Lactoferrine Fascinerende non-toxische bondgenoot in de verdediging tegen bacteriën, virussen, schimmels, parasieten, en zelfs tumoren

Lactoferrine Fascinerende non-toxische bondgenoot in de verdediging tegen bacteriën, virussen, schimmels, parasieten, en zelfs tumoren door Désirée L. Röver

© 2004

Lactoferrine is een bio-actieve glycoproteïne die via uiteenlopende processen het lichaam beschermt tegen endogene en exogene belagers. Zo moduleert, coördineert en reguleert dit lichaamseigen melkeiwit de cellulaire respons, en belemmert het via een unieke ijzerhuishouding een breed scala aan ziektekiemen en tumoren in hun groei en reproductie. Verder profileert de stof zich als een krachtig antioxidant en creatief regisseur van cytokinen. Dankzij moderne filtertechnieken kan dit veelzijdige peptide nu als voedingssupplement worden ingezet ter verhoging van de immuniteit, als probioticum, als adjuvans bij kankertherapie, en ook daar waar conventionele antibiotica geen resultaten (meer) opleveren. Veelzijdig, samenwerkend Lactoferrine is een uit één enkele reeks aminozuren opgebouwd glucoproteïnemolecuul dat bijzonder bestand is tegen afbraak – een eigenschap die deze stof na orale inname een profijtelijk langdurige activiteit meegeeft. De ijzergebonden vorm van lactoferrine heet hololactoferrine, de ijzervrije vorm wordt apolactoferrine genoemd. Het eiwit werd zo’n 35 jaar geleden ontdekt en blijkt veel verschillende kwaliteiten te hebben. De naam lactoferrine verwijst zowel naar de herkomst, als naar (slechts) een van de meest opmerkelijke eigenschappen ervan: het interactief vermogen om ijzer aan zich te binden, daar waar nodig naartoe te transporteren, of juist te onttrekken Het voornaamste ijzertransporterende eiwit in het lichaam is transferrine, een bèta-globuline met twee bindplaatsen voor ijzer, dat via de rode bloedlichaampjes ijzer de cel in brengt. In die kwaliteit is lactoferrine echter honderd maal krachtiger en eist daarmee moeiteloos de hoofdrol op in de immuunrespons van het lichaam – de stof vormt de frontlinie bij de verdediging tegen zowel in-, als externe ziekteverwekkende invloeden. Niet voor niets komen de hoogste concentraties van lactoferrine voor in colostrum – de eerste melkafgifte van zoogdieren en mensen. Het menselijk colostrum bevat 7 gram lactoferrine per liter, latere borstvoeding doorgaans 1 gram per liter – bij koemelk liggen beide percentages lager. Lysozym is een bacteriolytisch werkend enzym dat in 1922 door Fleming werd geïdentificeerd in neusvocht; naderhand werd dit lysosomaal enzym in bijna alle levende weefsels gevonden. Lysozym is enerzijds in staat de celwand van bacteriën te beschadigen, en helpt anderzijds de (antibacteriële) eigenschappen van lactoferrine te verhogen. Lactoferrine, in tandem met lysozym, helpt de baby na de geboorte niet alleen in de bescherming tegen virale en bacteriële infecties, maar ook bij het ontwikkelen van een gezond en goed functionerend immuunsysteem. Het zeer breed gerichte takenpakket dat lactoferrine tijdens de lactatieperiode vervult, is één van de vele redenen waarom borstvoeding voor het algeheel welbevinden van baby’s zo van cruciaal belang is – niet alleen voor de korte, maar juist ook voor de lange termijn. Bijzonder is verder dat lactoferrine ook al tijdens de zwangerschap een essentiële rol speelt: dan verhindert deze stof het immuunsysteem van de moeder te reageren op de vreemde eiwitten van de vader die door de foetus worden afgegeven.

Wei Behalve in moedermelk komt lactoferrine in het menselijk lichaam zoals gezegd ook op verschillende andere plaatsen voor: in neutrofiele granulocyten (fagocyten, witte bloedcellen), en in cellulaire afscheidingen zoals traanvocht, speeksel en sperma,; verder in het slijm van vagina, bronchiën en neus, in gal, en in de vloeistoffen van de alvleesklier. Bovendien wordt lactoferrine geproduceerd in polymorfonucleaire leukocyten die deze stof vervolgens naar de septische plaatsen brengen. Terwijl menselijke moedermelk tot 15% lactoferrine kan bevatten, ligt het gehalte daarvan in de wei van koemelk tussen de 1 en 0,5%. Koemelk bevat twee belangrijke proteïnen: caseïne en wei. • Caseïne – dit voornaamste melkeiwit is een fosfoproteïne gericht op de snelle groei van het kalf. De stof kenmerkt zich door een zeer grote plakkracht die bij het drinken van koemelk in de menselijke organen tot verklevingen kan veroorzaken. In de bronchiën leiden deze tot deze astma-achtige aanvallen die, zoals in het geval van de kleurrijke Amerikaanse atlete Flo Jo Griffith, de dood tot gevolg kunnen hebben. • Wei daarentegen blijkt over vele leven gevende eigenschappen te beschikken. Het is een complex eiwit dat uit verschillende kleinere subfracties (peptiden) bestaat: bètalactoglobuline, alfa-lactabumine, immunoglobolines (IgGs), glycomacropeptiden, bovine serum albumine (BSA), en kleinere peptiden zoals lactoperoxidase, lysozym en lactoferrine. Ieder van deze subfracties kenmerkt zich door geheel eigen, unieke biologische eigenschappen. De filtertechnieken nodig om deze subfracties van elkaar te scheiden, zijn recentelijk ontwikkeld – in Nieuw Zeeland en… in Nederland! Verschillende functionele processen Een goed inzicht over de eigenschappen van een bepaalde stof wordt doorgaans geboden door de locatie van de receptoren waarop deze stof zich bindt. Voor lactoferrine zijn er receptoren gevonden in de darmen, in de hersenen, op verschillende witte bloedcellen, op bloedplaatjes, en op bepaalde bacteriën. Een artikel in Nature beschrijft hoe lactoferrine zich kan binden met delen van het DNA in de celkern, en zo direct de activiteit kan beïnvloeden van de genen die coderen voor de eiwitten van de cel. Gezien de diversiteit van receptoren waarop lactoferrine bindt, is het dan ook niet vreemd dat de positieve effecten van deze stof worden verkregen vanuit verschillende afzonderlijke functionele processen: • ribonuclease activiteit: het vermogen om binnen nucleïnezuurmoleculen verbindingen te verbreken, o.m. in RNA; • het onthouden van ijzer aan pathogene bacteriën en tumoren waardoor deze in hun groei en reproductie worden belemmerd; • bevordering van T-celdifferentiatie (synthese van T4, T8, T-cytotoxische-, en NK-cellen (natural killer cells); • activering van het humorale systeem (antistoffen-synthese); • het doden van virussen en bacteriën bij contact. Virale effecten In directe zin grijpt lactoferrine in tegen virussen door zich te binden aan virale receptorplaatsen, zodat het desbetreffende virus de gezonde cellen niet kan infecteren. Laboratoriumexperimenten bevestigen hoe zowel het menselijk cytomegalovirus (HCMV), het menselijk herpes simplex virus-1, als het menselijk immunodeficiëntie virus (HIV) het in hun celvermeerdering moeten

afleggen tegen lactoferrine’s krachtige antivirale effecten. Wat HIV betreft, heeft men kunnen constateren dat lactoferrine zich krachtig bindt aan de V3-lus van de gp120 receptor op HIV-1 en HIV-2, met als resultaat dat virus en cel niet kunnen samensmelten. Indirect doodt of belemmert lactoferrine virussen door bij een virale invasie de systemische immuunrespons te verhogen. Interessant is dat mensen met een HIV-infectie een systemische deficiëntie van lactoferrine vertonen. Bij sommige aids-patiënten kan een tekort aan lactoferrine in het traanvocht het ’droge ogen syndroom’ opleveren, een aandoening gekenmerkt door te weinig traanvocht en een degeneratie in het oogweefsel. Een studie vergeleek 30 gezonde controlepersonen met 22 HIV-patiënten zonder, en 45 HIVpatiënten met symptomen, en vond dat de niveaus van lactoferrine in het plasma bij patiënten geïnfecteerd met HIV-1 lager zijn naarmate de ziekte verder is gevorderd. Een andere studie vond dat het gebrek aan lactoferrine (en secretoir IgA), aangetroffen in de mondholten van mensen met HIV-1, sterk overeenkwam met de frequentie van infecties in dat gebied bij aids-patiënten. Behalve studies waarbij naar voren kwam dat lactoferrine HIV en HCMV verhindert om gezonde cellen te infecteren, zijn er ook onderzoeken waarbij datzelfde mechanisme is ontdekt ten aanzien van herpes simplex type 1. Vermoedelijk wordt ook hier het hechten van het virus aan gezonde cellen steeds voorkomen door blokkering van de virale proteïnen, zowel als door directe maatregelen van het immuunsysteem via NK-cellen (natural killer cells), lymfocyten en fagocyten. In een experiment waarin muizen werden besmet met een virus dat op leukemie gelijkende symptomen veroorzaakt, bleek de groep die daarbij lactoferrine kreeg toegediend de ziekteverschijnselen aanzienlijk beter te verdragen dan de groep die het zonder deze suppletie moest stellen. De Japanse onderzoekers Ikeda et al van het Japanse kankerinstituut rapporteren dat bovine lactoferrine effectief hepatitis C voorkwam in gekweekte levercellijnen, door zich direct aan het hepatitis C virus te binden – en niet aan de geïnfecteerde cellen. Microbiële effecten Bij de antibacteriële effecten zijn zowel de ribonuclease-activiteit, als de ijzerbindende kwaliteiten van lactoferrine betrokken. Eén manier waarop lactoferrine bacteriën te lijf gaat, is dat het ene deel van het lactoferrinemolecuul zich aan de bacterie hecht, terwijl een ander deel ’ijzerkogels’ op het membraan ervan afvuurt; hierdoor valt de bacterie uiteen en wordt deze vervolgens door zijn eigen enzymen vernietigd – een pregnant voorbeeld van biologische oorlogvoering. Veel pathogene bacteriën, en ook andere microben, zijn voor hun groei en vermenigvuldiging van ijzer afhankelijk; lactoferrine weet dit voor hen essentiële element consequent buiten bereik te houden. Vooral Stafylococcus aureus, Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae en Heliobacter pylori (de belangrijkste microbiële veroorzaker van maagzweren) zijn niet bestand tegen de barrières die lactoferrine voor hen opwerpt. Zo bevestigde zowel in vitro-, als in vivo onderzoek inhibitie door lactoferrine van de toxische Heliobacter pylori. De lactoferrine toegevoegd aan het drinkwater van muizen die met stafylokokken waren geïnfecteerd, reduceerde hun nierontstekingen met 40% tot 60%, terwijl het getelde aantal bacteriën 5 tot 12 maal minder bedroeg dan in de controlegroep. Zoals gezegd, komt lactoferrine voor in diverse klierafscheidingen. Zo fungeert deze stof samen met de in het speeksel aanwezige antimicrobiële enzymen lysozym en peroxidase als bescherming

tegen gaatjes in het tandglazuur. Ook bepaalde schimmels – waaronder candida albicans – worden door lactoferrine in hun activiteiten gehinderd. Parasieten worden door lactoferrine aangepakt via fagocytose, een proces waarbij immuuncellen vreemde organismen eerst overmeesteren, en deze daarna verteren. Immuunondersteunende effecten Onderzoek wijst uit dat lactoferrine de proliferatie, rijping en activering van verscheidene soorten immuuncellen reguleert, bijvoorbeeld de neutrofielen en macrofagen, immuuncellen verantwoordelijk voor fagocytose. Neutrofielen, de leukocyten die zich in het begin van een ontstekingsreactie aan de vaatwand hechten, scheiden gedurende de loop van die ontsteking lactoferrine uit. Daarnaast beïnvloedt lactoferrine de rijping en functie van lymfocyten, immuuncellen verantwoordelijk voor de afscheiding van antilichamen en cellen die de vreemde organismen rechtstreeks te lijf gaan. Fatale cytomegalovirus infecties in muizen konden worden tegengehouden doordat lactoferrine de daadkracht van de lymfocyten (natural killer cells) in het doden en verwoesten van virussen vergroot. De muizen die in dit experiment geen lactoferrine kregen toegediend, overleefden geen van allen. Cytokinen zijn biochemische mediatoren die het immuunsysteem aansturen via specifieke interacties tussen de verschillende klassen immuuncellen. De cytokinen die de interacties reguleren tussen witte bloedcellen, oftewel leukocyten, heten interleukinen. Hedendaags onderzoek richt zich onder meer specifiek op het vermogen van lactoferrine om de activiteit en het vrijmaken van interleukinen en andere cytokinen te reguleren.

• • • • • • • • • • •

Activiteiten van lactoferrine activeert DNA tot krachtige immuunrespons tegen bacteriën, virussen en schimmels; interfereert met het koolhydratenmetabolisme van binnenkomende organismen; interfereert met het vermogen van binnenkomende organismen om RNA te synthetiseren, een proces dat zij voor hun proteïnesynthese nodig hebben; werkt in synergie met lysozym om de activiteit van beide proteïnen op te wekken; creëert natuurlijke antilichamen tegen een breed scala van ziektekiemen; verbetert transport en opname van ijzer (grote bindkracht voor twee ijzermoleculen); werkt samen met, en bespaart glutamine; brengt de darmflora in balans; uiterst krachtig antioxidant: vangt vrije radicalen, en voorkomt de vorming daarvan; krachtig anti-kanker effect – blokkeert de bloedtoevoer naar de kankercel (angiogenese); activeert NK-cellen (natural killer cells);

Spijsverteringskanaal Het maagdarmkanaal kan worden gezien als een ecologisch systeem waarin voor de optimale opname van voedingstoffen een bepaalde balans moet heersen tussen de verschillende daarin

aanwezige ’goede’ en ’kwade’ bacteriën. Wanneer daarin de verkeerde bacteriën de overhand krijgen, levert dat een reeks aan problemen op, die op hun beurt vrij baan geven aan talloze proinflammatoire mediatoren. Het eindresultaat van deze cascade is dat er door het gehele darmsysteem heen verstoringen optreden. Zoals altijd is het ook hierbij belangrijk om de mens als geheel te beschouwen, en bij de mond te beginnen, want ook daar zal het ecologisch evenwicht tussen de 200-300 daar voorkomende (overwegend vriendelijke) bacteriën in orde moeten zijn. Suikers uit voeding kunnen de verkeerde mondbacteriën tot groei aanzetten, waardoor cariës kan ontstaan. Dit kan vervolgens de mond tot een infectueuze haard maken die ten slotte een bedreiging voor het gehele lichaam vormt. Zo zijn er verbanden gevonden tussen ontstekingen in de mond en hart-, en vaatziekten, en ook vroeggeboorten. Wat het verband betreft tussen de staat van de mond en het gebit, en de organen in de rest van het lichaam, loopt Nederland aanzienlijk achter bij landen als Zweden en Zwitserland. Hier onderschat men ook nog altijd de cruciale functie die de epitheliale contactvlakken van mond en keel hebben als verdedigingszones tegen infecties. Lactoferrine heeft laten zien de goede bacteriën in de darm dramatisch in aantal te kunnen doen toenemen, terwijl het tegelijkertijd de slechte doet afnemen. Vooral E. coli, Stafylococcus, Streptococcus, Klebsiella pneumoniae, Heliobacter pylori en Clostridium blijken zeer gevoelig voor de krachtige wijze waarop lactoferrine het voor hen zo essentiële ijzer buiten bereik houdt. De ’goede’ darmbacteriën, zoals lactobacillus acidofilus, lactobacillus bifidus, en lactobacillus GG zijn voor hun ijzerbehoefte vermoedelijk minder afhankelijk van exogene bronnen, en hebben daarom minder last van deze eigenschap van lactoferrine. Voorkomen èn genezen Naast de eigenschap infecties te voorkomen, kan lactoferrine deze ook helpen te genezen. Uit dieronderzoek is gebleken dat de stof in staat is zowel intestinale, als systemische ontstekingen aanzienlijk te doen verminderen; niet alleen bij specifieke infecties, maar ook bij meer chronische aandoeningen. In proefdieren die pathogenen kregen toegediend zodat bij hen zowel intestinale-, als systemische darminfecties ontstonden, blijkt suppletie met lactoferrine niet alleen de beschadigingen aan de darmwand, maar ook de infecties terug te dringen. Wanneer het epitheel van de darm is beschadigd (lekkende darm syndroom), dan kunnen behalve grotere eiwitmoleculen, ook bacteriën rechtstreeks van de darm het bloed en het lymfatisch systeem binnenkomen – bij dat laatste spreekt men van bacteriële translocatie. Ongewenst migrerende eiwitten kunnen leiden tot verstoringen op geestelijk niveau, en wanneer wat betreft de bacteriën het immuunsysteem niet tussenbeide komt, kunnen hieruit infecties en ziekten ontstaan. Naast het vermogen om de bacteriegroei in goede banen te leiden, blijkt lactoferrine in staat dit proces te keren door de intestinale celgroei aanzienlijk te bevorderen; de stof is daarmee niet alleen een immuunmodulator, maar ook een zeer krachtig probioticum. In een onderzoek met muizen werd door suppletie met lactoferrine het dodelijk effect van het endotoxine lipopolysaccharide dramatisch teruggedrongen, terwijl de immuunrespons van deze dieren aanzienlijk toenam. Lipopolysaccharide kan ernstige toxische shock opleveren – voor intensive care patiënten in ziekenhuizen betekent deze gifstof een belangrijke doodsoorzaak. Het bij biggen inspuiten van het endotoxine Escherichia coli resulteerde in de groep die tijdens deze studie lactoferrine kreeg toegediend tot 17% sterfgevallen; in de groep zonder deze ondersteuning bedroeg dat percentage 74%.

Antioxidant kwaliteiten Afhankelijk van (de vraag vanuit) de cellulaire omgeving, is lactoferrine een antioxidant in staat om vrij ijzer op te vangen – en daarmee ongecontroleerde, op ijzer gebaseerde vrije radicale reacties te helpen voorkomen – of fungeert de stof als donor die ijzer kan afgeven wanneer het lichaam daar om vraagt. Ziekten als kanker, hartziekten en aids zijn allemaal nauw gerelateerd aan oxidatieve stress, hetzij als oorzakelijk gegeven, hetzij als bezwarende factor gedurende de progressie van de ziekte. Verscheidene studies suggereren lactoferrine’s vermogen om oxidatieve stress te verminderen. Een studie die de rol onderzocht van weiproteïnen, multigefermenteerde weiproteïnen en lactoferrine, leidde tot de uitspraak dat ”deze stoffen goede kandidaten zijn om als inhiberende dieetmaatregel te worden ingezet ter voorkoming van oxidatieve stress, en zouden kunnen worden beschouwd als potentiële medicinale voedingstoffen voor verschillende pathologieën, zoals HIVinfecties en kanker”. Kanker Terwijl het aan steeds meer mensen duidelijk wordt dat kanker, naast vanuit omgevingsfactoren, zeker ook vanuit psychische en emotionele achtergronden kan ontstaan, blijkt lactoferrine een machtige bondgenoot op de weg naar fysiek herstel daarvan. Gezien de verbazingwekkende effecten die deze non-toxische stof op kanker heeft, lijkt de relatief recentelijke beschikbaarheid de enige reden waarom deze substantie nog niet standaard in kankerbehandelingen is opgenomen. Behalve dat lactoferrine de angiogenese onderdrukt – de aanmaak van nieuwe bloedvaten, onontbeerlijk voor het bloeddorstig (voort)bestaan van kankercellen – blijkt deze stof in onderzoeken met muizen ook lever-, en longmetastasen aanzienlijk te beperken. Dierstudies laten verder zien dat lactoferrine in verschillende kankercellijnen al bij lage concentraties een hoge NKceltoxiciteit oplevert. Lactoferrine speelt niet alleen een systemische rol in de verbetering van de effectiviteit van immuuncellen op kankercellen, maar blijkt daarop ook een direct effect te hebben – al is nog niet geheel duidelijk op basis van precies welke mechanismen dit gebeurt. Ook de onderzoekers die vaststelden in welke aanzienlijke mate lactoferrine de groei van pancreaskankercellen blijkt te kunnen onderdrukken, kwamen tot de conclusie dat dit melkeiwit wel eens een van de meest gewilde stoffen zou kunnen worden als ondersteunende middel in de therapie tegen pancreaskanker. Opvallend is dat terwijl koemelk in Japan als voedingstof pas in 1945 door de Amerikanen werd geïntroduceerd, veel van het onderzoek naar de effecten van de daaruit afkomstige lactoferrine door Japanners is uitgevoerd en gepubliceerd. Zo voerde het nationale kanker researchcentrum in Tokyo een onderzoek uit waarbij lactoferrine colonkanker bij ratten met de helft deed verminderen. Tot slot Behalve als voedingssupplement heeft lactoferrine inmiddels ook andere commerciële toepassingen gekregen: in het langer houdbaar maken van levensmiddelen – de stof beschermt vlees tegen meer dan 30 bacteriën, waaronder E. coli, salmonella en campylobacter. Verder bij het kweken van vis, als toevoeging in babyvoeding, en in producten voor mondhygiëne. Vele van de positieve kwaliteiten van lactoferrine, voortkomend vanuit anekdotisch bewijs, worden inmiddels door onderzoeksresultaten gesteund. En ook al zal er nog meer onderzoek moeten plaatsvinden eer de gemiddelde wetenschapper zich durft te laten overtuigen, lactoferrine verdient nu al een prominente plaats in het bewustzijn van zowel artsen, oncologen en therapeuten, als van patiënten.

Literatuur • The Townsend Letter for Doctors and Patients, http://www.townsendletter.com/; • Lonnerdal B; Nutritional and physiologic significance of human milk proteins; Am J Clin Nutr 2003;77(6):1537S-1543S; • Baveye S, Elass E, Mazurier J, Spik G, Legrand D; Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein involved in the modulation of the inflammatory process; Clin Chem Lab Med 1999;37(3):281-6; • Dial EJ, Hall LR, Serna H, Romero JJ, Fox JG, Lichtenberger LM; Antiobiotic properties of bovine lactoferrin on Heliobacter pylori; Dig Dis Sci 1998;43(12):2750-6; • Zhang GH, Mann DM, Tsai CM; Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by a human lactoferrin-derived peptide. Infect. Immun. 1999;67(3):1353-8; • Lee WJ, Farmer JL, Hilty M, Kim YB; The protective effects of lactoferrin feeding against toxic shock in germfree piglets. Infect. Immun. 1999;(66)4:1421-6; • Yoo YC, Watanabe S, Watanae R, Hata K, Shimazaki K, Azuma I; Bovine lactoferrine and lactoferricin, a peptide derived from bovine lactoferrine, inhibit tumor metastasis in mice. Jpn J Cancer Res 1997;88(20:184-90; • Defer MC, Dugas B, Picard O, Damais C; Impairment of circulating lactoferrine in HIV-1 infection; Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand)1995;41(3):417-21; • Muller F, Holberg-Petersen M, Rolag H, Degre M, Brandtzaeg P, Froland SS; Nonspecific oral immunity in individuals with HIV infection; J Acquir Immune Defic Syndr 1992;5(1):46-51; • Florisa R, Recio I, Berkhout B, Visser S; Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivates thereof; Curr Pharm Des 2003;9(16):1257-75; • Clare DA, Catignani GL, Swaisgood HE; Biodefense properties of milk: the role of antimicrobial proteins and peptides; Curr Pharm Des 2003;9(16):1239-55; • Swart PJ, Kuipers EM, Smit C, van der Strate BW, Harmsen MC, Meijer DK; Lactoferrin. Antiviral activity of lactoferrine; Adv Exp Med Biol 1998;443:205-13; • Moshynskyy I, Jiang M, Fontaine MC, Perez-Casal J, Babiuk LA; Characterization of a bovine lactoferrine binding protein of Streptococcus uberis; Microb Path 2003;35(5):203-15; • Sakamoto N; Antitumor effect of human lactoferrine against newly established human pancreatic cancer cell line SPA; Gan To Kagaku Ryoho 1998;25(10)63; • Röver DL; Kiezen of helen; Arts & Apotheker • Jianglin He, Philip Furmanski; Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA; Nature 1995;373:721 – 724, Letters to Editor; • Singh PK, Parsek MR , Greenberg EP, Welsh MJ; A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development; Nature, 2002;417:552 - 555; • Weinberg ED; The therapeutic potential of lactoferin; Expert Opin Investig Drugs 2003;12(5):841-51.