121
GTGGACGAAT ATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATIACTGGTG
180
Que �y
10681
CAGGACCA
Sbjct
181
CAGGACCA
Sbjct
Query
I I \ I I I I I I I I I I l l I I I I I I I I I I I I I I il l I I I ! I 1"1 1 1 1 1 1 I I I I I I I II I I I I I I \
II 1111111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 \ l l l llllllllll\llll l\1111111111111
11111111
10560
10688 188
37
Exon t C017B Sco�e : 357 bi� (193), Expecc : Se-101 Idencicies = 193/193 (100%), Gaps • 0/193 (0%) Scrand=P1us/Plus Que�y
l0495
ATAGTCACATITTCATTATfiTT ATTAT.A.AGGCCTGCTGAA.AATGkCTGAATATAAACTT
Sbjcc
1
ATAGTCACATTTTCATTATfiTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT
Query
10555
Sbjcc
61
GTGGTAGTG TGGA CTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAAT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I tI I I I I I I l l
I I I I I II I I II I I I I I I I IIIII I I I I I I I I I
11111111 II
I I I I I I II I II I I I I II I
GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTACGCAAGACTCCCTTCACCATACAGCTAATTCAGAA T
l0554 60
10614 120
Query
10615
CATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATA TGCATATTA
10674
Sbjct
121
CATTTTGTGGACGAATATGA TCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAA TATGCATATTA
160
1111111111 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111111111 1 1 1 1 1 1 111 111111111
Query
10675
CTGGTGCAGGACC
10667
Sbjct
181
CTGGTGCAGGACC
193
1111111111111
Exon 1 C019B Sco�e = 348 bits (188), Expect • 3e-98 Idencities : 188/138 (100;), Gaps • 0/188 Sc�:and=P1us/Plus Que:ry
10501
Sbjcc
1
Oue�:y
10551
(0%)
ACATTTA TC TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTA I I I I I I I I I II I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I II I I I I I I I ACATTTA TC TTATTTTTATTA TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTA
Sbjcc
61
GTTGCTGGTG GAG GCGTAGGCAAGTGCCTTGACGAT AG ACAGCTAATTCAGAATCATTTT II I I I I I 1111 I I II I I I 1111 I I I I I I I I I I II II I I III II I I I I 1 1 1 1 1 1 II I I I II GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTT
Query
10621
GTGGACGAATATGATCCAACAA ATAG GGTAAATCTTGIIIIAATATGCATATTACTGGTG
Sbj cc
121
Que:y
10681
Sbjct
181
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 ·1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l i l t T CCAACAATAG A GGT AA I C A I I G J I II AA T A TGC.\TATTACTGGTG GTGG A C G AA TATGA
CAGGACCA I l l I l lI I CAGGACCA
10560 60
10620 120 10680 160
10688 188
Exon 1 C022B
•
Scor:e '
3�5 bits (1;:.7 ) , Expect • le-97 Identi ti�3 = 167/1>37 (100%), Gars = 0/167
Sttertd=l' lus/Flus
"
(0'<) 105151
Que�y
1(151)2
Sbjct
1
CATTTTCATT ATTTTTATI.uTAA(:GCCTGCTGAAJUT(:I\I:TGAATATAAACTTGTGGTAG I I I I I I I II I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II CATTTTCATTATITG TTATIATAA GCCTGCTGAAAC ATGA TC:AATATAAACTTGTGGTAG
Query
10562
TTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG
Sbjct.
61
TTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG
120
O'tecy
10622
TGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTG TAATAT CATATTACTGGTGC
10 681
Sbjct.
121
TC�ACGAA TATGATCCAACAAT AGAGGTAAATCTTGTTTC TAATATG ATATTACfGGTGC
1 80
Qu.,�y
1066�
Sbjct.
181
111111111111 1111111111111111111111111111111i1111111111111111
1 1 1 1 1"1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
AGGACCA I II I I I I AGGACCA
60 10621
10688 187
38
Exo n 1 C023B Score :
355
bics
(192) ,
Idencicies � 192/192
Scrand:Pl�s/P1�s
Q�ery
10496
Sbjcc
1
Query
10556
Sbjct
61
Qu�ty
10616
Sbjct
121
Query
10676
Sbjcc
181
• 2e-100 Gaps : 0/192 ( 0 � )
Expect
(100�),
TAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA TATAAACTTG I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I II Ill I I I I I I I I I I 1 1 1 1 I I I II I I TAGTCACATTTATAAGGCCTGCTGAAA TCATTATTTTTATT ATGACTGAATATAAACTTG
10555 60
TGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCT�TTCAGAATC I I I I I I I I l l 1 1 1 1 I I I I II I I I I I I I I I I I I I I IIIII I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I TGGTAOTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTI :;{;CTT(;ACC,ATACAGCTAATTCAGAATC
10615
ATTTC TGTGGA GAATATGATCCAACiu\TAC:AGGT AAATCTTGTAATATGCA TTT TATTAC I I II IIII III I I I II I I Ill I I II I I I I I I I I I I I II IIII I I II I II I III I II II I I ATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAA TCIIGIG�A IIIAATAT T ATTAC
10675
TGGTGCAGGACC 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 TGGTGCAGGACC
120
130
10687 192
Exo n 1 C025B >1c11 S2679 Length•276 Scot� = 351 bits (190), Expec t : 2e-99 ldenticies : 190/190 (100� ) , Gaps = 0/190 (O;) Scrand=P1us/P1us
a�"I:Y
Sbjct
10499 1
l)�ery
10559
Sbjcc
61
Query
10619
Sbjcc
121
Q\rery
10679
Sbjct
161
10558
TCACATTTTCATT AT11lrATTAT r AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGG II I I I III I I II I I I I I III I I II I I I I I I II II I III IIII I II II I I II II I II I I I I TCACATTTC T ATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATACT AA G TGTG
60
TAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAG��TCATT 1 1 1 1 ! I l l I I I II I I I I 1 1 I 1 1 1 1I I I I I I I I I I I l lI I IllI I I I I I I I I I I I I I : I I I TAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATG TCA AATCATT
120
TTGTGGACGACA ATATGATC GGTA ACAATAGA A AATCTTGTTTTAATA� TATTACTGG 1 1 1 1 1 1111111 I I I I I ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II I I TTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTA T ATATGCA TATTACTGG
180
TGCAGGACCA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TGCAGGACCA
10618
10678
10688 190
Exon 1 C027B Score = 3Sl bics (190] , Expecc = 2e-99 Identitie:� = 190!1'30 (100�) , Gapg • 0/190
(0%)
St:r!illd=Plo.l.S/P1ue Query
10498
Sbjct
1
Query
10553
Sbjcc
61
Query
10o1a
Sbjct.
121
Query
10678
:Sbjcc
181
10557
GTCACATTTCATTATTTT T TATTATAAGGC\TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTG II II I II I I III IIIII I I I IJ I I I II I l I I I lI I I II I II IIII II I II I I I lI I I I I I GTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAPAATGACTG��7ATAAACTTGTG
60
GTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCAT I I l l I I I I I II I I I I II I I I I I I I IIIIII I I I I I I I I Ill Ill 1111 I I I I I I I II I l l J;TAGTTGGAGCT:;GTGGCGTAGGCAAGAGTCCCTIGACGATACAGCTAATTCAGiu\TCA.T
120
TTTGTGGACGAATATGA TCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTC TTTAATATG ATATTACTG 1 1 1 1I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 I I I I I I 1 1 1 1 I I I I I I I I I I I I I l l 1 1 1 1 I I I I I I I 1 1 1 1 I TTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTG
180
GTGCAGGACC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 !'TGCAGGAC.C
10617
10677
10667 190
39
Exon 1 C028B Scor.e ,.,.
357 blt.s (193), Expect ;;;;. St'-101 Iden�ities = 193/193 (100<), Gaps = 0/193 Sttand•P1u3/PIus
(0<)
Quety
10495
ATAGTt:ACATTTTCATTATITITATTATAAGGCLTGCTGAAAATGACTGAAT.\TAAAm
10554
Sbjct
l
ATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT
60 10614
I I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 I I I I I I I I I II I I II I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I
Query
10555
GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTMTTCAGAAT
Sbjct
61
GTGGTAGTTGGAGCTGGTG&CGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAAT• 120
I I I I II I II I I Ill I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I II I I I I
Ouety
10615
CA1TITGTGGACGAATATGATCCAACAAT.\GAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTA
10674
Sbjc�:
121
CATTTCGACCAA TGT TATGATCCAACAGAGGT ATA AAATCTT&TTTTAATATGCATATTA
180
Ouery
10675
Sbjct
181
1111111111111111 1 1 1 1 1 1 1 1 :1111111 1111 11111111111 1!111111 11111
CTGGTGCAGGACC
1111111111111
. CTGGTGCAGGACC
10687 193
Exon 1 C030B Score = 331 bits (179), EXpec� = le-93 Identities = 179/179 (100�), Gaps = 0/179 Strand=P1us/P1us
(0�)
Quer:y
10510
TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT
Sbjct
1
TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAA 1.GACTGAATATAAA CTTGTGGTAGTTGGAGCT
60
Query
10570
GGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAG��TCATTTTGTGGACGAA
Sbjct
61
10629
GGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATG TCA AATCATTTTGTGGACGAA
120
1 1 1 1 1 1 1 1 111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1111111111 1 1 1 1 1 1 1 111111111 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1
I I I I I II I I I I I II I I I I l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I II I I I
Query
10630
T ATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTIGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCA
Sbjct
121
TATGATCC�.ACAATAGAGGTAAATCTTGTTTA TAATATGC TATTACTGGTGCAGGACCA
I1
II I I I II
1 11111 1111111
1111111
I I I I I I I I I I IIIII I I l l I I I I I I II I I I
10569
10688 179
Exon 1 C031B Quer y
Sco�e = 346 bits (167), �
�t.art. nosit.i=Jn
Query
10501
Sbjct
1
ACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA+ATAJL�CTTGTGGTA
60
Qu�ry
1056!
GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCA AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATITT
�bjct_
10620
61
QuHy
10621
GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTT1TAATATGCATATTACTGGTG
Sbjct
121
GTGGACGAATA TGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTG
ACATTTA TC TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGkATATAAACTTGTGGTA
IIIIIIll1
11111
II
1 1 1 1 1 1 1 1 1111111
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
IIIII
I111111
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
II
I llllllli I
fTTGG AGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTT
II III IIII IIIII III I I II IIIIIIII III I II I I I
Query
10681
CAGGACC
10687
Sbjct
181
CAGGACC
1 87
IIUIII
1111
IIIII II II II I II III I
10560
120 10680 180
Exon 1 C032B Score = 348 hits ( 1 8 8 ) , Expec� = 3e-98 Identities = 188/188 (100� ) , Gaps • 0/1 8 B ( 0 � ) Strand=P1us/P1us Query
10501
ACATTTTCATTATTTTTA TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAG AACTT T�;TA
1
I I I II I II I I I I I I I I I I I I I I I I II ! I I I I I I I I I I I I II II II I I I I I I I I I I I I I I I
10560
Sbjct
ACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAJL�CTTGTGGTA
60
Query
10561
GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG TGCCTTGACGATACAGCTAATC T AGAATCATTTT
10620
Sbjct
61
GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATC T AGAATCATTTT
120
Query
10621
GTGGAC GAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTA TAATATGC TATTACTGGTG
10680
Sbjct
121
GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATT ACTGG TG
130
10681
CAGGACCA
181
CAGGACCA
Qu"r:y Sbjct
I I I I II I I I I I II I I I I I I I I I I II I I I I II I I I I I I I II II I I I I I I I I I I I I I II I I I
I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I IIIII I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I
1 1 1 1 1 1 1 1
10688 188
40
Exon 1 C033B >lcli 2563 Length•336 357 bits (193), Expecc � �e-101 Iden&l&le� • 193/193 (100�), Geps = 0/193 (0%) Scrend=P1us/Plus
Score •
Query
10496
Sbjcc
1
Quet:y
10556
Sbjcc
61
Quer'/
10616
Sbjcc
121
Query
10676
Sbjcc
16 1
TAGTCACATTTTtATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTG 11111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTG
10555 60
TGGTAGTTGGAGCTGGTGITCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111111111 1 1 1 1 1 1 1 1 111 TGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAL>AGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATC
120
ATTTG TGTG ACGAATATGATCCAACAGTA ATAGAG A AATCTTGTTTTAATATGC TATTAC I I I I I I I I I I I I I l l II I I II I 1 1 1 1 1 1 1 III I I I I I I I I I IIII I II I I I I I I I I I l l I ATTTTGTGGACG�TATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTAATATGCATATTAC TTf
180
TGGTGCAGGACCA II 1111111 I II I TGGTGCAGGACCA
10615
10675
10688 193
Exon 1 C034B >lcll61605 Length=194 Sco�e = 350 bits (189 ) , Expect = 4e-99 Identi ties = 189/189 (100% ) , Gaps = 0/189 Strand=Plus/P1us
(0%)
Query
10500
CACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGT
10559
Sbjct
1
CACATTTTCATTATTTTTATTAT�_GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAC AA TTGTGGT
60
Query
10560
AGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATA TC GAATCATTT
10619
Sbjct
61
AGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTT
120
9uery
10620
TGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGT
10679
Sbjct
121
TGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGT
Query
106?0
GCAGGACCA
Sb..jct
IIIII 1 1 1 1 1 1 I I l l I II I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 1 1 I l l I I
I I I I I I I I I I I I I I I I II III III II I I I II III III I I I I I IIllI II I I I II I I I I I I
I I I I I II I II I I I I I I I II II II I I I I I I II I
1111 1 1 1 1 1 181
-
GCAGGACCA
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I II
10688
189
41
180
LAMP'IRAN 4 Hasil analisis BLAST sekuens gen KRAS exon 2 sampel
Exon 2 C017B >lc11 22609
LenqthQ66
Score • 132 bits ( 7 1 ) , Expect � 6e-34 Identicies = 81/86 {94� ) , Gaps • 0/86 (0'<) Sc�and•Plus/MinU3 Query
28632
Sbjct
86
Quer:y
28692
Sbjct
26
CTTTGTGTATC TTG CATAAATAA ATACTAAATC TTTGAAGATATTCACCLTTATAGGTGG I I I I III l lI IIII I1111 II II II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111111111 1 1 1 1 1 1 1 I I CTTTGTGTATTTGCCATAAATAATTTT ATCATTTGA TT G A ATATTCACCATTATAGGAGG GTTTAAATTGAATATAATAAGCTGAC II I I I III II II I I II I I II I I I I I I GTTTAAATTGAATATAATAAGCTGAC
28691 27
26717 1
Exon 2 C030B >lc1165389 Lenqeh=J30 Score • 597 bics ( 3 2 3 ) , Expect Identities = 326/327 ( 9 9 'c ) , C,o.ps Sttand•Plus/Plus Query
28443
Sbjcc
1
Query
28503
Sbjct
60
Qu�ry
26563
Sbjct
120
2e-173 1/327
(0%)
28.502
ATATAACACCTTT1G 11 AAGTAk�GGTGCACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCCCT 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I II I I I I II II I IIII II I I I I I I 1111111I I I I II I I II I ATATAACACCTTTTTTG-AGTAAAA AGGTGC CTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCCCT
59
GT TTCCTACAGGAAGCAAGTA AATTGATGGAGAAAC.C I G I C I C A I I GGATA TI TCICAGG I I I I I I I I I l l 1 1 1 1 1 1 1 I I I l l I 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I I I I I tlll l l l l l I I I I I I I I l l TCTCAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATG TGATG AGAAACCTGTCTCTTGGATATT
28562 119
CTCGACiiCAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGTGCAATGAG GGACCAGTACATGAGGACTGGG I I I I I I I I I I I I I I I I I � I I ! I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I CTCGACACAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGTGCA.ATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGG"
179
GAGGGCTTTCTTTGTGTATTTGCCATAAATAATACTAAATCATTTGAAGATATTCACCAT I I I I I I I II II ! I I I I I II I I I I I I I I II II I I I I I I I I I I I I I I Ill I: I I I I I I I I I I GAGGGCTIICTTTGTGTATTTGCCAT���TAATACTAAATCATTTG�G � ATATTCACCAT
239
Query
28623
Sbjct
180
Ouer:y
26683
Sb:lct
240
GG T GGGTTTA.V11T(; A l_i, TATAATA.\GCTGACATIJ. .t. _GGAGTAATT.ATAG � ':. '. •A"'� TA T . I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1.1 1 1 1 1 1 1 1 I i I I I I I I I I i l l ! T I l l I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I TATAGGTGGGTTTAAA TTGAA TATAA T.UGCTGACATTAAt:TGAGTAATTATAGTTTAT TT
Quety
28743
t': •::�.!:GAGTCTTTGCTAATGCCATGCA
Sbjct
300
-I I I I i I I I I rI 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I I I I TTTTGAGTCTTTGCTAATGCCATGCA T
28622
26682
2 8742 299
23769 326
Exon 2 C030B >lcll459l3 Lenuth=323 Scot� • 597 bits (323), Expect = 2�-173 Identities = 323/323 ( lOO'c ) , Gaps = 0/323 • Sttand•Plus/Plus •
Quety
28443
Sbjcc
l
Quny
28503
Sbjct
61
Query
28563
Sbjct
121
•
Query
28623
Sbjct
181
Quety
28683
Sbjct
241
Quer:y
28743
Sbjct
301
(Oq
ATATAACACCTTTTITG.AAGTAAAAGGTGCACTGTAATAATCCAGiiCTGTGTTTCTCCCT I II I II II I I I I II I II III I II I II 1111III II I I I I I I IIIIII I II I I I I I I i I II ATATAACACCTTT1G 11 AAGTAAAG AGGT CACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCCCT TCTCAGGA TTCCTACAGGAAGCF_!GTAGTAGAGA ATTGATG C AAC T�GATATT I I I I I I I I I I I Ill I I I I II II I I I I 1111 Ill I I I I I I I I I I I I I II II Ill I I I I I I I TCTCAGGATTCCTACAGcAA GCAAGTAGTAATG Tr.ATG AGAAACCTGTCTCTTGGATATT
28502 ·
60 26562 120 28622
CTCGACACAGCAGGTCAAGAGGAG TACAGTGCAATGAGGGACCAGT ACATGAGGACTGGG 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 / 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 / l l l l / 1 1 1 1 CTCGACACAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGGG
130
GAGG�CTTTCTTTGTGTATJIGCCATAAATAATACTAAATCATTTGAAGATATTCACCAT I I III III I III I III I Ii II III Ii II1111 II II I I I I I IIII IIIII I I IlI I I I II GAGGGCTTTCTC TTGTGTATTTG CATAAATAACTAAATCATTTGA AT G A ATATTCACCAT
240
TATAGGTr.GGTTTAG AATT AATATAATk�GCTGACATTAAGT AGG AATTATAGtttt�4C I I I I I I I I I I I ll l l I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I TATAGGTGGGTTTAAATTGAATA TAAT AAGCTGACATTAAGGAGT AATTATAGTTTTIAT t:�:�-tGAGTCTTTGCTAATGCCA I I I II II I I I I I I 1111 I I I I II T11rAGTCTTTGCTAATGCCA rTG
28682
28742 300
28765 323
42