Lampiran A. Data Persentase Kesakitan Ikan. Ulangan Perlakuan I II III

Lampiran A. Data Persentase Kesakitan Ikan

Ulangan Perlakuan

I Po(Kontrol) 0 pH 6,0 100 pH 6,5 80 pH 7,0 90 pH 7,5 80 pH 8,0 100 pH 8,5 60

II 0 90 100 100 90 80 60

III 0 100 90 80 100 80 70

% Total Kesakitan

% Rata-Rata Kesakitan

0 290 270 270 270 260 190

0 96,67 90,00 90,00 90,00 86,67 63,33

Keterangan: a. Waktu pengamatan dilakukan selama 6 hari dan dicatat kesakitan ikan setiap hari. b. Jumlah ikan pada awal perlakuan sebanyak 10 ekor per akuarium

Universitas Sumatera Utara

Lampiran B. Data Uji Normalitas, Non Parametrik Mann-Whitney Tests of Normality(b) Kolmogorov-Smirnov(a) Perlakuan Statistic df Sig.

Shapiro-Wilk Statistic df

Sig.

Kesakitan pH 6.0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5

0,384815 0,174678 0,174678 0,174678

3 3 3 3

. . . .

0,75 1 1 1

3 3 3 3

pH 8,0

0,384815

3 .

0,75

3

pH 8,5 0,384815 a. Liliefors significance Correction

3 .

0,75

3

-4,2E16 1 1 1 -4,2E16 -4,2E16

b. Kesakitan is contant when perlakuan = Po. It has been omitted

Npar Tests Kruskal-Wallis Test Mean Rank

Perlakuan N Kesakitan Po pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 pH 8,5 Total

3 3 3 3 3 3 3 21

2 16,83333 13,66667 13,66667 13,66667 12,16667 5

Test Statisticsa,b Kesakitan ChiSquare 14,18141 df 6 Asymp. Sig. 0,027674 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Perlakuan


Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N

Mean Rank

Kesakitan Po 3 2,00 pH 6,0 3 5,00 Total 6 a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan

Sum Rank 6 15

of

Sum Rank 6 15

of

Test Statisticb Kesakitan 0 6 -2,12132 0,033895

Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,1a a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan Po pH 6,5 Total

3 3 6

Mean Rank 2,00 5,00

Test Statisticsb Kesakitan 0 6 -2,08683 0,036904

Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,1a a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan


Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan Po pH 7,0 Total

3 3 6

Mean Rank 2,00 5,00

Sum Rank 6 15

of

Sum Rank 6 15

of

Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,08683 Asymp. Sig. (2tailed) 0,036904 Exact Sig. [2*(1tailed Sig.)] 0,1a a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan Po pH 7,5 Total

3 3 6

Mean Rank 2,00 5,00

Test Statistics(b) Kesakitan 0 6 -2,08683 0,036904



Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan Po pH 8,0 Total

3 3 6

Mean Rank 2,00 5,00

Sum Rank 6 15

of

Sum Rank 6 15

of

Test Statistics(b) Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

Kesakitan 0 6 -2,12132 0,033895 0,1a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan Po pH 8,5 Total

3 3 6

Mean Rank 2,00 5,00

Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,12132 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,033895 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,1a c. Not corrected for ties d. Grouping Variable: Perlakuan


Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan pH 6,0 pH 6,5 Total

3 3 6

Mean Rank 4,17 2,83

Sum Rank 12,50 8,50

of

Sum Rank 12,50 8,50

of

Test Statistics(b) Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties b. Grouping Variable:

Kesakitan 2,5 8,5 -0,94281 0,345779 0,4a


3 3 6

Mean Rank 4,17 2,83

Test Statistics(b) Kesakitan 2,5 8,5 -0,94281 0,345779



Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan Kesakitan pH 6,0 pH 7,5 Total

N 3 3 6

Mean Rank 4,17 2,83

Sum of Rank 12,50 8,50

Test Statistics(b)

Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2tailed) Exact Sig. [2*(1tailed Sig.)]

Kesakitan 2,5 8,5 -0,94281 0,345779 0,4a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank Perlakuan N Kesakitan pH 6,0 pH 8,0 Total

3 3 6

Mean Rank 4,33 2,67

Sum Rank 13,00 8,00

of





3 3 6

Mean Rank 5,00 2,00

Sum Rank 15,00 6,00

of

Sum Rank 10,50 10,50

of


Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan

0,100a


3 3 6

Mean Rank 3,50 3,50

Test Statistics(b) Kesakitan 4,500 10,500 ,000 1,000




3 3 6

Mean Rank 3,50 3,50

Sum Rank 10,50 10,50

of

Sum Rank 11,50 9,50

of

Test Statistics(b) Kesakitan 4,500 10,500 ,000 1,000



3 3 6

Mean Rank 3,83 3,17


Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,7 a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan



3 3 6

Mean Rank 5,00 2,00

Sum Rank 15,00 6,00

of


Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

0,1

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan


3 3 6

Mean Rank 3,50 3,50

Sum Rank 10,50 10,50

of

Test Statistics(b) Kesakitan 4,500 10,500 ,000 1,000 1,000a



Npar Test (Mann-Whitney Test) Ranks Perlakuan N Kesakitan pH 7,0 pH 8,0 Total

3 3 6

Mean Rank 3,83 3,17

Sum Rank 11,50 9,50

of

Sum Rank 15,00 6,00

of

Test Statistics(b) Kesakitan 3,500 9,500 -,471 ,637


,700a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Ranks Perlakuan N Kesakitan pH 7,0 pH 7,5 Total

3 3 6

Mean Rank 5,00 2,00

Test Statistics(b) Kesakitan ,000 6,000 -1,993 ,046

Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] ,100a c. Not corrected for ties d. Grouping Variable: Perlakuan



3 3 6

Mean Rank 3,83 3,17

Sum Rank 11,50 9,50

of

Sum Rank 15,00 6,00

of

Test Statistics(b) Kesakitan 3,500 9,500 -,471 ,637


,700a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Test (Mann-Whitney Test) Ranks Perlakuan N Kesakitan pH 7,5 pH 8,0 Total

3 3 6

Mean Rank 5,00 2,00

Test Statistics(b) Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

Kesakitan ,000 6,000 -1,993 ,046 ,100a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: Perlakuan



3 3 6

Mean Rank 5,00 2,00

Sum Rank 15,00 6,00

of

Test Statistics(b) Kesakitan ,000 6,000 -2,023 ,043 ,100a



Lampiran C. Amplikasi Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction

Amplikasi RNA dibagi menjadi dua reaksi protokol dalam mesin RT-PCR yaitu: a.

Protokol suhu reaksi PCR tahap I: 42°C 30 menit; 94°C 2 menit, kemudian 94°C 30 detik; 62°C 30 detik; 72°C 30 detik, ulangi 20 siklus, kemudian tambahkan 72°C 30 detik; 20°C 30 detik pada akhir siklus.

b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (Nested PCR): 94°C 20 detik; 62°C 20 detik; 72°C 30 detik, ulangi 30 siklus, kemudian tambahkan 72°C 30 detik; 20°C 30 detik pada akhir siklus. Persiapan Reagent a. RT-PCR Reaction: 8 µL/reaksi RT-PCR Pre-Mixed Reagent

: 7,0 µL

IQzymeTM, 2 unit/µL

: 0,5 µL

Reverse Transcriptase (RT) Mix Enzim

: 0,5 µL

b. Nested PCR Reaction: 15 µL/reaksi Nested PCR Pre-Mixed Reagent

:14 µL

IQzymeTM, 2 unit/µL

: 1 µL


Lampiran D. Pembuatan Isolat Virus Metode menurut Malole et al., (2006)

Ikan kerapu macan positif VNN Diambil organ mata dan otaknya Digerus dengan mortal Ditambahkan NaCl fisiologis Virus konsentrasi 10% Disentrifugasi pada 3.000 rpm selama 15 menit pada suhu 5°C Diambil supernatan Disaring dengan miliphore 0,45 µm Inokulan baku virus Ditambahkan antibiotik penicilin 10.000 IU dan Streptomicin µl tiap mililiter suspensi Disimpan dalam deef freezer suhu -40ºC Hasil


Lampiran E. Alur kerja Uji FID50 Metode Menurut Reed and Muench dalam Amrullah (2004) Ikan kerapu macan Diinfeksi virus VNN dengan konsentrasi masing-masing 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 sebanyak 0,1 ml/ekor Diamati gejala klinis dan dicatat kematian Dihitung nilai FID50 Hasil


Lampiran F. Pemeriksaan Hematologi Metode Menurut Benjamin (1983) 1. Penentuan Hemoglobin

Working Reagent Dimasukkan ke dalam 2 cuvet Dimasukkan sampel 10 µl ke dalam cuvet pertama Dimasukkan akuades 10 µl ke dalam cuvet kedua Dihomogenkan masing-masing campuran dan dibiarkan selama 3 menit Diatur spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm Diatur standar Dinolkan spektrofotometer Dimasukkan sampel dan dibaca hasilnya Hasil

2. Pemeriksaan Hematokrit (PCV)

Darah Dimasukkan ke dalam tabung hemotokrit sebanyak ¾ tabung dan ditutup ujungnya dengan lilin Disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 5 menit Dilakukan perhitungan nilai supranatan pada microhematocrite reader Hasil


3. Pemeriksaan Eritrosit

Darah Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Hayem sampai tanda 101 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah merah pada 5 kotak menengah di bagian tengah kamar hitung Dihitung jumlah eritrosit dengan Rumus: HPA= n x 10.000

Hasil


4. Pemeriksaan Leukosit

Darah Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Turk sampai tanda 11 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah putih pada 4 kotak besar pada bagian pinggir kamar hitung Dihitung jumlah leukosit dengan Rumus: HPA= n x 50 Hasil


Lampiran G. Pemeriksaan Histopatologi Metode Menurut Suntoro (1983)

Otak Dicuci dengan NaCl 0,9% Difiksasi (dimasukkan ke dalam fiksatif Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% selama 1 jam) Washing, (dengan menggunakan jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 70, 80, 96% selama 1,5 jam Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak alkohol absolut I,II,III selama 1 jam Clearing dilakukan dengan merendam otak dilakukan dengan xylol I,II,III se1ama 5 jam Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak pada parafin I,II yang dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC selama 2 jam. Embedding dilakukan dengan meletakkan otak pada kaset berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, menuang parafin yang telah cair ke dalam kaset tersebut, dan diberi label. Blok parafin


Blok parafin

Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 4 µm. Pita Parafin Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada gelas objek, dan dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan di atas waterbath beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada objek glass. Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan preparat ke dalam xylol I, II, III selama 3 menit Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan preparat ke dalam alkohol absolut I, II, III selama 3 menit Pewarnaan sediaan otak diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara gelas objek dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3 menit lalu dicuci dengan dengan air mengalir Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diamati di bawah mikroskop Hasil


Lampiran H. Uji Reverse Trancriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR)

Otak Dimasukkan 20 mg sampel otak ke dalam tabung mikro 1,5 ml Dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution Digerus sampai hancur, didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit Ditambahkan 100 µl CHCl3, kemudian divortex 20 detik. Biarkan pada suhu kamar selama 3 menit lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 µl yang berisi 200 µl 2-propanol Divortex sebentar, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol tersebut Dicuci pelet dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin down 9000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian dituang etanol dan dikeringkan pelet Dilarutkan dengan 200 µl ddH2O Pelet


Pelet Disiapkan reagent RT-PCR dan Nested PCR sesuai dengan sampel. Untuk setiap campuran reaksi perlu mempertimbangkan 3 standar positif (103, 102 dan 101) dan 1 kontrol negatif (ddH2O atau ragi tRNA). Dipipet 8 µl reagen RT-PCR ke dalam tabung mikro dan diberi label Ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar ke masing-masing campuran reaksi Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap I (First PCR Reaction) Ditambahkan 15 µl reagen Nested PCR untuk setiap tabung setelah tahap I selesai Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap II (Nested PCR Reaction) Ditambahkan 5 µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung dan dihomogenkan Hasil


Gel agarose Ditimbang gel agarose sebanyak 2 g Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 ml TAE Dipanaskan di dalam microwave sampai berubah bening Didinginkan pada temperatur ruang sampai temperatur 50°C Dituang dalam kotak gel dengan ketinggian 0,3-0,5 cm dan ketebalan 0,8 cm Dimasukkan sisir plastik (comb) ke dalam gel agarose Diangkat comb pada saat gel sudah memadat Ditambahkan buffer elektroforesis ke dalam kotak gel sampai garis pembatas Dimasukkan 5 µl marker ke sumur pertama, diikuti kontrol negatif dan sampel sebanyak 8 µl satu per satu Dilakukan proses elektroforesis pada tegangan 100-150 volt sampai warna biru mencapai ¾ bagian gel Dikeluarkan gel dari kotak gel Direndam gel ke dalam campuran 10 µl Ethidium Bromida dan 100 ml akuabides selama 10 menit Diangkat gel dan dicuci dengan akuades steril Diletak pada transilluminator UV gelombang untuk membaca hasil akhir Hasil


Lampiran I. Dokumentasi Penelitian

Sterilisasi

Sentrifugasi

Microwave

Spektrofotometer

Kolam penampungan

PCR

akuarium

Vorteks

Elektroforesis

UV-Transmillator

Sentrifugasi

Hematokrit Reader


Lampiran A. Data Persentase Kesakitan Ikan. Ulangan Perlakuan I II III

Recommend Documents