Lampiran 1. Persiapan Media Bakteri dan Jamur
Media Trypticase Soy Agar (TSA) Sebanyak 40 g bubuk TSA dilarutkan dalam 1000 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1 liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril.
Media Potato Dextrose Agar (PDA) Sebanyak 10g bubuk PDA dilarutkan dalam 500 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, lalu disimpan pada lemari es dengan plastik steril
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 2. Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi alat dilakukan sebelum semua peralatan digunakan, yaitu dengan cara membungkus semua peralatan dengan menggunakan kertas stensil kemudian di masukkan ke dalam oven dengan suhu 150oC selama 4 jam. Bahan atau media dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15psi (per square inci) selama 15 menit. Untuk alat yang tidak tahan panas tinggi disterilisasi dengan zat kimia berupa alkohol 70%.
Lampiran 3. Pembuatan Larutan Baku McFarland Larutan baku McFarland terdiri atas dua komponen, yaitu larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%. Sebanyak 0,05 mL larutan BaCl2 1% dicampurkan dengan 9.95ml larutan H2SO4 1% dan dikocok hingga homogen. Kekeruhan larutan diukur pada panjang gelombang 620nm dengan menggunakan akuades sebagai blangkonya. Nilai absorban larutan baku harus berada di kisaran 0,08 sampai dengan 0.13. Larutan baku McFarland 0,5 ekuivalen dengan suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 0.5 × 108 CFU/ml.
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 4. Proses Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Kulit buah manggis yang telah kering dan simplisia
Penimbangan dan penuangan pelarut
Proses penyaringan setelah maserasi dan Pemisahan ekstrak dengan pelarut menggunakan rotary evaporator
Proses pemekatan ekstrak dengan water bath
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 5. Proses Pengujian Toksisitas A. salina
Kista A. salina dan wadah penetasan
Proses pemipetan larutan uji dengan mikropipet, Proses pengukuran air 5ml dan Proses pemasukan A. salina
Setelah pengamatan 24 jam
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 6. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji Larutan induk adalah konsentrasi 80%, yaitu dengan perbandingan 0,8 gram dalam 1 ml DMSO (b/v). Untuk membuat konsentrasi 60%, 40% dan 20% dilakukan dengan pengenceran sebagai berikut: V1N1=V2N2
a. Konsentrasi 60% V1 x 80% = 0,5 x 80% V1 = 0,375 ml = 375μl
b. Konsentrasi 40% V1 x 80% = 0,5 x 40% V1 = 0,25 ml = 250μl
c. Konsentrasi 20% V1 x 80% = 0,5 x 20% V1 = 0,125 ml = 125μl
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 7. Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila
Uji motilitas motil dan uji O/F positif fermentative
Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 8. Analisis Kriteria Bakteri Edwardsiella tarda
Uji MR positif VP negative dan Citrat negatif
Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 9. Analisis Kriteria Jamur Saprolegnia sp.
Pengujian Jamur secara morfologi
Hasil pengamatan mikroskopis
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 10. Proses Pengujian Antimikroba
Penimbangan ekstrak, Penghomogenan ekstrak dengan vortex dan penyiapan suspensi bakteri
Pembandingan dengan Larutan McFarland dan Pengolesan suspense bakteri pada media
Perendaman cakram, peletakan cakram pada media uji dan pengukuran zona hambat
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 11. Hasil Skrining Fitokimia Kulit Buah Manggis
a
b
c
d
e
f
Hasil skrining fitokimia pelarut metanol dengan pereaksi: a. FeCl3, b. Wagner, c. Dragendroff, d. Mayer, e. Bouchardat dan f. Aqua
a
b
c
d
e
f
Hasil skrining fitokimia pelarut etil asetat dengan pereaksi: a.Aqua, b. Wagner, c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl3
a
b
c
d
e
f
Hasil skrining fitokimia pelarut n-heksana dengan pereaksi: a.Aqua, b. Wagner, c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 12. Hasil Pengujian Antimikroba
(a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri A. hydrophila dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana
(a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri Edwardsiella tarda dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana
(a) (b) (c) Hasil pengujian antijamur terhadap jamur Saprolegnia sp. dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (d) kontrol negatif (DMSO) (e) kontrol positif (nistatin)
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 13. Data Awal Kematian A. salina Pada Berbagai Konsentrasi Perlakuan Kontrol air laut Kontrol DMSO Metanol
Etil asetat
n-heksana
10 ppm 100 ppm 1000 ppm 10 ppm 100 ppm 1000 ppm 10 ppm 100 ppm 1000 ppm
U1 2 1 2 4 6 1 5 6 3 6 8
U2 1 2 3 5 7 2 5 6 4 6 7
Ulangan U3 U4 2 0 2 1 2 1 3 4 6 5 3 1 3 4 4 5 2 3 5 4 6 7
U5 2 2 2 4 5 2 5 6 2 4 6
Rata-rata 1,4 1,6 2 4 5,8 1,8 4,4 5,4 2,8 5 6,8
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 14. Contoh Perhitungan Penentuan LC50 a. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Metanol Pelarut metanol
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000
Total Populasi 50 50 50
Jumlah Kematian 10 20 29
Persen Mortalitas 20 40 58
Log Konsentrasi 1 2 3
Probit
LC50 (ppm)
4,16 4,75 5,2
372,524
Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm Persen mortalitas =
=
Jumlah Artemia Mati 20 50
Jumlah Populasi
x 100%
x 100%
= 40% Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak metanol:
Nilai Probit
Ekstrak Metanol 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
y = 1,78x + 2,296 R² = 0,837
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Log Konsentrasi
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 1,78x + 2,296 dan R2 = 0,837 Penentuan LC50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50%) maka 50%
nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log
konsentrasi.
Universitas Sumatera Utara
Perhitungan LC50 dari persamaan regresi y = 1,78x + 2,296 dan R2 = 0,837 Adalah sebagai berikut: 5 = 1,78x + 2,296 x = (5 – 2,296) / 1,78 x =2,571153846 anti log dari x = 372,5236471 LC50 = 372,524 ppm
b. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Etil asetat Pelarut Etil asetat
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000
Total Populasi 50 50 50
Jumlah Kematian 9 22 27
Persen Mortalitas 18 44 54
Log Konsentrasi 1 2 3
Probit
LC50 (ppm)
4,08 4,85 5,1
431,811
Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm Persen mortalitas =
=
Jumlah Artemia Mati 22 50
Jumlah Populasi
x 100%
x 100%
= 44%
Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:
Universitas Sumatera Utara
Ekstrak Etil asetat 6 y = 0,51x + 3,656 R² = 0,920
Nilai Probit
5 4 3 2 1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Log Konsentrasi
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 0,51x + 3,656 dan R2 = 0,920 Penentuan LC50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50%) maka 50%
nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log
konsentrasi. Perhitungan LC50 dari persamaan regresi y = 0,51x + 3,656 dan R2 = 0,920 adalah sebagai berikut: 5 = 0,51x + 3,656 x = (5 – 3,656) / 0,51 x = 2,635294118 anti log dari x = 431,8114139 LC50 = 431,811 ppm
Universitas Sumatera Utara
c. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut n-heksana Konsentrasi (ppm) 10 100 1000
Pelarut n-heksana
Total Populasi 50 50 50
Jumlah Kematian 14 25 34
Persen Mortalitas 28 50 68
Log Konsentrasi 1 2 3
Probit
LC50 (ppm)
4,442 5 5,47
114,384
Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm Persen mortalitas =
=
Jumlah Artemia Mati 25
Jumlah Populasi
50
x 100%
x 100%
= 50% Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak n-heksana:
Ekstrak n-Heksana 6 y = 0,514x + 3,942 R² = 0,997
Nilai Probit
5 4 3 2 1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Log Konsentrasi
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 0,514x + 3,942 dan R2 = 0,997
Universitas Sumatera Utara
Penentuan LC50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50%) maka 50%
nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi.
Perhitungan LC50 dari persamaan regresi y = 0,514x + 3,942 dan R2 = 0,997 adalah sebagai berikut: 5 = 0,514x + 3,942 x = (5 – 3,942) / 0,514 x = 2,058365759 anti log dari x = 114,3841262 LC50 = 114,384 ppm
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 15. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Buah Manggis a. Aeromonas hydrophila Ulangan Pelarut Metanol
Etil asetat
n-heksana
Konsentrasi DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol
U1
U2
U3
U4
U5
0 2 2,5 5 3 33,82 0 4 6 8,5 5 33,82 0 6 8 9 6 32,66
0 4 3 3 8 33,82 0 7 5 8,2 10 33,82 0 6 7 8,5 8 32,66
0 4 6 3 9 33,82 0 3 4 4 11 33,82 0 4 4,2 10 6 32,66
0 1 3 3,5 8 33,82 0 4 5 5,5 10 33,82 0 3 5 6 8 32.66
0 5 5 6 14 33,82 0 5 4 4,2 16 33,82 0 2 4 5 11 32,66
∑ 0 16 19,5 20,5 42 169,1 0 23 24 30,4 52 169,1 0 21 28,2 38,5 39 163,3
Ratarata (mm) 0 3,2 3,9 4,1 8,4 33,82 0 4,6 4,8 6,08 10,4 33,82 0 4,2 5,64 7,7 7,8 32,66
b. Edwardsiella tarda Ulangan Pelarut Metanol
Etil asetat
n-heksana
Konsentrasi DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol DMSO 20 40 60 80 Kloramfenikol
U1
U2
U3
U4
U5
0 3 7 8 13 34,76 0 4 6 8 13 34,76 0 1 2 4 6 33,61
0 4 5 6 8 34,76 0 4 6 8 10 34,76 0 1 2 5 8 33,61
0 4 6 7 9 34,76 0 10 13 14 18 34,76 0 1 2 3 7 33,61
0 3 5 6 7 34,76 0 3 4 5 8 34,76 0 1 3 5 6 33,61
0 2 4 5 7 34,76 0 3 5 6 11 34,76 0 2 3 5 7 33,61
∑ 0 16 28 32 44 173,8 0 24 34 41 60 173,8 0 6 12 22 34 168,05
Ratarata (mm) 0 3,2 5,4 6,4 8,8 34,76 0 4,8 6,8 8,2 12 34,76 0 1,2 2,4 4,4 6,4 33,61
Universitas Sumatera Utara
b. Saprolegnia sp. Ulangan Pelarut Metanol
Etil asetat
n-heksana
Konsentrasi DMSO 20 40 60 80 Nistatin DMSO 20 40 60 80 Nistatin DMSO 20 40 60 80 Nistatin
U1
U2
U3
U4
U5
0 2 4 5 6 11,45 0 2 3 6 9 11.45 0 1 2 3 4 10,32
0 1 3 4 7 11,45 0 2 4 6 7 11,45 0 1 2 3 4 10,32
0 1 2 4 5 11,45 0 1 3 5 8 11,45 0 1 2 4 6 10,32
0 2 3 5 6 611,45 0 1 2 7 9 11,45 0 2 3 5 7 10,32
0 1 4 4 7 11,45 0 2 4 5 6 11,45 0 1 2 3 6 10,32
∑ 0 7 16 22 31 68,25 0 8 16 29 39 68,25 0 6 11 18 27 51,6
Ratarata (mm) 0 1,4 2,8 4,4 6,2 11,45 0 1,6 3,2 5,8 7,8 11,45 0 1,2 2,2 3,6 5,4 10,32
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 16. Tabel Probit Menurut Vilchez dkk (2001) Persentase 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 99
0 3,72 4,16 4,48 4,75 5,00 5,25 5,52 5,84 6,28 0 7,33
1 2,67 3,77 4,19 4,50 4,77 5,03 5,28 5,55 5,88 6,34 0,1 7,37
2 2,95 3,82 4,23 4,53 4,80 5,05 5,31 5,58 5,92 6,41 0,2 7,41
3 3,12 3,87 4,26 4,56 4,82 5,08 5,33 5,61 5,95 6,48 0,3 7,46
Probit 4 5 3,25 3,36 3,92 3,96 4,29 4,33 4,59 4,61 4,85 4,87 5,10 5,13 5,36 5,39 5,64 5,67 5,99 6,04 6,55 6,64 0,4 0,5 7,51 7,58
6 3,45 4,01 4,36 4,64 4,90 5,15 5,41 5,71 6,08 6,75 0,6 7,67
7 3,52 4,05 4,39 4,67 4,92 5,18 5,44 5,74 6,13 6,88 0,7 7,75
8 3,59 4,08 4,442 4,69 4,95 5,20 5,47 5,77 6,18 7,05 0,8 7,88
9 3,66 4,12 4,45 4,72 4,97 5,23 5,50 5,81 6,23 7,33 0,9 8,09
Universitas Sumatera Utara
