LAPORAN AKBIR PENELITIAN

LAPORAN AKBIR PENELITIAN

Peran Ekstrak Buah Pare

(Momordica charantia) terhadap

Regenerasi Sel Endotel Pembuluh Darah pada Obesitas: Studi pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs)

Nama Penyusun Laporan :

1. Azham Purwandhono 2. Candra Bumi 3. Nindya Shinta

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS JEMBER

Jl. Kalimantan 37 Jember 2012

LAPORAN AKHIR PENELITIAN

nm

Ekstrak Buah Pare


eenerasi Sel Endotel Pembuluh Darah pada Obesitas: Studi pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs) ,_ ,

�

�

. '"�&

dan Pcugc1�lb:�;i':l� Kcscl&ata� I P E R P U S TA K l\A ��l �

Badan Penclitian

Tnngg�l

•

No. lnduk : No. Klass _4___ _

--·-·4·--

---

------

b-::0:--;:�:--.\' : ---\)\t\:L �.i�:·

-..:. .:: --� :::: :._

•.


1. Azham Purwandhono 2. Candra Bumi 3. Nindya Shinta


Jl. Kalimantan 37 Jember 2012

-

-

LAPORAN AKBIR PENELITIAN

eran Ekstrak Buah Pare e nerasi


Sel Endotel Pembuluh Darah pada Obesitas: Studi

pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs)

Pe:ran Ekstrak Buah Pare


Regenerasi Sel Endotel Pembuluh Darah pada Human ilical Vein Endothelial Cells (Huvecs) yang dipapar Leptin

----------. Badan Penc!ith:m dan Pcn�emhang:w Kr�tdutal'!

P ER P U S TAI
.. ·-·---------� ----· ·


4. Azbam Purwandhono S. Candra Bumi 6. Nindya Shinta


JI. Kalimantan 37 Jember 2012

SKPENELIDAN

IMh .'.( .,, h ' II �

' -�. \; 1

, ..

l,

,,

.. •

: .�

1\

r ,-'\,

'·,•

'

NJ.

..

.

lll

JF. t.

LEMBAR PENGESAHAN PENELITIAN RISBIN IPTEKDOK

I::.:dul : Peran Ekstrak Buah Paria (Momordica charantia) terhadap Regenerasi Set

...... Pembuluh Darah pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells --..=:;:zr Leptin ::etuaPeneliti DataPribadi

· ama Lengkap ..enis Kelamin �/Golongan Srata/Jab. Fungsional �tan Struktural Pakultas/Jurusan :Bidang Ilmu

_.Uamat Kantor

Telepon/F aks/E-mail -�amat Rumah

(HUVECs) yang

: dr. AzhamP urwandhono :Pria : 198105 18 20060 4 1 00 2/lllb

: Kedokteran :Patologi Anatomi : Jl. Kalimantan3 7 :0857168637 28 / [email protected] : n. Jagiran 27 Tambaksari Surabaya

Jumlah AnggotaPeneliti : dr. Candra Bumi, MSi _ �ama Anggota I : dr. Nindya Shinta, MKed �a Anggota II �Anggotaill -

:..Okas iPenelitian

: Laboratorium Faal Universitas Brawijaya

.!:mgka WaktuPenelitian

: 6 Bulan

Jember, 2 4 Desember2011 KetuaPeneliti,

dr. AzhamPurwandhono

�- 198 105 18 20060 41002

111

KElVIENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVE R S ITA S JEMBE R FAKULTAS KED OKTER AN Jl. Kalimantan 37 Kampus Tegalboto Telp. (0331) 337878 Jember 68121 E-Mail

:[email protected]

Surat Pernyataan :::-:g bertanda tangan di bawah ini: : AZHAM PURWANDHONO : 198105182006041002

: FAKUL TAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS JEMBER : Peran Ekstrak Buah Pare

(Momordica charantia)

terhadap

Regenerasi Sel Endotel Pembuluh D.Jrdh pada Obesitas:

Studi pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs) ·

menyatakan kesanggupan untuk menyelesaikan penelitian Riset Pembinaan

�et ahuan dan Teknologi Kedokteran yang telah dilakukan pad a tahun 2011,

enga n Surat Perjanjian Kerjasama yang dita ndata nga ni pada tahun 2011 "tahun ke-1).

d Kemudian hari, Saya tidak dapat mer.yelesaikan penelitian seperti ketentuan

d' atas, maka segala akibat yang timbul dari pen elitian tersebut me njadi ;::;:Ig jawab Saya sepenuhnya dan seluruh biaya penelitian yang telah dite rim a � kem ba lika n kepada Bad a n Penelitian dan Pengemb anga n Kesehatan. --, Surat Pernyataan i.1i Saya

--akan sebagaimana

mes tinya.

buat tanpa ada paksaan

dan untuk dapat

Jember, 10 Januari 2012 Yang membuat pernyataan,

<::::::s��wati, M.Kes 9700214199903200

dr. Azham Purwandhono NIP. 198105182006041002

DAFI'AR ANGGOTA TIM PENELITI

1 . AZHAMPURWANDHONO 2 . CANDRA BUM!

3. NINDYA SHINTA

v

KATAPENGANTAR

=emanjatkan

segala puji syukur kepada Allah swr, atas limpaban rahmat dan hidayah

: Peran Buah Pare (Momordica cl'arantia) terhadap Regenerasi Sel Endotel �oc� Darah pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) yang •"'l"""'.....- leptin.

�eliti dapat menyelesaikan penelitian dan laporan basil penelitian yang berjudul

mmgucapkan terima kasih yang sebesar-besamya kepada : Kepala beserta Staf Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan Republik Indonesia melalui program Risbin Iptekdok yang telah menyediakan dana penelitian. Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Jember yang telah memberikan izin dan kemudaban dalam pelaksanaan penelitian. Komite Etik RSUD Dr. Soetomo Surabaya yang telah memberikan izin dan kemudahan dalam pelaksanaan penelitian. Prof Fedik A. Rantam, PhD yang telah memberikan saran untuk perbaikan penelitian. Safarina G. MAlik, DVM, MSc., PhD yang telah memberikan bimbingan selama penelti i an. Kepala Laboratorimn Dmu Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya atas fasilitasnya sehingga. penelitian ini dapat dilaksanakan Para analis di Laboratorium Ilmu Faal Fal"U . Utas Kedokteran Universitas Brawijaya yang telah menyediakan waktu dan tenaga untuk membantu penelitian hingga terselesainya penelitian. Semua pihak yang telah membantu terselesaikannya penelitian ini, yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu. .

1t kami atas nama tim peneliti berharap mudah - mudahan basil peneJitian berguna dan .::==:taat baik unb.:Jk pengembangan ilmu dan teknologi pada umumnya dan khususnya ilmu dan ......_-'--'-'61• dalam bidang kedokteran. mengharapkan melalui laporan penelitian ini, para pembaca dapat memberikan saran yang ::::::::=:111:gun demi perbaikan penulisan basil penelitian tersebut. ·

Jember,

Februari 2012

Tini Peneliti,

VI

RINGKASAN

Obesitas meningkatkan resiko morbiditas dan mortalitas dari beberapa penyakit diabetes tipe 2 dan penyakit jantung (Adiningsih, 2005), karenanya peningkatan �- obesitas merupakan masalah kesehatan yang serius bagi dunia. Saat ini terdapat peningkatan prevalensi obesitas di seluruh dunia yang mencapai tingkatan yang _ _.. ..yakan . (Zimmet P, et, al, 2001). Perubahan perilaku, pola makan dan lingkungan _ebabkan perubahan pola penyakit di masyarakat (Adiningsih, 2005). Kecenderungan · bemlih dari makanan tradisional Indonesia mengkonsurnsi makanan siap saji (fast yang berlemak tarnpak mulai menjadi pola hidup. Pada obesitas terjadi perubahan adipositokin, yaitu peningkatan leptin. Keradangan _ karena leptin mengaktifkan faktor tmnskripsi Nuclear Factor Kappa Beta (NF-KB). '"';":.i(B yang teraktifasi akan menyebabkan kegagalan signal insulin melalui kegagalan ==�l3Il fosforilasi IRS-I. Akibatnya terjadi penurunan produksi NO di endotel (Bonetti, Endotel berperan dalam menjaga homeostasis vaskuler, mengatur tonus pembuluh prohferasi otot polos vaskuler, dan keseimbangan trmnbosis-trombolisis. A.danya z=;;8.1· stimulus mekanik dan kimia mengakibatkan sel endotel mensintesis dan �:4_eJuark.an sejumlah substansi vasoa.ktif, faktor pertumbuhan dan faktor lai11 yang :::::::rediasi fungsi ini (Calles-Escandon J, C ipol la M., 200 1). Buah pare telah diketn.hui dapat digunakan sebagai antioksidan, menghambat __ ...... i LDL, dan menghambat IGF-1 pada sel epitel prostat (Ho, 2002; Kaput, et., al, serta memiliki efek kardioprotektif. Komponen flavon()ids, suatu kom p on en jpbenolic pada tumbuhan dilaporkan mempunyai efek protektif terhadap patologis seperti penya kit jantung dan diabetes. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui mekanisme keija ekstrak buah pare dalam --.arffiam bat proses terjadinya disfungsi endotel akibat paparan leptin. Pene liti an dilakukan --.;an menggunakan kultur Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs). Setelah :::;:::!PaT dengan berbagai dosis ekstrak buah pare (Momordica charantia) kemudian ::5erikan leptin. Selanjutnya dilakukan identifikasi kadar p65 NF-l
=:run jukkan

bahwa terdapat perbedaan yang bennakna (p<0,05) kadar dan densitas p65

-=-«:B, ekspresi prQtein JRS-1, ekspresi protein VCAM-1 JXida kelompok yang tidal<: � leptin dengan kelompok yang dipapar human recombinan leptin (kontrol positif). �aan bermakna (p<0,05) juga ditemukan pada kelompok perlakuan dengan berbagai - ekstrak. Ekstrak buah pare (Jvfomordica charantia) berperan dalam memperbaiki

c..:mg m si endotel akibat papara dengan leptin. Mekanisme kerja ekstrak buah pare adalah .::.a:.gan menurunkan ekspresi VCAM melalui penurunan NF-l
Vll

ABSTRAK

Latar Belakang. Pada obesit.as terjadi perubahan adipositokin berupa peningkatan leptin.

Keradangan terjadi karena leptin mengaktifkan faktor transkripsi Nuclear Factor Kappa Beta (NF-KB). NF-KB yang teraktifasi akan menyebabkan kegagalan signal insulin melalui kegagalan hambatan fosforilasi IRS-1 . Akibatnya terjadi penurunan produksi NO di endotel. Peningkatan aktivitas NFKB akan meningkatkan ekpresi protein yang menjadi target NFKB yaitu VCAM-1. Penelitian ini bertujuan untuk menguji apakah ekstrak buah pare (Momordica charantia) dapat menurunkan ekspresi VCAM-1 melalui penurunan NF lCB & peningkatan IR.S-1 . Metode dan basil. Penelitian ini menggunakan model kultur Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Terdapat 7 kelompok yang terdiri dari kelompok kultur Huvecs tanpa leptin sebagai kontrol negatif, kedua adalah kelompok kultur Huvecs dengan leptin sebagai kontrol positif, dan lima kelompok lainnya yang diberi berbagai dosis ekstrak buah pare (0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,005 mg/ml, O,OOI mg/ml). Sel endotel diinkubasi selama 2 jam dengan ekstrak buah pare kemudian dilanjutkan dengan paparan leptin 500 ng/ml selama 6 jam. Pemeri ksaan dilakukan dengan menggunakan ELISA, imunofluoresen dan imunohistokimia. Pemberian leptin pada Huvecs meningkatkan kadar, densitas NFKB dan ekspresi VCAM-1 serta menghambat fosforilasi IRS-I secara bermakna. Dari penelitian ini juga dibuktikan bahwa ekstrak buah pare dapat menurunkan ekspresi VCAM melalui penurunan NF-l
NFKB, IRS-1, VCAM-1

Vlll

DAFI'ARISI

halaman SAMPUL DALAM ........ .................................................. .................... .............................. i SK PENELITIAN ................................................ ............................................................... ii LEI'vffiARPENGESAHAN ................................................. .............................................. iii DAFTAR ANGGOTA TIMPENEUTI ........................................................................... iv KATAPENGANTAR. ........................ ........ ......... . . ............................................................ v RINGKASAN ................................................................................... . . .............. ..... ............. vi ABS'I'RAK

. . . . . . . . ..................... . . . . . . ..................................................... ..................................

DAFTAR 181 ..

.............

.. ... .

. .. .

...... . .

.

.......

viii

.... . ..:.................................................................... ix .

DAFTAR TABEL ........ ... .......................... ......................................................................... xi DAFTAR GA.MBAR ................................................... ...................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN .......... ................................................. ....................... ............ ........ xiii I. PENDAIDJLUAN

. .. . ... .. .. .

.. .

.

...

...

.

....

.. ... .

...

...

.

..... . . . .

......... ... . ... ..

.

..

....

.... . . .

.

....

.........

....

... . 1 .

.

1 .1 I..,atar Belakang........... .... .............. ... .... . ............... ....... .. .... .. . . ..... ....... .. .. ............. . .. ....... .. 1 1 .2 Rumus an Masalah .... .... ...... ........ ..... ... .... .............. ........ .. . .. .................................. ..... .... 3 II. TUJUAN PENEUTIAN ............................................ ................................................... 4

2 .1 Tujuan Umum......... .... .. .... ......... .... ...... ...... ..... ...... .......... ... ........................................... 4 2 .2 Tujuan Khusus ......................................................................................................... ..... 4 2 .3 Manfaat .................................................... ................................................ ............... ...... 4 2 . 4 Hipotesis ............... ...... ....... ........................................................................................... 4 lll lvfE.TODEPENEI...TI1AN . .... . .... .. . ..... . ......... .. ....... ... .... ........ .... .. .. ..... . .. ... . ..... ... ... . ...... ..

3.1 ProsedurPenelitian .

....

...

.....

. . ... ...

.

......

.. .

.....

. ... .... .... .... .. .... ... .. .. . ...

...

..

...

.

..

.

..

.

..........

...

......

5 5

3.1 .1 Kultur Sel Endotel Manusia (H1NECs) ... ........ ... ......... ...... .. .... . ...... ..... .... .. . ....... .... 5 .

3.1.2 Perlakuan ekstrak buah pare pada sel endotel .. .......... .... ....... .... ......... .. . .. .. 6 ..

.

.

.

...

...

.

.

.

3.1 . 3Perlakuan Induksi Leptin pada HUVECs .................... . .. ......... . .. . .... . ....... ... .. ..... .. .. 7 .

.

3.1.4. ldentifikasi protein NFKB, IR.S-1 dan VCAM-1 dengan lmunofloresen .... ..... 7 ..

..

32 Analisis Data...................... ........... ....... ............................................................... .......... 7 IX

3.3 Diagram Alir Penelitian ............... .... .................. ......... ... ... ... . ...... ....... .. . .. .... ..... ............ 8 N.HASll.- DAN PEMBAHASAN

.

......

.

.....

..............

.

. . . . . . . . . . . .......

.

...... . . . . .

.

.

. . . . . ....

.

......

. .. ..

.

..

9

4.1 Hasil Penelitian....... ......... . ... .. .............. ...... ...... ....... ... ........ ....... .. . ... ... . ..... . ........... . ........ 9 4.1.1 Optimalisasi dosis ekstrak buah pare


.............

. .... ..

..........

10

4.1.2 Hasil Pengukuran Kadar p65 NF-KB Aktif sel HUVECs dengan ELISA............. 11 4.1.3 Hasil Evaluasi Densitas p65 NF -KB Aktif sel HUVEC dengan Imunofluoresen. 12 4.1.4 Hasil Perhitungan Ekspresi protein IRS-I pada sel HUVEC dengan Imunohistokirnia........................................................................................................ 13 4.1.5 Hasil Perhitungan Ekspresi protein VCAM-1 pada sel HUVEC dengan Imunohistokimia ....... . .. ...... . .. ... .. . ..... .. ....... .. ...... .............. .. ... ............. . .. . ....... ........... . . 15 4.2. Pembahasan Penelitian................................................................................................ 18 4.2.1 Disfungsi endotel akibat aktivasi p65 NF-KB, hambatan sinyal transduksi IRS-I dan peningkatan ekspresi VCAM-1........ ........ . .. . ........... .. .. .... .. ... . ..... . .......... . 18 4.2.2 Efek ekstrak buah pare terhadap aktivasi p65 NF-lCB sel endotel . .

........

.

...........

. . 19 .

4.2.3 Efek ekstrak buah pare terhadap hantaran sinyal transduksi IRS-1 sel endotel.... 20 4.2.4 Efek ekstrak buah pare terhadap ekspresi protein VCAM-1 sel endotel............... 21 V KESIMPULAN ..... ... .. ... . .. ......... . . ......... .. . ..... ...... . .... .. . .. . ............... .. . . ...... ... ..... . .. ............. 22 UCAPAN TERIMA KASlli ....... ...... . ...... ........ ... ... . . ... .. ... ... .... ........................ . ........ . ........ 23 DAFTARPUSTAKA

.....

.

...

......................

...... . . . . . . ....

LAMPIRAN

.

.......

..

..... . . . .

. . ...

.

.. . 24

. . . . . . . . . . . . . . ............

..

.

. . . . . . ....... . . . .................... . . . . . . . ............ . . . . . . ..................... . . . .............. .......... ...........

X

26

DAFI'AR TABEL

Tabel4.1. Optimalisasi Dosis Ekstrak Buah Pare

.

.....................

.

.......

.

.....

. .

........ ...

. tO

....

..

Tabel4.2. Basil pengukuran kadar p65 NF-KB aktif ..................................................11 Tabel4.3. Hasil pengukuran densitas p65 NF-KB aktif menggunakan Immunofluoresen

13

. . ..................... . . . . . . . . . . . . . .............................

Tabel4.4. Basil ekspresi IRS-I menggunakan Immunohistokimia............................ 14 Tabel4.5. Basil ekspresi VCAM-1 menggunak.anlmmunohistokimia ..................... 17

Xl

DAFrAR GAMBAR

pbar 4.1 Gambaran sel endotel normal

9

mbar 4.2 Hasil imunofluoresen menggunakan anti p65 NFkB

12

tmbar 4.3 Hasil imunohistokimia menggunakan anti IR.S-1

15

lmbar 4.4 Hasil imunohistokimia menggunakan anti VCAM-1

16

xu

DAFfAR LAMPIRAN

iran 1

Data Statistik Kadar NFkB Statistik Densitas NFkB

29

Data Statistik Ekspresi IRS-I

31

iran 2 Data ....., iran 3

26

piran 4 Data

Statistik Ekspresi VCAM-1

Xlll

33

BABI I PENDAHULUAN

1.1.

Latar Belakang

Obesitas meningkatkan resiko morbiditas dan mortalitas dari beberapa penyakit seperti diabetes tipe 2 dan penyakit jantung (Adiningsih, 2005), karenanya peningkatan insiden obesitas merupakan masalah kesehatan yang serius bagi dunia. Saat ini terdapat

bukti

peningkatan prevalensi obesitas di sel uru h

dunia

yang

mencapai tingkatan yang membahayakan (Zimmet P, et, al, 2001 ). Perubahan perilaku, pola makan dan Iingkungan menyebabkan perubahan pola penyakit di masyarakat (Adiningsih, 2005). Kecenderungan untuk beralih dari tradisional

Indones ia mengkonsurnsi makanan s iap

saji (fast food)

tampak mulai menjadi pola hidup. Hal ini merupakan salah berbagai penyakit

satu

makanan

yang berlemak

penyebab timbulnya

sindroma metabolik, sehingga obesitas merupakan central problem

yang memerlukan penatalaksanaan dengan baik dan teratur. Bersarnaan

dengan

meningkatnya

obesitas,

hal

ini

diikuti

dengan

perkembangan sindroma metabolik dan diabetes tipe 2 yang keduanya berhubungan dengan terjadinya resistensi

insulin

dan peningkatan resiko komplikasi penyakit

kardiovaskuler akibat disfungsi endotel. (Steinberg GR., 2007; Deedwania PC., 2006) Pada obesitas terjadi perubahan regulasi adipositokin seperti peningkatan sitokin proinflamator tumor necrosis factor (TNF) inhibitor (PAI)-1

a.,

leptin,

resistin, plasminogen-activated

dan terjadi penurunan adiponektin. Adanya aktivasi jalur signal

proinflamasi di jaringan adipose pada obesitas merupakan mekanisme penyebab teijadinya

penurunan

signal insulin yang

berperan pada

resistensi insulin

(Carl,

2007). Leptin adalah salah satu dari produk adiposit, yaitu suatu protein dengan berat 16 kDa. Pada kondisi obesitas, sekresi leptin di tubuh sangat berlebih (Indra, 2006). Keradangan terjadi karena leptin mengaktifkan faktor transkripsi Nuclear Factor Kapp a Beta (NF-KB,

NF-KB

yang teraktifasi akan menyebabkan kegagalan signal

1

insulin melalui kegagalan hambatan fosforilasi IR.S-1 yang berakibat pada penurunan

produksi NO di endotel (Bonetti, 2003). Efek resistensi insulin berkaitan dengan aktivasi jalur inflamasi NF-kB yang diindikasikan dengan peningkatan fosforilasi IKK-� dan peningkatan ekspresi NF-kB yang tergantwlg gen-gen proinflamator IL-6

dan ICAM-1. Dengan demikian obesitas akan menyebabkan perkembangan inflamasi yang kronis dan sistemik yang merupakan komponen utama dari patogenesis resistensi insulin (Wellen KE, 2005). Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa disfungsi endotel berperan utama pada patogenesis aterosklerosis. Resistensi insulin sistemik dan disfugsi endotel merupa.kan dua hal yang saling berkaitan dan saling mendukung. Adanya

abnormalitas metabolik pada obesitas akan meningkatkan signal transduksi NF-kB yang berperan pa.da modulasi sel endotel terha.dap kondisi inflamasi (Suarez. 2005 ). NF-kB dapat diaktivasi oleh berbagai stimulasi meningkat

pada

obesitas.

Peningkatan

termasuk ROS, FFA, TNF-a yang

deposit lemak

pada jaringan adiposit

khususnya lemak visceral berhubungan dengan peningkatan produksi beberapa \ mediator proinflamasi seperti

TNF-a, IL-6, IL-l p,

mengaktifkan jalur NF-KB sehingga

resistin dan leptin yang akan

menyebabkan kegagalan

aksi insulin

di

jaringan. Peningkatan kadar leptin juga ditunjukkan mengaktifkan IKK-P di adiposit

dan hepatosit yang dapat meningkatkan fosforilasi serin dari IRS-I, yang diikuti dengan penurunan fosforilasi tirosin IRS-I, dan transport glukosa (Middleton, 2000).

IKK-13 merupakan serin kinase yang faktor

mengontrol aktivasi NF-kB yang merupakan

transkripsi inflamasi. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme jalur inflamasi

berkontribusi terhadap kegagalan signal insulin dan bahwa leptin menyebabkan \

kegagalan aktivitas fosforilasi IRS-1 yang berakibat pada penurunan produksi NO sebagai respon terhadap insulin melalui efek yang dimediasi oleh NF-kB melalui jalur IRS-1/PI3-K/eNOS (Melotti, et.al., 200 I: Monaco, 2004). Indonesia sebagai negara tropis mempunyai keragaman flora yang mempunya1 potensi besar untuk dikembangkan dalam dunia pengobatan. Akan tetapi penelitian tentang hal tersebut masih sangat terbatas, padahal berbagai kandungan zat yang mempunyai khasiat sebagai obat banyak terdapat pada tumbuhan-tumbuhan tersebut.

2

Tumbuh-tumbuhan dengan komponen d il aporkan jantung

tlavonoids, suatu komponen polyphenolic

mempunyai efek protektif terhadap patologis kronik seperti penyakit

dan diabetes. Salah satu bahan alam yang telah sering dipergunakan oleh

masyarakat sebagai terapi untuk penyakit sindroma metabolik seperti diabetes adalah buah

pare.

Buah

pare

telah

diketahui

dapat

digunakan

sebagai

anti o k sidan

,

menghambat oksidasi LDL, dan menghambat IGF-1 pada sel epitel prostat (Ho,

2002; Kaput, et., al, 2004). serta memiliki efek kardioprotektif. Penelitian pada hewan model obesitas, ekstrak buah pare mampu menurunkan adiposity, kadar insulin trigliseride serum (K.arisson,

dan

1997). Namun masih diperlukan eksplorasi lebih jauh

tentang dosis efektif dan mekanisme penghambatannya sehingga lebih optimal. Pada penelitian ini akan dikembangkan suplemen diet yang mengandung ekstrak buah pare varietas M. charantia var. charantia dengan berbagai dosis yang dimungkinkan berguna sebagai pencegahan dan pengobatan berbagai perubahan fungsi yang tetjadi pada sindroma metabolik. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek ekstrak buah pare terhadap aktifasi NF-kB, IRS-1 dan

VCAM-1

pada kultur sel endotel yang dipapar dengan leptin agar dapat menyerupai sel endotel pada penderita obesitas. Dengan demikian

basil

penelitian ini diharapkan

dapat

mengungkap lebih jelas mekanisme ketja buah pare pada fungsi vaskuler, khususnya sel endotel,

dan dapat digunakan sebagai dasar terapi untuk penyakit akibat disfungsi

endotel.

1.2.

Rumusan Masalah

1.2.1. Apakah pemberian paparan leptin rekombinan pada kultur sel endotel (HlNECs) menimbulkan aktifasi sinyal transduksi dari NF-KB , IRS-1 dan VCAM-1 1.2.2.

Apakah pemberian ekstrak buah pare


berbagai dosis

mempengaruhi sinyal transduksi NF-KB, IRS-I dan VCAM-1

3

BABD TUJUAN PENELITIAN

2.1.

Tujuan Umum:

Menguji mekanisme kerja fitofarmaka khususnya ekstrak buah pare dalam menghambat

proses

terjadinya

disfungsi

endotel,

keradangan

dan

aterosklerosis.

2.2.

Tujuan Khusus: l.

Dapat mengetahui pengaruh ek:strak buah pare pada tahap sinyal tmnduksi NF-l

IRS-1 in vitro,

2. Dapat memperoleh bukti aktifasi sinyal transduksi dari NF-KB dan atau IRS-I sebagai akibat paparan leptin rekombinan. 3. Dapat

memperoleh

dosis

efektif

ekstrak

buah

pare

yang

dapat

menghambat aktifasi NF-KB dan peningkatan sinyal IRS-1.

4. Dapat mengetahui p�nghambatan ekstrak buah pare terhadap proses disfungsi endotel pada obesitas berdasarkan ekspresi VCAM-1.

2.3.

Manfaat:

Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan mengena1 mekanisme keija ekstrak buah pare


pada kultur sel

endotel yang d ipapar oleh leptin.

2.4.

Hipotesis: Pemberian ekstrak buah pare

(Momordica charantia) mampu memperbaiki

kultur sel endoteJ yang dipapar oleh human recombinan leptin dengan

menurunkan ekspresi VCAM melalui penurunan NF"KB & peningkatan IRS-1

4

BABID METODE PENELITJAN

Penelitian ini merupakan eksperimen

mumi (trne eksperimental) yang

dikerjakan di laboratorium secara invitro dengan rancangan percobaan Randomized Group Only Design pada tahap

1 dan Randomized post test only control group design

pada tahap 2(in vivo). Penelitian dilakukan untuk mengkaji pengaruh ekstrak buah pare terhadap sinyal transduksi yang berperan terhadap gangguan jalur sinyal insulin yang mengakibatkan disfungsi endotel, pada sel endotel yang dipapar oleh leptin. Awalnya penelitian ini berjudul "Peran Ekstrak Buah Pare (Momordica charantia) terhadap Regenerasi Sel Endotel Pembuluh Darah pada Ohesitas: Studi pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs) berubah menjadi

"

kemudian atas masukan dari para panelis

"Peran Ekstrak Buah Pare (Momordica charantia) terhadap

Regenerasi Sel Endote/ Pembuluh Darah .pada Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Huvecs) yang dipapar Leptin

".

Hal ini dikarenakan penelitian dilakukan pada

kultur sel endotel yang dipapar leptin

dan belum bisa menggambarkan

keadaan

obesitas yang sebenamya. Penelitian ini telah mendapatkan kelaikan etik oleh Komite

Etik Penelitian Kesehatan RSUD Dr. Soetomo Surabaya.

3.1

Variabel Penelitian

I. Variabel bebas (independen):

1.

Pemberian ekstrak buah pare

II. Variabel tergantung (dependen) :

1.

Kadar p65 NF-KB

2.

Densitas p65 NF -KB

3.

Ekspresi IR.S-1

4.

Ekspresi VCAM-1

ill. Variabel moderator : kultur HUVECs IV. Variabel k en da li

5

1.

Pemberian leptin

3.2 Defmisi Operasional Variabel Penelitian 1. Kultur HUVECs adalah kultur sel endotel yang berasal dari sel endotel pada umbilicus bayi yang baru lahir. Sel endotel diinkubasi dengan inkubator C02 5% pada suhu 37°C hingga sel konfluen dan terbentuk monolayer

2. Pemberian ekstrak buah pare adalah pemberian dan inkubasi ekstrak buah pare (Momordica charantia) pada kultur HUVECs dengan dosis yang telah ditentukan, yaitu 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mglml, 0,005 mg/ml, 0,001 mg/ml. Dosis ini diperoleh dari melalui peneltian pendahuluan melalui optimasi

dosis.

3. Pemberian leptin adalah pemberian

human recombinan Leptin dengan 500

ng/ml pada kultur HUVECS. Dosis ini diperoleh dari penelitian sebelurnnya (Fatmawati eta/, 2011). 4. Kadar p65 NF-KB adalah pengukuran kadar sub unit p65 NF-1<.8 yang mengalami translokasi di dalam inti sel endotel dengan menggunakan NF

x:Bip65 ActivELISA Kit (IMGENEX). 5.

Densitas p65 NF-KB adalah pengukuran densitas p65 NF-KB yang mengalami translokasi di dalam inti sel endotel dengan menggunakan immunofluoresen

dan mikroskop konvokal. 6.

Ekspresi IRS-I adalah jumlah set endotel yang mengekspresikan molekul

g

adhesi IRS-1. Penghitun an dilakukan dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia.

7. Ekspresi VCAM-1 adalah jumlah sel endotel yang mengekspresikan molekul adhesi VCAM-1. Penghitungan dilakukan dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia.

3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Kultur Sel Endotel Manusia (HUVECs)

6

Umbilicus untuk kultur sel endotel diperoleh dari RSUD Dr. Soetomo Surabaya yang memenuhi kriteria inklusi sebagai berikut kehamilan aterm, persalinan normal spontan atau caesarian section, APGAR score baik (nilai >7), bayi tidak mengalami asfiksia, berat badan normal (> 2500 gram). Sedangkan kriteria eksklusi meliputi kehamilan dengan penyulit diabetes mellitus, hipertensi, preeklampsia, eklampsia, partus kasep, ibu mengalami ketuban pecah premature (infeksi), persalinan buatan dengan forceps, vacuum. Metode kultur ini merujuk Bouloumie, et a/, (1999). Kultur HUVECs menggunakan kultur primer dengan pengulangan sebanyak 4 x pada masing-masing kelompok. Umbilicus dibersihkan dari jaringan dan sisa darah dengan kasa steril yang dibasahi dengan alkohol 70 %. Masing-masing ujung umbilicus dipotong secara transversal. Kanul dimasukkan salah satu ujung pembuluh vena kira-kira em lalu diikat erat dengan benang. Pembuluh vena dicuci dengan PBS

A

I

melalui

kanul Yl:\llg telah terpasang dengan menggunakan spuit 10 cc. Lakukan 2-3 kali. Setelah bersih, ujung umbilicus yang lain diklem. Larutan Collagenase tipe

II

dimasukkan dan spuit dibiarkan menancap pada kanul. Selanjutnya umbilicus dihangatkan dengan cara didekap kedua belah tangan selama 7 menit. Larutan Collagenase yang mengandung endotel dikeluarkan dari umbilicus dengan

cara

menyedot melalui spuit yang terpasang pada ujung kanul. Kemudian Collagenase tersebut dimasukkan tabung sentrifuse steril 15

cc.

Larutan yang mengandung

endotel disentrifugasi dengan kecepatan 1300 rpm selama 7 menit sehingga diperoleh pellet yang berisi sel endotel. Supematan dibuang kemudian ditambahkan 4 mL medium kultur pada pellet dan diresuspensi dengan cara pipeting sehingga sel endotel terpisah. Larutan dipindahkan ke dalam flask 25 cm2 yang telah dilapisi larutan Gelatin 0,2 % kemudian dimasukkan dalam inkubator COz 5 % pada suhu 37°C selama 30 menit. 3.3.2 Perlakuan ekstrak buah pare pada sel endotel Ekstrak buah pare varietas M. charantia var. charantia diperoleh dari Lab Farrnasi Universitas Jember. Sel endotel yang sudah monolayer diinkubasi dengan

7

ekstrak buah pare dengan beberapa dosis. Dosis yang diberikan adalah sebagai berikut kontrol negatif, kon tro l positif, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,001 mg/ml. Kelompok tersebut diinkubasi dengan ekstrak pare selama 2 Jam.

3.3.3 PerlakuanInduksi Leptin pada HUVECs

Metode ini bertujuan untuk membuat model sindroma metabolik pada sel �

kultur endotel secara in vitro. Me tode induksi leptin pada set kultur en dotet manusia merujuk pada Spritzer et a/., (2001). Set endotel diin kubas i dengan 500 nglml human recombinant leptin (hiperleptin). Set endotel diinkubasi 37°C selama 6 jam.

3.3.4. ldentifikasi protein NFKB, IRS 1 dan VCAM-1 dengan lmunofloresen. -

Metode ini merujuk Melotti, eta/, (2001). Kultur sel endotel masing-masing perlakuan difiksasi dengan fonnalin 10 % (v/v) dalam PBS pH 7,4 selama 20 men it. Sel dicuci dengan PBS pH 7,4 sebanyak tiga kali selama masing-masing 5 menit. Sel I

ditetesi dengan 0,02 % (w/v) sodium azide. Sel kemudian dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Sel ditetesi dengan 0,1 % Triton-X 100 dan diinkubasi selama 5 menit. Sel dicuci dengan PBS-T 3

x

5 menit. Sel diblocking dengan 5% FBS selama 30 menit

overnight pada suhu 4°C. Sel ditetesi dengan.first antibody. Sel dicuci dengan PB S -T 3 x 5 menit. Sel diberi dengan second antibody IgG FITC dan counterstain menggunakan mayer hematoxilen untuk melihat inti, diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4°C. Set dicuci dengan PBS-T 3

x

5

menit. Sel diamati secepatnya

menggunakan mikroskop konvokal.

3.4 Analisis Data

Data hasil pengukuran ditampilkan dalam mean± SD. Data dianalisis dengan menggunakan one-way ANOVA (analisis ragam) dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat

perbedaan

masing·masing

komputerisasi menggunakan metode

variabel.

Analisis data

dilakukan

dengan

SPSS versi 11 .

8

3.5 Diagram Alir Penelitian

Secara skematis diagram alir penelitian tahap l adalah sebagai berikut:

lnkubasi ekstrak pare

Kontrol-

l

Kontrol +

I

0,1 mg/ml

O,OSmg/ml

I

{

0,01mg/ml O,OOSmg/ml

I

0,001mg/ml

l

I

lnkubasi dengan human recombinant leptin (hr leptin) 500 ng/ml

j

ldentifikasi

NF.C:B, IRS-1,VCAM-1

�

I

ELISA p6SNF1eB IF p6SNF1e8 IHC IRS-1 IHCVCAM-1

9

BAD IV

BASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Basil Penelitian Penelitian

ini

dilakukan

menggunakan

kultur Human

Umbilical

Vein

Endothelial Cells (HUVECs). Setelah dipapar dengan leptin dan berbagai dosis ekstrak buah pare (Momordica charantia) kemudian dilakukan identifikasi kadar p65

NF-KB aktif, densitas p65 NF-lCB, dan ekspresi IRS-1 dan VCAM-1. Metode isolasi

dan kultur,HUVECs menggunakan metode standar/baku yang

biasa dipergunakan dalam penelitian-penelitian sebelumnya. Hasil kultur HUVECs ditunjukkan pada gambar 4.1 dib awa h

ini :

�, '

.

.

'

Gambar 4.1. Gambaran sel endotel normal pada hari keempat kultur, diambil dengan menggunakan mikroskop inverted pembesaran 400x

Menurut Arjita dkk (2002), ciri-ciri set endotel normal secara morfologis adalah bentuk sel endotel cobblestone dengan ciri spesifik sel pada bagian tengah tarnpak bulat dan terang (menyala), bentuk sel pipih dengan jarak antara sel yang teratur dan rapat, permukaan sel mulus ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma, extra celluler matriks (ECM) dan tidak terdapat sel yang apoptosis serta monolayer primer

10

{

4.1.1

Optimalisasi dosis ekstrak buah pare (Monwrdica charantia) Optimalisasi dosis ekstrak buah

ekstrak secara

pare

bertujuan unfuk

melihat toksisitas

kasar pacta sel endotel dan mendapatkan dosis ekstrak yang tepat untuk

digunakan dalam kelompok perlakuan. Dosis yang dipergunakan dalam optimalisasi dosis ekstrak adalah 2 mg/ml, l mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,001 mg/ml. Sel endotel diinkubasi selama 2 jam dengan pengamatan tiap Jam. Tabel 4 . 1 . Optimalisasi Dosis Ekstrak Buah Pare Waktu Pengamatan Jam ke-1 Jam ke-2

2 Sel Mati (Apoptosis) Sel Mati Mengambang

Dosis Ekstrak Buah Pare (mg/ml

1 Sel Hidup Set Mati

0,1 Sel Hidup Sel Hidup

0,05 0,01 Sel Sel Hidup Hidup Sel Sel u p Hidup Hid



Sel endotel yang diinkubasi dengan ekstrak buah pare dosis 2 mg/ml mengalami kematian (apoptosis) dan sel lepas (mengarnbang) pada medium serta banyak

{

terdapat daerah yang kosong pada jam pertama. Hal ini menunjukkan bahwa

dosis ekstrak 2 mg/ml toksik bagi sel endotel. Demikian pula untuk dosis I mg/ml. Pada pengamatan jam pertama sebagian besar sel tampak mulai mengembung (membesar), mulai ada yang mengalami shrinkage (mengkerut), jarak antar sel

melebar, meskipun masih terdapat sebagian sel hidup. Pada pengamatan jam kedua didapatkan sel mengalami kematian (apoptosis). Sedangkan inkubasi sel endotel dengan ekstrak 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,001 mg/ml terlihat sel hidup hingga pengamatan pada jam kedua. Kelima dosis tersebut digunakan dalam kelompok perlakuan.

4.1.2

Basil Pengukuran Kadar p65 NF-KB Aktifsel HUVECs dengan ELISA Pengamatan NF-KB aktif dilakukan dengan mengukur kadar sub unit p65 NF

K.B yang sudah terjadi translokasi di dalam inti sel menggunakan NF-KB1p65 ActivELISA Kit (IMGENEX). Sampel yang digunakan adalah hasil kultur sel endotel yang dipapar leptin 500 ng/ml kemudian dilanjutkan dengan pemberian ekstrak buah

II

pare dengan dosis 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,001 mglml. Hasil pengukuran p65 NF·KB dapat ditunjukkan di bawah ini. Kadar p65 NF-KB meningkat pada kelompok dengan pemberian leptin 500 ng/ml (kontrol positif). Peningkatan p65 NF·KB ini berbeda secara bennakna dibandingkan dengan kelompok sel normal tanpa pemberian leptin (kontrol negatif). Pemberian ekstrak buah pare selama 2 jam pada dosis besat;, meningkatkan aktivitas p65 NF·KB. Dengan menurunkan dosis didapatkan penurunan kadar p65 NF·KB yang

aktif seperti pada tabel 4.2. Hasil analisis menunjuk.kan bahwa pemberian efek ekstrak buah pare dosis 0,005 mglml dapat menurunkan aktifitas p65 NF-KB secara berrnakna dibandingkan kontrol positif dan ini tidak jauh berbeda dengan kelompok tanpa pemberian leptin. Tabel 4.2. Hasil analisis statistik pengukuran kadar p65 NF·KB aktif pada kelompok .

perlakuan dengan One Way Anova Kelompok

'

Mean ± SD

*

421 .927 ± 370.957 a 5578.073 ± 893 . 1 10 od

Kontrol Kontrol Positif 0,1 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin

6870.432 ± 2068 .823

d

5405.3 1 56 ± 2253 .125

0,05 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin

cd


3 1 26.2458 ± 568.388 be

0,005 mglml ekstrak buah pare + Leptin

2438.5382 ± 722.200


1 023.2558 ± 779.758

Keterangan (p<0,05)

4.1.3

Basil

ab

ab

notas1 yang sama menunJukkan tldak ada perbedaan yang nyata

Evaluasi

Densitas

p65

NF-KB

Aktif

sel

HUVEC

dengan

dengan

metode

Imunoftuoresen Densitas

p65

NF-KB

pada

penelitian

ini

diamati

imunofluoresen terhadap masing·masing kelompok (gambar 4.2.). Pada kelompok kontrol tarnpak sel tidak kuat menyerap zat fluoresen, sedangkan

pada kelompok kontro l positif dimana diberikan leptin 500 ng/ml tampak sel terwama kuat dengan zat fluoresen. Hal yang sama juga tampak pada kelompok yang

12

diinkubasi dengan ekstrak buah pare dosis besar (0, 1 mg/ml). Penurunan dosis ekstrak buah pare menyebabkan penurunan ekspresi dari sel en?otel.

Gambar 4.2. Hasil pengecatan imunofluoresen kultur sel HUVECs dengan menggunakan antibodi anti p65 NFkB

Keterangan : Kelompok 1 : Kontro� Kelompok 2: Kontrol positif, Kelompok 3 : ekstrak buah pare 0,1 mglmJ, Kelompok 4: ekstrak buah pare 0,05 mglml, Kclompok 5: ekstrak buah pare 0,0I mglml, Kelompok 6: ekstrak buah pare 0,005 mg/ml. Kelompok 7: ekstrak buah pare 0,001 mglml. Gambar diambil dengan menggunakan fotomikroskop Olympus CX3 l dengan perbesaran 1OOOx. Hasil pengamatan pada penelitian ini menunjukkan bahwa densitas p65 NF�· KB pada kelompok kontrol ( 1 6 1 9.909 ± 3 1 0.735) berbeda secara signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (p<0.05). Sedangkan pada kelompok yang diberi ekstrak buah pare dosis 0,001 mg/ml (1443.1 57

±

233.5331), densitas p65

NF-l
maupun kelompok yang mendapat ekstrak buah pare dosis 0,1 mg/ml. Penurunan ini tidak berbeda dengan kelompok kontrol negatif(161 9.909 ± 3 1 0.735). Dari

hasil analisis

densitas

p65

NF-KB

dan

berdasarkan

tabel

4.3

menunjukkan bahwa penurunan dosis ekstrak pare dapat menurunkan densitas p65 '

NF�KB. Penurunan signifikan densitas p65 NF-KB terjadi pada pemberian dosis ekstrak buah pare dibawah 0,005 mg/ml (p<0,05).

13

Tabel 4.3. Hasil analisis statistik pengukuran densitas p65 NF-KB aktifmenggunakan Immunof1uoresen pada ke Iompo kperlakuan dengan 0ne Way Anova Kelompok Kontrol Kontrol Positif 0,1 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,05 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,01 mglmJ ekstrak buah pare + Leptin 0,005 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,001 mg/ml ekstrak buah pary + Leptin

Mean ± SD

*

310.735 a 2997.431 ± 362.175 I> 282 1 . 1 3 1 ± 256.281 b 241 1 .990 ± 477.989 b 161 9.909 ±

2742.751 ± 47 1 . 9 1 3

b

1 595.508 ± 339.366 a 1443,157 ± 233.5331

a

Keterangan : notast yang sama menunJukkan ttdak ada perbedaan yang nyata (p<0,05)

4.1.4

Basil Perhitungan Ekspresi protein IRS-1 pada sel HUVEC dengan Imunohistokimia

Hasit pengamatan dan perhitungan ekspresi protein IRS-1 pada kelompok kontrol positif (24.40 ± 3.975) didapatkan penurunan jumlah sel yang terekspresi IRS-I. Hal ini menunjukkan perbedaan bennakna jika dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (41.60 ± 4.219). Pada ekstrak buah pare dosis rendah terjadi peningkatan ekspresi protein lRS-1 secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (p:=;0.05). Pemberian ekstrak buah pare dosis 0,001 mg/ml (51 .20

±

1 6.649) tidak berbeda signifikan bila dibandingkan

pada kelompok

kontrol

negatif (41 .60 ± 4.219).

Tabel 4.4. Hasil analisis statistik ekspresi IRS-1 menggunakan Immunohistokimia pada kelompok perlakuan dengan One Way Anova Kelompok

Kontrol Kontrol Positif 0,1 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,05 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,01 mglml ekstrak buah pare + Leptin 0,005 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin 0,001 mg/ml ekstrak buah pare + Leptin Keterangan

Mean ± SD * 41 .60 ± 4.219 ab 24.40 ± 3 975 8 32.20 ± 8.729 ab 41 .60 ± 14.293 ab 37.80 ± 1 4.923 ab 48.80 ± 12.617 b .

5 1 .20 ± 16.649 b

notast yang sama menunJukkan ttdak ada perbedaan yang nyata

(p
14

Hasil pengecatan secara imunohistokimia pada kultur sel endotel yang telah diberi ekstrak buah pare selama 2 jam kemudian dipaparkan

dengan leptin

selama 6

jam tampak pada gambar 4.3. Pada kelompok kontrol positif terjadi penurunan ekspresi protein IRS-1 yang ditandai dengan sitoplasma berwama coklat pucat. Dari

gambar tersebut tampak bahwa semakin rendah dosis ekstrak buah pare maka ekspresi protein

VCAM-1 semakin meningkat. Hal ini ditandai dari semakin

bertambahnya jumlah dan intensitas wama coklat pada sitoplasma sel endotel.

Gambar

4.3

Keterangan

Hasil

pengecatan

imunohistokimia

menggunakan antibodi anti IRS-I

kultur

set

HUVECs

dengan

Kelompok 1 : Kontrol, Kelompok 2: Kontrol positif, Kelompok

3:

ekstrak buah pare 0,1 mg/ml, Kelompok 4: ekstrak buah pare 0,05

mg/ml, Kelompok 5: ekstrak buah pare 0,01 mg/ml, Kelompok 6: ekstrak buah pare 0,005 mg/ml. Kelompok 7: ekstrak buah pare 0,001

mg/ml. Wama coklat dalam sitoplasma yang menunjukan ekspresi IRS-

1 (panah merah). �bar diambil dengan menggunakan fotomikroskop Olympus CX31 dengan perbesaran 1 OOOx.

15

4.1.5

Basil Perbitungan E kspresi protein VCAM-1 pada sel HUVEC dengan lmunohistokimia Pada gambar 4.4 menunjukkan basil pengecatan secara imunohistokirnia pada

kultur sel endotel yang telah diberi ekstrak buah pare selama

2

jam kemudian

dipaparkan dengan leptin selama 6 jam. Pada kelompo� kontrol positif terjadi peningkatan ekspresi protein VCAM-1 yang ditandai dengan sitoplasma berwarna kecoklatan. Dari gambar tersebut tampak bahwa semakin rendah dosis ekstrak buah pare maka ekspresi protein VCAM-1 semakin menurun. Hal in i ditandai dari semakin berkurangnya jumlah

dan intensitas wama coklat pada sitoplasma sel endotel.

Gambar 4.4 Hasil pengecatan imunobistokimia kultur sel HUVECs dengan antibodi anti VCAM-1

menggunakan

Keterangan : Kelompok 1: Kontrol, Kelompok 2: Kontrol positif, Kelompok 3: ekstrak buah pare 0,1 mg/ml, Kelompok 4: ekstrak buah pare 0,05 mg/ml, Kelompok 5: ekstrak buah pare 0,01 mglml, Kelompok 6: ekstrak buah pare 0,005 mg/ml. Kelompok 7: ekstrak buah pare 0,001 mg/ml. Warna coklat dalam sitoplasma yang menunjukan ekspresi VCAM-l (panah merah). Gambar diambil dengan menggunakan fotomikroskop Olympus CX3 1 dengan perbesaran I OOOx.

16

Hasil pengamatan dan perhitungan ekspresi protein VCAM- 1 pada kelompok · jumlah sel yang mengalami

kontrol positif didapatkan peningkatan meskipun peningkatan

ini

ekspresi

tidak bermakna jika dibandingkan dengan kontrol.

Peningka1an jumlah sel yang mengalami ekspresi VCAM-1 terjadi pada pemberian ekstrak buah pare dosis besar (0, 1 mglml) selanjutnya dengan penurunan dosis hingga 0,001 mg/ml tetjadi penurunan ekspresi VCAM-1 . Penurunan ekspresi VCAM ini (1 9.40 ± 18.955)

berbeda secara bermakna hila dibandingkan dengan

kelompok

kontrol positif (65.00 ± 4.950) maupun pada kelompok yang mendapat pemberian

ekstrak buah pare dosis 0,1 mg/ml (60.40 ± 23.093). Tabel 4.5. Hasil analisis statistik ekspresi VCAM-1 menggunakan Immunohistokimia pada kelompok perlakuan dengan One Way Anova Mean ± SD

Kelompok

*

Kontrol

46.00 ± 15 .668 800

Kontrol Positif

65.00 ± 4.950


60.40 ± 23.093


48.00 ± 10.794


40.80 ± 7.855

c

be abc

abc

+ Leptin

34.60 ± 1 4.859

ab


19.40 ± 18.955

8

0,005 mg/ml ekstrak buah pare Keterangan

{p
notast yang sama menunJukkan ttdak ada perbedaan yang nyata

4.2 Pembahasan Penelitian 4.2.1

Disfungsi endotel akibat a ktiva si p65 NF-KB, hambatan sinyal transduksi

IRS-1 dan peningkatan ekspresi VCAM-1

Endotel berperan dalam men jaga homeostasis vaskuler, mengatur tonus

pembuluh darah, proliferasi otot polos vaskuler. dan keseimbangan trombosis trombo lisis. Adanya berbagai stimulus mekanik dan kimia mengakibatkan sel endoteJ mensintesis

dan mengeluarkan sejumlah substansi vasoaktif, fuktor pertumbuhan

faktor lain yang memediasi fungsi ini

Disfungsi endotel merupakan vasokonstriksi dan

vasodilator.

dan

(Call es-Escandon J, Cipolla M., 2001 ).

suatu kondisi kctidakseimbangan antara faktor faktor yang meningkatkan

dan menghambat

17

pertumbuhan, faktor pro- dan antiaterogenik, dan faktor pro- dan antikoagulan . .

Aktivasi

NF-KB dapat dipicu oleh peningkatan sitokin inflamasi, metabo lit

maupun ROS pada obesitas terjadi akibat aktifitas enzim protein kinase C (Ramana,

et al., 2004). Pada penelitian ini di peroleh hasil terdapat peningkatan kadar dan densitas NF-lCB pada sel HUVECs yang dipapar dengan leptin 500 ng/ml. Terjadi peningkatan kadar NF-KB secara signifikan pada kelompok yang dipapar leptin

gkan dengan kelompok kontrol negatif (421.927 ±

(5578.073 ± 893. 1 10 ) dibandin

370.957). Begitu pula dengan densitas NF-KB terjadi peningkatan bennakna pada kelompok kontrol positif dengan kontrol negatif (p<0,05) lni menunjukkan peran leptin sebagai agen pro inflamasi pada keadaan obesitas. Aktivasi oleh leptin, menyebabkan translokasi NF-KB ke dalam nukleus. Pada kondisi sel istirahat (resting cell), NF-KB berada di sitoplasma dalam keadaan inaktif yang mengandung sub unit p50 dan p65 yang berikatan dengan protein inhibitor KB

(IkB) untuk mencegah translokasi ke dalam nukleus (Droge,

2002;

Celeg, 2004). Akibat aktifitas enzim PKC menyebabkan penambahan fosfat pada IkB sehingga ikatan NF-KB - IkB terlepas. IkB merupakan serin kinase yang mengontrol aktivasi p65 NF-KB yang merupakan faktor transkripsi inflamasi. Terlepasnya ikatan ini menyebabkan NF-KB menjadi aktif Secara otomatis NF-KB berpindah ke dalam inti sel, karena p50 mempunyai nuclear localization signal (NLS) yang terhambat saat berikatan dengan IkB (Droge, 2002; Celeg, 2004). Peningkatan kadar NF-KB selanjutnya menyebabkan hambatan pada aktivitas fosforilasi IRS-I dan mengakibatkan terganggunya sinyal downstream selanjutnya yaitu pada fosforilasi PI3-Kinase dan eNOS. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme

jalur inflamasi berkontribusi terhadap kegagalan sinyal insulin dan menyebabkan kegagalan aktivitas fosforilasi IRS-I dan PI3-Kinase yang berakibat pada penurunan produksi NO yang berakibat tetjadinya disfungsi endotel (Montagnani M, et al., 2002). Hasil uji one�way Anova terdapat penurunan bermakna (p<0,05) hantaran sinyal transduksi lRS-1 pada kelompok sel endotel yang dipapar dengan leptin 500 ng!ml (41.60 ± 4.219) dengan kelompok sel endotel (24.40 ± 3.975) normal .

18

Hambatan aktivitas fosforilasi IRS-1

dan PI3 -Kinase berakibat pada penurunan

produksi NO yang menyebabkan terjadinya disfungsi endotel. Adanya hambatan transduks i sinyal IRS-1 menginduksi ekspresi molekul adesi vascular cell-adhesion molecule I VCAM-1

dengan Monosit serta

sel

(VCAM- 1 ) pada permukaan endotel. Ikatan T melalui

Very Late Antigen

(YLA4)

menstimulus terbentuknya chemokines yang memicu penarikan dan retensi sel mononuclear dalam lapisan intima sehingga memperberat disfungsi endotel dan memulai pembentukan plak aterosklerosis di pembuluh darah arteri. Pada peneliti.an ini terdapat peningkatan ekspresi IRS-I pada kelompok kontrol positif sebesar 65.00

:i::

4.950 dibandingkan pada kelompok sel normal

ekspresi IRS-I sebesar 46.00

:i::

1 5 .668. Narnun berdasarkan uji statistik one-way

Anova perbedaan tersebut tidak bermakna secara signifikan.

4.2.2

Efek ekstrak buah pare terhadap aktivasi p65 NF-KB sel endotel Pemaparan dengan leptin 500 ng/ml akan mengaktifkan jalur NF-1
menyebabkan terjadinya disfungsi endotel. Pengukuran p65 NF-KB pada penelitian ini merupakan NF-l0,05). Penurunan terendah terjadi pada kelompok yang mendapat ekstrak pare dosis rendah (0,001 mglml). Pemberian ekstrak pare dosis rendah menghambat paparan sitokin inflamasi dalam mengaktifkan NF-l
Hal ini membuktikan peran protektif (anti oksidan) ekstrak pare sebagai terhadap· leptin yang meningka� pada obesitas melalui jalur signal proinflamasi, disamping juga menghambat aktivasi NF-l
19

dengan penelitian Crespo dkk 20ds dan Stewart 2008 dengan menggunakan quercetin sebagai anti oksidan. Didapatkan penurunan ekspresi sitokin ·proinflamator melalui aktivitas p65 NF-KB. Adanya penurunan aktivitas p65 NF-KB maka hambatan terhadap fosforilasi IR.S-1 menjadi turun sehingga penurunan produksi NO melalui efek yang dimediasi oleh p65 NF-KB melalui jalur IRS-l!Pl3-K/eNOS tidak te.rganggu.

4.2.3

Efe k ekstrak buab pare terhadap bantaran sinya l transduksi IRS-I sel endotel Adanya

hambatan

pada

aktivitas

fosforilasi

IRS-1

mengakibatkan

terganggunya sinyal downstream selanjutnya yaitu pada fosforilasi PB-Kinase dan eNOS. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme jalur inflamasi berkontribusi terhadap kegagalan sinyal insulin dan menyebabkan kegagalan aktivitas fosforilasi IRS-I dan PI3-Kinase yang berakibat pada penurunan produksi NO yang berakibat terjadinya disfungsi endotel (Montagnani M, et al., 2002). Pemberian ekstrak buah pare berbagai dosis meningkatkan hantaran sinyal transduksi IRS-1. Peningkatan hantaran

IRS-I bertambah besar pada pemberian

ekstrak buah pare pada dosis rendah. Uji dengan menggunakan one-way Anova menunjukkan perbedaan yang bermakna. Pada dosis 0,001 mg/ml tetjadi peningkatan hantaran IRS-1 sebesar 5 1 .20 ± 1 6.649 dibandingkan dengan dosis ekstrak pare 0,1 mg/ml (32.20 ± 8.729) maupun kelompok kontrol positif (24.40 ± 3.975). Adanya peningkatan hantaran IRS-I menstimulus pembentukan produksi NO sehingga fungsi vasodilatasi tidak terganggu serta tidak terjadi disfungsi endotel.

4.2.4

Efek ekstrak buab pare terhadap ekspresi protein VCAM-1 sel endotel Salah satu fungsi dari sel endotel adalah menjaga tonus pembuluh darah dan

memproduksi NO sebagai salah satu substansi vasodilator yang tergantung endotel. NO tidak hanya sebagai vasodilator NO juga berperan dalam berbagai proses pada ,

vaskuler seperti menurunkan migrasi dan pertumbuhan sel otot polos, agregasi platelet dan thrombosis, serta inflamasi. Penurunan bioaktivitas NO merupakan salah

20

satu pertanda adanya disfungsi endotel yang akan mendasari berbagai penyakit vaskuler.

NO

berperan

penting

pada

perkembangan

aterosklerosis,

ekspresi

endothelial terhadap molekul adesi dan sitokin prointlamasi yang terlibat pada intlamasi aktif dan penumpukan makrofag pada tempat pia� secara selektif diturunkan oleh NO (Bonetti, eta/., 2003).

Ikatan VCAM-1

dengan Monosit dan sel T

melalui Very Late Antigen

(VLA4) menstimulus terbentuknya chemokines yang memicu penarikan dan retesi set

mononuclear dalam lapisan intima sehingga memperberat disfungsi endotel dan memulai pembentukan plak aterosklerosis di pembuluh darah arteri. Pada penelitian didapatkan bahwa pemberian ekstrak buah pare dosis 0,1 mg/ml meningkatkan ekspresi VCAM-1 (60.40 ± 23.093). Uji one-way Anova menunjukkan peningkatan ini tidak berbeda secara bermaknajika dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (65.00 ± 4.950). Penurunan dosis ekstrak ikut menurunkan ekspresi VCAM-1. Ekspresi VCAM-1 pada sel endotel yang diberi ekstrak pare dosis rendah (0,001 mg/ml) menurun secara bermakna hila dibandingkan ekspresi pada dosis besar (0,1 mg/ml).

21

BAB V KESIMPULAN

Ekstrak buah pare (Mon.zordica charantia) berperan dalam memperbaiki disfungsi endotel akibat paparan dengan human recombinan leptin. Mekanisme kerja ekstrak buah pare adalah dengan menurunkan ekspresi VCAM-1 melalui penurunan

NF-'KB & peningkatan IRS- I . Dosis rendah ekstrak buah pare (0,001 mg/ml) berperan optimal dalam ketiga mekanisme tersebut.

22

UCAPAN TERIMA KASffi

1. Badan

Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan Republik

Indonesia melalui program Risbin Iptekdok

2.

Fakultas Kedokteran Universitas Jember

3.

RSUD Dr. Soetomo Surabaya

4.

Laboratorium Ilmu Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

23

DAFfAR PUSTAKA

Adiningsih Sri, 2005, Indonesia Nutritional Pattern in Contributing Prevalence of Obesity, Fourth Basic Molecular Biology Cours in Patophysiology of Obesity, p:

36-44 Atjita, 2002. Pengaruh Kadar Glukosa Tinggi Terhadap Sintesa Nitrix Oxide Dari Huvecs Culture Dengan Teknik Bioassay. Biosain, Volume 2 No 1 April. Barrata M., 2002, Leptin-frorn a signal of adiposity to a hormone mediator in peripheral tissues. Med Sci Monit 8 :RA 282-292 Bonetti, P.O., Lilach, O.L., Amir, L., 2003. Endothelial Dysfunction: A Marker Of Atherosclerotic Risk. Arteriosclerosis, Thrombosis, And Vascular Biology,

23:1 68. Case, J., and Davison, C. A 1999. Estrogen alters relative contributions of nitric oxide and

cyclooxygenase

products

to

endothelium-dependent

vasodilation.

J.

Pharmacol. Exp. Ther. 291 (2):524-530. Crespo, 1., Garcia-Mediavilla, M.V., Almar, M., Gonzalez, P., Tunon, M.J., Sanchez Campos, S., Gonzalez-Gallego, J., 2008. Differential effects of dietary flavonoids on reactive oxygen and nitrogen speci es generation and changes in

antioxidant enzyme expression induced by proinflammatory cytokines in Chang Liver cells. Food Chern. Toxicol. 46, 1 555-1 569. Crespo, I., Garcia-Mediavilla, M.V., Gutierrez, B., Sanchez-Campos, S., Tunon, M.J., Gonzalez-Gallego, J., 2008. A comparison of the effects of kaempferol and quercetin on cytokine-induced pro-inflammatory status of cultured endothelial cells. Br. J. Nutr. I 00, 968-976.

human

Deedwania, P.C., Volkova, N. 2006. Metabolic syndrome and cardiovascular disease: epidemiology, pathophysiology and therapeutic implications. In PK Shah, ed:

Risk Factors for Coronary Artery Disease. London, UK: Taylor and Francis: 1 -

34.

H, Satuman, Rudijanto A, Indra MR. 201 I . Pengaruh Likopen terhadap Penurunan Aktivitas Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) dan Ekspresi Endothelin-1 (ET-1) pada Kultur Huvecs yang Dipapar Leptin. Jumal Natur

Fatmawati

Indonesia 13(2) 1 62-167 Gareus, R., Kotsaki, E., Xanthoulea, S., Made, I., Gijbels, MJ.J., Kardakaris, R., Polykratis, A., Kollias, G., Winther, M.P.J., Pasparakis, M. 2008. Endothelial Cell-Specific NF-kB Inhibition Protects Mice from Atherosclerosis. Cell Metabolism 8, 372-383. Haque ME, Alam MB, Hossain MS. 201 1 . The Efficacy Of Cucurbitane Type Triterpenoids, Glycosides and Phenolic Compounds Isolated From Momordica

24

Charantia : A Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research Vol. 2(5): 1 135�1 1 46. Ho, E., 2002. NF-kB - What Is It and What's The Deal With Radicals? Linus Pauling Institute Scientist Department Of Nutrition And Food Management, Oregon State University. Indra, M.R, 2006. Adiposit, obesitas dan masalah kesehatan global di era millenium. Edisi Pertama. Penerbit. Lab. llmu Faal FK UNIBRAW. Malang. ISBN

:

979�

25-9010-2. Kaput, J., Jose, MO., Lynnette, F., Ben, V.M., et a/., 2005. The Case for strategic international alliances to harness nutritional genomics for public and personal health. British Journals ofNutrition. 94, 623-632.

Karisson P., Lindell K., Svensson E., Bergh C., Lind P., Billig H., Carisson L.M. S , and Carisson B., 1 997, Expression of.fimctional leptin receptors in the human .

ovary. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 82:4144-4146 Libby, P., Paul, M.R., Attilio, M., 2002.

Inflammation and Atherosclerosis.

American Heart Association, Inc., Circulation 105:1 1 3 5:1 143.

Melotti, P. E Nicolis, A Tamanini, R Rolfini, A Pavirani and G Cabrini. 200 1 . Activation ofNF-kB mediates ICAM-1 induction in respiratory cells exposed to an adenovirus-derived vector. Gene Theraphy. Volume 8, Number 1 8, Pages 1436-1442 Middleton, E., Chithan, K, Theoharis, C.T., 2000.

The Effects of Plant Flavonoids

on Mammalian Cells:Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts (T.C.T.),Vol. 52, Issue 4, 673-751 Monaco, C., Jenifer, G., Ewa. P.,2004. The Role Of The NF-kB Pathway In Atherosclerosis. Kennedy �stitute Of Rheumatology & Division Of Surgery, Anesthetic and Intensive Care, Faculty Of Medicine, Imperial College, London, UK. Montagnani M, Ravichandran LV, Chen H, Esposito DL, Quon MJ. 2002. Insulin receptor substrate-.! and phosphoinositide�dependent kinase�l are required for insulin-stimulated production of nitric oxide in endothelial cells. ,\4ol E'ndocrinol

1 6 : 1 93 1 - 1 942. Papayianni, A ,

Alexopoulos,

E, Giamalis, P., Gionanlis, L., Belechri, A.M.,

Koukoudis , P., Memmos, D. 2002. Circulating levels of ICAM- 1 , VCAM-1, and MCP-1 are increased in haemodialysis patients: association with inflammation, dyslipidaemia, and vascular events. Nephrol Dial Transplant I 7: 43 5-441 . Sarbini D, Sargowo D, Rohman MS. 2007. Efek Ekstrak Teh Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa Linn) terhadap Penghambatan Aktifu.si NF-KB, Ekspresi Protein TNF-a dan ICAM� l pada Biakan HUVECS yang Dipapar dengan Low Density Lipoprotein Teroksidasi. J Kard iol Ind 28: 1 3 3-141 .

25

Soileau JL, Ribnicky D, Wang ZQ, Raskin I, Poulev A, Majewski M, Cefalu WT, Gettys TW. 2008. Quercetin transiently increases energy expenditure but persistently decreases circulating markers ·of inflammation in C57BL/6J mice fed a high-fat diet. Metabolism, Clinical and Experimental I 57:S39-S46.

Stewart LK,

Suarez, L., 2005. Nutritional Genomics:Customizing Diet Plans According to Genetic Makeup. Diabetic microvascular complications today. Issues in Diabetes. Steinberg, G.R. 2007. Inflammation in obesity is the common link between defects in fatty acid metabolism and insulin resistance. Cell Cycle ; 6:888-894. WHO. 2000. Obesity: Preventing and Managing the Global Epidemic. Geneva. Wihastuti TA, Sargowo D, Rohman MS. 2007. Efek Ekstrak Daun Kelor (Moringa Oleifera) Dalam Menghambat Aktifasi NFkB, Ekspresi TNF-a dan ICAM-1

pada HUVECS yang DipaparLDL Teroksidasi. J Kardiol Ind 28: 181 -188. Hotamisligil, G.S. 2005. Inflammation, stress, and diabetes. J Clin Invest 1 15: 1 1 1 1-1 1 19.

Wellen, K.E.,

26

Lampiran 1 Data Statistik Kadar NFkB Descriptives

95% Std.

Mean

N

Deviation

Std. Error

J

Confidence Interval for Mean

Minimu

Lower

Upper

Bound

Bound

Maxi1

m

m

I

5

421.9269

370.95668

165. 89687

-38.6766

882.5305

1 09.63

92::

2

. 5

5578.0731

893 . 1 1014

399.4 1 1 00

4469 . 1 304

6687 .0158

4910.30

685::

3

5 6870.43 1 9

2068.82334

925.20593

430 1 .6484

9439.2154

3465 . 1 2

886::

4

5

5405.3 1 56

2253 . 1 2494

1007.628 1 1

2607.69 1 5

8202.9397

1 803.99

735:

5

5 3 1 26.2458

568.38795

254.1 9082

2420.4990

3831 .9927

2534.88

386�

;)

5

2438.5382

722 . 19984

322.97759

1 5 4 1 . 8087

3335.2677

1372.09

336�

7

5

1023.2558

779.75835

348.71854

55.0579

1991 .4537

43 . 1 9

198(

35

3 5 5 1 . 9696

2588.44501

437. 52706

2662.8077

444 1 . 1 3 1 6

43 . 1 9

886:

,

Total

Test of Homogeneity of Variances

"I

Levene

Statistic

II

. .1

2.391

dfl

Sig.

dt2

.054

28

6

ANOVA

�I Between

Sum

of

Squares l .808E8

Groups

Mean

Df

Square 6

3.014E7

Within Groups

4.698E7

28 1 1 677788. }67

Total

2.27-8E8

34

F

1 7.962

Sig. .000

27

Post Hoc Tests Multiple Comparisons

Dependent

(I) Perlakuan

(J)

.

Mean

Perlakuan

Difference Std. Error

(I-J) Tukey

1

HSD

2

.000

-9047. 1655

-3849.84L

.000

-7582.0492

-2384. 72�

5

8 1 9.21625 * -4983.38870 8 1 9.21625 -2704.31 894* 8 19.21625

.037

-5302.9795

- 1 05.65�

6

-2016.61 1 30 8 19.21625

.212

-46 1 5.2718

582.04�

7

8 1 9. 2 1 625

.989

-3 1 99 . 9894

1997.3 3 1

1

-60 1 .3 2890 " 5 1 56 . 1 4 6 1 8

819.2 1 625

.000

2557.4857

7754 80t

3

- 1 292.35880

8 1 9.2 1 625

.697

-3891.0193

1 306.30 J

4

172.75748 8 1 9. 2 1 625

1 . 000

-2425.9030

277 1 .4 H

5

.074

- 1 46.8333

5050.48�

.010

540.8744

5738.19:

.000

1956.1 568

7 1 53.47�

1

245 1 .82724 81 9.21625 . 3 1 39.53488 8 19.21625 4554.81 728. 8 19.2 1625 . 6448.50498 8 1 9.21625

.000

3849.8445

9047.16:

2

1292.35880 819.21625

.697

- 1 306.3 0 1 7

389 1 .01�

4

1465 . 1 1 628 8 19 . 2 1 625 * 3 744.1 8605 819.21625 443 1 . 89369* 8 1 9. 2 1 625

.566

- 1 1 33.5442

4063.77{

.002

1 145.5255

6342.84<

.000

1 833.2332

7030. 55t

5 6

I I

I

-5 1 56. 14618 -6448.50498

.

*

,

7

5847. 1 7608

8 1 9. 2 1 625

.000

324 8. 5 1 5 6

8445.83(

1

4983.38870*

819.21625

.000

2384.7282

7582 .04�

2

- 1 72.75748

8 1 9. 21625

1 .000

-277 1 .4 1 80

242 5 .90:

3

- 1465 . 1 1628 8 19.21625

.566

-4063.7768

1 133.54"

5

2279.06977 819.21625 . 2966.77741 819.21625 4382.05980. 8 1 9.21625 * 2704.3 1 894 8 1 9.21625

.115

-3 1 9.5907

4877.73(

.017

368.1 169

5565.43'

.000

1 783.3993

6980.72!

.037

105.6584

5302.971

.074

-5050.4878

146.83:

3

-245 1 . 82724 8 1 9.21625 -3744. 1 8605 . 8 1 9.21625

.002

-6342.8466

- 1 145.52:

4

-2279.06977 8 1 9.21625

. 1 15

-4877.7303

3 1 9.591

6

687.70764 8 1 9 . 2 1 625

.97 8

-191 0.9529

3286.36:

8 1 9 . 2 1 625

. 1 75

-4 95. 670 5

4701.65·

6 7 5

Bound

-2557.48�

7

(

Bound

-7754.8067

6

4

Sig.

Upper

.000

4

3

.

Lower

81 9.21625

3

2

9 5% Confidence Interval

1 2

7

2102.99003

28

6

1

7

2016.6 1 1 30 819.21625

.212

-582 . 04 92

461 5 .27 1 8

819.2 1625

.010

-5 73 8 . 19 54

-540. 8744

.000

-7030.5542

- 1 833.2332

.017

-5565.4379

-368 . 1 16�

2

-3139.53488.

3

.

4

-443 1 . 89369 819.21625 . -2966.77741 8 1 9. 2 1 625

5

-687.70764 8 1 9.21625

.978

-32 86.368 2

1 91 0. 952S

7

1 4 1 5.28239 819.2 1625

.

604

- 1 1 83.3781

4013 .9425

1

60 1 . 32890 819.2 1625

.989

-1997. 3 3 1 6

3 1 99.9894

.

2

-4554.81 728*

819.21625

.000

- 7 1 53 . 4778

-1956. 1 56�

3

-5847.17608* 819.21625

.000

-8445.8366

-3248 .515(

4

-43'82. 05980. 8 1 9.21625

.000

-6980.7203

- 1 783.399�

5

-2 1 02.99003 8 1 9.21625

. 1 75

-470 1 . 6505

495.670=

-6

- 1 4 1 5.28239 819.21625

.604

-40 1 3 . 9429

1 1 8 3 . 3 78 :

Homogeneous Subsets

iQ

Subset for a ha = 0.05

Perlakuan

2

1

N

Tukey

1

5

421 .9269

HSDa

7

5

1 023.2558

1023.2558

6

5

243 8 . 53 82

243 8. 5382

5

5

4

5

2

5

3

5

Sig.

4

3

3 1 26.2458 3 1 26.2458 5405.3 1 5 6 5405.3 1 5 6 \

5578.0731

5578.073 1 6870 43 19 .

.2 1 2

. 1 75

.074

.566

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000.

29

:.ampiran 2 Data Statistik Densitas NFkB

Desc riptives

95% Confidence Interval for Std.

Mean

N

Std. Error

Deviation

Mean

-Minimu

Lower

Upper

Bound

Bound

Maxim

m

m

1

5 1 6 19.9092

3 1 0.73544 138.965 1 1

1 234.0802

2005.7382

1 145.69

1 887.:

2

5 2997.43 14

362.1 7486

1 6 1 .96952

2547.73 19

3447. 1309

2387. 1 4

3346. '

3

5 282 1 . 1306

256.28060

1 1 4.6 1 2 1 7

2502.9162

3 1 39.3450

24 1 1 .29

3057.:

4

5 24 1 1.9902

477.98884 213.763 1 1

1 8 18.4887

1 942.32

3058.:

5 6

5 2/42.75 1 2 5 1595.5078

3005.4917

471 .9 1 267 2 1 1 .04576

2156.7942

3328.7082

2263.09

3404.t

j�otal

339.36593

1 5 1 .76906

1 1 74 . 1 293

2016.8863

1249.81

2043.(

1 04.43905

1 1 53 . 1 8 8 1

1 7 3 3 . 1 267

1 1 45,69

1743.�

1 1 8 . 8 1 232

1991 .6697

2474.58 1 1

1 1 45.69

3404.t

5

1443.1 574

233.53281

35

2233.1254

702.903 1 7

rest of Homogeneity of Variances Levene Statistic

1.075

dfl

Sig.

dQ

28

6

.401

ANOVA Densitas NFkB

Sum

of

Squares Between

Mean

Square

df

1 .3 1 4E7

t5

2 190220.502

3657154.360

28

1 30612.656

1 .680E7

34

F

16.769

Sig. .000

Groups Within Groups Total

30

Homogeneous Subsets Subset for alpha

Pedakuan

=

0.05

2

1

N

Tukey

7

5 1443 . 1 574

HSDa

6

5 1595. 5078

1

5 1 6 1 9.9092

4

5

241 1 .9902

5

5

2742. 7 5 1 2

3

5

282 1 . 1 306

2

5

2997.4314

Sig.

.986

' 1 77


31

Lampiran 3 Data Statistik Ekspresi IRS-1 Descriptives

95% Confidence Interval Mean

N

1

5

4 1 .6000 24.4000

Std.

Std.

Deviation

Error

4.21 900

for Mean Lower

Upper

Bound

Bound

Minimu

Maximu

m

m

1 . 88680

36.3614

46.8386

37.00

48.00

3.97492

1 . 77764

19.4645

29.3355

19.00

29.00

3 .90J 84

21.3612

43 .03 88

2 2.00

44.00

2

5

3

5·

32.2000

8 . 7292()

4

5

4 1 .6000

14.29336

6.392 1 8

23.8525

59.3475

22.00

59.00

5

5

37.8000

14.92314

6.67383

19.2705

56.3295

25.00

62.00

6

5

48.8000

12.61745

5.64269

33.1334

64.4666

37.00

63.00

7

5

5 1 .2000

16.64932

7.44580

30.5271

7 1 .8729

23.00

66.00

39.6571

13.79"886

2.33243

34.9 1 7 1

44.3972

19.00

66.00

35

Total

'

Test of Homogeneity of Variances Levene

Statistic 1.482

dfl 6

Sig. 28

.221

ANOVA

Sum of Squares

Mean

�f

Square

Between Groups

2581 .086

6

430. 1 8 1

Within Groups

3892.800

28

139.029

Total

6473.886

34

F

3.094

Sig. .019

32

Post Hoc Tests Homogeneous Subsets

Subset for alpha =

Perlakuan

0.05 N

Tukey HSDa

I

2

1

2

5

24.4000

3

5

32.2000

32.2000

5

5

37. 8000

37.8000

l

5

41 .6000

4 1 . 6000

4

5

41 .6000

41 .6000

6

5

48.8000

7

5

5 1 . 2000

Sig.

.276

.181


33

Lampiran 4 Data Statistik Ekspresi VCAM-1 Descriptives I

95% Confidence Interval for Mean

N

Std.

Std.

Deviation

Error

Mean Lower

Upper

Bound

Bound

Minimu

Maximu

m

m

1

5

46.00

1 5.668

7.007

26.55

65.45

27

63

2

5

65.00

4.950

2.214

58.85

71.15

59

71

3

5 5

60.40 48.00

23.093 10.794

10.328 4.827

3 1 .73 34.60

89.07 6 1 .40

43 40

101 66

5

5

40.80

7.855

3.513

3 1 .05

50.55

30

48

6 7

5

6.645 8.477

16. 1 5 -4.14

53.05 42.94

12 6

48

5

34.60 19.40

14.859 18.955

35

44.89

19.843

3.35 4

38.07

5 1 .70

6

101

4

Tota:l

52

r

est of Homogeoeity of Variances

Levene Statisti� 1.273

Sig.

df2 6

28

.301

ANOVA

Sum of Sguares Between

Mean Square

df

7 1 4 1 . 143

6

1 1 90.190

6246.400

28

223.086

13387.543

34

F

5.335

Sig. .001

Groups Within Groups Total

34

>ost Hoc

Tests

Elomogeneous Subsets

I Tukey HSDa

Subset for alpha = 0.05

Perlakuan

N

1

7

5

19.40

2

3

6

5

34,60

34.60

5

5

40.80

40.80

40.80

1

5

46.00

46.00

46.00

4

5

48.00

48.00

48.00

3

5

60.40

60.40

2

5

Sig.

65,00 . 069

. 1 27

' Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

. 1 76

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000.

35

LAPORAN AKBIR PENELITIAN

Recommend Documents