1·587 UMU
}
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Korelasi Mutasi JAK2 V617F dengan Keparahan Klinis pada Pasien Neoplasma Myeloproliferatif yang Memiliki Kromosom Philadelphia Negatif
Penyusun Laporan : 1. dr. Santosa, SpPD 2. dr. Fanti Saktini 3. dr. Puspita Kusuma Dewi
FAKULTAS KEDOKTERAN UNDIP
Jl. Dr. Sutomo No. 18, Semarang 50231
Tip. (024) 8311480/8311523; Fax (024) 8446905 2011
?
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Korelasi Mutasi JAK2 V617F dengan Keparahan Klinis pada Pasien Neoplasma Myeloproliferatif yang Memiliki Kromosom Philadelphia Negatif
r--
-
-----------�
Hmlim Pe�dit:;m d�·! ::'� ;-g�::: hrn:.;·m Kc�ch.!!tan
P- 11.: P 0 eu � _: it \. .. �-
·r . i-t �'t!,.) ! ,;•·\ .... :'
�
,',
-\
l-' \ ;,�...
�-I
s 'i
Tan;rg�d
No. IrHhlc : No. Klass
:
---r:;:�.z: =�ttt11t
Penyusun Laporan :
1. dr. Santosa, SpPD 2. dr. Fanti Saktini
3. dr. Puspita Kusuma Dewi
FAKULTAS KEDOKTERAN UNDIP
Jl. Dr. Sutomo No. 18, Semarang 50231 Tip. (024) 8311480/8311523; Fax (024) 8446905 2011
__ _ _
LEMBAR PENGESAHAN
Pc:nelitian be1judul "Korelasi Mutasi
JAK2 V617F
dengan Keparahan. Klinis pada Pasien
:-teOplasma Myeloproliferatif yang Memiliki Kromosom Philadelphia Negatif' ini, dinyatakan
_
:dab diperbaiki sesuai masukan Tim Panel pada Seminar Hasil RISBIN IPTEKDOK Tahun
2011 pad a tanggal
12-14 Desember 2011.
Mengetahui. Dekan FK UNDIP
ii
SURAT KEPUTUSAN PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan berdasar Pengembangan
Kesehatan
Nomor
Surat Keputusan Kepala Badan Penelitian dan :
HK.03.05/l/393/2011
tentang
Penetapan
Tim
Pelaksana Riset Pembinaan llmu Pengetahuan Kedokteran Tahun2011.
Sumber dana penelitian ini adalah dari DIP A Sekretru.iat Badan Litbangkes Nomor: 0682/024.11.1.01/00/2011 sebesr.u · Rp. 144.916.708,00.
iii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat limpahan. karunia Nya Laporan Akhir Penelitian dengan judul "Korelasi Mutasi
)AK2
V617F dengan
Keparahan K.linis pada Pasien Neoplasma Myeloproliferatif yang Memiliki Kromosom Philadelphia N egatif' ini dapat diselesaikan dengan baik. Penyusunan laporan ini merupakan bagian penting dari rangkaian kegiatan Riset Pembinaan llmu Pengetahuan Kedokteran (RISBlN IPTEKDOK)
Tahun 2011 yang
diselenggarakan oleh Badan
Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Badan Litbangkes) Kementrian Kesehatan RI. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah khazanah pengetahuan dalam ilmu pengetahuan kedokteran, khususnya hematologi-onkologi, mengenai peran mutasi
Jak2
V617F terhadap karakteristik klinis penderita Neoplasma Myeloproliferatif. Selain itu, diharapkan penelitian ini juga dapat memberikan data dasar untuk penggunaan mutasi Jak2 V617F sebagai biomarker diagnosis, dan pada saatnya nanti, sebagai biomarker target terapi spesifik
Jak2 inhibitor yang saat ini tengah dalan1 uji k.linis di lingkup intemasional.
Tim peneliti mengucapkan terima kasih kepada Badan Litbangkes Kemenkes RI selaku penyelenggara RISBIN IPTEKDOK Tahun 2011 yang telah membiayai penelitian ini. Terima kasih juga ditujukan kepada para staf Divisi Hematologi-Onkologi Medilc RSVP Dr. Kariadi Semarang, Dekan Fakultas Kedokteran UNDIP, Direktur beserta staf Laboratorium Center
for Biomedical Research FK Undip Semarang, dan staf laboratorium
Genetika BPPT Serpong yang telah mendukung terlaksananya penelitian ini. Kami menyadari bahwa masih ada kekurangan dan keterbatasan dalam laporan penelitian ini, maka
segala
kritik
dan
saran
akan
penulis terin1a
dengan tangan
terbuka. Akhimya, Semoga Tuhan YME senantiasa meridhai dan memberikan petunjuk •
kepada kita semua dalam setiap langkah kita mengembangkan ilmu pengetahuan yang bermanfaat bagi sesama.
Semarang, 27 Desember 2011,
Tim Peneliti
iv
RINGKASAN EKSEKUTIF
Neoplasma myeloproliferatif terdiri dari Polisitemia Vera. (PV), Trombositemia ·Esensial (TE), Myelofibrosis P1imer (MFP), dan leukemia myeloid kronis
JAK2 V617F
mempakan
mutasi
yang
paling
sering
dijumpai
(LMK).
pada
Mutasi
neoplasma
myeloproliferatif dengan kromosom Philadelphia negatif. Terjadi pada �95% kasus PV, 3
�50% kasus TE dan pada �65% kasus MFP. Mutasi
JAK2 V617F
dihubungkan dengan
resiko trombosis pada pasien PV dan ET pmritus pada PV, splenomegali, dan transfonnasi leukemik pada MFP. Mutasi
inhibitors yang
JAK2 V617F
dapat menjadi target terapi spesifik dari
Jak2
tengah dikembangkan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui korelasi mutasi
JAK2 V617F
dengan
keparahan klinis pada pasien N eoplasma Myeloproliferatif yang memiliki kromomosom Philadelphia negatif. Pengumpulan sampel secara
consecutive sampling
dilakukan di RSUP Dr. Kariadi
Semarang. Data klinis dan parameter hematologi didapatkan dari anamnesis dan rekam medis. Peiheriksaan sitogenetika dilakukan dari sumsum tulang mencari kromosom Philadelphia. Darah diekstraksi menjadi DNA dan dianalisis menggunalcan
Refractory Mutation System polymerase chain reaction (ARMS-PCR)
Amplification
untuk mengetahui
mutasi JAK2 V617F. Mutasi
Jak2 V617F
ditemukan pada 14 (73,68%) sampel kasus, ia dapat menjadi
biomarker diagnostik kasus NMP. Sebaliknya, kontrol non-NMP menunjukkan hasil yang negatif. Meski secara statistik tidak didapatkan hubungan yang bermakna, hasil penelitian ini menunjukkan efek mutasi •
Jak2
V6 1 7F terhadap terjadinya eritrositosis dan trombosis.
Sebaliknya tidak ditemukannya mutasi, menunjukkan efek terhadap terjadinya perdarahan . Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, diperlukan penelitian berikutnya dengan periode penelitian lebih lama atau desain
cohort
untuk
multi-center
untuk memperbesar jumlah sampel, atau
mengetahui perjalanan penyakit terutama transfmmasi ke arah
leukemia, respon terhadap terapi, dan survival.
v
ABSTRAK
Penyakit myeloproliferatif laonis merupakan penyakit sel punca klonal hematopoiesis yang ditandai oleh proliferasi satu atau lebih jenis sel myeloid di sumsum tulang dan meningkatnya jumlah sel-sel matur dan imatur di darah tepi. William Damashek pada tahun 1951 memperkenalkan istilah "neoplasma myeloproliferatif" mengacu pada Polisitemia Vera (PV), Trombositemia Esensial (TE), Myelofibrosis Primer (MFP), dan leukemia myeloid kronis (LMK). Mutasi JAK2 V617F merupakan mutasi yang paling sering dijumpai pada neoplasma myeloproliferatif dengan kromosom Philadelphia negatif. Terjadi pada �95% kasus PV, -50% kasus TE dan pada -65% kasus NlFP. Mutasi JAK2 V617F dihubungkan dengan resiko trombosis pada pasien PV dan ET pl1.llitus pada PV, splenomegali, dan transfonnasi leukemik pad a MFP. Tujuan penelitian adalah mengetahui korelasi mutasi JAK2 V617F dengan keparahan klinis pada pasien · Neoplasma Myeloproliferatif yang memiliki kromomosom Philadelphia negatif. Metode: Pengumpulan sampel secara consecutive sampling di RSUP Dr. Kariadi Semarang. Data klinis dan parameter hematologi didapatkan dari anamnesis dan rekam medis. Pemeriksaan sitogenetika dilakukan dari sumsum tulang mencari kromosom Philadelphia. Darah diekstraksi menjadi DNA dan dianalisis menggunakan Amplification Rejracto1y Mutation System polymerase chain reaction (ARMS-PCR) untuk mengetahui mutasi JAK2 V617F. Hasil: Distribusi diagnosis adalah 5 (26,3%) PV, 11 (57,9%) TE, 1 (5,3%) MFP, dan 2 (105 , %) NMP non spesifik. Selunth19 subyek penelitian negatifkromosom Philadelphia. Empat belas (73,68%) dari 19 kasus positif mutasi JAK2 V617F. Karakteristik subyek penelitian (usia, jenis kelamin, serta rerata hemoglobin, hematolait, leukosit, and trombosit) tidak berbeda secara signifikan antara kelompok positif dan negatif mutasi JAK2 V617F. Kedua kelompok juga hampi.r serupa dari perbedaan derajat hemoglobin, hematolait, leukosit, and trombosit, frekuensi flebotomi, riwayat trombosis, derajat ukuran lien dan hepar, riwayat perdarahan dan frekuensi transfusi PRC. Tidak ditemukan mutasi JAK2 V617F pada 19 subyek non NMP yang dipasangkan menurut jenis kelamin dan usia. Kesimpulan: High frequency of JAK2 V617F mutation were found in MPN patients with negative Philadelphia chromosome. JAK2 V617F mutation was less likely correlated with severity ofMPN patients. Latar Belakang:
.
ARMS-PCR, biomarker, Jak2 V617F, kromosom Philadelphia negatif, myelofibrosis primer, neoplasma myeloproli.feratif, polisitemia vera, trombositemia esensial.
Kata ku.nci:
•
vi
1
DAFTARISI HalanlaJ.l Judul ......................................................................... :. .. . . ..
Halaman.Pengesahan
. . . . . . .
..
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. . .. .. . . . .. .... .... . . . . . . . . . . . .... .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . m
· . ........ . . . . . . . . . . . . . . . . .·. . . . . . . . . . . . . . . .................... . . . . . . . . . . . . ................. . ..........
......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... ......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Daftar Isi
. . . .
..... ..
Daftar Tabel.
. . . . . .
Daftar Ga1nbar
.
...
..... ... .. ............ . . . . . . . . . . .......................................................................
.. .
..
.. . ... .... .. ,..........................................................................................
........ . ...... .. ................... . .. ..... .. ... .... .................. . ...................... ............ .
Dafta1· Lan1piran
. . ....
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... .... ............. ... . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .
LAPORAN PENELITIAN . . . .
A. Pendahuluan
.
.
..
........
.... . .. .. . ...... . . . . . . . . . .... . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . ... .... . ............. ........................... ......... .. .... .. . . . . . ............ .. ...... .
B. Tujuan Penelitian C. Metode
u
.
.. . . ; . .... .... ..... ............... ... .. ............. .... .. . . . . ... . .. ............ ........... .............. ... 1v
Ringkasan Eksekutif Abstrak
.... . . . . . . . . .. . ..... . . . . . . .
.. . . . . . . . . . . . ......... . : ...................................................................
Surat Keputusan Penelitian Kata Penganta1· . .
.
.
.. . ............... ...... .... .......... ........... .... ...... ... ........ ... ........... .... .
.................................. ...................... ..................................................
v v1 vu Vlll IX x
1 1 2
3
D. Hasil da11 Pembahasa11 ......... ......................... ........... ............. ......... ... ...... ....
14
E. Kesimpulan dan Sara11
.... . . . .. . . . . . . . . . .. . . . ...... ... ..... . .. .. . .. . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . .
18
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . . . . . . ..... . ... ......... ... . . . . . . . ..... . .... . ..... . ..
19
........................... ............. .. ........ . ................... ......................... .. .
20
La1npiran ................ ............................. .......... ........... . .................................................
22
. .
Ucapa11 Tet�una Kasih Dafta1· Kepustakaan .
..
. . . . . .
. . . . . . . . . . . .
•
vii
DAFTAR TABEL
1
0
Tabel lo Distribusi diagnosis sampel
2 Tabel20 Karakteristik sampel 0
. .. . ..
.. . . 0 0 0
0
.
. 0 ..
0 0 0 0
0
. .
......o 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . 0 0 0 0 0 . . 0 0 . . 0 0 . . . . . . . . 0 . . . . . . 0
o O O O O O O O O O o o o o o o o o o oooooo o o o o o o o o o O O O O o O O O o o o o O O O O O O o O .
3 0 Tabel 3 0 Basil analisis mutasi Jak2 V617F dengan ARMS-PCR 4
0
Tabel4o Keparahan klinis pada NMP
.
00
.o o O O o O O O O O o o O O o o o o o o o o o
00
O O . . o o o o o o o o o o o o o o o o o oO O o o o o o o o o o o o oo o o o o o o o o o
0 0 00 00 .
...o
..
.
14
00000
15
00 0
16
0 0 0 0 . 0 0 . 0 0 0 .
0
o o o o o ....... o o o o o o o o o o o
17
viii
DAFTAR GAMBAR
'1. Gambar 1. Deteksi mutasi Jak2 V617F menggunakan ARlVIS-PCR .. . ................ ..
9
2 . Gambar 2. Amplifikasi untuk cycle sequencing.........................................................
11
.
..
.
3. Gambar 3. Hasil sequencing menggunakan primer forward.... . . . . . . . . . . . . . ..... . . .. . . . . . . . . . ...
12
4. Gan1bar 4. Hasil sequencing menggunakan primer reverse.......................................
12
•
1
ix
DAFTAR LAMPIRAN
1. Kriteria Diagnosis Neoplasma Myeloproliferatif dari WHO 2008
2. Ethical Clearance
..
.. .. .. ....... .. .. ..... .. .. ... ... .... .. .. ... .. ... .. ... .. .. .... ..... .. .. .. ...................... .. ....
3. Fonnat Catatan Medik Penelitian
........
................................ ......................................
4. Hasil analisis kromosom sumsum tulang ·
5. Sekuens gen Jak2 6. Desain Prin1er
7.
�..................
.........
...................... .....
.
......
.
...
....
..
24 25
..... .. .. .. ... ..... .............. .......... .. .............. ... .
27
. ...................
29
.
....
.
.....................................
............................................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........................... . . . . . . . . . . . . . . . .
Informed consent
22
.. .. .. .. .... ......... ....... ..... ........ ...... .. .. . .. ... . .. .. . . ... .. .. ......... .............. .. .. ....
31 33
"
X
A.
PENDAHULUAN
Penyakit
myeloproliferatif
kronis
merupakan
penyakit
sel
punca
klonal
hematopoiesis yang ditandai oleh proliferasi satu atau lebih jenis sel myeloid di sumsum tulang dan meningkatnya jumlah sel-sel matur dan imatur di darah t�pi.1 William Damashek adalah ilmuwan yang pertama kali pada tahun 1951 memperkenalkan istilah
"neoplasma
myeloproliferatif'
mengacu
pada
Polisitemia
Vera
(PV),
Trombositemia Esensial (TE), Myelofibrosis Primer (MFP), dan leukemia myeloid kronis (LMK). Hal ini dilandasi oleh kesamaan fenotipe klinis dan hipotesisnya bahwa ada suatu kesamaan mekanisme proliferasi di sumsum tulang akibat satu penyebab yang sama, namun
belurn diketahui.2
Diketahuinya hubungan antara kromosom Philadelphia (Ph) dengan LMK pada tahun 1960, mengubah klasifikasi keganasan myeloid. Membedakan Uv1K dengan neoplasma myeloproliferatif lainnya, dan memunculkan istilah "neoplasma myeloproliferatif klasik" untuk neoplasma myeloproliferatif Iainnya dengan kromosom Philadelphia negatif. 3 Kromosom Philadelphia terbentuk dari translokasi resiprokal antara lcromosom 9 dan 22, yaitu t(9;22)(q34;qll). Penemuan berikutnya tahun 1980-1990 fusi gen BCR-ABLI sebagai mutasi yang menyebabkan LMK. Identifikasi kromosom Philadelphia dan fusi gen BCR ABLJ tidak hanya berguna untuk kepentingan diagnostik, namun evoiusinya juga dapat menjadi petunjuk respon terapi pada pasien leukemia dan lirrifoma.4 Pada awal tahun 2005, beberapa grup melaporkan beberapa mutasi bam serta fungsi dan relevansi klinisnya dalam patogenesis neoplasma myeloproliferatif. 5 Mutasi JAK2 V617F merupakan mutasi yang paling sering dijumpai pada neoplasma myeloproliferatif dengan kromosom Philadelphia negatif. Te1jadi pada �95% kasus PV, -50% kasus TE dan pada -65% leasus MFP. Perubahan nukleotida pada ekson 14 basa urutan lee 1849 dari G •
lee T, menyebabkan perubahan asam amino valine menjadi fenilalanine di kodon 617 . Mutasi ini terjadi di domain pseudokinase (lli2) di gen JAK2 yang terletak di lcromosom 9p24 yang berperan penting dalam berbagai proses seluler; seperti proliferasi, fungsi hematopoiesis normal, imunitas, fungsi jantung, dan lain-lain. Domain pseudokinase mempakan suatu regio yang homolog dengan domain tyrosine kinase namun tidak memiliki residu katalitik yang penting. Domain ini seharusnya berfungsi menghambat sinyal JAK2 dengan cara interaksi langsung dengan domain kinase. Akibat adanya mutasi,
1
tidak
terjadi
penghambatan
sinyal sehingga timbul hipersensitifitas
sel-sel myeloid
6 terhadap faktor-faktor pertumbuhan pada penderita neoplasma myeloproliferatif. Tingginya frekuensi
mutasi JAK2
V617F
pada neoplasma myeloproliferatif,
menjadi salal1 satu alasan pada tal1un 2008 V.lHO memasukkaniJ.ya sebagai salah satu kriteria diagnostik mayor dalam klasifikasi keganasan myeloid. Di RSUP dr. Kariadi Semarang pada periode Januari hingga Desember 2009, tercatat
16
pasien PV dan
4
didiagnosis penyakit myeloproliferatif (talc spesifik). Mutasi JAK2
78 ET •
V617F dihubungkan dengan resiko trombosis pada pasien 10 9 pmritus pada PV, splenomegali, dan transformasi leukemik pada MFP Kesamaan
mekanisme
patogenesis pada PV, TE,
MPF
bagaimana
mutasi
JAK2
V617F
dapat
PV dan
mendasari
yang masing-masing memiliki perbedaan manifestasi klinis
dapat menjadi target terapi spesifik baru, seperti halnya kromosom Philadelphia yang menjadi target tyrosine kinase inhibitor, seperti imatinib, dan menunjukkan hasil yang 11
baik. Beberapa obat anti-JAK2 telal1 dikembangkan dan telah menjalani uji klinis fase II.
Ruang lingkup penelitian mencakup genetika molekuler dan hematologi-onkologi. Penelitian ini menggunakan desain kasus-kontrol. Penelitian ini bertempat di RS Dr. Kariadi di Semarang, laboratorium
Center of Biomedical Research (CEBIOR) FK UNDIP,
dan Badan Pengkajian Dan Penerapan Teknologi (BPPT).
B. TUJUAN PENELITIAN
2. Tujuan Riset a. Tujuan unmm : Mengetahui korelasi
mutasi JAK2
V617F
dengan
keparahan klinis pada pas1en
Neoplasma Myeloproliferatif yang memiliki kromomosom Philadelphia negatif. •
b. Tujuan khusus :
1)
Merigkonfirmasi
kromosom
Philadelphia
negatif
pada
pas1en
Neoplasma
Myeloproliferatif. 2) Mengidentifikasi mutasi JAK2
V617F
pada pasien Neoplasma Myeloproliferatif
dan membandingkan dengan kontrol.
3)
Mengetahui perbedaan keparahan klinis pada pasien Neoplasma Myeloproliferatif menurut status mutasi JAK2
l
V617F.
2
3. Manfaat penelitian
a.
Memberikan pemahaman lebih lanjut pada patogenesis Neoplasma Myeloproliferatif khususnya mengenai peran mutasi JAK2 V617F terhadap keparahan klinis .
b.
Memberikan dasar digunakannya muta8i JAK2 V617F sebagai biomarker diagnosis N eoplasma Myeloproliferatif.
c.
Memberikan dasar digunakannya mutasi JAK2 V617F sebagai biomarker target spesifik terapi.
C. METODE 4. Populasi dan Sampel
Populasi studi adalah pasien yang didugalsudah didiagnosis Polisitemia Vera (PV), Trombositemia Esensial (TE), dan Myelofibrosis Primer (menurut kriteria diagnosis WHO 2008)
di RS. Dr. Kariadi Semarang.
Kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah : a. Penderita Polisitemia Vera (PV), Trombositemia Esensial (TE), dan Myelofibrosis Primer yang akan diambil sampel sumsum tulangnya untuk pemeriksaan biopsi sumsum tulang. b. Penderita Polisitemia Vera (PV), Trombositemia Esensial (TE), dan Myelofibrosis Primer dengan hasil penl.eriksaan sitogenetika homosom Philadelphia negatif. c. Bersedia mengikuti penelitian yang dinyatakan da1am surat pemyataan (informed consent).
Kriteria eksklusi dalam penelitian ini adalah a.
:
Gangguan koagulasi
Sampel direkrut secara consecutive sampling. Dari data empiris tahun 2009 di RS Dr. Kariadi Semarang, kasus neoplasma myeloproliferatif diperkirakan 25 orang. Terd:iri dari 25 pasien yang diduga/didiagnosis PV. TE, dan l\1FP (kasus) dan 25 orang sehat (kontrol).
3
5. Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalan1 penelitian ini : a.
lembar rekam medis yang didesain khusus.oleh peneliti,
b.
peralatan untuk pengambilan darah,
c.
incubator dan lanlinar flow untuk kultur homosom,
d.
waterbath untuk ekstraksi DNA,
e.
mesin PCR amplifilcasi gen,
f.
komputer untuk menyimpan dan mengolah data.
Bahan yang digunakan adalah: a. media dan suplemen untuk kultur homosom, b.
primer DNA,
c. enz1m.
6. Prosedur Pengumimlan Data Data pasien yang sudah/diduga didiagnosis dengan PV, TE, IvlFP diambil dari rekam medis, berupa data klinis dan pemeriksaan laboratorium. Klinis yang dilihat adalah : splenomegali (kategori Schuffner), kejadian trombosis baik ru1erial maupun vena, kejadian perdarahan mayor, frekuensi flebotomi. Paran1eter hematologi yang dilihat adalah Hematokrit, Hemoglobin, Leukosit, Trombosit. Pasien yru1g memenuhi kriteria diberikan persetujuan mengikuti
penelitian
kemudian
informed consent
dan surat pernyataan
dilakukan anamnesa
dengan
formulir
catatan medis khusus yang dibuat peneliti.
"
7. Prosedur Pengambilan Sampel a. Pengambilan sumsum tulang
1)
Sumsum tulang diambil melalui biopsi oleh seorang dokter ahli hematologi.
2)
Sebelum biopsi, dicatat identitas pasien dan diagnosis pasien, se11a data lain yang dapat mempengaruhi hasil kultur (apakah pertama kali diagnosis, sudah mendapat terapi, jumlah leukosit).
3)
Sampel yang dirunbil adalah sumsum tulang asp1ras1 tengah (karena lebih banyak mengandung sel-sel dan cenderung menggumpal)
4
4) Masuk.kan dalam tabung yang berisi media transpmt (setiap liter terdiri dari 10% lamtan Hanks Stock yang mengandung Hepes 0,1 M dan heparin tanpa pengawet 10 IU/ml, pH 7,2 di-filter dalam keadaan steril) yang bersuhu ruangan. b. Pengambilan darah 1) Jenis darah yang diambil darah vena 5 cc dengan EDTA untuk pemeriksaan DNA. 2) Pencatatan dan pengisian identitas pada format san1pel dan tabun:g dilakukan satu persatu menjelang pengambilan darah.
8. Pemrosesan Laboratorium a. Pemeriksaan Kromosom
1) Penanaman Langsung (Direct Culture) a) Sumsum tulang dipusingkan, diambil 1-2 tetes buffy coat (tergantung jumlah leukosit), teteskan pada 8 ml media }.farrow Max ™ Bone Marrow Medium (Gibco, cat.no. 12260-014) yang mengandung glutamine dan antibiotik. b) Inkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. c) Tambahkan 2 tetes colchicine (Gibco) pada 1 jam sebelun1 pemanenan.
2) Peminaman Tidak Langsung (Indirect Culture) a) Sumsum tulang dipusingkan, diambil 1-2 tetes buffy coat (tergantung jumlah leukosit), teteskan pada 8 ml media Marrow Max b) Inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. c) Tan1bahkan Ethidium Bromide (Sigma) 400 ul 75 menit sebelum "
pemanenan. d) Tambahkan 2 tetes colchicine pada 45 menit sebelum pemanenan ..
3) Pemanenan a) Teteskan 3 tetes colchicine atau colcemid pada setiap tabung, temskan inkubasi selama 30 menit. Kemudian pusingkan selama 10 menit pada 1000 rpm.
5
b) Buang supematan, resuspensikan endapan (pelet) dan tambahkan larutan hipotonik hangat KCI (Merck) 0,075 M, resuspensi homoge n dan ink:ubasi 37°C dalam waterbath selama 15-30 menit. c) Pusingkan 1.000
1pm selama 10 menit, huang supe.matan dan tambahkan
larutan fiksasi Camoy' s pelan-pelan me lalui dinding tabung, ke mudian kocok. Pemberian latlltan fiksasi diulangi 3 kali sampai sampai didapatkan presipitat yang j emih. d) Suspensikan residu de ngan lam tan Camoy' s secukupnya sesuai de ngan jurnlah pelet. Sebarkan pada gelas obyek dengan me neteskan 2 te te s suspensi pada lokasi yang berbeda. 4 ) Pe ngecatan
G-banding
a) B iarkan slide menjadi tua 3-5 hari. b) Celup slide yang sudah bemmur > 3 hari ke dalam larutan Trypsin 0,1% yang clilarutkan dalan1 larutan
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 6,8, sege ra
cuci 2 kali dengan PB S kemudia cat dengan G iemsa 1 0 % (Merck) dalam
phosphate buffer.
5) A nalisis kromosom a)
Menyiapkan format analisis untuk me ncatat koordinat dan jumlah fase
yang dihitung dan dianalisis. b) A nalisis dengan pengecatan G-banding paling sedikit 6 metafase dan untuk penghitungan 20 metafase. c) Me ncari adanya Philadelphia kromosom.
6) Pelaporan a) Cara melaporkan bentuk kromosom me ngikuti
International System for
Human Cytogenetics Nomenclature (ISCN)
b. Pemeriksaan Mutasi JAK2
V617F
1 ) Ekstraksi DNA a)
Hemolisis eritrosit : Tambahkan 5-10 ml buffer lisis NH4Cl ke dalam sampel darah EDTA dan biarkan se lama 10-30 menit eli suhu kamar. Tabung
6
5 menit pada 3000-3500 rpm. Supematan dibuang dan
dipusingkan selama
NH4Cl lysis buffer dan dipusingkan lagi hingga didapatkan
ditambah
endapan (pelet) putih.
2 ml buffer �trong TE, 30-50 J.Ll
b) Pencemaan protein : Pelet putih ditambah Proteinase K dan
100 J.Ll 10 % Sodium dodecyl sulphate (SDS), kemudian waterbath. Kemudian angkat
kocok. Tabung diinkubasi semalaman dalam dan biarkan dalam suhu ruang selama 30 menit. c) Presipitasi dengan metode volume,
kocok dan
salting out: Tambahkan NaCl 6M sebanyak 1/3
Supematan (yang mengandung tambahkan
4.000 1pm selama 10 menit.
pusingkan selama
DNA) dipindahkru.1 k:edalam tabung baru,
100% ethanol sebanyak 2 kali volume sru.npel. DNA berupa
jru.·ingan putih diru.nbil dan dicuci dengan Kemudian dilarutkan dengan
70 % ethanol, dikeringk:an.
bufef r TE 300-500 J.Ll untuk menyimpan DNA,
inkubasi dalam suhu ruang semalaman.
2)
Pemeriksaan
Kualitatif
dengan
Allele-specific
Polymerase
Chain
Reaction
(Amplification Refractory Mutation System [ARMS}) a)
Tek:nik: ini dilakukan menurut Baxter menggunal<:an satu dimana satu fo rward
et al. 12 Prinsip teknik: ini adalah
common reverse primer dru.1 dua forward primer, primer al<:an terikat secara· spesifik: k:e JAK2 V617F
mutan dan yang lain akan terikat pada tipe liar dari
uJ ung
31
sengaJ a
tidak:
(wild-type). Basa ketiga
dicocokkan
(mismatch)
untuk:
memaksimalk:an spesifitas allele. b) Profil PCR : Denaturasi awal sebanyak: "
5 menit pada suhu 95°C. Kemudian
36 sik:lus reaksi PCR, yang terdiri dari denaturasi 5 detik pada
Denaturasi awal
5 menit pada suhu 94°C, annealing 30 detik pada suhu
58°C, ek:stensi 30 detik pada, suhu 72 °C. Ek:stensi fmal 7 menit pada no c. c) Bahan : pada
DNA sampel ditambahkan 1 J.LffiOl!L dari common reverse
primer dru.1 masing-masing 0,5 J.Lrnol/L fon-vard primer, larutan buffer, MgC12, ciNTPs, enzi.m Taq polymerase .. d)
Reverse primer 5 '-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3'.
e)
Forward primer 5'-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-
7
3'. (spesifik untuk mutan)
f) Forward primer 5'-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG3'. (untuk tipe liar) g) Produk PCR kemudian dilarika : n di gel agarose. yang mengandung ethidium bromide 0,1% dan divisualisasi di bawah sinar UV: band 364 bp akan muncul pada setiap reaksi dan dipakai sebagai kontrol internal, sementara band kedua pada 203 bp mempakan diagnosis adanya mutasi. Dari hasil optimasi kami mendapatkan protokol sebagai berikut : 1. Master mix: Komponen
Konsentrasi
I
dH20 PCRBuffer MgCI2
35.75 ,LLl
25 mM
dNTPs Primer JAK2 Primer
F
JAK2 MF
Primer JAK2 R Taq Polymerase DNA
Volume
j I
5 ).11 3 ).11 1 ).11
10 ,LLM
1 ).11
10 !J.M
1 .. , tl
1 10 11M
1 )ll 0.25 )ll
50-1 00 )lg/ml
2 !ll 50 !ll
Total
2. Kondisi PCR menggunakan Gene Amp® PCR system AB 9700 (Applied Biosystem, Foster City, CA) : Tahap
Temperatur
Waktu
Initial denaturation
95°C
5 menit
Denaturation
94°C
1 menit
Annealing
57°C
45 detik
Extension
72°C
30 detik
Final extension
75°C
5 menit
}
35 siklus
8
Gel electrophoresis:
3.
Bahan gel: 0.50 gram serbuk Agarose dalam 50 m l TBE 1 x, dengan ditambahkan 2 J.Ll Ethidium Bromide.
Loading PCR product : 5 fll PCR Product ditambahkan dengan 2 Ill Orange dye Marker, 4fll l00 bp marker ladder Running: 120 volt, 30 menit
Gambar 1 . Deteksi mutasiJak2 V617F menggunakan ARMS-PCR
3) Konfirmasi mutasi positif dengan Direct Sequencing Sete lah didapatkan sampe l yang positif mutasi
JAK2 V617F, akan dilakukan direct
sequencing untuk mengkonfirmasi substitusi G>T tersebut. Sequencing dilakukan menmut me tode
chain termination atau yang sering disebut sebagai metode Sange r.
a) AMPLIFIKASI PCR CYCLE SEQUENCING •
•
.
Buat campuran berikut ini dalam tabung 0,2 ml
SOLUTION 5X
Sequencing Buffer
Primer (1 ,6 pmol/ pJ)
1
VOLUME SAlVIPEL 3 ,LLl
2 J..ll
Big Dye V.3.1
1 J..ll
Template
1 J..ll
ddH20
3 J..l l
Total Volume
10 Ill
9
• II II II
Campm dengan tapping pelan-pelan Spindown lamtan dengan sentrifugasi Set mesin
thermal cycler sesuai program yang diinginkaq
Jalankan PCR
Program PCR 96°C
: 2 menit
96° C
:10 detik
50°C
: 5 detik
60°C
:4 menit
4° C
:oo
}
25X
b) Purifikasi product PCR Cycle sekuensing • •
Sarripel hasil Tan1bahkan
PCR Cycle sequencing ditambah 10 !ll ddH20 (sampai 20 !l l)
2 !ll lamtan EDTA 125mM, 2 !ll lamtan natrium asetat 3M dan 50 J.!l
etanol absolut II
Sampel diinversi sebanyak (tutup dengan
• • II • ,.
•
aluminiwnfoil)
Sentrifuge dengan kecepatan 5000g selama 20 menit Supematan dibuang, lalu pelet ditambah 70 Ill etanol 70% Sentrifuge dengan kecepatan 3000g selama 10 menit, supematan dibuang
Spindown untuk menghilangkan sisa etanol 70%, kemudian dikeringkan dengan menggunakan
•
4 kali, dan diink:ubasi pada suhu mang selama 15 menit
Elusi dengan
vaccum desicator selama 7 menit 12 J.!l ddH20
Panaskan dengan
heat block digital pada suhu 42 °C selama 5 menit, tapping
perlahan setiap 2 menit • •
Spindown lamtan dengan sentrifuge Sampel siap di-sekuensing
10
c) •
Sekuensing Hidupkan komputer dan mesin
Foster City, CA) sampai lampu • •
AB 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem,
hij au menyala.
Klik RUN DATA COLLECTION (Tunggu sampai semua kotak berwama hijau) Klik PROTOKOL MliliAGER (Klik NEW, lsi nama, Type (reguler), Run Module (Fastseq 50_pop_llstandart50_POPl )Dye(Z-BigDye V.3.1), Klik OK)
•
Klik PLATE MANAGER. (Klik NEW, lsi plate dialog, Klik OK. lsi Plate Record SEQ ANALYSIS PLATE EDITOR).
•
Klik RUN SCHEDULER (Klik FIND ALL, pilih plate name dari daftar, Klik POS lSI PLATE untuk LINK)
'" •
Pada START DIALOG BOX (K.lik tanda panah warana hijau, klik OK) RUNNING (Didapatkan basa nukleotida)
Untuk mengkonfumasi hasil positif mutasi JAK2 V617F menggunakan ARMS-PCR, akan dilal'Ukan
direct sequencing
untuk mengkon:finnasi substitusi G>T tersebut. Kami
memilih lima pasien untuk dilakukan sequencing, namun 1 tidak berhasil diamplifikasi.
Gan1bar 2. Amplifikasi untuk cycle sequencing
"
Primer untuk
sequencing
tidak didesain klmsus, melainkan menggunakan primer
yang sama dengan primer yang digunakan untuk ARMS-PCR. Namun untuk tujuan sequencing ini, hanya dua primer saj a yang digunakan tanpa Sehingga akan didapatkan
amplicon
mutant forward primer.
sebesar 364 bp (Gambar 2).
11
Sekuensing dilakukan dua kali untuk setiap subyek penelitian, menggunakanforward primer (Gambar 3) dan reverse (Gambar 4). Dari
keempat pasang basil sekuensing menggw1akan Forward primer maupun
Reverse, didapatkan pembacaan yang mengkontinnasi adanya mutasi V617F, yaitu
perubahan basa G ke T pada pembacaan menggunakanjorward primer dan perubahan basa C
ke A pada pembacaan menggunakan Reverse primer.
Gambar 3. Hasil sequencing menggunakanforward prime r dari sampel 07/F/11
c·���c·rtfGC1!'tr �·11 C¢C G ·C
1:1 no
u.J
D6
U9- 141 u� us l!t1 :t�4 :5tt
ttJo
u;J l�� l(i� tn l"'!i>
Gambar 4. Hasil sequencing menggunakan reversedprimer dari sampel 07/F/11
•
12
9. Variabel Keparahan Klinis Data keparahan klinis didapatkan dari anamnesis dan pemeriksaan fisik menggunakan Catatan Medik penelitian khusus dan juga disarikan dari Catatan Medik Rumah Sakit. Masing-masing variabel dibagi menjadi tiga derajat dan dibandingkan antara subyek yang mutasi
JAK2
V617F positif dan negatif. Derajat hemoglobin dibagi menjadi :S 15,0 g%,
15,01-18,0 g%, dan > 18 g%. Derajat hematokrit dibagi menjadi :S 45,0 g%, 45,01-55,0 g%, dan > 55,0 g%. Frekuensi flebotomi dikategorikan menjadi: tidak pemah dilakukan,
<
3 3 500 cc, � 500 cc. Derajat leukosit dibagi menjadi :S llx103/mm3, 11-22. 10 /mm , > 22. 3 3 3 3 3 10 /mm . Derajat Trombosit :S 500x10 /mm , 500-1.000 x10 !mm
3 3 >1.000 x10 /mm .
Riwayat trombosis dibedakan menjadi: tidak: ada, trombosis minor
(transient isc{1emic
\
attack,
penurunan visus, atau oklusi arteri perifer), dan trombosis· mayor (stroke, infark
miokardium, angina pektoris, trombosis vena dalam, emboli vena abdominal, atau emboli 3 3 paru). Derajat leukosit terbagi menjadi :S 8,0 x 10 / mm , 8,01-11,0 x 103/ mm3, > 11,01 x 3 10 / mm 3 . Splenoni.egali adalah pembesaran lien berdasarkan garis Schuffner line dan/atau gambaran USG, dilmtegorikan menjadi : tidak: ada, splenomegali minimal, splenomegali besar. Splenomegali minimal didefinisikan sebagai ukuran lien hingga Schuffner II, atau splenomegali dari gambaran USG ultrasound tanpa splenomegal nyata saat pemeriksaan fisilc Splenomegali besar didefmisikan sebagai ·ukuran lien lebih dari Schuffner II.
•
Perdarahan adalah riwayat perdarahan sebelum diagnosis, dikategorikan menjadi : tidak: ada, perdarahan minor, perdarahan mayor. Perdarahan minor terdiri dari : mudah memar, epistak:sis, perdarahan gusi. Perdarahan mayor terdiri dari: hematemesis, hemoptoe dan melena. Anemia adalah penurunan kadar hemoglobin level, dikategorikan menjadi tidak anemia & anemia ringan, anemia sedang, anemia berat. Anemia ringan didefmisikan sebagai hemoglobin di atas 9 g%,
sedang jika hemoglobin 7,0 - 8,9 g%, berat jika
hemoglobin di bawah 8 g%. Transfusi
packed red cell (PRC)
didefinisikan sebagai jumlah
13
kantong PRC yang diberikan kepada pasien selama dirawat ·inap saat diagnosis, data dikategorikan menjadi tidak ada, 1-2 kantong, lebih dari 2 kantong.
10. Analisis
Distribusi diagnosis NMP akan dideskripsikan menmut kriteria diagnosis
WHO
2008. Karakteristik subyek penelitian (usia dan jenis kelamin) dan paran1eter hematologi (Hb, Ht, Leukosit, Trombosit) dideskripsikan setelah diuji nonnalitasnya menggunakan Shapiro-Wille. Hasil analisis mutasi pada subyek dan kontrol non-MNP yang dipasangkan menurut usia dan j enis kelamin akan dideskripsikan. Indikator keparahan klinis akan dianalisis menurut status mutasi menggunakan uji komparasi non-parametrik
tidak
berpasangan
Kolmogorov-Smimov,
nilai
p<0,05
akan
menunjukkan perbedaan signiflkan. Variabel yang menunjukkan perbedaan bermakna, akan dianalisis lebih lanjut menggunakan uji korelasi multivariat regresi logistik. Deskripsi, uji komparasi dan korelasi dilakukan menggunakan software SPSS 15.0 for Windows Evaluation Version. D. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam periode penelitian yang telah direncanakan, penelitian ini berhasil mendapatkan 1 9 orang san1pel yang memenuhi kriteria. Distribusi diagnosis neoplasma myeloproliferatif berdasarkan Konsensus
WHO
2008 dan hasil pemeriksaan sitogenetika
sumsum tulang ditampilkan dalam Tabel 1 . Lima (26,3%) digolongkan sebagai PV, 1 1 (57,9%) ET , 1 (5,3%) MFP, dan 2 (1 0,5%) sebagai unspecified MPD. Terdapat.2 pasien ya.llg menolak diperiksa sitogenetika, namun tetap dirnasukkan dalam analisis karena •
sulitnya mendapatkan sampel kasus NMP. Semua subyek yang sumsumg tulangnya diperiksa, tidak ditemukan kromosom Philadelphia. Tabel 2 menggambarkan karakteristik sampel penelitian. Lebih banyak penderita pria ditemukan pada penelitian kami, baik. pada kelompok mutasi positif (64,3%) maupun
negatif (80%), dengan usia rata-rata 50,68±13.9 tahun. Penelitian Tefferi
et al pada
tahun
2005 juga mendapatkan frekuensi pria lebih tinggi (56%) dengan median usia 55 tahun (rentang, 18-83 tahun) pada sub-populasi PV.
13
14
Pada 14 (73,68%) ·sampel kasus dideteksi memiliki mutasi Jak2 V617F menggunakan metode ARMS-PCR, sementara tidak didapatkan mutasi Jak2 V617F pada subyek kontrol yang dipasangkan menurutjenis kelamin dan usia. Tefferi et a! menemukan 92% subyek dengan mutasi positif. 13 Tabel l. Distribusi diagnosis sampel
No. 1. 2. .) , ,.,
4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.
14. 15. 16. 17. 18. 19.
Kode 02/F/1 0 03/F/ 1 1 05/F/1 1 13/F/11 1 5/F/ 1 1 01/F/10 04/F/ 1 1 06/F/ 1 1 07/F/1 1 09/F/ 1 1 10/F/ 1 1 14/F/1 1 16/F/ 1 1 17/F/ 1 1 1 9/F/1 1 21/F/ 1 1 1 8/F/ 1 1 1 1/F/ 1 1 12/F/1 1
Diagnosis WHO 2008 Polycythemia vera Polycythemia vera Polycythemia vera Polycythemia vera Polycythemia vera Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thro1nbocythernia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Essential Thrombocythemia Primary Myelofibrosis Myeloproliferative disorder, unspesified Myeloproliferative disorder, unspesified
Kromosom Philadelphia Menolak diperiksa Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif
Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Menolak diperiksa Negatif Negatif Negatif
Tabel 2. Karakteristik sampel
•
Jak2 V617F
Jak2 V617F
Positif
Negatif
Total
p
Jenis kelamin
9 (64,3%)
5 (35,7%)
14 (100%)
4 (80%)
1 (20%)
5 (100%)
Umur (tahun)
50,50 (±9,1)
51,2 (±24,7)
50,68 (±13,9)
0,95
(g%)
14,26 (±5,4)
8,72 (±4,6)
12,80(±5,6)
0,06
43,35(±16,3 1 ) .
29,83(±1 5,6) *
40,17(±16,7)
0,16
27,41(±12,8)
23,60 (±19,5)
26,41(±14,3)
0,62
869,07 (±542,1)
1 .213,80 (±291,4)
959,79 (±505,4)
0,20
Pria Wanita Hb
Ht (%) Leu (103/mm3) Tr (1 03/mm3)
0,62
Satu data missing 15
Tabel 3. Hasil analisis mutasi Jak2 V617F dengan ARMS-PCR No.
Usia
Jenis
(tahun)
Kelamin
Kode
Mutasi
Kode
Mutasi
1.
48
Pria
01/F/10
Positif
46/Stock/07
Negatif ·
2.
52
Wariita
02/F/10
Positif
54/Stock/07
Negatif
..., .) ,
43
Pria
03/F/ 1 1
Positif
50/Stock/07
Negatif
4.
51
Pria
04/F/1 1
Positif
1 84/AR/05
Negatif
5.
51
Pria
05/F/1 1
Positif
190/AR/05
Negatif
6.
31
Pria
06/F/1 1
Negatif
633/AR/08
Negatif
7.
69
Pria
07/F/ 1 1
Positif
01/K/F/ 1 1
Negatif
8.
63
Pria
09/F/1 1
Positif
01/DS
Negatif
9.
71
Pria
10/F/ 1 1
Negatif
0 14/GLH
Negatif
10.
81
Pria
1 1/F/1 1
Negatif
0 19/GLH
Negatif
11.
51
Pria
12/F/1 1
Positif
17/SW
Negatif
12.
38
Pria
13/F/11
Positif
24/ABD
Negatif
13.
50
Wanita
14/F/ 1 1
Positif
63/DU
Negatif
14.
49
Pria
15/F/ 1 1
Positif
03/D
Negatif
15.
47
\Vanita
16/F/ 1 1
Positif
05/TJ
Negatif
16.
49
Pria
17/F/ 1 1
Negatif
03/CLH
Negatif
17.
60
Wanita
1 8/F/1 1
Positif
60fMYT
Negatif
18.
24
Wanita
19/F/ 1 1
Negatif
96/TSR
Negatif
19.
35
Wanita
21/F/ 1 1
Positif
59/SRJ
Negatif
Kasus
. Kontrol
Tabel 4 menunjukkan perbandingan klinis menumt status mutasinya. Subyek dengan mutasi positiflebih tinggi frekuensinya yang memiliki Hb > 18 g% (35,7% vs 0%), Ht > 3 55% (23,1% vs 0%), leukosit > 22.000/mm , riwayat trombosis (42,9% vs 0%). Frekuensi yang hampir sama (21,4% vs 20%) didapatkan pada subyek dengan ukuran lien > Schufner
II dan volume flebotomi > 500 cc saat subyek dirawat inap. Sementara. subyek dengan mutasi negatif memiliki frekuensi lebih tinggi pad a subyek dengan hepatomegali > 2 em di bawah arkus kosta, riwayat perdarahan mayor, anemia berat, dan tranfusi PRC. Satu hal 3 menarik adalah, trombosit > l .OOO. OOO/mm lebih banyak ditemukan pada subyek tanpa mutasi walaupun riwayat trombosis lebih banyak pada subyek dengan mutasi.
16
Tabel 4. Keparahan klinis pada NMP
Indikator
Status
mutasi
(g/dl) Hema
tokrit
(%)
Positif Negatif Positif"
Negati(
Flebotomi
rawat inap (cc)
Positif Negatif
Leukosit
(1031tnm3)
Positif Negatif
Riwayat
n (%)
15 7 ( 50 ,0) 4 (80,0) < 45 7 (53,8) 3 (80) Tidak dilakukan
1 1 (78,6) 5 ( 1 00) < II 1(7,1)
0 < 500
Trombosit
(103/mm3)
Sedang
n (%) �
Hemo globin
Ringan
Positif
Negatif
t:rombosis
4(28,6) 0 (0)
Tidak ada
Negatif Spleno
1 1 (78,5) 5 ( 1 00)
Tidak ada
Megali
Hepato
Positif N egatif
5 (35,7)
3 (60,0) Tidakada
Megali Positif Negatif
Riwayat perdarah an
Positif Negatif
Anemia (g/dl) Positif Transfusi
15-18
Negatif
PRC Positif Negatif
7 (50,0)
4 (80) Tidak ada 8 (57,1)
2 (40,0)
(%)
> 18
0,73
3 (23,1) 0 (0)
13 (100) 4 (100)
0,99
0 (0) 0 (0) 11-22 4(28,6) 4 (80) 500-1.000 6 (42,8) 1 (20)
3 (21 ,4) 0 (0)
14 (100) 5 ( 1 00)
0,99
Trombosis
Trombosis
45-55
3 (23,1) 1(20) < 500
5 (35,7) 0 (0,0) >55
� 500
> 22 9 (64, 3) 1 (20) >1.000
4(28,6) 4 (80) ma l!..or
0 (0) 0(0)
3 (21,5) 0 (0)
Schuffner I-
Schuffner
II
6 (42,8) 1 (20, 0) � 2 cm
> II 3 (21 4) 1 (20,0) >2 cm
BACt
BACt
5 (35,7)
0 (0) Minor 2 (14,3) 1 (20,0)
,
2 (14,3)
1 (20) Ma)!_or 4 (28,6) 2 (40,0)
Normal /Ringan
Sedang
Berat
1 1 (78,6) 2 (40)
2 (14,3) 0 (0) 9 kantung
(7,1) 3 (21,4)
Tidak ada
12 (85,6) 2 (40)
p
1 4 (100) 5 (100)
2 (14,3) 1 (20,0)
minor Positif
Total
Berat 11
1 (7,1) 1 (20)
1
•
14 ( 1 00) 5 (100) 14 (100) 5 ( 1 00)
0,46
0,28
14 (100) 5 (100)
0,50
1 4 ( 1 00) 5 (100)
0,98
14 (100) 5 (100)
0,89
14 (100)
1,00
( 100)
0,26
1 4 (100) 5 (100)
0,42
5 (100)
14
5 ( 100)
>2 kantuncr
1 (7, I ) 2 (40)
•
Satu data missing
17
E. KESIMPULAN DAN SARAN
Mutasi Jak2 V617F dapat menjadi biomarker diagnostik kasus NMP. Meski seca.ra statistik tidak didapatkan bubungan yang bennal
Jak2
V617F terbadap eritrositosis dan trombosis. Sebaliknya
tidak ditemukmmya mutasi, menunjukkan efek terbadap perdarahan. Untuk mendapatkan basil yang lebih baik, diperlukan penelitian berikutnya dengan periode penelitian lebih lama atau desain
multi-center untuk mempe.rbesar jumlal1 sampel, atau
cohort untuk mengetalmi perjalanan penyakit terutama transformasi ke arah
leukemia, respon terhadap te.rapi, dan
survival.
18
UCAPAN TERilVIA KASIH Tim peneliti mengucapkan terima kasih kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kemenkes RI yang telah membiayai penelitian ini. Peneliti juga mengucapkan terima kasih kepada dokter dan staf di Divisi Hematologi-Onkologi Medik RSUP Dr. KaTiadi Semarang, Dekan Fakultas Kedokteran UNDIP, Direktur dan staf Laboratorium Center for Biomedical Research FK Undip Semarang, serta staf laboratorium Genetilca BPPT Serpong .
..
19
DAFTAR KEPUSTAKAAN
1.
Levine RL, Gilliland DG. Myeloproliferative disorder. Blood. 2008; 1 12: 2 1 90-2198
2.
Tefferi A. Molecular drug targets in myeloproliferative neoplasms: mutant ABL1, JAK2,
MPL, KIT, PDGFRA, PDGFRB and FGFR1. J Cell Mol IVfed. 2009
Feb; l3(2):215-37. 3.
Epub 2008 Oct 23.
Varuiucchi AM, Guglielmelli P, Tefferi A. Advances in Understanding and Management of Myeloproliferative Neoplasms. Cancer J Clin 2009; 5 9 : 1 7 1 - 1 9 1 . doi: 10.3322/caac.20009
4.
Hemandez JM, Granada I, Solt� F, et al. From conventional cytogenetics to microarrays. Fifty years ofPhiladelphia chromosome. Med Clin (Bare). 2010 Jun 28. [Epub ahead of print]
5.
Tefferi A. Novel mutations and their functional and clinical relevance in myeloproliferative neoplasms : JAK2, MPL, TET2, ASXLl, CBL, IDH and IKZF l . Leukemia. 2010; 24: 1 1 28-1 138
6.
Jones AV, et al. Widespread occurrence ofthe JAK2(V617F) mutation in the chronic myeloproliferative disorders. Blood. 2005 Sep 1 5 ; 1 06(6) :2162-8.
7.
Ziakas PD. Effect ofJAK2 V617F on thrombotic risk in patients with essential tlu·ombocythemia: measuring the uncertain. Haematologica. 2008; 93(9) : 1 4 1 2-4.
8.
Carobbio A, Finazzi GnRH, Guerini V, et al. Leukocytosis is a risk factor for thrombosis in essential thrombocythemia: interaction witl1 treatment, standard risk factor, and Jak2 mutation status. Blood. 2007; 109:2310-3.
9.
Pieri L, Bogani C, Guglielmelli,et al. The JAK2V617F mutation induces constitutive activation and agonist hypersensitivity in basophils from patients with polycytemia vera. Haematologica. 2009:94( 1 1 ) : 1537-45.
10. Barosi G, Bergamaschi G, Marchetti M, et al. JAK2V617F mutational status predicts progression to large splenomegali and leukemic transfmmation in primary myelofibrosis. Blood. 2007; 1 1 0:4030-6 11.
Verstovsek Srdan. Therapeutic potential ofJAK2 inhibitors. Hematology Am Soc 2009: 636-42
12.
Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Acquired mutations of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorder.
Lancet 2005; 365: 1054-6 1 .
20
1 3 . Tefferi A, Lasho TL, Schwager SM, et al. The clinical phenotype of wild-type, heterozygous and homozygous Jak2 V617F in polycythemia vera. Cancer 2005; 106 (30):631-5.
,.
21
LAMPIRAN l
2008 WHO Diagnostic Criteriafor "Classic" MPN Criteria
Polycythemia Vera
frimary Myelofibrosis
Essential Thrombocythemia
Major
1. Hgb > 18.5 g/dL (men)
1. Sustained
criteria
or
count -:::. 450
>16.5
g/dL
(women) Q!:. Hgb or Hct showing >
991h percentile
or
residence
altitude Q!:. Hgb
109/L 2. BM proliferation and atypia*
proliferation
accompanied
by
either
the reticulin and/or collagen
of
lineage fibrosis Q!:. In the absence
megakaJyocytic
of with increased numbers of of reticulin fibrosis, the > 1 7 enlarged,
g/dL (men) or > 15 g/dL (women)
x
of mainly
reference range for age, sex,
platelet 1. Megakaryocyte
megakaJyocytes.
if associated significant
with a documented and left-shift
changes
mature megakaJyocyte No
increase of
or
must be accompanied by increased
marrow
neutrophil cellularity,
sustained increase of?:.2 granulopoiesis
granulocytic
or proliferation
and
often
g/dL from baseline that erythropoiesis 3. Not
decreased erythropoiesis
cannot be attributed to
(i.e., pre-fibrotic cellular-
meeting the WHO criteria
correction
of
deficiency
QI. elevated MDS or other myeloid
meet WHO criteria for
neoplasm 4. Demonstratio
CML, PV, MDS, or other
red
cell
above
mass
mean
iron for PV, PMF, CML, or phase disease) 2.Does not
> 25% normal
n ofJAK2V617F or other myeloid
predicted
clonal
value 2. Presence
evidence
ofJAK2V617F or similar
thrombocytosis
mutation
marker of
!l.!. no
neoplasm 3. Demonstratio
reactive
n ofJAK2V617F or other clonal evidence
marker of
Q! no
reactive
marrowfibrosis
22
Minor
1. BM
criteria
hypercellularlity for age and
showing
trilineage
1. Leukoe1ythroblastosis
-
growth
(panmyelosis)
2. Subnormal serum Epo
2. Increased serum LDH
level 3. EEC growth
3. Anemia 4. Palpable splenomegaly
Diagno
Both major criteria + 1
stic
minor criterion
com.bin
major
ations
minor criteria
criterion
A l/ 4 criteria must be met
minor criteria
Q!.first
+
All 3 major criteria + 2
2
WHO indicates World Health Organization; MPN, myeloproliferative neoplasm; CML, BCR ABLJ chronic myelogenous leukemia;
PV, polycythemia ·vera; PMF, primary myelofibrosis;
MDS, myelodysplastic syndrome; BM, bone marrow biopsy specim.en,· Epo, erythropoietin; EEC,
endogenous e1ythroid colonies; LDH,
lactate dehydrogenase.
*Small to large
megakaryocytes with an aberrant nuclear/cytoplasmic ratio and hyperchromatic, bulbous, or irregu
lar lyfolded nuclei and dense clustering.
..
23
LAMPIRAN 2 Ethical Clearance
24
LAMPIRAN 3 Format CM Penelitian
CATATAN MEDIK PENELITIAN Y617F - 2011
Kunjungan I
.
I.IDENTITAS PENDERITA
Tgl.
NO.CM RSDK KELAMIN I.AKI O PEREMPUAN HPfTLP PEKERJAAN PENDIDIKAN sSMP 0SMA O !:! S1
NO.CMP NAMA UMUR Al.AMAT
0 0
II. ANAMNESIS
RIWAYAT PENYAKIT SEKARANG
I
KELUHAN UTAMA
I
GEJALA (Centang 'Ibila geja/a ditemui) (Mengarah PV)
M udah Lelah Lemah
Sutit konsentrasi
Mudah lupa
Mudah mengantuk
Sakit kepala
Pusing berutar
(Mengarah ET)
D D D D D
Mimisan
Gusi berdarah
0
0
Kulit kem erahan Gatal Rasa penuh perut kiri Lain-lain
D
0
Berak darah
0 0
Perda rah a n lain
0
Sakit kepala
..
·-·
0
0
0
Mudah Ielah D Nyeri di bawah rusuk I{] Rasa penuh di kiri 0 Mudah kenyang 0 Nafas pendek-pendekO Demam 0
Perdarahan abnormal 0 Mudah memar 0 Berat badan turun 0 Keringat malam hari 0 Lain-lain 0
0
Pusing berputar 0 Mudah memar 0 Sering berkeringatO
0
0
Meriang
Lain-lain
I
0
KOMPLIKASI (Centang ...J bila ada komplikasi, sebutkan waktunya)
'
Stroke ·
n
lnfark miokard akut Trombosis lain
Deep vein thrombosis n
RIWAYAT PENGOBATAN
Nama Obat
Mulai
·
Smp Dosis
Ada OTidak 0 Hubungar Orangtua
RIWAYAT PENYAKIT KELUARGA
Nama •
-
Menstruasi banyal{]
Telingan mendenging D Sesak nafas
(Mengarah PMF)
hebat 0 Jendalan darah 0 Batuk darah 0 Perdarahan
Ill. PEMERiKSAAN FISIK
TO
Nadi
HR RR
1
mmHg
Tgl
x/mnt c
PEMERIKSAAN FISIK ABNORMA (Cen/ang --I yang sesuai)
0 Mukosa bibir merah geiO Pelebaran kapiler kulit
Mala merah Sianotik
O
0 0
{Centang ...J yang sesuai)
O Anak
0 Lainnya 0
Kg
TB
em
IMT
Kg/M2
BSA
x/mnt
Konjungtiva pucat
Efek Samping
BB
x/mnt
Kulit wajah kemerahan O
Efek
0 ]
Ekimosis Urtikaria
)_ain-lain
Hepatomegali Splenomegali
Lain-lain
m2
0 0
0 0 0
Ukuran
Schuffner 1
25
IV. LAB HEMATOLOGI Ht
gr"lo %
MCV
fl
Hb Eritrosit MCH
MCHC
Leul
Eosinetil
%
Jtlmm3
Stab
%
pg g/dl
Limfosit
Jt/mm3
Trombosit
Jtlmm3
Basofil
Tgl
Ureum
%
Cratinin
Segmen
%
GDS
Monosit
%
LDL
%
mg/dl
mg/dl
Kolest.Total
g/dl
HDL
·
Trigliserida
V. DIAGNOSIS (Anamnesis, Fisik, Hematologi) Polychytemia vera
n
Essential thrombochytemia
Myeloproliverative DiSOrder lain IV.TERAPI (Nama Phlebotomy
O
Penyakit lain
obatltindakan, dosis)
D D
Primary myelofibrosis
0
(Catalan perkembangan klinis)
..
2
26 .....
LAMPIRAN 4 Hasil analisis kromosom sumsum tulang
LABORATORIUM SITOGENETIKA : A- T J.I• •
Nama
Umur
No. LAB I No. RM
: 38/05/11 · I 21231918 : Dr.SANTOSO,SpPD .
:
38 TAHUN
Dokter Pengirim
:
PALA BARAT RAYA MEJASEM BARAT
Diagnosis Penoiriman : MPD,E.T
Alamat
I I._:�'·
I I.;
. ;. •' �
.
•
6
fl I 0 8 14
II 19
UJ a
. ·
10
9
11
16
" :: ·�-
a
.
. ,. 21
a 22
,
. .
.' ,"'.
:
.
.
1'?
'.
.
.
5
12
X
:ringan Yang Diperiksa
: Sumsum tulang
..mlah Kromosom Setiap SeJ ·
: 46
.1nlah Sel Yang Dlanalisis
:
.mlah Se! Yang Dihitung
: 20
:OOtip
: 46,XY
'
18 .
y
·.
..
".
II I
a
.
· . '· ..
.
.
.
.' r � .. · . .
'
.
.
'
..
213 .
.
•I
15
·
;' · i• . . : '
4
a
.
. .
'
.:
8
7
13
•
.·
3
2
1
-:
.
<:
.
.
8
3impulan
Pada metafase yang dihitung dan dianalisis tidak menunjukkan kelainan struktur dan jumlah kromosom.
27
.
lABORATORlUM SITOGENET!KA 'lama
: S$ E 3
No. LAB / No. RM
�mur
:
Dokter Pengirim
0
62 TAHUN
Jamat : DE5A BADAK DEUK RT 1/ RW 4 PEMALANG
2
1
6
8
:
Dr.SANTOSO,SpPD
Diagnosis Pengiriman : MPD
\0
3
7
: 52/08/1 1 0/ 0021240256
4
9
;
18 .
11
12
16
17
18
22
X
y
,
It
�0,
� I
JJ
19
15
14
13
21
za
7lgan Yang Diperiksa
·
�
0
lah Kromosom Setiap Sel
"'.lah Sel Yang Dianalisis
..
: Sumsum tulang : 46
:
8
:.ah Sel Yang Dihitung
: 20
'JXip
: 46,XX
o'llpulari
Pada metafase yang di�itung dan dianalisis tidak menunjukkan kelainan struktur dan jumlah
kromosom.
28
LAMPIRAN 5 Sekuens Jak2
e/Ensembl JAK2-001 (ENST00000381652)
Transcript: De:;;cription
Janus kinase 2 [Sou rce:HGNC Symboi;Acc:61 g21
Chromosorne.9: 4,985.245-5.128.183 forward strand.
Location
This transcript is a product of gene ENSG00000096968 - There are 4 transcripts in this 9ene
Gene
_ _ _ _ _ _ � _ S_ �howlhide col u mns
,
· - ---· - ----- - ---
Transcript 10
Name
5285
JAK2-002 ENST00000476574
----·--·
-·-
1 1 32
No protein product
773
--- --� -
_ _
_ _ 1 t e r. L
Length (aa)
No protein product
367
JAK2-004 ENST00000487310
-
ENSPQQQ_Q.Q3_7.1.Q91
327
JAK2·003 ENST00000472549
..
Protein 10
Length {bp)
JAKZ-001 ENS_TOOOQQ38 1652
. .
- .
Biotype P.rs-t�i�-��2!r
.� rgg��.��Sl.!!:?1.1�
r_ C.�p� �-��9..!!:?.1!_! Processed Iran�
No protein product
..,,u,•--·---•"•"•�•--·-··-
.'ranscript and Gene level displays
Views in Ensembl are �eparated into gene based views and transcript based views according to which level tr.e information is more appropriately associated with. This view is a transcript level view. To flip between !he tv.•o sets of · · views you can click on the Gene and Transcript tabs in the menu bar at the top of the page.
eDNA sequence Key
Codons
{ Aitematino codons
[ Ait•matino
Exons
@ ematincexons
lAi t ematinQ exons
y
1 CTGCAGGAAGGAGAGAGG.�GAGGAGCAGAAGGGGGCAGCAGCGGACGCCGCT;\ACGGCC . . . . . . . .
.
.
. . . . . .
.
. . .
. .
.
.
.
.
.
.
. . . .
.
.
.
. .
.
· · · · · .
. . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. . .
.
.
.
.
.
.
.
' . . . .
.
· -
.
.
.
. . .
.
.
.
.
.
. .
.
.
.
· -
.
.
.
.
.
.
. . . . . .
6 1 TCCCTCGGCGCTGACAGGCTGGGCCGGCGCCCGGCTCGCTTGGGTGTTCGCGTCGCCACT . .
· -
.
.
.
.
.
.
-
.
.
.
. . . . .
· - . . . . . . . . . . . . .
.
-
.
.
.
.
.
-
. . . . . . . . . .
y
C
.
.
.
.
.
.
-
. . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. . . . . . ' . . . .
. -. .
.
.
- · -
-
.
.
.
.
.
.
.
.
. . . . . .
.
.
. .
' . . .
121 TCGGCTTCTCGGCCGGTCGGGCC CTCGGCCCGGGCTTGCGGCGCGCGTCGGGGCTGAGG . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . .
· · .
..
.
. . . . . . . . . . . . .
.
. . . . .
· · · · . .
.
.
.
.
.
.
.
. . - . . � . . . . . . . . . . . . .
· · · · · · · · ·
.....�...
. . · · · -
- - . .
.
.
191 GCTGCTGCGGCGC.'\GGGAGAGGCCTGGTCCTCGCTGCCGAGGGATGTGAGTGGGAGCTGA . . . . . . . . . .
.
.
.
.
. .
. . . . . .
.
.
. .
. . . . . . . . . ' . . . . . . ' . . . . . . . .
..
. . . . .
...
.
.
.
.
. . . .
. . . . .
.
.
. . .
. . . .
.
.
. . . . .
.
.
.
.
. . .
. . . . . . . . .
?
..
.
- .
. . . .
.
. . . .
'!
241 GCCCACACTGGAGGGCCCCCGAGGGCCCAGCCTGGAGGTCGTTCAGA CCGTGCCCGTCC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
hrtr..tl�oio """Pmhl nron-lmnr> ��ni�r <:!Ti-,m�crint/Seauence cDNA?dlrcore:.C!.�t 3 NSG00000096968;r. .. .
29
07/04/201
cmbl release 61
- Feb 2011
© WfSI / EBI
\.·.J\.\ 1 9 8 1 ('-;'J\!V\'i':.;<·T,jT,-'t_·l·;:: ·ct'\r\l\ ;t '\ ·;i . ·_:_!._ l .·\:\:·-.:: t . . . .A.C( ;p...A' 1'� :; 1 r: 8 '7 �-:-·I'N\A'{'t,.;,;,:··I·G·l·C(,�C(."l�/\;\/\t)t 'L".:\JL,f-\l\�;-,.:1·1'\ ; .i\f-..'!'C:f\l•./\.� ·, ··:··:·� ''l 'f1.�. ;·! ··.:·t·' I'C f\!.;f.•
4 96
.! .
- -K
· C · · \:
·
•
! ' - - l' ··
·
r:
l' · - Y. · · IJ •
-
Y. ·
·
�;
N
I.
! . - - V ··
·
F · - l< · - T - ,. !< .
helpdesk@en::;_embl
-
2 0 4 1 (j' l'GT' l"l'l"l\;{\'J'l)T/ICC/\1-Il.'C"l'l'ACCiV'-CfiT'I'/\CAGf\( ;(;'•.'C"l'f'-.!."i'(.'J\T/\'!'Ij/\ 1 \l'C.'l,J\ATGG 1 54 7 GTGTTTC"1'GATGTACCAACCTCACCl>..li.C/\1"J'ACAGAGG('lTACTCATATGAACCAAATGG
51 6 G · · V · - S · · U · - V - - P - - T - - 5 - - P - · T · · L· - Q - - R - - P - - T - · H · · M- · N - -Q- - M - -
2 l 0 l TG'l" 1"l'C /\Civ\..A.ATCAGMATrJAJ.IGA'l"l" l'C /\'J ·1\T'J" l'AATGAAAGCCTTCGCC.A.AGGCAC:J'T 1 6 0 7 TGTTTCP..CA.r..A."-.TCAGAAATGAAGATTTGA'l'A1'TTAA1'G Al\AGCC'l'TGGCCAAGGCACT1'
53 6 V - - F - - H - - K - ·- 1 - - R - - N - - E - - D - - L - - I - - F - - N - - E - - S - - L- - G - - Q - - G - - T - *
2 1 6 1 1'TACAAAGATTI'TTAAAGGCGTACGAAGAGAAGTAGGAGACTACGGTCAJI.CTGCATGAAA
1 6 6 7 17ACAAAGATTTTTAAAGGCGTACGP.AGAGAAGTAGGAGACTACGGTCAACTGCATGAAA 5 5 6 F - - T - - K - - I - �F � - X - - G - -V - - R - - R - - E - - V - - G - - 0 - - Y - - G - - Q - - L - - H - - E - R
W
2 2 2 1 CAGAAGTTCTTTTAAAAGTTCTGGATAAAGCACACAGA��CTATTCAGAGTCTTTCTTTG 17_27 CAGAAGTTCTTTTAAAAGTTCTGGATAAAGCACACAGA?ACTATTCAGAGTCTTTCTTTG 5 7 6 T - =E� -V - - L - -L- - K - - V - - L - =D � - K - - A - - H - - R - -N- - Y - - 5 - - E- - S - - F- - F - -
2 2 8 1 AAGCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTAT 1 7 8 7 AAGCAGC��GTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTAT 5 9 6 E - -A - - A - - 5 - - M - - M - - S - - K - - L - - S - - H - - K - - H - - L - - V - - L - -N - - Y - - G - - V - K
2 3 4 1 GTGTCTGTGGAGACGAG.�.TATTCTGGTTCAGGJ:I.GTTTGTP.-�1\.TTTGGATCACTAGATA
1 8 4 7 G'TGTCTGTGGAGACGAGAATATTCTGGTTCAGGJl.G;rTTGTJ:I..Al>. A.. TTTGGATCACTAGATA 6 1 6 C: = V= - C - - 9 � - D - - E- - N - - I - - L- -V- - Q - - E - - F - -V - - K - - F - - G - - S - - L --D - y
2 4 0 1 CATATCTGf\p.All.AGAATAA..:.T .AJ>.. TGTATAAATATATT.�TGGAAACTTGAAGTTGCTAAAC 1 9 0 7 CATATCTGAAAAAGAATAAAAATTGTATAAATATATTATGGPAACTTGAAGTTGCTAAAC 6 3 6 T - - Y - - L- - K - -K - -N - -K - -N - - C - - 1 - - N - - I - - L- -W- - K - - L- - E- -V - - A - -K- -
2 4 6 1 AGTTGGCATGGGCCATGCATTTTCTAGAAGAAAACACCCTTATTCATGGGAATGTATGTG 1 9 67 AGTTGGCATGGGCCATGCATTTTCTAGP.AGAAAACACCCTTATTCATGGGAATGTATGTG 6 5 6 Q - - L - - A - -W - - A- -M - - H - - F - - L - - E - - E - - N - - T - - L - - 1 - - H - - G - -N - � V - - C - -
AAT TTCTGCTTATCAGAGP.AGAAGACAGGP..AGACAGGAAATCCTCCTTTCATCA 2 5 2 1 CCAAAA
2 0 2 7 CCAAAAATATTCTGCTTATCAGAGJ:I.AGAAGACAGGAAGAC.�GGAAATCCTCCTTTCATCA"·1 6 7 6 A - - K - - N - - I - - L - - L- - I - - R - - E - - E - - D - - R - - K - - T- - G - - N - - P - - P - - F - - 1 - -
,.
GAC TTCTTCAGGAGAGAA 2 5 8 1 AACTTAGTGATCCTGGCATTAGTATTACAGTTTTGCCPAAGA
T CCAAAGGACATTCTTCAGGAGAGAA 2 0 8 7 AACTTAGTGATCCTGGCATTAGTATTACAGTTTG
696" K - - L - - S - -D- - P - -G - - I - - S - - 1 - -T - -V - - L - - P - - K - - D - - I - -L - - Q - - E - - R - K
2 6 4 1 TACCATGGGTACCACCTGAATGCATTGAAAATCCTAAAAATTTAP.ATTTGGCAACAGACA
2147 TACCATGGGTACCACCTGAATGCATTGAAAATCCT�n.ATTTAAATTTGGCAACAGAtA 7 1 6 I - - P - - W - - V - - P - - P - -E - - C - - 1 - - E - -N - - P - - K - - N - - L - -N-=L�-A - -T - - D - -
2 7 0 1 AATGGAGTTTTGGTACCACTTTGTGGGAAATCTGCAGTGGAGGAGATAAACCTCTAAGTG
2 2 0 7 AATGGAGTTTTGGTACCACTTTGTGGGAAATCTGCAGTGGAGGAGATAP.ACCTCTAAGTG 7 3 6 K- -W- -S- - F - - G - - T - � T - - L - - W- - E - - 1 - - C - - S - - G - - G - - D - - K - - P - -L-- S - -
2 7 6 1 CTCTGGATTCTCAAAGAAAGCTACAATT T TATGAAGATAGGCATCAGCTTCCTGCACCAA
2267 CTCTGGATTCTCAAAGAAAGCTACkl\.TTTTATGAAGATAGGCATCAGCTTCCTGCACCAA 7 5 6 A - - L - - D - - 5 - -Q - - R - - K - - L - - Q - - F - - Y - - E - - D - - R - - H - - Q - - L - - P - -A - - P - -
3.0.
LAMPIRAN 6 Desain Primer
LOCUS
NT_008413
ACCESSION
NT 008413 REG ION: 5 0 1 1 9 8 8 .. 5 1 1679 1 GPS_000125272
VERSION
NT_0084 1 3 . 1 8 81:224514694
DBLINK
Project: 1 6 8
Gene
< 1 . . > 1 04804
104804 bp
DNA
linear
CON 28-0CT-2010 DEFI NITI ON · Homo sapiens chro mosome 9 geno mic contig, GRC h37.p2 reference primary assembly.
/gene::::"JAK2" /note="Derived by automated com putational analysis using gene predi ction method: BestRefseq." MRNA
join(< 1 . . 226, 7796.. 7919 ,224 16 .. 2253 42896..43053,44.691 ..44802,4
3,28699.. 28844,32576.. 32897,336
82.. 3380 1,
7035 ..47221,47938..48065,50505 .. 50639 , 5 1 7 1 1 ..5179 8,
55466.. 5559 3,563 19 .. 56457,582
42. '58393,58546 . .58696,59738 ..$98_74,67687..6787 6,
68459.. 68583,68752. .68924, 1 0 1 0 1 7.. 1 0 1 1 34,1 04346.. 1 04459, 1046
/g ene:"JAK2"
97. .>1 04804)
/pro·d uct:"Janus kinase 2"
JAK2_F (51593 - 51622)
51541 gttgatggca gttgcaggtc f}- �_g catataaagg gaccaaagca cattgtatcc t d, cta ta 515 41 caac·caccgt caacgtccag gtatatttcc ctggtttcgt gtaacatagg agtagatatc . 5 1 6 0 1 ltca tgc tgaa agtag gaga a aqjtgcatctt tattatggca gagagaattt tctgaactat 516 01 agt acg act t tcatcct'ctt tcacgtagaa ataataccgt ctctcttaaa agacttgata ....i
aE
\ .�
.
5 1 6 6 1 ttatggacaa cagtcaaaca acaatt:cttt gtactttttt ttttccttag tctttctttg 5 1 6 6 1 aatacctgtt gtcagtttgt tgttaagaaa catgaaaaaa aaaaggaatc agaaagaaac
5 1 7 2 1 aagcagcaag tatgatgagc aagctttctc 517 2 1 ttcgtcgttc atactactcg ttcgaaagag
ttttaaat tat ccaaaattta atacctcata
��1 51781 w. 1 ctgtgg agacgagagt
,.
aagtaaaact acaggctttc taatgccttt ctcagagcat 51781 cac·agacacc tctgctctca ttcattttga tgtccgaaag attacggaaa gagtctcgta
5 1 8 4 1 ctgtttttgt ttatatagaa aattcagttt caggatcaca gctaggtgtc agtgtaaact 51841 gacaaaaaca. aatatatctt t � a agtcaaa gtcctagtgt cgatccacag tcacatttga · 5 1 9 0 1 ata att taa c aggagttaag tatttttgaa actgaaaaca ctgtaggact attcagttat 51901 tattaaattg tcctcaattc ataaa ctt tgac tttt gt gaca tcct ga taagtc ta
�
I
�
JAK2 R 15 1956 - 51927) 5 1 9 6 1 atc ttg tga a aaaggaaagc aatgaagtta aaagtagaag gtta caat gc ccaaacaata 5 1 9 6 1 tag aac act t
I
tttcctttcg ttacttcaat tttcatcttc caatgttacg ggtttgttat
-- ·
/
31
J . \ K� \' (> 1 7 1: rmrl�rt ion i 11 I'll L·hn >Jlh>S\llllL' r1<..·g�1ti \.,. { i ) r Fanti Saktini)
\ 1yl'IPpro!i 1\.:rati \'L' rlt.:\lplasms ( \ 11 '\:s) pat it.: nts
JAK2_for: 5 ' A H ..'Ti\TACITC.,\ H ICTCI!\i\/\CIT/\(i(i!\CI/\A/\Ci 3 '
r!"!l�T
008_�..2.3.:.181 Homo sapiens chromosome 9 genomic contig, GRCh37 p2 reference primary
assembly Length=39964 796
Features in this
part of subject sequence: tyrosine-pr
Score = 60.0 bits (30), Expect = 6e-08 Identities = 30/30 (100%), Gaps = 0/30 (0%) Strand=Pius/Pius Query
1
ATCTATAGTCATGCTGAftAGTAGGAG��G
30
Sb j c t
5063580
ATCTATAGTCATGCTGAftAGTAGGAGAAAG
5053609
111111111111111111111111IIIIII
Used NT 0084 1 3 Length=1 04804 to blast: Score = 60.0 bits (30), Expect = 2e-12 Identities = 30130 (100%), Gaps = 0/30 (0%) Strand=Pius/Pius Query
Sbj ct
1
30
ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAG���G
Sl593
III I I II II IIII III II III II I
II
IIII
51622
ATCTATAGTO.TGCTG�IV>.GTAGGAGJI.JI.AG
JAK2_mut for: 5' AG CATTTGGTTTTAAAITATGGAGTATATT 3 ' (:iOrner) reffNT 00841 3 . 1 81 Length=39964796 Features in thfs part of subject sequence: y t rosine-protein kinc;se JAK2 Score = 54.0 bits (27), Expect = 4e-06 I dentities = 27/27 (100%), Gaps = OdT (O%) . Strand=Pius/Pius Query
1
Sbjct .
5063741
AGCATTTGGTTTT��TTATGGAGTAT
111111111111111111 IIill IIII . AGCATTTGGTTTTJI�.TTATGGAGTAT
27 50637�7
Used NT 008_4 1 3 L�nGth= 104804 to blast: Score = 54.0 bits (27), Expect = 1e-10 Identities = 27/27 (100%), Gaps = 0/27 (0%) Strand=Pius/Pius Query
1
AGCATTTGGTTTTAP.ATTATGGAGTAT
27
Sbjct
51754
AGCATTTGGTTTTAft.ATTATGGAGTAT
51780
I I I I I I 1 1 1 1 1 11 I l l I I I I I I I I I I I
JAK2 rev:S' CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA 3' refiNT 0084 1 3 . 1 81 Homo sapiens chromosome 9 genomic contig, GRCh37.p2 reference primary assembly Length=39964796 Features in this part of subject sequence: y t rosine-protein kinase JAK2 Score = 60.0 bits (30), Expect = 6e-08 Identitie s = 30/30 (1 00%), Gaps = 0/30 (0%) Strand=Pius/Minus Query
1
CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA
30
32
. I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I 1 1 I I I
5 0 6 3 943
Sbj ct Used NT
008413
Score =
60.0
Query
. 1
CTGAATAGTCCTJI-CAGTGTTTTCAGTTTCA
Length= 104804 to blast:
bits (30), Expect = 2e-12 Identities =
30/30 (100%), 30
CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA
51927
llllllllllllllllllllllllllllll
PCR product of JAK2_for/JAK2_rev
=
364
PCRproduct of JAK2_mut_for/JAK2_rev
l<.aAA. Jr(\) fT-
CO"Yl L
·
-
l0
=
..
203
fC�.ekLt�
( �� -
.-
� \��\N
-)
\1{1 tVlfb.r
o\�
Gaps =
CTG&�TAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA
51956
Sbjct
5 0 6 3 914
0/30 (0%) Strand=Pius/M inus
JUDUL PENELITIAN : KORELASl MUTASI JAK2 V617F DENGAN KEPARAHAN KLINIS PADA PASIEN NEOPLASMA MYELOPROLIFERATIF YANG MEiVliLIKI KROMOSOM PHILADELPHIA NEGATI"F !NSTANSI PELAKSANA : BAGIAN/SMF ILMU PENYAKIT DALAM FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVE�SITAS DI PONEGORO/RSUP DR. Y..ARIADI SEMARANG
Persetujuan setelah penje!asan Yth. Bapak/fbu/Sdr :
(Informed Consent)
........................ . . . . . . . . . . .
A. Bag!an Informasi
��
Berikut ini naskah yang akan dibacakan pa /wa! � r d aorang�tua
�---../
Tujuan penel i tian Mengetahui
kore!asi
mutasi JA K2
ponden penelitian:
V617F dengan keparahan
klinis
pada pasien
Neoplasma Myeloproliferatifyang memiliki kromomosom Philadelphia negatif. Tindakan yang akan dialami Bapak!Ibu/Sdr Bapak/Ibu/Sdr akan ciiperiksa o!eh dokter residen !PD/dokter ahli sub bagian hemato onko!ogi medik /peneliti di klinik atau di bangsal Penyakit Dalam. Dokter akan mencatat identitas secara lengkap, dan mengajukan bebcrapa pertanyan dalam kues!oner yang harus dijawab secara jujur dan terbuka. Pertanyaan-pertanyaannya meliputi keluhan, tanda dan gejala, riwayat keluarga, faktor risiko, yang mengarah ke penyakit neopiasma
Myeloproliferatif. Keluh&n tanda dan gejala
yang mengarah ke penyakit neopl2sma
Myeloproliferatif antara lain terjadi di seluruh tubuh (umum), limpa, darah, dan sumsum
tulang
.
Bapak/Ibu/Sdr akan diambil darah lewat pembuluh dnrah balik sebanyak sekitar 5 cc oleh tenaga medis yang berkompeten. Darah akan disimpan dalam tabung steril dengan pelarut EDTA dan dikirim ke Jaboratorium
Center for Biomedical Research (CEBJOR)
FK
UNDIP untuk dilakukan ekstraksi DNA dan selanjutnya pemeriksaan mutasi gen Jak2
V6l7F. Sumsum tulang 1 0 cc yang diperoleh dari biopsi sumsum tulang sebagai bagi an
proses diagnostik rutin akan diperiksa sitogenetilca (kromosom Phialdelphia).
Efek sam p ing setelah pengamb i l an darah langsung yang mungkin terjadi adalah memar (hematoma), dan tidak !angsung adalah infeksi pasca tindakan. Pengambilan darah dan sumsum tulang akan di lakukan dengan prosedur standar aseptik oleh petugas yang
·
berkompeten, sehingga efek samping langsung dan tidak langsung bisa dihindari. Bila terjadi efek samping memar dapat diberikan gel pemecah bekuart darah (trombolitik} seperti Thrombophob®, jika terjadi infeksi lokal Bila terjadi efek samping dalam posisi terlentang
biopsi
(supine)
di kulit dapat diberikan sal'ep antibiotik.
surnsum tulang berupa perdarahan, posisikan pa.!lien
dengan luka tertutup kassa (balut tekan), sehingga iuka
tetap mendapat tekanan minimal selarna 30 men it, j ika masih perdarahan lanjutkan selama 1 jam. Pasien diminta untuk menjaga pembalut luka tetap
kering selama 48 jam,
jika masih ada perdarahan pasien diminta menghubungi dokter/peneliti untuk mendapat penanganan
Jebih
Janjut, misilinya obat
pengheoti
perdarilian,
atau
faktor-faktor
pembekuan; serta biaya akan ditanggung oleh penclitian. Jika teijadi infeksi lokal di kulit dapat cliberik.an salep antibiotik, jika infeksi berlanjut pasien dapat rnenghubungi peneliti untuk m"!ndapat penanganan Iebih lanjut, misalnya antibiotik oral, dan biaya akan ditanggung oleh penelitian . .
Peneliti selalu tunduk dan berpegang pada Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 657/MENKES/PerNll/2009 tentang
pengiriman dan
penggunaan spesimen kJinik, materi
biologik dan muatan informasinya. Hasil pemeriksaan ak.an didiagnosis dan dianalisis oleh ahli yang berkompeten. Hasil di<�;, onos!s dan analisis akan diserahkan kepada penel iti dan akan. diinforn'lasikan kepzda Bapakr1bu/Sdr secara tertutup dan :rahasia. Apabila peneiitian ini
dipublikasikan,
kerahasiaan penderita tetap teljaga. Bapak/IbUJSdr
tidak
mendapatkan
interv'ensi
pt!ngobatan
apapun,
sehingga tidak:
mempengaruhi prosedur terapi standar saat ini (hingga ditemukan obat pilihan terbaru untuk penderita yang spesiflk uiltuk rnutasi tersebt.:t di Jika
terdapat
pertanyaan/keluhan
mengenai
atas).
penelitian
m1,
Bapak/Ibu/Sdr
dapat
menghubungi : dr.Santosa, SpPD 0813 25062592; dr.Fanti 08122942077; dr.Puspita 08174151092
Terimakasih atas kerjasama Bapak/lbu/Sdr.
B. Bagian Persetujuan Saya telah mendengar dan memahami penjeiasan meogenai penelitian ini, serta semua.
pertanyaan
saya
telah dijawab dengan jelas dan baik. Sewaktu-waktu saya dapat
mengundurkan diri dari penel itian ini tanpa mempengaruhi standar terapi yang saya
. .
peroleh. Maka, dengan ini saya menyatakan; SETUJU J TAK SETUJU untuk ikut serta sebagai responden/subyek dalam penelitian ini.
Semarang, tanggal
Peneliti
dr. Santosa, SpPD
.
...... . . . . .
.
.
. ........
bulan
Salcsi
.....
.
. . . .. . . . . . . . . . . . .
tahun 2010
Yang membuat pemyataan
Nama :
.................................................
Alarnat : .............................................. No. Tlpf.Hp : . .
......
.
... . .... ... . ....
.
..
... ....... .. .
Contact Person : dr.Santosa, SpPD 0813 25062592; dr.Fanti 031 22942077; dr.Puspita 08174151092
..
.
