LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111)
C Příprava diagnostického testu na bázi lateral flow immunoassay
Vedoucí práce: Ing. Aram Zolal Ing. Lukáš Filip Umístění práce: laboratoř S58
1. Úvod Úkolem tohoto laboratorního cvičení bude připravit diagnostický test na bázi lateral flow (LFIA) pro detekci psychotropních látek ve slinách. Student se seznámí s jednotlivými kroky přípravy LFIA zahrnující syntézu zlatých nanočástic, jejich konjugaci s protilátkami, a i samotné složení a testování LFIA testů. LFIA testy jsou jednoduché detekční nástroje určené k zjištění přítomnosti analytu ve vzorku bez nutnosti pořizovat jakékoliv přístrojové vybavení. Principem LFIA testu je kombinace chromatografie a imunoafinitních reakcí (tj. reakce protilátky, produkované organismem a antigenu – analytu). Tyto testy jsou určené jak pro širokou laickou veřejnost, tak pro specialisty v odborných zařízeních jako rychlý orientační test. Oblast jejich využití zahrnuje celou škálu oborů – LFIA testy se používají např. v medicíně, potravinářství ale i ochraně životního prostředí. Nejrozšířenějším příkladem LFIA testem je těhotenský test. LFIA test je složen ze čtyř funkčních částí (viz Obrázek 1) – nejdůležitější část tvoří membrána, na které se zobrazuje výsledek testu v podobě jedné, nebo dvou barevných linií, které vypovídají o výsledku testu (pozitivní, nebo negativní). Linie se označují jako testovací a kontrolní linie. Vzorek se nanáší na podložku pro nanášení vzorku, odkud vzorek vzlíná na konjugační zónu, kde se nachází biomolekula (nejčastěji protilátka) imobilizovaná na barevné nanočástici (např. zlaté, uhlíkové, latexoné nanočástice). Konjugát je kapalinou obsaženou ve vzorku unášen na membránu, kde je schopen se vázat na testovací a kontrolní linii. Vzorek, který proteče přes membránu je absorbován na podložce pro zachycení vzorku. Jednotlivé funkční části LFIA testu jsou nalepeny na plastové podložcePrincip detekce LFIA ttestu je závislý na zvoleném uspořádání. Nejčastěji se vyzžívá přímém, anebo kompetitivním uspořádání.
Absorpční podložka pro nanášení vorku
membrána
absorpční podložka pro zachytávání vzorku
kontrolní linie testovací linie konjugační zóna
Obrázek 1: Typické uspořádání lateral flow testu
1.1.
Přímé uspořádání Přímé uspořádání se využívá pro detekci analytů s větší molekulovou hmotností (řádově
kDa), které ve své struktuře obsahují více antigenních míst (minimálně dvě). Pokud vzorek obsahuje sledované analyty, vytváří se komplex mezi antigenem a primární protilátkou, která je značená barevnou nanočásticí a nachází se v konjugační zóně. Komplex antigen-značená primární protilátka vlivem kapilárních sil vzlíná přes membránu k oblasti testovací linie (TL), která je tvořena imobilizovanými primárními protilátkami proti sledovanému analytu, které reagují s antigenem na jiném antigenním místě než primární protilátky z konjugační zóny. Pokud vzorek sledovaný analyt obsahuje, dojde k jeho navázání na tyto protilátky a testovací linie se zbarví barevnými nanočásticemi (Obrázek 2A – pozitivní výsledek). Kontrolní linie (KL) je tvořena imobilizovanými sekundárními protilátkami proti primárním protilátkám. Sekundární protilátky vytváří komplex s primárními označenými protilátkami pocházející z konjugační oblasti (jak v případě, že jsou v komplexu s detekovaným antigenem, tak i pokud jsou ve volné formě – tj. nedošlo k navázání antigenu na primární protilátky). V případě pozitivní testu (vzorek obsahuje sledovaný antigen) tak vznikají na LFIA dvě linie (TL a KL). Naopak negativní výsledek LFIA je charakterizován vznikem pouze KL.
1.2.
Kompetitivní uspořádání Kompetitivní uspořádání se používá pro detekci o menší molekulovou hmotnosti analys
schopné vazby jen s jedním antigenem. Toto uspořádání se dále dělí na přímé a nepřímé kompetitivní uspořádání. U přímého kompetitivního uspořádání (Obrázek 2B) je barevnou nanočásticí značena primární protilátka určená k vychytávání sledovaného analytu. Pokud vzorek obsahuje sledovaný analyt, dochází opět na konjugační zóně k jejich vychytání značenými primárními protilátkami. Testovací linie je v tomto případě tvořená sledovaným analytem vázaným na BSA (bovine serum albumin), z čehož plyne, že komplex antigen-značená primární protilátka již není schopna se na tuto linii vázat a tím jí zbarvit. Kontrolní linie (KL) je opět tvořena imobilizovanými sekundárními protilátkami proti primárním protilátkám. Sekundární protilátky vytváří komplex s primárními označenými protilátkami (jak v případě, že jsou v komplexu s detekovaným antigenem, tak i pokud jsou ve volné formě – tj. nedošlo k navázání antigenu na primární protilátky).
Nepřímé kompetitivní uspořádání se od přímého příliš neliší. V konjugační zóně se nachází primární protilátka vázána na sekundární protilátku, která je značena barevnou nanočásticí. Testovací linie je stejného složení jako u uspořádání přímého kompetitivního. Kontrolní linie je tvořena imobilizovanými protilátkami proti sekundárním protilátkám. Vizualizace výsledků probíhá totožným způsobem. V případě pozitivního testu (vzorek obsahuje sledovaný antigen) se zobrazuje na LFIA v kompetitivním formátu pouze KL a naopak negativní výsledek LFIA je charakterizován zobrazením dvou linií (TL a KL).
Analyt
Analyt
Konjugát
Primární protilátky
Sekundární protilátky
Analyt-BSA Konjugát
Sekundární protilátky
pozitivní výsledek
negativní výsledek
Obrázek 2A: Přímé uspořádání LFIA
Obrázek 2B: Nepřímé uspořádání LFIA
2. Pracovní náplň
Syntéza zlatých nanočástic
Příprava pufrů potřebných pro přípravu LFIA testů
Příprava materiálů pro sestavení laterál flow testů
Příprava konjugátu zlatá nanočástice s primárními protilátkmi
Imobilizace imunoreagencií na nitrocelulózové membráně a konjugační zóně
Sestavení a testování LFIA testu
3. Pracovní postup 3.1.
Syntéza zlatých nanočástic Zlaté nanočástice budou připraveny reakcí podle Turkeviche, kdy dochází k redukci kyseliny
tetrachlorozlatité pomocí citrátu sodného. Touto reakcí vzniká zlato v atomární podobě a po saturaci roztoku dochází ke vzniku krystalů, které dále rostou do formy nanočástic. V prvním kroku se přivede k varu za stálého míchání deionizovaná voda. Následně se přidá roztok kyseliny tetrachlorozlatité (reakční směs nažloutlé barvy). Po přibližně dvou minutách se přidá roztok citrátu sodného. Reakční směs se nejdříve odbarví, poté prudce zčerná a následně přejde na rubínově červenou, která signalizuje vznik koloidního roztoku zlata. Velikost připravených nanočástic bude ověřena UV-VIS spektrofotometrickyna základě absorpčního maxima .
Obrázek 3: Schéma přípravy zlatých nanočástic
3.2.
Pufry potřebné pro přípravu LFIA testu V rámci práce, je nezbytné připravit níže uvedené pufry, které je nezbytné používat při
přípravě LFIA. Úkolem daných roztoků je např.: stabilizace konjugátu zlaté nanočástice-protilátka, impregnace podložek za účelem úpravy pH vzorku.
3.2.1.
50 mM Fosfátový pufr pH 7,4 Pro přípravu pufru budou připraveny následující roztoky:
0,05 M (100 ml) roztok NaH2PO4·H2O v deionizované vodě
0,05 M (100 ml) roztok Na2HPO4·2H2O v deionizované vodě
Do roztoku hydrogenfosforečnanu sodného bude následně za stálého míchání a měření pH přidáván roztok dihydrogenfosforečnanu disodného, dokud pH roztoku nedosáhne na hodnotu 7,4., 3.2.2.
500 mM Borátový pufr pH 8,4 Pro přípravu pufru budou připraveny následující roztoky:
0,5 M (100 ml) roztok kyseliny borité v deionizované vodě
0,5 M (100 ml) roztok hydroxidu sodného v deionizované vodě
Do roztoku kyseliny borité bude následně za stálého míchání a měření pH přidáván roztok hydroxidu sodného, dokud pH roztoku nedosáhne na hodnotu 7,4. 3.2.3.
Roztok pro úpravu pH roztoku koloidního zlata (dále Roztok 1) Připravte 0,2 M roztok K2CO3 (XY ml) v deionizované vodě.
3.2.4.
Blokační roztok volných vazebných míst na zlatých nanočásticí (dále Roztok 2) Připravte 10% (w/w, XY ml) roztok BSA ve fosfátovém pufru.
3.2.5.
Roztok pro stabilizaci konjugátu (dále Roztok 3) Připravte XY ml 10 % (w/w) roztok polyethylenglykolu a 0,2% (w/w)Surfactantu 10G ve
fosfátovém pufru. 3.2.6.
Impregnační roztok absorpční podložky pro nanášení vzorku (dále Roztok 4) Připravte roztok BSA (0,5% w/w), PEG (0,5% w/w) a Surfactantu 10G (0,2% w/w) v
borátovém pufru.
3.3.
Materiály pro sestavení LFIA testů Tabulka 1: Materiály a jejich rozměry určené k sestavení LFIA testů Materiál Skelná vlákna
Výška [cm]
Šířka [cm]
0,7 2,9
Nitrocelulózová membrána
3,1
Celulóza Plastová podložka s adhezním lepidlem
2,0 8,1
10
Skelná vlákna budou impregnována pomocí Roztoku 4 a sušena 1 hodinu při 37°C.
3.4.
Příprava konjugátu zlatá nanočástice-primární protilátka Konjugát je tvořen primárními protilátkami imobilizované na povrch zlatých nanočástic.
Konjugace primárních protilátek a zlatých nanočástic probíhá v pH, které se se blíží hodnotě izoelektrického bodu dané protilátky. Vzhledem k tomu, že vhodná hodnota pH pro konjugaci se u jednotlivých protilátek liší, je nezbytné provést sérii pokusů konjugace v prostředích o různých hodnotách pH (5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 7,0; 7,4), Postup konjugace zlatých nanočástic a primárních protilátek je následující:
1. Úprava pH roztoku zlatých nanočástic pomocí (Roztok 1 2. Přidání roztoku protilátek 3. Inkubace reakční směsi 4. Odstřeďování reakční směsi 5. Stabilizace konjugátu Roztok 3
3.5.
Imobilizace imunoreagencií na nitrocelulózové membráně Dalším krokem v přípravě laterál flow testů je tvorba testovací a kontrolní linie na membráně.
V této části práce budou na nitrocelulózovou membránu imobilizovány imunoreagencie v oblasti detekčních a kontrolních linií s využitím elektrostatických sil a hydrofobního efektu.
Obrázek 4: Princip imobilizace imunoreagencií na nitrocelulózové membráne Testovací a kontrolní linie budou nanášeny využitím printeru Camag Linomat 5. Po nanesení linií bude provedena inkubace membrány s nanesenými liniemi.
3.6.
Sestavení LFIA testu Po připravení všech částí budou veškeré části nalepené na plastovou podložku, která bude
následně nařezána na proužky o šířce 3 mm (vioz obr. 5). U připravených testů bude dále ověřena jejich funkčnost.
A
B
C
D
E Obrázek 5: Postup při sestavování LFIA testu
3.7.
Testování lateral flow testu
3.2.7.
Nalezení nejstabilnějšího konjugátu primární protilátky a zlaté nanočástice
Test bude prováděn na šesti proužcích, na které bude vždy nanesen jeden z připravených konjugátů (1 µl). Jako vzorek bude použita voda. Odetečtení testu se provádí po 5 minutách. K dalšímu testování bude vybrán konjugát, který způsobí vznik nejsytějších linií na LFIA proužku. Stanovení optimálního množství konjugátu Na konjugační zónu se nanese 1 µl; 0,75 µl; 0,5 µl a 0,25 µl vybraného konjugátu z předchozího experimentu Pouplynutí doby 5 minut se stanoví okometricky optimální množství konjugátu, které se má nanášet na LFIA proužek. 3.2.8.
Stanovení limitu detekce připraveného proužku
Limit detekce bude stanoven na základě odezvy LFIA proužku s optimálním množstvím konjugátu (stanoveno v předchozím kroku) na snižující se koncentrace analytu (koncentrace analytu 100 ng·ml-1; 50 ng·ml-1; 25 ng·ml-1; 12,5 ng·ml-1; 6,25 ng·ml-1 a 3,125 ng·ml-1). Po uplynutí doby 5 minut bude LOD vyhodnocen okometricky.
