Labinfo. p. 4 Gebruik en validatie van Real-Time PCR-methoden voor de detectie van voedselpathogenen

HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 10

JULI 2013

Labinfo Verantwoordelijke uitgever : Gil Houins

Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid

p. 4

Gebruik en validatie van Real-Time PCR-methoden voor de detectie van voedselpathogenen

p. 8

Kwaliteitscontrole bij de microscopische analyse van diermeel

p. 11

Kwaliteitsbewaking van diergeneeskundige reagentia (ELISA en real-time PCR) voor diagnostische laboratoria

p. 13

Geharmoniseerde benaderingen voor validatie van methoden voor GGO detectie in het NRL volgens de nieuwste EU aanbevelingen

p. 18

Algemene en technische vereisten voor het organiseren van geaccrediteerde “proficiency tests” overeenkomstig de ISO 17043 norm

p. 21

Recente ontwikkelingen op het vlak van antibioticascreeningstesten

p. 25

Hoe de meetonzekerheid ramen bij de kwantificering van bestrijdingsmiddelen ?

p. 35

Workshops & Symposia

FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel

NRL

N AT I O N A L REFERENCE LABORATORIES

NRL

N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA

L

RL


NRL


LNR

L A B O R ATO I R E S N AT I O N A U X DE REFERENCE

LabInfo Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid Redactiegroep Dirk Courtheyn, Marnix De Gruyter, Mieke De Mits, Conny De Schepper, Alain Dubois, Marc Evrard, Geert Janssens, Alain Laure, Bert Vandenborre, Eva Wevers en Marie-Christine Wilem Auteurs van dit nummer Geert De Poorter, Sarah Denayer, Katelijne Dierick, Nadine Botteldoorn, Jeroen Vancutsem, Mandy Lekens, Yves Van der Stede, Nina Papazova, Nancy Roosens, Isabel Taverniers, Marc De Loose, Hadewig Werbrouck, Koen De Reu, Wim Reybroeck, Laure Joly en Vincent Hanot Vertaling Vertaaldienst van het Agentschap Redactiegroep Foto’s en illustraties Aangebracht door de laboratoria Vormgeving Gert Van Kerckhove Redactieadres LabInfo p.a. D. Courtheyn FAVV AC-Kruidtuin – Food Safety Center 4de verdieping, bureel K04/120218 Kruidtuinlaan 55 1000 Brussel Tel.: 02.211.87.33 [email protected]

2

Editoriaal Beste lezer, De zomer is volop in het land en iedereen geniet van een korte of lange vakantie. Daarom is de literatuur in deze nieuwsbrief gericht op kwaliteit en dit in zijn ruimste benadering: het voldoen aan de verwachtingen van de klant. Echter door de crisis dienen laboratoria alsmaar efficiënter te gaan werken en dikwijls is de “kwaliteit” daarvan het slachtoffer. Dat uit zich in minder vormingsdagen, er worden minder gecertificeerde referentiematerialen ingezet, deelnames aan ringtesten worden teruggeschroefd. Dit leidt misschien tot besparingen op korte termijn maar op middellange en lange termijn is dit dodelijk voor een analytisch/microbiologisch laboratorium. Daarom zijn audits van accreditatie-organisaties zoals BELAC en van bevoegde overheden zoals het FAVV meer dan noodzakelijk. En ik moet inderdaad samen met mijn medewerkers vaststellen, als vertegenwoordigers van de bevoegde overheid, dat de kwaliteit soms niet altijd gegarandeerd is. Het gaat gelukkig om een zeer beperkte minderheid, maar deze minderheid veroorzaakt een oneerlijke concurrentie in vergelijking met de labs die de regels van het kwaliteitsspel wel rigoureus volgen. Ik zou dan ook een oproep willen doen om de erkenningsvoorwaarden, zoals die zijn vastgelegd in het koninklijk besluit van 3 augustus 2012 betreffende de erkenning van de laboratoria die analyses uitvoeren in verband met de veiligheid van de voedselketen, strikt na te leven, ook wat de meldingsplicht betreft. Ook in dit laatste domein wordt spijtig genoeg nog altijd vastgesteld dat de meldingsplicht soms zeer eenzijdig wordt geïnterpreteerd. Bij twijfel kan u altijd contact opnemen met één van mijn medewerkers. Een andere hulpmiddel is het volgende gezegde: “Beter éénmaal te veel melden dan éénmaal te weinig”. Ik wens u allen een deugddoende vakantie en veel leesplezier met Labinfo nummer 10 !

Geert De Poorter Directeur-generaal Laboratoria

3

Gebruik en validatie van Real-Time PCR-methoden voor de detectie van voedselpathogenen Sarah Denayer, Katelijne Dierick en Nadine Botteldoorn WIV-ISP, Juliette Wytsmansstraat 14, 1050 Brussel

Hoewel de detectie van voedselpathogenen in een routine-laboratorium voornamelijk nog gebaseerd is op conventionele microbiologische methoden, wordt er een sterke opmars van moleculaire detectiemethoden waargenomen. Voor de detectie en isolatie van pathogene bacteriën uit voedingsmiddelen volgens de klassieke methoden zijn verschillende stappen vereist waardoor deze vaak arbeidsintensief en langdurig (5-14 dagen) zijn. Hoewel deze technieken onmisbaar zijn in het microbiologische voedingsmiddelenlaboratorium, bieden moleculaire technieken een oplossing voor deze nadelen. Screening van aangerijkte stalen door middel van Real-Time PCR laat immers toe om negatieve stalen snel (≤ 24h) vrij te geven, wat een belangrijk aspect is voor de producent.

Introductie van moleculaire technieken in het laboratorium Om moleculaire methoden -waaronder Real-Time PCR- binnen een laboratorium uit te oefenen, zijn een aantal voorzorgsmaatregelen nodig. De internationale standaardisatie organisatie (ISO) heeft de vereisten voor het laboratorium en de algemene testvereisten voor de analyse van voedingsmiddelen via PCR-gebaseerde methoden gebundeld in verscheidene ISO-normen (ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006, ISO 22118:2011 en ISO 22119:2010). Tabel 1: ISO richtlijnen voor PCR gebaseerde methoden ISO

Titel

Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen 22174:2005

Algemene vereisten en definities

20837:2006

Vereisten voor staalvoorbereiding voor kwalitatieve detectie

20838:2006

Vereisten voor amplificatie en detectie voor kwalitatieve methoden

22118:2011

Performantiekarakteristieken van moleculaire detectiemethoden

22119:2010

Real-Time PCR – algemene vereisten en definities

4

Validatie van Real-Time PCR methoden: modulaire aanpak In november 2012 werd een eerste ISO-norm gepubliceerd die berust op een eerste screening van het staal via Real-Time PCR voor de specifieke detectie van voedselpathogenen, namelijk ISO 13136:2012 voor de detectie van pathogene E. coli. Wellicht volgt binnenkort ook de ISO referentiemethode voor de detectie van Norovirus en Hepatitis A in voeding, die louter gebaseerd is op Real-Time PCR detectie. De Europese Commissie voor Normalisatie (CEN) steunt tevens de ontwikkeling van gestandaardiseerde methoden voor de detectie van onder meer Vibrio parahaemolyticus en V. vulnificus, Clostridium botulinum, Yersinia enterocolitica en Y. pseudotuberculosis volgens dezelfde methodologie. Deze methoden zijn opgebouwd uit twee grote onderdelen, namelijk de detectie van de pathogeen via RealTime PCR en –indien positief voor vooropgestelde criteria- de daaropvolgende isolatie van de kiem. Dit betekent dat wanneer men dergelijke methoden in het laboratorium wil introduceren onder accreditatie (ISO 17025), een modulaire validatie vereist is voor de beide onderdelen (Figuur 1). Dit houdt in dat de selectiviteit, detectielimiet, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de methode aangetoond moeten worden voor zowel de screening als de isolatiestap. Deelname aan een interlaboratoriumtest is ook vereist om de juistheid van de methode te bepalen.

Module A: Staalname van voedingsmatrix Vb groenten, zuivel, vlees, … NEE JA

Correctieve acties

Aan de vooropgestelde criteria wordt voldaan

Module B: Vooraanrijking/aanrijking (selectief of niet) NEE JA

Correctieve acties


Module C: DNA extractie (Laboratorium ontwikkelde methode, kit, …) NEE JA Correctieve acties


Module D: Real-time PCR NEE JA Correctieve acties


Module E: Bevestiging, isolatie (uitplaten, serotyping, …) Figuur 1: Schematische weergave van de modulaire aanpak in voedselmicrobiologie (gebaseerd op Kagkli et al., 2011)

5

Methode-afhankelijke validatiestrategie Het laboratorium kan voor de detectie van een pathogeen via Real-Time PCR (de zogenaamde screening) opteren voor het gebruik van de reagentia zoals beschreven in de ISO-richtlijn (vb ISO13136:2012 VTEC), alternatieve commerciële kits of een eigen ontwikkelde methode. 1 Reagentia zoals beschreven in de ISO-methode Een laboratorium kan opteren om de primers en probe zoals beschreven in de ISO-richtlijn te gebruiken. Hierbij kan het laboratorium de primers en probe zelf bestellen bij een leverancier naar keuze of kan een commerciële kit gebruikt worden die dezelfde primers en probe bevat zoals beschreven in de ISO-richtlijn. In beide gevallen wordt de beoogde detectielimiet gedefinieerd in de ISO-richtlijn of in de handleiding van de gebruikte commerciële kit en moet het laboratorium aantonen dat deze worden behaald. Daarnaast moeten ook de overige validatieparameters zoals eerder beschreven bepaald worden. 2 Alternatieve methoden: commerciële kits Een laboratorium kan tevens opteren voor commerciële kits die gebaseerd zijn op Real-Time PCR detectie van een pathogeen in plaats van de klassieke microbiologische ISO- methode (vb Listeria en Salmonella). Ook voor RealTime PCR gebaseerde ISO-richtlijnen kunnen commerciële kits gebruikt worden die niet de reagentia gebruiken zoals hierin beschreven. In dit geval spreekt men van een alternatieve methode. Het Federaal Agentschap voor Veiligheid van de Voedselketen (FAVV) laat het gebruik van dergelijke methoden toe in kader van het officiële controleprogramma, mits ze werden opgenomen in de lijst van erkende methoden die beschikbaar is op de website van het FAVV (http://www.favv.be/laboratoria/erkendelaboratoria/dienstnotas/_documents/2012-04-12_Lijstmicrobio-methoden_v12.pdf ). Voorwaarde om in deze lijst opgenomen te worden is een ISO 16140 validatie van de kit tegenover de referentiemethode (ISO-normen) voor de desbetreffende pathogeen. Deze lijst wordt jaarlijks bijgewerkt. Aangezien validatie wordt gedefinieerd als het bevestigen dat een methode voldoet aan vooropgestelde eisen, dit voor een specifiek beoogd gebruik, dient men in de eerste plaats rekening te houden met het toepassingsgebied van de commerciële kit. Een protocol kan namelijk verschillend zijn naargelang de te onderzoeken matrix (humaan, water, voeding, omgeving). In dergelijk geval werd de kit enkel volgens de gepubliceerde procedure op een gedefinieerde matrix ISO 16140 gevalideerd door de leverancier. Het laboratorium kan het validatiedossier van de leverancier hanteren voor het aantonen van de selectiviteit (inclusiviteit/exclusiviteit) van de commerciële kit maar het moet tevens nagaan of zij de beschreven detectielimiet kunnen behalen. Het introduceren van procescontroles voor het opvolgen van de DNA-extractie en interne controles voor het bewaken van de inhibitie en PCR-reactie zijn onontbeerlijk voor Real-Time PCR methoden. Hoewel commerciële kits vaak een interne controle bevatten, is een procescontrole niet steeds voorzien. Tot slot dient een laboratorium de overige validatieparameters, zoals herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en juistheid te definiëren in het validatiedossier, dit zowel voor het gedeelte screening als voor de daaropvolgende isolatiestappen van de kiem.

6

3 Eigen methode Wil men een eigen ontwikkelde Real-Time PCR-methode voor de detectie van een kiem op punt stellen en onder accreditatie brengen, dan kan dit enkel indien de methode ISO 16140 ‘in house method’ gevalideerd wordt binnen het laboratorium.

Conclusie Het introduceren van moleculaire detectiemethoden in het microbiologische laboratorium houdt dus meer in dan een klassieke validatie en vereist mogelijk ook aanpassingen van de infrastructuur. Moleculaire detectiemethoden bieden als voordeel dat conforme stalen binnen 24h vrijgegeven kunnen worden. De isolatie van een kiem blijft echter noodzakelijk voor het definiëren van een pathogeen als zijnde aanwezig in de onderzochte matrix en voor de verdere virulentiebepaling.

Referenties: - ISO 16140:2003 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Protocol voor de validatie van alternatieve methoden - ISO 17025:2005 – Algemene eisen aan de competentie van beproevings- en kalibratielaboratoria - ISO 22174:2005 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen - Algemene vereisten en definities - ISO 20837:2006 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen - Vereisten voor staalvoorbereiding voor kwalitatieve detectie - ISO 20838:2006 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen - Vereisten voor amplificatie en detectie voor kwalitatieve methoden - ISO 22118:2011 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen - Performantie karakteristieken van moleculaire detectiemethoden - ISO 22119:2010 - Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Polymerase kettingreactie (PCR) voor de detectie van voedselgebonden pathogenen – Real-Time PCR – algemene vereisten en definities - Kagkli, D-M., Weber, T.P., Van den Bulcke, M., Folloni, S., Tozzoli, R., Morabito, S., Ermolli, M., Gribaldo, L. & Van den Eede, G. (2011). Application of the modular approach to an In-House validation study of Real-Time PCR methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl Env Microbiol 77 (19), 6954-6963

[email protected]

7

Kwaliteitscontrole bij de microscopische analyse van diermeel J. Vancutsem en M. Lekens (FLVVT, Tervuren)

In tegenstelling tot een klassieke chemische analyse met HPLC of GC, is het bij een microscopische analyse niet evident om een goede kwaliteitscontrole van een analysereeks in te voeren. Elke microscopische bepaling is immers een eenmalige interpretatie van een microscopisch preparaat door een expert in microscopie. Naast de goede opleiding van de expert zijn dus ook de kwaliteit en representativiteit van het preparaat uiterst belangrijke factoren waarmee men rekening moet houden bij het uitvoeren van de analyse en welke men moet proberen zo optimaal mogelijk te controleren. In deze context werd bij het invoeren van de kwaliteitscontrole bij microscopische analyses in het FLVVT de nadruk gelegd op het vermijden van kruisbesmetting bij de bereiding van het microscopische analysepreparaat. Ook tijdens de analyse zelf moet er over gewaakt worden dat er geen contaminatie van het te analyseren monster optreedt. Tot slot is ook het continu opleiden en controleren van de analisten microscopie een zeer belangrijk aandachtspunt.

Kruisbesmetting De kans op kruisbesmetting van het te analyseren monster begint reeds onmiddellijk na aankomst van het monster in het bereidingslokaal van het laboratorium waar een veelheid aan matrices wordt gemalen. Sommige van deze matrices bestaan voor 100% uit diermeel, zoals de monsters bestemd voor de analyse van GTH. In een rundveevoeder moet datzelfde diermeel dan weer helemaal afwezig zijn, dus specifieke maatregelen voor het verhinderen van kruisbesmetting zijn noodzakelijk. Bovendien toonde het EURL-AP aan dat gehalten van 0,0025% diermeel goed kunnen teruggevonden worden door laboratoria. Dit betekent dat op een aangeleverde monsterhoeveelheid van 500 g (volgens bijlage I van Verordening 152/2009) een overdracht van 10 mg reeds een vals positief resultaat kan opleveren. Dit aandachtspunt is geen alleenstaand geval: ook de analyse van gemedicineerde diervoeders gevolgd door de analyse van residu’s van deze stoffen in diervoeders is een vergelijkbaar voorbeeld en gelijkaardige maatregelen moeten hiervoor genomen worden. Het FLVVT heeft een aantal maatregelen uitgewerkt om kruisbesmetting te voorkomen bij de monsterbereiding. De monsters voor de analyse van diermeel worden afzonderlijk gemalen en de volgorde wordt op een werkformulier genoteerd. Bovendien wordt na elk monster een spoelcharge met maïs gebruikt om eventueel restmonster te verwijderen (zie afbeelding 1).

8

Afbeelding 1: Maaltoestel voor het malen van monsters voor analyse van diermeel Ook bij de analyse zelf is nog extra aandacht voor het vermijden van contaminatie nodig. Voor de analyse van de zeeffracties dienen de monsters gezeefd te worden over een zeef van 0,25 mm. Hierbij is het mogelijk dat een monster dat bijvoorbeeld toegelaten vismeel bevat, gezeefd wordt vóór een rundveevoeder waarbij vismeel niet toegelaten is. Daarom wordt op een formulier genoteerd in welke volgorde de monsters gezeefd worden zodat een eventuele besmetting traceerbaar is. Ook het reinigen van de zeven is een kritische stap en werd bijgevolg wettelijk beschreven. Verordening (EG) nr. 51/2013 vermeldt: “De zeven moeten worden gereinigd met een borstel met harde, synthetische haren. Na het zeven van vettig materiaal zoals vismeel wordt aangeraden de zeven tot slot nog met aceton en perslucht te reinigen.” Van belang hierbij is het gebruik van een borstel met synthetische haren omdat een borstel gemaakt met bijvoorbeeld varkenshaar een besmetting kan geven bij verlies van enkele borstelharen die een vals positief resultaat kunnen opleveren. In dezelfde verordening is ook een gedetailleerde beschrijving opgenomen voor het reinigen van de scheitrechters die gebruikt worden bij de sedimentatie: “De scheitrechter moet voor het reinigen uit elkaar worden genomen. De onderdelen van de scheitrechter en het glaswerk worden eerst met de hand en vervolgens machinaal gewassen.” Een andere maatregel is de monitoring van contaminatie van de omgeving (lucht). Het materiaal van dierlijke oorsprong kan, hetzij als analysemonster, hetzij als referentiemateriaal, in de lucht verspreid worden als stofdeeltjes. Om te controleren of er contaminatie tijdens de analyse optreedt, kan men open petrischaaltjes op het werkoppervlak plaatsen en die op geregelde tijdstippen analyseren op de aanwezigheid van producten van dierlijke oorsprong.

9

Controlemonsters Door maatregelen te nemen om kruisbesmetting bij de monsterbereiding te vermijden heeft het FLVVT er voor geopteerd om het controlemonster niet bij de bereiding mee te nemen, maar pas vanaf de analyse zelf. Gezien volgens de wijziging in Verordening (EG) nr. 51/2013 de methode ter bepaling van diermeel enkel nog een kwalitatieve methode is, wordt het controlemonster gebruikt om na te kijken of de sedimentatie correct werd uitgevoerd. Het sedimentgewicht wordt genoteerd op een controlekaart en beoordeeld volgens statistische criteria (bijvoorbeeld Nordtest TR 569, NEN 6603). Daarnaast wordt ook een monster meegenomen als referentiemonster voor de microscopische analyse. Daartoe wordt bij elke analysereeks het sediment van een geaddeerd monster van bijvoorbeeld 1% diermeel in vismeel geanalyseerd waarbij de analist in staat moet zijn het onderscheid te maken tussen diermeel en vismeel (zie afbeelding 2).

Afbeelding 2: Microscopische analyse van diermeel

Literatuur: P. Veys, G. Berben and V. Baeten. (2010). CRL-AP Proficiency Test 2009 (32 p) VERORDENING (EG) Nr. 152/2009 VAN DE COMMISSIE van 27 januari 2009 tot vaststelling van de bemonsteringsen analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders VERORDENING (EU) Nr. 51/2013 VAN DE COMMISSIE van 16 januari 2013 tot wijziging van Verordening (EG) nr. 152/2009 wat betreft de analysemethoden voor de bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in het kader van de officiële controle van diervoeders H. Hovind, B. Magnusson, M. Krysell, U. Lund and I. Mäkinen (2011). Nordtest rapport TR 569 Internal quality control. Handbook for chemical laboratories NEN 6603: Milieu en voedingsmiddelen – Eerstelijnscontrole met controlekaarten voor chemische en microbiologische analyses [email protected]

10

Kwaliteitsbewaking van diergeneeskundige reagentia (ELISA en real-time PCR) voor diagnostische laboratoria Yves Van der Stede CODA-CERVA Operationele Directie “Interacties en Bewaking” Operationele Eenheid “Coördinatie van de diergeneeskundige diagnose - epidemiologisch onderzoek en risico analyse”

Het vrije verkeer van dieren en dierlijke producten in de internationale handel heeft ontegensprekelijk zijn weerslag in de diergezondheid. Voor de bewaking van de diergezondheid spelen de diergeneeskundige veterinaire diagnostische laboratoria een zeer belangrijke rol. Eén van de meest voor de hand liggende zaken hierin is de vraag naar hoogwaardige en kwaliteitsvolle commerciële diergeneeskundige diagnostische reagentia. Het laboratorium van de dienst Coördinatie Diergeneeskundige Diagnose-Epidemiologie en Risico Analyse (CDD-ERA) van het CODA-CERVA zorgt, in opdracht van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (FAVV), voor de kwaliteitscontrole van de diergeneeskundige reagentia (ELISA en Real-time PCR-kits) die gebruikt worden voor officiële dierziekteprogramma’s zoals bijvoorbeeld Infectieuse Bovine Rhinotracheïtis (IBR), Brucellose en Leucose bij runderen en ziekte van Aujeszky bij varkens. De kwaliteitscontrole van deze diergeneeskundige reagentia is afhankelijk van het vermogen van het laboratorium en de betrouwbaarheid van de testresultaten bij deze controle. De garantie hiervoor wordt bekomen door het toepassen van procedures en de implementatie hiervan binnen een kwaliteitssysteem volgens ISO 17025.

11

De Kwaliteitscontrole van diergeneeskundige reagentia (ELISA en real-time PCR) op het CODA-CERVA: Vooraleer er een producent van bepaalde diergeneeskundige reagentia, voor één specifieke dierziekte, wordt toegelaten voor de Belgische markt moet deze deelnemen aan en slagen voor een initiële controle. Deze initiële controle laat toe om de veterinaire reagentia aangeboden door de producenten te toetsen aan vooraf opgelegde minimale criteria die worden opgesteld door de dienst CDD-ERA samen met het Nationaal Referentielaboratorium van het CODA-CERVA. Deze criteria zijn enerzijds van administratieve aard. Door middel van gestandaardiseerde documenten en checklisten [volgens OIE en AFNOR-richtlijnen (NF U47-301)] worden de noodzakelijke gegevens met betrekking tot de diagnostische reagentia aan de producenten opgevraagd. Deze gegevens zijn o.a. de scoop van de test (= waarvoor dient de test?), het uitgebreid validatiedossier met hierin essentiële parameters zoals sensitiviteit en specificiteit van de test, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de testen, de samenstelling van het product, het testprotocol en het eigen kwaliteitssysteem en de criteria waaraan de test moet voldoen. Bovendien worden epidemiologische studies en rapporten van proficiency testen opgevraagd die het gebruik en de accuraatheid van de te evalueren reagentia illustreren. Wanneer voldaan wordt aan deze administratieve criteria wordt anderzijds de producent gevraagd om één specifiek lot van zijn reagentia naar het CODA-CERVA te sturen. Dit lot wordt getoest aan de minimale technische critera die op voorhand zijn vastgelegd. Deze criteria hebben betrekking op de scoop van de test, alsook op de analytische en diagnostische sensitiviteit en specificiteit, de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Pas wanneer de reagentia van de producenten slagen voor de administratieve en technische criteria worden deze toegelaten op de Belgische markt. De lijst van de toegelaten diergeneeskundige reagentia zijn per producent, dierziekte, matrix en protocol opgelijst op de website van het FAVV. Elke producent is daarna verplicht om elk lot (batch) van diergeneeskundige reagentia, dat kan aangeboden worden aan erkende Belgische diergeneeskundige diagnostische laboratoria, eerst te laten controleren op zijn kwaliteit door de dienst CDD-ERA van het CODA-CERVA. Deze ‘batch-controle’ gebeurt volgens een geldende SOP en toets telkens dezelfde kwaliteitscriteria (sensitiviteit, specificiteit, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid, detectielimiet) met een set van goed gekarakteriseerde stalen. Van elke goedgekeurde batch wordt een certificaat gemaakt en gestuurd naar de eindverbruikers. Deze eindverbruikers zijn diagnostische laboratoria die binnen de scoop van officiële dierziektebestrijding, in opdracht van het FAVV, testen uitvoeren met deze reagentia. Via deze eindgebruikers krijgt de dienst CDD-ERA van het CODA-CERVA ook feedback van het terrein m.b.t. de kwaliteit van deze reagentia. Door deelname aan proficiency testen, georganiseerd volgens ISO 17043 door het CODA-CERVA, worden de eindgebruikers alsook de diergeneeskundige reagentia en zijn producenten jaarlijks opnieuw geëvalueerd op hun kwaliteit. Wanneer blijkt dat er teveel problemen zijn met bepaalde reagentia/producenten kunnen deze van de lijst geschrapt worden.

Conclusie: De kwaliteitscontrole van diergeneeskundige reagentia door de dienst CDD-ERA van het CODA-CERVA laat toe om op een éénduidige en gestandaardiseerde manier controle te doen en te houden over de diagnostiek die gebeurt in het kader van officiële dierziektebestrijding. Dit garandeert de testresultaten gerapporteerd door de erkende Belgische veterinaire diagnostische laboratoria. Dit bevordert de diergezondheid en ontegensprekelijk de internationale handel in dieren en dierlijke producten.

[email protected]

12

Geharmoniseerde benaderingen voor validatie van methoden voor GGO detectie in het NRL volgens de nieuwste EU aanbevelingen N. Papazova, N. Roosens Platform Biotechnologie en Moleculaire Biologie, Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, J. Wytsmanstraat 14, 1050 Brussel, België I. Taverniers, M. De Loose Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO), Eenheid Technologie & Voeding (T&V), Burg. Van Gansberghelaan 115, 9820 Merelbeke, België

Implementatie van EU-RL GMFF gevalideerde methoden in een routine laboratorium werkend onder ISO 17025: de EU context De EU-wetgeving inzake genetisch gemodificeerde levensmiddelen en diervoeders vereist dat event-specifieke methoden voor de detectie van GGO’s gebruikt worden (1). Real-time PCR of qPCR is momenteel de meest toegepaste techniek voor GGO detectie en dit dankzij de hoge gevoeligheid en de mogelijkheid voor kwantificering van de doelsequentie. Real-time PCR methoden voor GG event-specifieke kwantificering zijn ontwikkeld door de biotech-bedrijven die deze methoden indienen bij de aanvraag van een vergunning voor een nieuwe GG-event. De methoden werden eerst geëvalueerd en vervolgens gevalideerd in een interlaboratoriumtest georganiseerd door het Europees referentielaboratorium voor genetisch gemodificeerde levensmiddelen en diervoeders (EURLGMFF). De methoden worden zo omgevormd tot officiële methoden voor de nationale referentielaboratoria. Deze methoden zijn opgenomen in het Compendium van referentiemethoden voor de analyse van het GGO’s (2) en zijn beschikbaar op de EU-RL-website (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx). De EU-RL methoden zijn methoden voor kwantificering van de GG event. Echter, een GGO analyse bestaat uit verschillende stappen: screening met behulp van element-specifieke methoden (bijvoorbeeld p35S, tNOS, CP4 EPSPS, enz.), identificatie van de aanwezige events met behulp van event-specifieke methoden, en kwantificering ook met behulp van event-specifieke methoden. Bij de identificatie stap wordt de event-specifieke methode toegepast als kwalitatieve methode die als resultaat aan- of afwezigheid van de GG events geeft alsook, in geval events aanwezig zijn, of deze al dan niet kwantificeerbaar zijn. Momenteel zijn er 51 methoden gepubliceerd voor EU-toegelaten events alsook events die wachten op toelating (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx). De nationale referentielaboratoria van elke lidstaat van de EU moeten de officiële methoden implementeren voor events toegestaan onder Commissie Verordening nr. 1829/2003 (1) en de onlangs goedgekeurde Commissie Verordening nr. 619/2011 (“low-level” aanwezigheid of LLP; 3). Negenentwintig events zijn momenteel toegelaten voor voedingsmiddelen, diervoeders of teelt, 18 events zijn opgenomen in de LLP lijst. Echter, deze aantallen veranderen heel snel en stegen aanzienlijk de afgelopen twee jaar.

13

In 2011-2012 is het aantal nieuwe, te implementeren methoden snel toegenomen. Tot 2011 was het voldoende voor de laboratoria om 4-5 methoden te implementeren per jaar, terwijl in 2011 en 2012 na de uitvoering van de verordening LLP dit nummer verhoogd is tot 13. De NRL staat voor een enorme uitdaging om het toenemend aantal officiële methoden op een geharmoniseerde wijze op laboratorium niveau te implementeren. De vragen “Hoe de event-specifieke methode implementeren in het laboratorium voor (kwalitatieve) identificatie en kwantificering?”, “Welke criteria in acht te nemen voor acceptatie van de testen?”, “Welke monsters en hoeveel monsters te testen?” en “Hoe de experimentele opstelling te organiseren teneinde representatieve resultaten te bekomen?” vormen grote uitdagingen voor de analytische controlelaboratoria, zoals de Belgische nationale referentie laboratoria (NRL). Tot 2011 bestonden er geen specifieke richtsnoeren voor laboratorium verificatie van GGO detectiemethoden. Als gevolg daarvan gebruikte elk ENGL laboratorium zijn eigen benaderingen gebaseerd op bestaande normatieve documenten of interne procedures. Meestal werd het document “Method Performance Requirements” (4) gebruikt als basis voor de laboratorium validatie van de methode. Ook werden verschillende artikelen over dit onderwerp gepubliceerd (5, 6, 7), echter waren er geen geharmoniseerde richtlijnen op EU-niveau beschikbaar.

Geharmoniseerde ENGL leidraden voor methode verificatie In 2009 werd binnen het Europees netwerk van GGO laboratoria (ENGL) een werkgroep opgestart rond methode verificatie, dewelke als output van haar werkzaamheden een document publiceerde inzake de laboratorium implementatie / methode verificatie van event-specifieke methoden gevalideerd in een interlaboratorium ringonderzoek. Het document “Verificatie van analytische methoden voor het GGO testen bij implementatie van interlaboratorium gevalideerde methoden” (8) harmoniseert enkele termen en definities en, wat het meest relevant is, verschaft leidraden voor het verifiëren van de gevalideerde methoden in het routine laboratorium. Het ENGL methode verificatie document (8) harmoniseert verschillende items: • Terminologie: Geharmoniseerde definities worden aangerijkt voor laboratoriummonster, analysemonster, testportie, DNA replicaten en PCR replicaten. Deze staan weergegeven in de woordenlijst. Definities van de analytische parameters zijn tevens beschikbaar. Een volledige lijst van definities kan worden gevonden in het document verificatie methode (8). • Procedure voor de beoordeling van de parameters: Het document beschrijft algemene procedures voor de beoordeling van verschillende parameters, inclusief het minimum aantal analyses dat moet worden uitgevoerd (bijvoorbeeld minimum aantal punten in calibratiecurves ter bepaling van R2, PCR efficiëntie, dynamisch bereik; minimum aantal PCR resultaten om juistheid en precisie te bepalen). Belangrijke informatie in dit verband is de procedure om de absolute LOD (detectielimiet) en LOQ (kwantificatielimiet) te bepalen, aangezien deze vaak als “cut-off” waarden gebruikt worden in de identificatie stap van routinematige GGO analyses. Vóór de publicatie van het verificatie document was er geen uniforme wijze voor het bepalen van deze parameters. Gedetailleerde informatie over de beoordeling van DNA kwaliteit en zuiverheid wordt eveneens verstrekt. Voor elke parameter worden de aanvaardbaarheidscriteria, die in overeenstemming zijn met de methode verificatie richtsnoeren in het document, ook opgegeven. • Voorbeelden worden gegeven van experimentele opstellingen voor de evaluatie van de parameters. De voorbeelden bieden verschillende alternatieve instellingen voor het gebruik van een aantal verschillende calibratiecurves, punten in elke ijkcurve, PCR replicaten, test stalen, GM % niveaus, enz. Op deze manier kan het laboratorium haar eigen set-up definiëren die past binnen de minimale vereisten gedefinieerd in de

14

procedure voor het bepalen van de specifieke parameter. Een voorbeeld van experimentele instelling voor de verificatie van een kwantitatieve methode wordt gegeven in figuur 1.

Fig. 1. Voorbeeld van een workflow voor verificatie van GGO kwantatieve methoden. Tenminste twee verschillende GGO % niveaus worden geanalyseerd: één op 0,1% en één rond de drempelwaarde van 0,9%. Een derde GGO % rond de bovengrens van het dynamisch bereik kan optioneel worden meegenomen. Voor elk GGO % worden 2 DNAextracten bereid. Op elk DNA extract worden twee PCR replicaten gepipetteerd. Voor de bepaling van R2, PCR efficiëntie, dynamisch bereik, worden vier kalibratiecurves bereid. Elk van hen bevat ten minste 5 kalibratiepunten. Elk calibratiepunt wordt daarbij in duplo uitgevoerd in de PCR. Ter bepaling van de juistheid en precisie worden 4 onafhankelijke PCR replicaten geanalyseerd. Dit resulteert in 32 PCR-resultaten in totaal. De aanvaardingscriteria voor de methode verificatie zoals beschreven in het methode verificatie document (8) komen overeen met deze in het “Methode Performantie Vereisten” document (4).

15

Implementatie van ENGL leidraden binnen het Belgische NRL-GGO De implementatie van de methode verificatie richtsnoeren in de uitvoerende laboratoria is een complex gegeven aangezien de labs hun validatieprocedures dienen aan te passen. Bovendien zijn de vereisten verschillend voor in de EU-toegelaten GG events versus events die onder de verordening LLP richtlijn vallen. Voor de eerste groep geldt een drempel van 0,9% voor verplichte etikettering, terwijl voor het tweede een MRPL (“Minimum Required Performance Limit”) van 0,1% is ingesteld. Dit vereist dat het laboratorium dergelijke events moet kunnen kwantificeren tot op 0,1%. Daarom moeten geschikte experimentele instellingen worden toegepast om via eenzelfde experimentele setup alle methoden te kunnen valideren. Op 4 oktober 2012 organiseerde het Belgische NRL-GGO in samenwerking met het FAVV een workshop “Methode validatie en MO (meetonzekerheid) bepaling voor kwantificering van GGO’s”. Deze workshop was gericht op een discussie rond de praktische implementatie van de nieuwe ENGL richtsnoeren in de laboratoria en de problemen die de labs daarbij ondervinden. De conclusies van de workshop waren dat het NRL zeer geavanceerd is in de implementatie van de ENGL richtsnoeren voor verificatie van methoden. Alle verplichte parameters worden getest, zoals aanbevolen in het “Verificatie” document en de criteria voor elk van de parameters worden aangenomen. De bepaling van de LODabs en de LOQabs wordt uitgevoerd op een vergelijkbare manier. De verificatie van methoden voor kwantificering volgt verschillende set ups, maar gebeurt in lijn met de aanbevolen richtsnoeren. De gebruikte instellingen laten toe om een voldoende aantal PCR resultaten te genereren voor zowel de kalibratiecurves als de analysemonsters, om zodus de verplichte parameters - R2, PCR efficiëntie, juistheid en precisie - te kunnen berekenen.

Vooruitzichten Harmonisatie in methode verificatie, noodzakelijk in functie van de uitvoering van de EU-RL GMFF officiële, event-specifieke real-time PCR methodes voor alle EU-toegelaten en LLP events op een routinematige basis in de uitvoerende laboratoria, zorgt ervoor dat uniforme criteria op EU-niveau in de laboratoria worden gebruikt. Echter, tijdens deze verificatie kunnen de laboratoria specifieke problemen ondervinden of vragen hebben, bvb. over de te gebruiken analysemonsters, hoe om te gaan met methoden die niet voldoen aan de criteria voor acceptatie, criteria voor absolute LOD, LOQ, wanneer en hoe robuustheid te testen (bijvoorbeeld wijzigingen in het volume van de reactie, gebruik van verschillende PCR instrumenten, …), enzomeer. Bovendien wordt het document “Methode Performantie Vereisten” momenteel herzien en wordt publicatie van een nieuwe, meer uitgewerkte versie binnenkort verwacht. De ENGL richtsnoeren zullen verder worden verbeterd om specifieke vragen van de labo’s te kunnen beantwoorden. De goedkeuring van de geharmoniseerde richtsnoeren door het NRL-GGO zorgt voor het toepassen van betrouwbare methoden en op die manier tevens voor hoge kwaliteit van de analytische resultaten. De NRL-GGO verbetert voortdurend de methode verificatie procedures op laboratorium niveau en zal actief deelnemen aan de verdere verbetering van de ENGL richtsnoeren. Echter, de uitdaging blijft het implementeren van alle officiële methoden op een tijds-, kosten- en arbeid-efficiënte wijze.

16

Referenties: 1. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parlament and the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed. Official Journal of the European Union, L 268, pp.1-23. 2. European Union reference laboratory for GM food and feed (EURL-GMFF), European Network of GMO Laboratories (ENGL), Compendium of Reference Methods for GMO analysis, JRC reference reports, EUR-Scientifical and Technical Research series, EUR 24596 EN, 2010, Available at http://ec.europa.eu/dgs/jrc/downloads/ jrc_reference_report_2010_11_gmo_analysis_compendium.pdf 3. Commission Regulation (EU) No 619/2011 of 24 June 2011 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed as regards presence of genetically modified material for which an authorisation procedure is pending or the authorisation of which has expired 4. European Network of GMO Laboratories (ENGL), Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical methods of GMO Testing, 2008, http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/guidancedocs.htm. 5. Žel J., Mazzara M., Savini C., Cordeil S., Camloh M., Štebih D., Cankar K., Gruden K., Morisset D.and Van den Eede G.. Method Validation and Quality Management in the Flexible Scope of Accreditation: An Example of Laboratories Testing for Genetically Modified Organisms, Food Anal. Methods, 1 (2): 61-72, 2008. 6. Scholtens I.M.J., Kok E.J., Hougs L., Molenaar B., Thissen J.T.N.M., van der Voet H. Increased Efficacy for Inhouse Validation of Real-time PCR GMO Detection Methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry 396 (6): 2213-27, 2010. 7. Ciabatti I., Froiio A., Gatto F., Amaddeo D., Marchesi U. In-house validation and quality control of real-time PCR methods for GMO detection: a practical approach. Dev. Biol. 126: 79-86; discussion 324, 2006. 8. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. EUR 24790 EN. 2011.

Vocabularium: Methode verificatie Verificatie is de bevestiging, door het verstrekken van objectief bewijsmateriaal, dat er aan specifieke vereisten voldaan wordt [ISO 9000:2000 paragraaf 3.8.4]. De verificatie dat een laboratorium adequaat een standaard methode kan uitvoeren, vereist dat het laboratorium objectieve aanwijzingen levert dat aan de performantie parameters, gespecificeerd in de testmethode, voldaan wordt voor de matrices waarop de methode wordt toegepast. De kritische eisen zijn over het algemeen de juistheid (meestal uitgedrukt in termen van “bias”) en de precisie (beschouwd als herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid) die worden weergegeven in de meetonzekerheid. De objectieve aanwijzingen zijn de juistheid en precisie verkregen op basis van werkelijke laboratorium resultaten. DNA-extractie replicaten DNA geëxtraheerd uit verschillende testporties van eenzelfde analysemonster. PCR replicaten PCR reacties uitgevoerd op eenzelfde DNA-extract echter geanalyseerd in verschillende reactietubes. Testresultaat Een testresultaat is een Ct-waarde of het aantal kopijen afkomstig van een PCR replicaat. Minimum Required Performance Limit (MRPL) De laagste hoeveelheid of concentratie van het analyt in een monster dat betrouwbaar gedetecteerd en bevestigd moet worden door officiële laboratoria.

[email protected]

17

Algemene en technische vereisten voor het organiseren van geaccrediteerde “proficiency tests” overeenkomstig de ISO 17043 norm Hadewig Werbrouck en Koen De Reu ILVO-T&V, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek – Eenheid Technologie en Voeding, Brusselsesteenweg 370, B-9090 Melle

Inleiding en context Sinds meer dan 25 jaar staat het Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek - Eenheid Technologie en Voeding (ILVO-T&V) in voor de wetenschappelijke begeleiding van het melk controle laboratorium MCC-Vlaanderen. Dit laboratorium is verantwoordelijk voor de bepaling van de kwaliteit en de samenstelling van de rauwe melk in het kader van de uitbetaling door de koper (= zuivelindustrie) aan de producent (= melkveehouder). De wetenschappelijke begeleiding biedt MCC-Vlaanderen de mogelijkheid om uniforme en juiste resultaten te bekomen in het kader van de uitbetaling van de rauwe melk. Om deze doelstelling te bereiken voorziet het ILVO-T&V o.a. pilootmonsters (= eerste lijnscontrole), standaarden, kalibratiereeksen, … en ook “proficiency tests”. Om de organisatie van deze “proficiency tests” aantoonbaar te waarborgen koos ILVO-T&V ervoor om deze in 2004 te accrediteren overeenkomstig de ISO 17043 norm.

Proficiency tests Een “proficiency test”, ook wel gekend als bekwaamheidstest of geschiktheidsproef is een interlaboratoriumstudie waarbij analyse- of meetresultaten afkomstig van diverse personen, instellingen en/of apparaten anoniem statistisch onderling vergeleken worden. Het zijn onafhankelijke controles op de kwaliteit van de uitgevoerde analyses. Door deelname aan “proficiency tests” kunnen de deelnemers verschillende aspecten zoals precisie, meer bepaald de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid, alsook de juistheid van hun analyses evalueren. Bovendien krijgen de deelnemers, vooral bij meerdere deelnames, inzicht in de stabiliteit van hun analyseresultaten in de tijd door het vaststellen van trends. Zo kunnen bv. systematische afwijkingen binnen een laboratorium, tussen methodes of tussen toestellen waargenomen worden. Het laboratorium krijgt hiermee dus een algemeen beeld van de kwaliteit van de eigen (routine)analyses. Daarnaast kan het laboratorium haar prestaties vergelijken met de prestaties van andere deelnemers. Bovendien kan hiermee ook aangetoond worden dat zij competent zijn voor het uitvoeren van de desbetreffende analyse bij het bekomen van goede resultaten. Aan de hand van al deze gegevens kunnen de werkwijze en het kwaliteitssysteem tevens verbeterd worden.

18

ISO 17025 Deelname aan “proficiency tests” is een effectieve, externe manier om te controleren of de aangewende analysemethoden kwaliteitsvol zijn. Het maakt bovendien ook deel uit van één van de vermelde kwaliteitsborgingen die beschreven staan in de ISO 17025 norm. Deze internationale ISO 17025 norm beschrijft de kwaliteitseisen voor beproevings- en/of kalibratielaboratoria. In deze norm zijn eisen aan de organisatie (management vereisten) en de uitvoering van beproevingen of analysemethoden en kalibraties (technische vereisten) vastgelegd.

ISO 17043 In tegenstelling tot niet geaccrediteerde “proficiency tests” wordt het prestatieniveau bij ISO 17043 geaccrediteerde “proficiency tests” aantoonbaar gewaarborgd. Daarom kiezen steeds meer organisatoren, zoals het ILVO-T&V, ervoor om hun “proficiency tests” te accrediteren. De algemene vereisten voor de organisator staan beschreven in de ISO 17043 norm. Voor bepaalde types van “proficiency tests” bestaan er naast deze norm nog specifiekere normen (vb. voor microbiologische “proficiency tests” in voedingsmiddelen en voeders ISO/TS 22117). Net zoals de ISO 17025 norm bevat de ISO 17043 norm twee grote onderverdelingen: management en technische vereisten. De management vereisten zijn grotendeels gelijklopend met deze beschreven in de ISO 17025 norm. Een aantal belangrijke management vereisten zijn o.a. organsatiestructuur, management review, klachtenprocedure, documentenbeheerssysteem (traceerbaarheid, archivering, ….), vertrouwelijkheid, procedure voor belangenconflicten, interne audits, klantentevredenheid, procedures voor inkoop van goederen en diensten, … Ook voor de technische vereisten zijn een aantal vereisten gelijklopend met de ISO 17025 norm zoals opleiding, training en functiebeschrijving van personeel (o.a. toekennen van bevoegheden) en beschrijving van de infrastructuur (geschiktheid, registratie, …). Echter, de meeste technische vereisten vermeld in de ISO 17043 norm zijn verschillend van deze vermeld in de ISO 17025 norm. Zo moet er eerst en vooral door de organisator een planning of kalender van de “proficiency tests” opgemaakt worden. Naast deze planning moet er ook duidelijkheid zijn over de naam en adres van de organisator, naam en adres van de coördinator, criteriavoorwaarden voor deelname, de analyseparameters waarvoor de “proficiency test” is aangemaakt, de range van de analyseparameters, de evaluatiecriteria, … Al deze gegevens dienen documentair vastgelegd te zijn. Eveneens dient de organisator te beschikken over technische expertise in het relevante domein van de “proficiency tests”. Eventueel kan hiervoor een raadgevende of technische werkgroep samengesteld worden. Men moet tevens over procedures beschikken waarin de voorbereiding, aanmaak en bewaring van de monsters voor de “proficiency tests” beschreven staan. Hierbij wordt getracht om monsters aan te maken die zo dicht mogelijk aanleunen bij de praktijkmonsters. Twee belangrijke criteria hierbij zijn de borging van homogeniteit en stabiliteit. Het borgen als organisator van deze laatste twee parameters is uiteraard van zeer groot belang aangezien de deelnemers geëvalueerd worden op criteria zoals herhaalbaarheid en juistheid. Tevens moeten per type “proficiency test” procedures opgesteld worden waarin homogeniteits- en stabiliteitscriteria beschreven staan (methoden die aangewend kunnen worden staan meer in detail vermeld in de ISO 13528 norm). De homogeniteit dient bepaald en geborgd te worden op monsters die zich in dezelfde (uitverdeelde) toestand/fase bevinden als de monsters die opgestuurd worden naar de deelnemers. Bij voorkeur wordt de homogeniteit ook getest vooraleer de monsters verzonden worden. Om de stabiliteit te borgen, moet de organisator kunnen aantonen dat de monsters stabiel zijn gedurende de maximale analysetermijn van de deelnemers. De monsters mogen evenzeer geen significante wijzigingen ondergaan tijdens het transport en de bewaring. Het vastleggen van toegelaten criteria voor temperatuur tijdens bewaring

19

en transport en het valideren van geschikte bewaarmiddelen voor de monsters is hier dan ook van groot belang. Voor wat betreft de toegekende waarde, zijn er verschillende mogelijkheden om deze te bepalen: gekende waarden (1), gecertificeerde referentiewaarden (2), referentiewaarden (3), consensuswaarden afkomstig van expert deelnemers (4) en consensuswaarden afkomstig van de deelnemers (5). Het door het deelnemend laboratorium bekomen resultaat wordt vervolgens beoordeeld t.o.v. de toegekende waarde. De ISO 17043 norm eist eveneens dat de nauwkeurigheid (juistheid en precisie) en de meetonzekerheid van de onderzochte parameter, het mininum aantal deelnemers, het aantal decimalen, de relevantie van significante cijfers aan het gerapporteerde resultaat, het aantal monsters … in een statistisch ontwerp vermeld worden. Daarnaast moeten alle aangewende data-analyse methoden om parameters zoals de homogeniteit, stabiliteit, toegekende waarde, standaardafwijking, “outliers” en evaluatiecriteria te bepalen, gedocumenteerd zijn. De keuze van de data-analysemethoden moet tevens onderbouwd zijn. Aan de deelnemers dient tevens een instructieblad meegegeven te worden waarin belangrijke zaken vermeld staan zoals o.a. de noodzakelijkheid van het aanwenden van de door hen gebruikte routinemethode, gedetailleerde procedure voor bewaring en behandeling van de monsters, veiligheidsvereisten, contactgegevens van de organisator en de coördinator, maximale leveringstermijn van de resultaten, … De ISO 17043 norm eist eveneens dat de organisator zelf de eindrapporten opmaakt (m.a.w. deze taak mag niet uitbesteed worden). Deze rapporten moeten ook aan een aantal eisen voldoen: o.a. de resultaten van alle deelnemers moeten anoniem en duidelijk vermeld staan, naam en contactgegevens van de organisator en eventueel de coördinator, toegekende waarde, evaluatie van de resultaten, statistische aangewende methoden, … Bovendien dienen deze rapporten binnen de afgesproken termijn naar de deelnemers doorgestuurd te worden. Zoals in de ISO 17043 beschreven, is de organisator ook verplicht om deskundige toelichtingen/suggesties te geven op de bekomen resultaten indien de deelnemer dit wenst.

Besluit Algemeen kan geconcludeerd worden dat aan heel wat eisen moet worden voldaan om ISO 17043 geaccrediteerde “proficiency tests” te kunnen of mogen organiseren. Doch de organisatie van dergelijke “proficiency tests” is aantoonbaar gewaarborgd waardoor een betrouwbare evaluatie van de deelnemers gegarandeerd wordt. Een bewuste keuze van het ILVO-T&V.

Referenties Eurachem. Selection, Use and Interpretation of Proficiency Testing schemes, second edition (2011) Anonymous. ISO 13528 Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons (2005). Anoniem. ISO 17025 Algemene eisen voor de competentie van beproevings- en kalibratielaboratoria (2005). Anonymous. ISO 17043 Conformity assessment – general requirements for proficiency testing (2010).

[email protected] [email protected]

20

Recente ontwikkelingen op het vlak van antibioticascreeningstesten Dr. Wim Reybroeck, ILVO-T&V ILVO-T&V, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek – Eenheid Technologie en Voeding, Brusselsesteenweg 370, B-9090 Melle

Voor de detectie van antibioticaresiduen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong worden vaak screeningstesten, zoals microbiologische inhibitortesten, ELISA’s, receptortesten en eenvoudige diagnostische kits gebruikt. Het laatste decennium zijn bepaalde testen verbeterd en werden nieuwe sneltesten ontwikkeld, voornamelijk voor de controle van rauwe melk bij aankomst op het zuivelbedrijf. Bij deze ontwikkeling zien we meerdere trends.

Verkorting van de testduur Microbiologische inhibitortesten zijn gebaseerd op het algemeen principe dat infectiewerende middelen de groei van een testorganisme remmen. Deze groeiremming kan worden bepaald door bijvoorbeeld het meten van een remzone bij plaattesten of het volgen van een kleuromslag van een pH-indicator zoals broomcresolpurper bij agardiffusietesten. In het verleden werd gepoogd om de inherente incubatiestap bij microbiologische inhibitietesten in te korten door zich te beroepen op een ander meetprincipe zoals een ATP-meting (Lumac Rapid Antibiotic test, Lumac bv - 90 minuten) of een meting met een luminometer van het licht geproduceerd door het genetisch gemodificeerd luminescent testorganisme (Valio T-102 test, Valio Ltd.). De tijdswinst bleef evenwel relatief beperkt. Door DSM-Food Specialties werd een versie van de Delvotest (incubatieduur 3 uur) ontwikkeld met een verkorte incubatieduur nl. de Delvotest Accelerator. Een verhoging van het aantal sporen in de voedingsbodem versnelt de zuurproductie maar maakt het moment van de kleuraflezing meer kritisch. Dit probleem wordt gecounterd door een continue kleuraflezing tijdens het incuberen en het werken met een flexibele incubatieduur (105-140 minuten) die bepaald wordt door het bereiken van de gele kleur in een ingesteld aantal cupjes van de microtiterplaat. Meer relevante tijdswinsten werden geboekt in het domein van de sneltesten. De eerste sneltest ontwikkeld voor de screening van rauwe melk op ß-lactamantibiotica was de Penzym test (UCB-Bioproducts s.a.), een enzymatische (carboxypeptidase) colorimetrische test die een resultaat gaf in 20 minuten. Daaropvolgend werden in de jaren ‘80 en ‘90 verschillende ß-lactam-screeningstesten commercieel beschikbaar met een totale testduur van minder dan 10 minuten zoals de receptortesten SNAP (Idexx Laboratories, Inc. - 9 min), ßeta-s.t.a.r. (Neogen Corporation - 5 min), Charm MRL Beta-lactam Test (ROSA) (Charm Sciences Inc. - 8 min), and the immunoassays Lactek (Idexx laboratories, Inc. - 8 min) and Parallux (Idexx Laboratories, Inc.- 5 min). Met het oog op tijdswinst werden recent bepaalde testen aangepast of nieuwe testen ontwikkeld met een testduur van 3 minuten of minder. Dergelijke korte testen laten toe om de controle reeds bij de ophaling vóór het oppompen van de hoevetankmelk uit te voeren in plaats van op de tankwagenmelk bij aankomst op het zuivelbedrijf. Op die manier kan het vernietigen van grote volumes melk worden vermeden. Zo zijn nu beschikbaar met 3 minuten testduur: Charm MRLBL3 (Charm Sciences Inc.); BetaXpress & TwinExpress Milk (Unisensor s.a.) en βeta-s.t.a.r. Combo 3.0 (Neogen Corporation); met 2 minuten testduur: ßeta-s.t.a.r. 1+1 (Neogen Corporation) en Charm MRLBLTET2 & MRLBLRFTET2 (Charm Sciences Inc.) en met 1 minuut testduur: Charm MRLBL1 (Charm Sciences Inc.).

21

Verbreding detectiespectrum De meeste sneltesten sporen slechts één enkele substantie op of enkel substanties behorende tot één enkele antibioticafamilie. Waar het gamma vroeger voornamelijk beperkt bleef tot testen voor de screening van β-lactam (melk), tetracyclines, sulfamethazine of chlooramphenicol zijn nu generische sneltesten beschikbaar voor de detectie van aminoglycosiden, (fluoro)quinolones, sulfonamiden,… Daarnaast zijn recentelijk tal van gecombineerde testen voor het gelijktijdig aantonen van ß-lactam- en tetracycline-antibiotica in melk ontwikkeld zoals de TwinSensor Milk & TwinExpress Milk (Unisensor s.a.), Charm MRL Beta-Lactam/Tetracycline Combo Test & Charm MRLBLTET2 (Charm Sciences Inc.), βeta-s.t.a.r. Combo 3.0 (Neogen Corporation) en SNAPduo (ST) (Idexx Laboratories, Inc.). De generische Trisensor (Unisensor s.a.) dipstick screeningstest laat toe tegelijkertijd ß-lactam-, tetracycline- en sulfonamide-residuen in melk op te sporen. Met de 4Sensor Milk (Unisensor s.a.) of de ßeta-s.t.a.r. 4D (Neogen Corporation) kan melk in minder dan 10 minuten gescreend worden op de aanwezigheid van ß-lactam-, tetracycline-, streptomycine- en chlooramphenicolresiduen. Tenslotte detecteert het Parallux Milk Residue Testing System (MEDEXX CO., Ltd.) residuen van 6 belangrijke β-lactamverbindingen, tetracyclines, spectinomycine, neomycine, streptomycine, spiramycine, sulfonamiden en quinolones in melk in 4 minuten met één enkele test. Voor honingresiduonderzoek is er de Bee4Sensor multipele teststrip voor de controle op tylosine, (fluoro)quinolones, sulfonamiden en chlooramphenicol met één enkele test.

Verbeterde detectiecapaciteit Er wordt voortdurend verder gesleuteld aan de samenstelling van de voedingsbodem van microbiologische inhibitortesten met als doel meer componenten op EU-MRL te kunnen opsporen. Zo zijn de Eclipse 3G (ZEU INMUNOTEC), Charm Blue-Yellow II (Charm Sciences Inc.) en de Delvotest T (DSM Food Specialties) telkens een verbeterde versie van een bestaande test. Een andere aanpak is het gebruik maken van meerdere testplaten met telkens een andere samenstelling of een ander testorganisme. Ook de detectiecapaciteit van sommige sneltesten werd recent verbeterd en beter aangepast aan de verzuchtingen van het cliënteel. Voorbeelden hiervan zijn de SNAP ST (Idexx Laboratories, Inc.) die meer β-lactamverbindingen op EU-MRL opspoort en tegelijkertijd de cefalosporines minder gevoelig en dichter bij de norm detecteert. Voor de controle van levensmiddelen bestemd voor de Russische markt, met zijn specifieke residunormen, werden bepaalde screeningstesten aangepast zoals de Charm MRLBLRFTET2 (Charm Sciences Inc.) en de Tetrasensor Tissue 10 ppb (kit 036, Unisensor s.a.). Op vraag van de zuivelindustrie in Australië en NieuwZeeland werd een test met een gecorrigeerde testcapaciteit voor cefalonium ontworpen, namelijk de Charm SL Kiwi test.

Vereenvoudiging uitvoering (aflezing, incubatie,…) De meeste microbiologische inhibitortesten en sneltesten zijn visueel afleesbaar. Ter vervanging van de subjectieve kleuraflezing van agardiffusietesten kan nu gebruik gemaakt worden van reflectometrische kleuraflezing met een vlakbedscanner gestuurd door specifieke software [Delvoscan & Cscan (DSM Food Specialties), Premiscan (R-Biopharm AG) en GVSCAN (Charm Sciences Inc.)]. Bij sommige testen [Delvotest Accelerator (DSM Food Specialties), BRT Incubator & BRT Scan (AiM GmbH) en Eclipse & Explorer 2.0 met een i-Reader (ZEU INMUNOTEC)] wordt de kleur tijdens de incubatie gevolgd en bepaalt de software het einde van de incubatie. Ook bij de sneltesten kent men recentelijk dezelfde ontwikkeling. Zo ontwikkelde Charm Sciences Inc. de EZ-Reader, een gecombineer-

22

de incubator/reader zodat na beëindiging van de incubatie de teststrip niet meer in een aparte reader dient te worden aangebracht. Nu kan men pas spreken van een echte ‘ROSA’ of ‘Rapid One Step Assay’. De reader vervult hierbij niet alleen de functie van afleestoestel doch via software wordt ook de melkflow over de teststrip gevolgd en worden afwijkingen geregistreerd. Tevens kan de software beslissen bij resultaten in de buurt van de beslissingsgrens om de incubatieduur kort te verlengen om zo een duidelijker resultaat te bekomen. Andere kitproducenten hebben zich meer gefocust op een test die bij kamertemperatuur kan gebruikt worden zodat geen verwarmingstoestel meer nodig is. Voorbeelden hiervan zijn de SNAP ST & SNAPduo ST (Idexx Laboratories, Inc.) en BetaSensor Milk (Unisensor s.a.). Dergelijke testen zijn zo geconcipieerd dat ze zonder labo-apparatuur bij de producent kunnen uitgevoerd worden. Ook voor het testen van honing zijn meerdere dergelijke sneltesten commercieel beschikbaar: TetraSensor & SulfaSensor Honey (met het field testprotocol) (Unisensor s.a.); Chloramphenicol, Tetracyclines & Quinolones Residue Rapid Inspection Test Devices (Hangzhou Nankai Biotech Co., Ltd.) en de Chloramphenicol, Tetracycline, Quinolones, Sulfadiazine & Penicillins Drug Residue Rapid Test Devices (SmarK!T, Zhejiang Huazheng Import & export Co., Ltd.). Geheel apart en minder geschikt voor voedingslaboratoria is de ontwikkeling van nieuwe technologieën zoals biosensoren, cellulaire bioassays, transcriptomics en proteomics en optische biosensoren, gebaseerd op surface plasmon resonantie (SPR). Eerste applicaties van molecularly imprinted polymers (MIP) zijn nu ook beschikbaar voor residuanalyse; in de meeste gevallen worden MIPs toegepast als een selectief absorbant in solid-phase extractiemethoden bij de clean-up van stalen. Nieuwe electrochemische en optische immunosensoren, flowcytometrische immunoassays en biochip array technologietoepassingen zijn al (Evidence, Randox Laboratories) of binnenkort beschikbaar voor residuanalyse. Tevens mogen toepassingen van aptameren (artificiële oligonucleotiden (RNA of DNA)) verwacht worden. Tenslotte worden de laatste jaren - ondanks het kostenplaatje - steeds meer massaspectrometrische methoden toegepast voor een zeer selectieve en specifieke multiresidudetectie.

[email protected]

23

24

Hoe de meetonzekerheid ramen bij de kwantificering van bestrijdingsmiddelen ? Laure Joly en Vincent Hanot WIV-ISP, Juliette Wytsmanstraat 14, 1050 Brussel

De onzekerheid, een sleutelelement bij het nemen van beslissingen Binnen het bijzondere kader van de voedselveiligheid moeten de gevonden concentraties van bestrijdingsmiddelen absoluut kleiner zijn dan een toegestane maximumconcentratie (MRL). Het is daarbij van het grootste belang dat men over volledige informatie kan beschikken wanneer men moet beslissen of een product wel of niet conform is aan de geldende voorschriften. Die concentraties krijgen echter pas echt betekenis als zij worden genuanceerd aan de hand van de betreffende meetonzekerheid, waarmee de spreiding van de waarden die men redelijkerwijs aan een meting kan toekennen kan worden aangegeven met een welbepaald betrouwbaarheidsniveau (k) [1]. Om de meetonzekerheid voor de concentratie van een bestrijdingsmiddel te ramen kunnen meerdere benaderingen in overweging worden genomen mits zij in overeenstemming zijn met de GUM (guide to the expression of uncertainty in measurement [2]) en met de norm ISO 17025 [3].

Verschillende mogelijke benaderingen Meetonzekerheid, een complexe en lastige berekening die ons weer naar de schoolbanken brengt De alomvattende benadering, ook bekend als « bottom-up », staat beschreven in de EURACHEM gids [4] die voorstelt om als volgt te werk te gaan: om te beginnen een lijst opmaken van alle mogelijke bronnen van onzekerheid en de met elk daarvan samenhangende onzekerheid berekenen. Daarna worden de verschillende vastgestelde bijdragen uitgedrukt als standaardafwijkingen. Tot slot worden de standaardafwijkingen met elkaar gecombineerd om tot een onzekerheid van het samengestelde type te komen (uc) op basis waarvan een zogenaamde “uitgebreide” meetonzekerheid wordt berekend (U). Bijvoorbeeld: U=k uc= 2 uc voor een betrouwbaarheidsniveau van 95 %. Dankzij die strikte benadering worden de aan elke bron of procedurestap verbonden onzekerheden duidelijk geïdentificeerd en gekwantificeerd. Het feit dat men de aan elke onzekerheid gekoppelde eigen waarde kent, kan later worden gebruikt om de analyseprocedure te optimaliseren. Bij toepassing op het bijzondere gebied van de analyse van bestrijdingsmiddelen blijkt die benadering echter bijzonder lastig en vrijwel onmogelijk uit te voeren. Verder bestaat de neiging dat de meetonzekerheid in complexe gevallen wordt onderschat, vooral vanwege het feit dat men moeilijk alle bijdragen in de eindberekening kan opnemen [5].

25

Onzekerheid berekenen zonder de bronnen ervan te kennen De door het Analytical Methods Committee (AMC) [6] ontwikkelde “top down” methode kan dan weer alleen worden gebruikt voor methoden die reeds gevalideerd zijn. Het gaat om een empirische benadering waarbij de onzekerheid wordt getypeerd voor de resultaten van 1 laboratorium en van interlaboratoriumproeven. In die benadering, U= √(u2bias+ u2 Rw ) , wordt de systematische fout bepaald op grond van de bij de interlaboratoriumproeven verkregen z-scores en de metingen van referentiematerialen terwijl de intralaboratorium herhaalbaarheid (URw,) wordt bepaald aan de hand van kwaliteitscontrolemonsters (QC) en validatiegegevens. Omdat de « top down » benadering de grootste waarschijnlijkheid geeft dat alle bijdragen in aanmerking worden genomen wordt zij vaak gebruikt in de analytische scheikunde. Ook het FAVV prijst die benadering aan [7].

Onzekerheid op 50 % vaststellen door de aanbevelingen uit SANCO 12495/2011 toe te passen In de praktijk blijkt het totaal onmogelijk om op welke manier ook de meetonzekerheid te berekenen voor honderden moleculen en in tientallen verschillende levensmiddelen (wat het geval is bij multi-residuanalyses van bestrijdingsmiddelen). Zich bewust van die problematiek raadt SANCO 12495/2011 [8] de laboratoria die hun geschiktheid tijdens interlaboratoriumproeven hebben bewezen aan om de onzekerheid vast te stellen op 50 %. Die schijnbaar willekeurige waarde vloeit voort uit de vaststelling van robuuste standaardafwijkingen (Qn-RSD) in de Europese interlaboratoriumproeven over een aantal jaren. Figuur 1 laat zien dat de robuuste standaardafwijking voor de meeste bestrijdingsmiddelen om en bij 25 % ligt, ongeacht de matrix. De passende standaardafwijking (FFP-RSD ) is daarom vastgesteld op 25 % en de uitgebreide onzekerheid U=2 FFP-RSD op 50 % voor een betrouwbaarheidsniveau van 95 %. Wij zien in figuur 1 ook dat de Qn-RSD over de jaren heen de neiging vertonen om de waarde van de FFP-RSD te benaderen.

Figuur 1. Robuuste standaardafwijking (Qn-RSD) van de verschillende bij 10 Europese interlaboratoriumproeven gevonden bestrijdingsmiddelen. De geanalyseerde matrices zijn fruit- of groentesoorten die elk jaar verschillen. De verkregen bestrijdingsmiddelenconcentraties schommelen tussen 50 en 1000 ng/g matrix. De grafiek werd overgenomen met toestemming van het European Union Reference Laboratory for residues of pesticides in fruits and vegetables (EURL-FV).

26

Onzekerheid meten met de vergelijkingen van Horwitz en Thompson (aangepaste Horwitz) Dit is een totaal andere benadering dan de twee voorgaande. Ze steunt op de empirische vergelijkingen van Horwitz en Thompson en beschouwt de onzekerheid als uitsluitend evenredig met de bestrijdingsmiddelenconcentratie. De vergelijking van Horwitz (U= 0.02 c0.8495 voor een betrouwbaarheidsniveau van 95 %) wordt gebruikt voor concentraties (c in g/g) die begrepen zijn tussen 1.2 10-7 (120 ppb) en 0.138 (13.8 %). Voor kleinere concentraties wordt de vergelijking van Thompson (aangepaste Horwitz) gebruikt ; U= 0.22 c [9, 10]. Met die benadering kan men zich vooral een goed beeld vormen van de grootteorde van de onzekerheid.

Vergelijking van de met de verschillende methoden verkregen onzekerheden Het EURL “Pesticides Fruits and Vegetables” raamde de met verschillende bestrijdingsmiddelen samenhangende onzekerheid bij een concentratie van 10 ppb aan de hand van elk van de hierboven besproken methoden [11]. Dit zijn de belangrijkste resultaten: de “bottom up” benadering werd niet gebruikt omdat ze te complex is, de “top down” benadering raamt de onzekerheid op 54 %, de SANCO-methode geeft een onzekerheid van 50 % te zien en de Thompsonvergelijking raamt de onzekerheid ten slotte op 44 %.

Volledigheidshalve moet echter ook worden aangestipt dat de onzekerheid op de meting van de concentratie van een bestrijdingsmiddel in een aantal welbepaalde gevallen ver onder 50 % ligt. Dat is met name zo voor de analyse op bromiden die gebeurt aan de hand van een zogenaamde “single residu” methode waarbij de gevonden concentraties gelijk zijn aan ongeveer 50 ppm. Volgens de Horwitzvergelijking en gelet op de gevonden hoeveelheden is de onzekerheid gelijk aan 10 %, wat een resultaat is dat de robuuste RSD (Qn-RSD) van de interlaboratoriumproeven (8.6 % voor PT –SRM6) benadert. De onzekerheid is ook kleiner bij gebruik van een isotopenstandaard in “single residu” methoden. De isotopenstandaard wordt in het begin van de analyse toegevoegd en corrigeert de meeste onzekerheden die samenhangen met extractie, voorzuivering en injectie. Daardoor zijn de verkregen systematische fout en interlaboratorium herhaalbaarheid minimaal en ligt de uitgebreide meetonzekerheid ver onder 50 %. Bibliografie 1. International vocabulary of basic and general terms in metrology (VIM),ISO 1993 2. Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM). BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML. International organization of standardization, Geneva Switzerland, 1st edition 1993, corrected and reprinted 1995 3. ISO/DIS 17025, General Requirements for the Competence of Calibration and Testing Laboratories, ISO, Geneva, Switzerland, 2000. 4. Quantifying uncertainty in analytical measurement. EURACHEM/CITAC Guide,2nd ed., 2000 5. Measurement uncertainty in testing, Eurolab Technical report N°1/2002 6. Analytical Methods Committee of the Royal Society of Chemistry, Analyst, 1995, 120 ; 2303. 7. Procédure pour la détermination de l’incertitude de mesure pour les analyses chimiques quantitatives. Note de service de l’AFSCA n°LAB P 508 disponible sur le site web de l’AFSCA 8. Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Doc SANCO/12495/2011 9. Horwitz, W., Kamps, L.R., Boyer, K.W., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1980, 63 ; 1344.

27

10. Thompson, M., Analyst, 2000, 125 ; 385. 11. Comparative study of the main top-down approaches for the estimation of measurement uncertainty in multiresidue analysis of pesticide in fruit and vegetables, Medina, P, Presentation at EURL SRM/FV Workshop, 27-28 October 2010 Almeria (Spain) [email protected]

28

De opleidingen voor de erkende laboratoria, georganiseerd door het FAVV in samenwerking met de nationale referentielaboratoria, vindt U terug op de website van het FAVV (www.favv.be > Beroepssectoren > Laboratoria > Seminaries & workshops). Deze tabel wordt regelmatig geactualiseerd, gelieve daarom regelmatig de website te consulteren. Andere interessante workshops en symposia zijn hieronder opgenomen.

Workshops & Symposia Datum

Onderwerp

Plaats

Meer informatie (website)

25.08-28.08.2013

127 AOAC Annual Meeting & Palmer House Hilton, Exposition Chicago, Illinois, USA

http://www.aoac.org/meetings1/127th_annual_mtg/ main_2.htm

25-29.08.2013

24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP)

Perth Exhibition Centre, Perth, Western Australia

http://www.waavp.org/

25-30.08.2013

The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (POP’s) - DIOXIN 2013

Daegu, Korea

http://www.dioxin2013.org/

09-10/09/2013

qPCR and digital PCR congress Lyon, France

www.globalengage.co.uk/qpcr.html

12-13.09.2013

18th Conference on Food Microbiology

Brussels, Belgium

organized by the Belgian Society for Food Microbiology vzw/aslb (BSFM) http://www.ilvo.vlaanderen.be/Default.aspx?alias=www.ilvo. vlaanderen.be/bsfm www.bsfm.be

19.09.2013

Trends in Food Analysis VII

Gent, Belgium

http://voeding.kvcv.be/trends%20VII.php

19.09.2013

IUNS 2013 Sponsored Session: “Maintaining health with Grenada, Spain nutrient rich diets”

https://twitter.com/dairynutr and http://www.fil-idf.org/ Public/SiteEventType.php?ID=23123

18.10.2013

5th symposium Belgian Wildlife CODA-CERVA, Disease ociety: Spatial Tervuren, Belgium Approach of Wildlife Diseases

http://www.bwds.be

24.10.2013

‘Methoden in de The Netherlands levensmiddelenmicrobiologie’

http://www.fimm.nl/symposium-microbiologie/ microbiologische-methoden-onderzoek/

28.10-1.11.2013

IDF World Dairy Summit

http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType.php?ID=23123

th

Yokohama, Japan

29

5-8.11.2013

6th International Symposium on RECENT ADVANCES IN FOOD ANALYSIS RAFA 2013

Prague, Czech Republic

http://www.rafa2013.eu/RAFA_2013_flyer_1.pdf

19-22.11.2013

Contaminants in feed and food

Gembloux, Belgium

Short course; http://www.cra.wallonie.be/img/ article/201307053659955f.pdf

20-21.11.2013

3rd International Fresenius Conference Residues of Food Contact Materials in Food

Cologne/Germany

http://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/ output.php?kurs=386

28-31.01.2014

HTC-13: International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers

Brugge, Belgium

http://www.htc-conference.org/

March 2014

IDF Symposium on Science and Technology of Fermented Melbourne, Australia Milk


March 2014

IDF Symposium on Microstructure of Dairy Products

Melbourne, Australia


2-5.06.2014

7th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis

Gent, België

7-9.05.2014

IAFP’s European Symposium on Food Safety

Budapest, Hungary

http://www.foodprotection.org/europeansymposium/

15-20.05.2014

IDF/ISO Analytical Week 2014

Berlin, Germany


27-31.10.2014

IDF World Dairy Summit

Tel Aviv, Israel

http://www.idfwds2014.com/

3-7.11.2014

Management of Microbiological Hazards in Foods (15th edition)

Wageningen, The Netherlands

Organised in cooperation with: European Chair in Food Safety Microbiology http://www.vlaggraduateschool.nl/eduvlco.html

30

31

RL


NRL


LNR

L A B O R ATO I R E S N AT I O N A U X DE REFERENCE

Labinfo. p. 4 Gebruik en validatie van Real-Time PCR-methoden voor de detectie van voedselpathogenen

Recommend Documents