Kuliah I. Sejarah, Pengertian dan Kontribusi Bioteknologi dalam bidang Pertanian: Konsep sel sebagai produsen dalam Bioteknologi

Kuliah I Sejarah, Pengertian dan Kontribusi Bioteknologi dalam bidang Pertanian: Konsep sel sebagai produsen dalam Bioteknologi

Copyright Statement:

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya) bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.

Cuplikan GBPP No

Tujuan Instruksional Khusus 1. Mahasiswa mampu menje-laskan sejarah, pengertian, dan kontribusi bioteknologi dalam bidang pertanian. Mahasiswa juga harus mampu menjelaskan konsep sel sebagai produsen dalam persepektif bioteknologi

Pokok Bahasan Sejarah, Pengertian dan Kontribusi Bioteknologi dalam bidang Pertanian: Konsep sel sebagai produsen dalam Bioteknologi

Sub Pokok Bahasan 1. Sejarah Bioteknologi 2. Pengertian Bioteknologi dan ilmu terkait dalam Bioteknologi 3. Kontribusi bioteknologi dalam bidang pertanian 4. Konsep sel sebagai produsen dalam bioteknologi

Est. Daftar Waktu Kepustakaan 15 menit 1, 6, 7 5 menit

60 menit

20 menit

I. Sejarah Bioteknologi

Perkembangan Bioteknologi Jaman sebelum Louis Pasteur •

Minuman beralkohol (Bir, anggur, tuak)

•

Makanan terfermentasi (Keju, yoghurt, tape,tempe, petis, terasi)

Perkembangan Bioteknologi

Jaman Louis Pasteur • Alkohol (Etanol, Butanol, aseton, gliserol) • Asam organik (Asam sitrat, asam asetat) • Pengolahan limbah secara aerob


Jaman antibiotika • Antibiotika (Penisilin, tetrasiklin, streptomisin) • Vaksin (Vaksin anti NCD, vaksin anti polio) • Transformasi steroid (DOPA) • Teknologi fermentasi media cair • Teknologi biakan jaringan hewan


Jaman pasca antibiotika • Asam amino (Asam glutamat, lisin, aspartame) • Protein sel tunggal • Enzim (amilase, glukosa isomerase, glukosa dehidrogenase) • Teknologi imobilisasi sel dan ensim • Teknologi pengolahan limbah cair anaerob (Biogas) • Polisakarida bakteri (Xanthan, Trehalosa)

Timeline Perkembangan Bioteknologi Seleksi kuda (Babylonia-6000 SM): benih padi :Cina; Gandum, jagung : Eropah dan Amerika Perkembangan ilmu Genetika :  Mendel (1822-1884)  1843, Abbe` Napp (1843)

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Timeline Perkembangan Bioteknologi Tahun

Kejadian penting

1865

Gen dianggap sebagai faktor partikulat

1900

Penemuan kembali hukum Mendel (Correns, Tschermak, de Vries)

1903

Khromosome adalah unit keturunan

1910

Gen-gen terletak pada kromosom

1913

Kromosome mengandung gen-gen yang tersusun secara linear

1927

Mutasi adalah perubahan physik pada gen

1931

Rekombinasi disebabkan oleh pindah silang

1944

DNA adalah materi genetik

1945

Gen adalah pengkode protein

1953

DNA berbentuk double helix (Watson dan Crick)

1958

Replikasi DNA bersifat semikonservatif

1961

Kode genetik tersusun secara triplet

1972

Kloning DNA ke dalam plasmid vektor

1976

Kloning gen pengendali insulin

Timeline Perkembangan Bioteknologi Tahun 1972 1973 1975 1975 1977 1978 1981 1982 1983 1984 1985 1987 1988 1989 1992

Kejadian Dihasilkannya rekombinan DNA pertama dengan bantuan enzim Ligase, Dihasilkannya organisme transgenik pertama oleh Cohen, et al. Ditemukannya teknik elektrophoresis dengan Agarose Sekuensing dengan metode pemutusan berantai Metode hibridisasi DNA Didirikannya perusahaan yang bergerak dalam teknologi gen: Genentech Diperkenalkannya RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 579 gen manusia berhasil dipetakan diperkenalkannya Hibridisasi in-situ Genbank sekuens pertama didirikan Identifikasi pertama penyakit Huntington’s pada kromosom IV Diperkenalkannya Pulsefield Gel Elektroporesis (PFGE) Diperkenalkannya PCR (Polymerase Chain Reaction) Diperkenalkannya YAC (Yeast Artificial Chromosome) Didirikannya proyek pensekuenan genom manusia Peta lengkap pertama genome Hemophilius influenzae Peta tautan lengkap genome manusia pertama

Timeline Perkembangan Bioteknologi Tahun Kejadian 1993 Diperkenalkannya ESTs (Expressed Sequences Tags), Dipublikasikannya peta fisik pertama genome manusia 1995 Genom Haemophilus influenza dan Mycoplasma genitalium lengkap disekuens 1996 Genom Saccharomyces cereviceae (Eukaryot) lengkap disekuens, juga Eschericia coli , Methanococcus fannaschii (Archaeobacteria) lengkap disekuens, Diperkenalkannya teknologi chip 1997 Dipublikasikannya peta fisik genom manusia yang lengkap 1998 Genom C. elegans selesai disekuens 1999 Genom Drosophila melanogaster selesai disekuens 2000 Genom Arabidopsis thaliana selesai disekuens 2000 Genome manusia H.sapiens selesai disekuens 2000 Genom Oriza sativa selesai disekuens 2002 Genom nyamuk Anopheles gambiae dan Plasmodium palcifarum selesai disekuens

2. Pengertian Bioteknologi • Bios : makhluk hidup • Teknos : teknik/metode/prosedur • Logos : ilmu pengetahuan

Definisi CBD (Convention on Biological Diversity) 29 Desember 1993 –Rio de Janeiro: • Bioteknologi adalah teknologi yang mengaplikasikan penggunaan sistem biologis, organisme hidup, atau turunannya untuk membuat atau memodifikasi produk ataupun proses untuk tujuan tertentu. • Interpretasi (luas) mencakup berbagai alat dan teknik yang digunakan dalam berbagai kegiatan produksi material. • Interpretasi (sempit) berkaitan dengan teknik-teknik DNA (Deoxyribonucleic acid) yakni material genetik yang terdapat pada setiap organisme hidup, biologi molekuler dan aplikasi-aplikasi teknik reproduksi.

Pengertian Bioteknologi dan Ilmu Terkait dalam Ilmu Bioteknologi Bidang Kajian pendukung sesuai bidang kajian

Pertanian

Kedokteran Peternakan Farmasi

Biotek nologi

?????????

Teknologi pangan Lingkungan Kehutanan

Industri Nanoteknologi

3. Kontribusi bioteknologi dalam bidang pertanian

Penciptaan Varietas Resisten • Resistensi terhadap Herbisida Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman transgenik pertama yang diusahakan secara komersial, dengan alasan: 1.Relatif mudah untuk menghasilkannya 2.Gulma dapat menyebabkan 10-15% pengurangan hasil 3.Penggunaan herbisida yang tidak saja mahal, akan tetapi juga tidak ramah lingkungan.


Herbisida Total X Herbisida Selektif •Meracun terhadap semua jenis tumbuhan •Cepat terurari di tanah •(Phosphinothricin, Basta=(WP) PPT/10 hari), Glyphosat (Round up (WP)/3-60 hari)

•Aktif pada dosis tertentu terhadap tumbuhan tertentu dengan karakter morfologi dan fisiologi tertentu •Persistensi lama di tanah dan air. •Atrazin, Bromoxynil, 2.4-D


Penciptaan Tanaman Resistensi terhadap Herbisida Herbisida Basta ® Sumber gen Resisten: gen bar- dan gen pat- diisolasi dari Bakteri tanah Streptomyces hygroscopicus dan S. viridochromogenes Mutan Lucerne (Medicago sativa) gen toleran terhadap Basta Produk: Phosphinothricin-acetyltransferase Fungsi: detoksifikasi melalui proses acetilasi Promotor: 35S-Promotor dari CaMV Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai


Glyphosat Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor) dari A. tumifaciens strain CP4 (mutant) Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Kapas, kentang, Jagung, kedelai, tembakau dan gandum 1996-1997 (USA): Tanaman transgenik resisten herbisida menurunkan penggunaan herbisida 22-26%. Erosi tanah menurun 90%, peningkatan produksi 5%

Problem : kekuatiran tentang penyebaran gen herbisida resisten, dicoba penggunaan plastida sebagai target untuk pengintegrasian gen asing Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Resistensi terhadap herbisida


Resistensi terhadap Serangga Pertimbangan: Penggunaan insektisida yang jelas selain tidak ekonomis juga tidak ramah lingkungan

Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin Tanaman: Kapas, kentang, jagung, tomat

European corn borer

Keuntungan: Kapas: penghematan insektisida 3,6 juta liter, produksi 7% meningkat Jagung : 300.000 kg (10%) Western corn rootworm


Resistensi terhadap Serangga


Problem: Ada serangga yang resisten terhadap δ_endotoxin,

Strategi lain: Serin-Proteinase-inhibitor (menghambat enzim pencernaan)


Resistensi terhadap Virus Cross protection Coat protein gen ditransfer sebagai pelindung thdp. virus asing

Source: www.apsnet.org Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

R-Gene (-Resistent Gen) Resistensi terhadap Bakteri dan jamur 200 jenis bakteri bersifat pathogen (prokaryot) 8000 jenis jamur bersifat pathogen (Eukaryot) (100.000 jenis nonpathogen) Pathogen

Tanaman Inang

Gejala Penyakit

Bakteri

Agrobacterium tumifaciens

Tumbuhan dikotil

Erwinia amylovora

Apel, peer

Pseodomonas syringae pv. lachrymans

Timun

Bercak daun

Streptomyces scabies

Kentang

Bisul

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Padi

Blast

Ophiostoma novo-ulmi

Ulm

Mati ulm

Phytoptora infestans

Kentang

Busuk umbi

Puccinia graminis

Gandum

Karat hitam

Pembentukan tumor

Jamur


Kerusakan akibat Jamur dan Bakteri: • Kerusakan morfologis, fisiologis • kontaminasi (mycotoksin) didalam bahan makanan dalam jangka panjang bersifat carcinogenic Kasus Phytoptora infestans Tanaman kentang di USA (1845), kelaparan terparah di dunia sehingga menyebabkan migrasi besar-besaran dari Irlandia ke USA

Strategi: - Chitinase untuk mencerna lapisan chitin dinding sel jamur (spesifik) - α-Thionin terhadap Pseudomonas syringae, dan Fusarium oxysporum Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Strategi - Gen Cholinoxygenase dari bakteri Arthrobacter globiformis menghasilkan Transgenik Arabidopsi thaliana toleran terhadap kadar garam tinggi (Glycinbetain) - Mannitol-Dehydrogenase (E. coli )menyebabkan akumulasi mannitol yang bisa meningkatkan toleransi terhadap kekeringan pada tanaman tembakau - Quicsilberreduktase (bakteri) pada tanaman Liriodendron tulipifera meningkatkan toleransi terhadap logam perak - Gen Metallothionin pada tanaman tembakau meningkatkan resistensi terhadap logam Cadmium


Toleran terhadap stress lingkungan (abiotic-stress) • Panas, • Dingin, • Kekeringan • Kadar Garam yang tinggi • Kekurangan mineral • Logam berat • Radiasi UV-B


Gene glutathione dari E. coli berperan dalam chelating untuk mengurangi keracunan pollutant.

Deteksi pollutant

Rumput lapangan golf

 Tahan herbisida  Tumbuh lambat mengurangi pemangkasan mengurangi polusi Bio Steel  Jaring laba-laba adalah protein terkuat  Protein penyusu jaring laba-laba diekspresikan di bulu domba  Hasilnya utuk membuat baju tahan peluru (Nexia)

Deteksi Ranjau Darat Dibutuhkan oleh Angkatan Darat, Tanpa upaya ini,anak-anak dan penduduk sipil terancam Bantuan Bioteknologi Tanaman (dikembangkan oleh Aresa Biodetection) • Gen yang peka terhadap logam dimasukkan ke dalam tanaman • Apabila akar tanaman menyentuh ranjau darat, Tanaman berubah warna dari hijau menjadi merah

Mendeteksi ranjau darat

Perubahan pada bahan makanan Negara berkembang: kekurangan pangan Negara Maju : Alergi, kualitas bahan makanan, transportasi

Strategi - Gen AGPase (ADP-Glucose-phsoporilase) dari E. coli digunakan untuk meningkatkan kandungan pati pada tanaman kentang Sebaliknya teknik ekspressi antisense Dihasilkan kentang yang menghasilkan amylopketin, tapi tanpa amylosa (penting untuk industri) - Gen Thioesterase dari Umbellularia californica dapat meningkatkan kandungan Laurat pada tanaman Raps, berguna dalam pembuatan margarin


Perubahan pada bahan makanan Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

- Pada tanaman padi dihasilkan tanaman transgenikj yang mampu menghasilkan kadar β-Carotin yang tinggi. Untuk itu empat macam gen pengkode empat macam enzim diintegrasikan: - Phyton-Synthase, Phytoen-Desaturase, ζ-Carotin-Desaturase dan Lycopen-ß-Cyclase.

- Golden Rice


Rasa dan Daya Simpan •

•

Polygalacturonase dengan teknik antisense dapat diinaktifkan dan daya simpan menjadi lama. Tomat dengan tanda Flavr Savr®.

Bahan baku industri •Poly (3HB) = PHB untuk menghasilkan materi bioplastik. Berhasil dicobakan pada plastida tanaman Arabidopsis thaliana dari gen Ralstonia eutropha

Source: Wikipedia E. coli

Produksi Metabolik Sekunder • Alkaloid : Morphin = Atropin (Papaver somniferum) Taxol untuk kanker dari Taxus brevifolia • Bahan untuk imunisasi: Gen spaA menghasilkan protein yang mampu mencegah karies gigi

proteins such as growth hormones, insulin, blood substitutes, and trypsin inhibitor Promega-3 fatty acid not from fish Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

PENGANTAR PEMULIAAN TANAMAN

Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar Tumbuhan Steril (MS)

Tumbuhan Normal TA29

Barnase

TA29

Barnase

TA29

Barstar

Barnase

+

Barstar

Barnase Degradasi RNA di tapetum Tapetum mati Tapetum hidup Pollen tidak terbentuk

Pollen terbentuk normal

Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA

References: 1. Hayward, et al. (1993). Plant Breeding-principles and prospects. Chapman & Hall. 2. Fehr, W.R. (1987). Prnciples of cultivar development. Macmillan Publishing. Co. New York.


SELEKSI BERPANDUAN PENANDA

MARKER ASSISTED SELECTION (MAS)


Penanda Morfologis

Catharanthus roseus Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Sistem Penanda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)


Sistem Penanda STS (Sequences Tagged Sites) CAPs (Cleavage Amplified Polymorphisms) Mm m fmm mf mmm f f m mmm

V

Mm

MM

mm

Mm

MM

mm

A 400 bp 211 bp 152 bp 104 bp 85 bp

430 bp

20-39 bp

STS

B

104 bp

189 bp

341 bp 361 bp

ASP2-SP6 (M)

400 bp 104 bp

C ASP2-SP6 (m)

85 bp 104 bp

152 bp

20 bp

39 bp

189 bp 400 bp

104 bp

85 bp

CAPs Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Sistem Penanda SNP (Single Nucleotide Polymorphism)


4. Konsep Sel Sebagai Produsen Peluang pemanfaatan sel sebagai produsen dengan menggunakan potensi bioteknologi Kultur starter protein, aroma buatan, bahan pengawet, Zat perasa, konsentrat

Protein pakan ternak, Asam amino, vitamin silase, Biopestisida, Tanaman resisten, metabolik sekunder

Enzim: untuk mencerna lemak, selulose, protein, pati,

Produksi bahan makanan Produk Pertanian

Konversi bahan mentah Sel Sebagai Produsen

Antibiotika, hormon, enzim, bahan, imunisasi,

Produksi bahan obatobatan Teknik Lingkungan dan Energi alternatif

Bahan baku dalam industri Enzim pencuci, kosmetik, Plastik dan pembungkus ramah lingkungan,

inhibitor, antibodi, vitamin

Degradasi dan perubahan kontaminan berbahaya untuk pembersihan sampah. Biogas,


Selesai

Tugas • Buatlah essai singkat (1 halaman folio) tentang kemungkinan aplikasi bioteknologi dalam bidang pertanian untuk berbagai macam tujuan. • Thema yang digunakan tidak dibenarkan sama, material kajian harus berbeda. • Tulis dengan kalimat sendiri, bila menggunakan kalima orang lain maka sumber harus dituliskan! • Kumpul tanggal: 29 Agustus 2012, sebelum kuliah dimulai.

Materi II.

Struktur Detail dan Fungsi Molekul Genetik: DNA, RNA dan Protein.


Copyright statement: Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas) bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku dinegara kesatuan Republik Indonesia.

Sub Pokok Bahasan 1. Struktur detail sel dan organelorganelnya 2. Struktur detail dan fungsi DNA 3. Struktur detail dan fungsi RNA 4. Struktur detail dan fungsi protein

Tujuan Instruksional Mahasiswa mampu menjelaskan struktur detail DNA, RNA, dan Protein

1. Struktur detail sel dan organelorganelnya

1. Struktur detail sel dan organel-organelnya Liver Cell Structure of an animal cel


Lokasi materi genetik DNA dan RNA (eukaryot)

N

C

N

M

M M

S

Tumbuhan

S

Hewan

Lokasi materi genetik DNA dan RNA (prokaryot/virus)

Bakteri

Virus

Dogma Sentral Materi

Proses

DNA (Gen)

Lokasi Nukleus

Transkripsi

mRNA

Nukleus/Sitoplasma

Translasi

Protein

Nukleus/Sitoplasma /organel lainnnya

2. Struktur detail dan fungsi DNA

2. Struktur detail dan fungsi DNA


Materi Genetik


Materi Genetik

Idiogram kromosom manusia Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Materi Genetik

Source: Reamon Büttner, S.M.

Analisis FISH dengan berbagai probe Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

STRUKTUR HALUS MATERI GENETIK


2. Struktur Halus Materi Genetik




MATERI GENETIK H H

H O

5‘

Ikatan hidrogen

Timin C

H

H

O

C

3‘

Nukleotid

C

H

H

T

O

A

N

N

H

C

C

Adenin

N

N

C

C

C

O

C

Dioxyribosa

H

H

N

N

C G

C

H

N

C

C

N

N

G

Ikatan hidrogen

H

Citosin

C

H O

C

C N

N

A C

H

H

C

C N

T

C

O Dioxyribosa

Guanin

N

N

C

H

G 3‘

5‘ Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Materi Genetik



Struktur Double Helix DNA menurut Watson dan Crick Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Materi Genetik 20Å (2,0 nm)

34Å (3,4 nm)


Materi Genetik

Sekuens DNA 8 genotipe beet gula Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


telomer repetitiv sekuens daerah kaya gen sentromer



Panjang rata-rata sebuah gen ~ 1,2 kb < 1 kb = 1000 bp > 32 kb = 10.000 bp

Prokaryot: tidak mengandung intron Eukaryot : Mengandung Intron


3. Struktur detail dan fungsi RNA

Ekspresi Genetik Gen A 5‘ 3‘

Exon E

Intron Exon Intron

Exon

P Titik stop

Titik start

5‘ 3‘

Sekuens DNA

Transkripsi m-RNA sementara

Pemisahan intron

m-RNA matang

Nukleus Sitoplasma

Translasi

Protein


Materi Genetik


Materi Genetik Pita atas

5‘ ACTGTTGCACCGGTTATATAGCGTAAGTCAGTCTCGA 3‘ TGACAACGTGGCCAATATATCGCATTCAGTCAGAGCT Pita bawah Sintesis mRNA

5‘ ACUGUUGCACCGGUUAUAUAGCGUAAGUCAGUCUCGA 3‘ Sintesis cDNA (Reverse transkriptase)

5‘ACTGTTGCACCGGTTATATAGCGTAAGTCAGTCTCGA 3‘


TRANSKRIPSI Coding strand = sense

Template strand = antisense

Transkripsi


BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2005-2006

mRNA pada Eukaryot Struktur cap yang terbentuk pada ujung 5‘ mRNA eukaryot O

CH3

C

N

H2N

C

CH

CH N

N C

HN

C

HN C

NH2

C

O

O

N CH2

O

P O

O

P O

O

C

HC O

N

P

CH2

O

N

NH2 C

O

OCH3 HC O O

P

O

N C

HN

CH N

C N

CH2

O

OCH3 O O

P

O

O


Siklus

min

Transkripsi mulai

RNA polymerase

min

Transkripsi mulai

<1

0

mRNA

ppp

pp p

Modifikasi ujung 5‘ 6

Ribosom memulai translasi

a. Bakteri

RNA polymerase

Ujung 3‘ mRNA dipotong dan dilepaskan

0,5

b. Eukaryot

ppp 20

Degradasi dimulai pada ujung 5‘

Ujung 3‘ dipoliadenilasi

1,5 AAAAAA

ppp

2,0 RNA polymerase berhenti di ujung 3‘

25

mRNA ditransport ke dalam sitoplasma

AAAAAA

ppp 3,0

Degradasi mRNA berlanjut, ribosom menyelesaikan translasi

> 4 >h hr

Ribosom mentranslasi mRNA

ppp

AAAAAA


tRNA tRNA adalah adapter yang menghubungkan antara mRNA dengan asam amino. Ciri-ciri penting:

1.Setiap satu tRNA mewakili satu jenis asam amino yang berikatan secara kovalen. 2.Mengandung sekuens trinukleotid antikodon berkomplementer dengan kodon yang mencerminakan asam aminonya. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Asam amino

tRNA 5‘

Base-paired stem

Single stranded loop

Anti codon-codon pairing mRNA


NH2 H

C

R

C =O

O Asam amino

5‘

CH2

OH O

tRNA

Base-paired stem

Single stranded loop

Anti codon-codon pairing mRNA

Ujung 3‘ tRNA

BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2004-2005 Any base A

Invariant

C

Semi invariant

C

Sometimes absent

73

Lengan penerima

Lengan D

17 17:1

16

U*

Pu 13 12

G 20

72

2

71

3

70

4

69

5

68

6

67

7

66

22

Lengan TΨC

Py

Py 10

49

50 51 52

G

27

43

28

42

29

41

30

40

31

39

Py* U 34

59 A* Pu C

T

Ψ

47:16 47:15

26

Antikodon

C

Py

23 Pu 25

A 20:1 20:2

63 62

65 64

9

A

G*

1

Lengan extra

44 45 46 47 47:1

38 Pu 35

36



Modifikasi basa pada tRNA Modifikasi basa yang terjadi pada tRNA mempengaruhi kemampuan „pairing“. O C

O

O

H

C

HN

CH

C

CH N

O

O

O

HN

C

H

HN

C

C

H

C O

N H

Uridine

C

C

Dihydrouridine (D)

CH3 C CH

N

Ribothymidine (T)

O

HN

NH

C

CH N

Pseudouridine (v)


BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2004-2005 NH2

CH3

C

C

C

N

CH

N

CH

C

CH

C

CH

O

O

N

O

N

C

C

N C

C

CH N

N

N

C

HC

C

CH

CH C N

C

O

NH2

HC

CH3

N

5-methylcytidine

3-methylcytidine

Cytidine

N

NH2

NH

N

Adenosine

N

N

Inosine


rRNA (ribosomal RNA)

Karakteristik rRNA

Berada dalam ribosom (ribonucleoprotein) Ukuran ribosom ditentukan oleh tingkat pengendapannya, diukur dengan satuan S (Svedbergs). Ribosom bakteri ~70S, sedangkan eukaryot memiliki nilai sedimentasi ~80S.


Struktur 30S subunit Kaya RNA Kaya Protein S11

S7 S13 S19 S9 S1 S14 S10

S3

S20

Ujung 3‘

S18 S6 S21 S15 S17 S2 S16 S12 S8

Ujung 5‘

Domain protein

Domain pusat rRNA

Domain 3‘ rRNA

Domain 5‘ rRNA


rRNA (ribosomal RNA)

• Pada sub unit kecil (30S) bakteri, terdapat jenis 16S rRNA & 21 protein. Sedangkan unit besarnya (50S) mengandung 23S rRNA dan 5S rRNA serta 31 protein. • Pada eukaryot: terdapat 18S rRNA dan 28S rRNA serta protein yang lebih banyak.


rRNA (ribosomal RNA) Ribosom

rRNA

Protein

Bakteri 50S

70S

23S = 2904 basa

Masa= 2,5 x

106 D

66% RNA

5S = 120 basa 21

30S

16 S = 1542 basa

Mamalia 60S

80S

28S = 4718 basa

Masa= 4,2 x 106 D 60% RNA 40S

31

49

5,8S = 120 basa 5S = 120 basa 18S = 1874 basa

33


Fungsi rRNA dalam sintesis protein • Ujung 3‘ rRNA berinteraksi secara langsung dengan mRNA pada tahap inisiasi • Daerah spesifik 16S rRNA berinteraksi secara langsung dengan derah antikodon tRNA

• Interaksi subunit melibatkan baik 16S dan 23S rRNA, meskipun belum jelas apakah interaksi terjadi secara langsung antara RNA-RNA atau RNA-protein. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

4. Struktur detail dan fungsi protein


PROTEIN Komponen esensial untuk organisme hidup Jenis protein: Protein sederhana : hidrolisis menghasilkan hanya asam amino Protein majemuk : hidrolisis menghasilkan asam amino dan senyawa lain (organik –non organik = gugus prostetik)


Klasifikasi protein sederhana Nama Albumin Globulin

Glutelin Gliadin (Promalin) Histon

Protamin

Sifat Kelarutan Larut dalam air, dapat diendapkan oleh garam dengan kadar tinggi Tidak larut dalam air murni, larut dalam garam encer, tetapi tidak larut dalam larutan garam ¼ atau ½ jenuh. Tidak larut dalam larutan netral, tapi larut dalam larutan basa atau asam encer Tidak larut dalam air atau etanol absolute, tapi larut dalam etanol 70-80% Larut dalam air, tidak larut dalam larutan amonia encer, histon bersifat basa

Larut dalam air dan bersifat basa (lebih basa dari histon), dan berupa protein kecil. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Klasifikasi Protein Majemuk Berdasar Gugus Prostetiknya Nama Nukleoprotein Glikoprotein Phospoprotein Lipoprotein Khromoprotein Flavoprotein

Gugus Prostetik Asam Nukleat Karbohidrat Phospat Lipid Zat Warna (pigmen) Flavin nukleotida

Flavoprotein sering dimasukkan kedalam kelas khromoprotein, karena flavin juga berwarna


Asam Amino sebagai Molekul Dasar Protein

H R

C

COOH

NH2


Asam Amino


Simbol-simbol untuk asam-asam amino penyusun protein No. 1. 2. 3. 4.

Asam amino Alanin Arginin Asparagin Asam aspartat

Simbol 3 huruf Ala Arg Asn Asp

Simbol 1 huruf A R N D

5. 6. 7. 8. 9. 10.

Asn + Asp Sistein Glutamin Asam Glutamat Gln + Glu Glisin

Asx Cys Gln Glu Glx Gly

B C Q E Z G

11. 12. 13. 14. 15. 16.

Histidin Isoleusin Leusin Lisin Methionin Phenilalanin

His Ile Leu Lys Met Phe

H I L K M F

17. 18. 19. 20. 21. 22.

Prolin Serin Threonin Tirosin Valin Triptophan

Pro Ser Thr Tyr Val Tri

P S T Y V


Struktur Kimia Senyawa Poplipeptida

Ujung N/N terminal

Ujung C/C terminal

H2N– AA1—AA2—AA3—AA4—AAn-2—AAn-1—AAn--- COO

g N (amino)

Ujung C (kar

Klasifikasi protein berdasar fungsi biologisnya Golongan

Fungsi Biologis

1. Enzim

Mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia, misalnya ribonuklease, tripsin, amilase, dll.

2. Protein cadangan

Disimpan sebagai bahan cadangan , misalnya gliadin, dalam gandum, zein dalam jagung, ovalbumin dalam putih telu

3. Protein transpor

Mentransfor zat-zat atau unsur tertentu, seperti hemoglobin untuk O2, albumin serum untuk asam lemak dll.

4. Protein kontraktil

Untuk kontraksi jaringan-jaringan tertentu misalnya miosin untuk kontraksi otot, dinein untuk kontraksi cilia dan flagellata

5. Protein pelindung dalam darah mamalia

Melindungi tubuh terhadap agen-agen asing, seperti zat antibodi, fibrinogen dll.

6. Toksin

Racun-racun yang berasal dari hewan atau tumbuhan, seperti risin (racun dalam beras), racun ular, dll.

7. Hormon

Senyawa yang berfungsi sebagai pengatur proses hidup dalam tubuh, seperti insulin, hormon pertumbuahan, dll.

8. Protein struktur

Protein penyusun struktur sel, jaringan dan tubuh organisme, seperti glikprotein untuk dinding sel, keratin untuk rambut, bulu, skleretin untuk bagian luar serangga , dll. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Sintesis Protein = Expressi Gen Dua Proses Utama: 1.Transkripsi : proses menghasilkan RNA pita tunggal yang identik dengan salah satu pita dari pita ganda DNA.

2.Translasi : proses perubahan sekuen asam nukleat RNA kedalam sekuens asam amino penyusun protein.


BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2004-2005 Basa pertama

Basa kedua

U U C A G

UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG

Phe Leu

Leu

Ile

Met Val

C UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG

Ser

Pro

Thr

Ala

A UAU UAC UAA UAG

Tyr

CAU CAC CAA CAG

His

AAU AAC AAA AAG

Asn

GAU GAC

Asp

STOP

Gln

Lys

Glu

G UGU UGC UGA UGG

Cys

CGU CGC CGA CGG

Arg

AGU AGC AGA AGG

Ser

GGU GGC GGA GGG

STOP Trp

Arg

Gly


Daftar asam amino, simbol 3 dan 1 huruf serta karakteristik masing-masingnya. Asam amino Alanin Arginin Asparagin Asam aspartat Asn + Asp Sistein Glutamin Asam Glutamat Gln + Glu Glisin Histidin Isoleusin Leusin Lisin Methionin Phenilalanin Prolin Serin Threonin Tirosin Valin Triptophan Asam amino tidak spesifik

Simbol 3 huruf

Simbol 1 huruf

Ala Arg Asn Asp Asx Cys Gln Glu Glx Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Tyr Val Tri

A R N D B C Q E Z G H I L K M F P S T Y V W X

Karakteristik berdasar gugus R hidropobik Basa Netral Asam Asam Netral Asam Basa Hidropobik Hidropobik Basa Hidropobik Hirdopobik Hidropobik Netral Netral Netral-Hidropobik Hidropobik Hidropobik

Struktur Protein Struktur primer, yakni struktur protein berdasarkan sekuen asam amino penyusunnya. GFP-Sekuens (238) • MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFIC TTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQ ERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEY NYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIG DGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDE LYK

Struktur sekunder • Struktur yang terbentuk oleh adanya ikatan hidrogen antara rantai utama peptida.

Struktur tertier Struktur tiga dimensi dari molekul protein tunggal. Struktur tiga dimensi akan ditentukan oleh interaksi hidrofobik non spesifik antara struktur α-heliks dengan struktur pita-β membentuk struktur globular.

Struktur quartener • Struktur yang terdiri dari beberapa macam sub unit ikatan polipeptida ataupun protein. Structure of human hemoglobin, source: Wikipedia

Struktur Protein

SELESAI


Bioteknologi Tanaman

Dasar-Dasar Teknik Analisis Molekuler





2.1. Isolasi DNA



2.1. Isolasi DNA Tujuan : Membebaskan molekul DNA didalam sel tanpa merusak keutuhan molekul DNA, (protein histon, inti sel, dinding sel). Hal Penting yang harus dipertimbangkan 1. Keutuhan ukuran molekul DNA 2. Efektifitas isolasi 3. Kemurnian DNA hasil isolasi

4. Praktis dan ekonomis



Langkah-Langkah Isolasi 1. Pemecahan sel dari jaringan: cara: Mekanis , dengan menggerus jaringan (akar, daun, batang dll) kimiawi , dengan menggunakan enzim spt. sellulase, pektinase, dan lain-lain. Pemurnian dilakukan dengan cara lisis menggunakan deterjen spt: SDS = Sodium Duodecyl Sulfonat

CTAB = Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

2. Deproteinase: cara : Proteinase K, Phenol yang dilanjutkan dengan mengendapkannya dengan Chloroform dan isoamylalkohol



3. Pemanenan DNA: Cara: Kromatografi adsorpsi, Kromatografi pertukaran ion, Presipitasi dengan, isopropanol ataupun alkohol

Isolasi juga dapat dilakukan dengan Kit Isolasi tetapi harganya mahal Kontrol Kualitas: Cara : Teknik elektrophoresis standar menggunakan gel agarose



Contoh hasil analisis kualitas DNA dengan elektrophoresis standar 25 50 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12 13 14 15

Sumber DNA Genomik asparagus, dokumentasi Jamsari



2.3. Elektroporesis



Electrophoresis:

Proses pemisahan molekul-molekul dengan menggunakan arus listrik Bedakan dengan : Electrophoration Diperkenalkan tahun 1973 bersamaan dengan penemuan agarose (Sambrook, et al. 1973)



Prinsip:

DNA bermuatan negatif, karena itu mengalir dari negatif menuju positif Molekul besar bermigrasi lambat, molekul kecil bermigrasi cepat

Power Supply

Horizontal electrophoresis

Vertical electrophoresis



Gambar Bak Elektrophoresis

Sumber: Bio Rad (Jerman)



Faktor penentu laju migrasi

1. Berat molekul, 2. Konsentrasi gel, 3. Bentuk konformasi dari molekul DNA, 4. dan kekuatan arus listrik 1. Berat molekul,

Semakin berat semakin lambat



2. Konsentrasi gel, Kisaran daya pisah molekul DNA pada berbagai konsentrasi gel agarose

Konsentrasi agarose (% [w/v])

Kisaran molekul DNA dalam bentuk linear yang efisien untuk dipisahkan (kb)

0,3

5,0 - 60,0

0,6

1,0 - 20,0

0,7

0,8 - 10,0

0,9

0,5 - 7,0

1,2

0,1 - 6,0

1,5

0,2 - 3,0

2,0

0,1 - 2,0

Methaphore gel untuk molekul DNA berukuran kecil < 0,3 kb Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


polyaccrylamid gel (PAGE). Acrylamid dan Methylenbisacrylamid untuk memisahkan dengan resolusi beberapa basa

Kisaran efektif pemisahan molekul DNA pada berbagai konsentrasi PAGE Konsentrasi PAGE [%(w/v)]

Kisaran molekul DNA yang efisien untuk dipisahkan (bp)

Xylen Xyanol

Bromophenol Blue

3,5

1000 - 2000

460

100

5,0

80 - 500

260

65

8,0

60 - 400

160

45

12,0

40 - 200

70

20

15,0

25 - 150

60

15

20,0

6 - 100

45

12



M 123 4 5

Contoh Penggunaan PAGE

300 bp

200 bp

100 bp

Sumber: Jamsari



Pengatur arah arus

Power Supply

-

Pompa pendingin

-

120°°

+

+ +

PFGE (Pulse Field Gel Elektrophoresis).



Penentuan besar ukuran insert 20 klon BAC terpilih yang dirunning dengan menggunakan PFGE setelah dilakukan pemotongan enzim NotI M 1 2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M

145.0 kb 97.0 kb 48.5 kb 23.1 kb

6.5 kb

Sumber: Jamsari


SELESAI


2.3. Enzim Restriksi





2.2. Enzim Restriksi Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi, internal = endonuklease Aktifitas: Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA



3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan

dengan cutting site (titik pemotongan)

Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide) Contoh: 4: AfaI ; GT AC ; 37°C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65°C-15 menit 6: Eco RI; G AATTC; 37°C; Escherichia coli H709C; 60°C-15 menit 8; Not I; GC GGCCGC; 37°C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol



Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease C T G A T G A A T T C C G T G A C T A C T T A A G G C A

EcoRI

A

Ujung kohesif Cohesive end

C T G A T G G A C T A C T T A A

A A T T C C G T G G C A

G A T G A T G A A T T C C G T C T A C T A C T T A A G G C A

B

Ujung tumpul

G A T GA T G A A C T A C T A C T T

MseI

T T C C G T A A G G C A

Blunt end


Analogi Pemotongan Enzim Restriksi Enzim A 1

2

3

4

5

Enzim B 6

7

8

9

10

11

A 20,0 11,5 11,0

7,0 3,0 2,5 1,0

12

13

14

15

16

B AB

17

18

19

20 21 22 23

24 25 26

27

28


Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA M V

1 2 3

4 5

6 7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M

12 kb 6 kb

3 kb

2 kb 1,6 kb

DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


Frekuensi pemotongan = 4n 4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT) N = jumlah sisi pengenal spesifik Contoh :

EcoRI, hexanukleotid , maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 46 basa = 4096

Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000, akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan EcoRI,

Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment



Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) Northern Transfer (RNA) Western Transfer (Protein)



Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977)

Pemberat Tumpukan kertas penghisap

Membran selulosa

Bahan penghisap larutan alkali Bak berisi larutan alkali

Gel tempat DNA



Hibridisasi Asam Nukleat Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe) yang sudah diketahui identitasnya Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita miliki (70-100%) Sumber Probe: 1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih. 2. Pustaka cDNA 3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)



Hibridisasi Asam Nukleat Langkah-langkah Proses Hibridisasi

Hibridisasi dengan Probe

Restriksi

Agarose gel

Nylon membran

Röntgen Film



Hibridisasi Asam Nukleat Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi dengan DNA genomik tanaman asparagus,

Sumber, Jamsari


Selesai


KULIAH V PCR, Sekuensing





PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaksi Berantai Polymerase



PCR PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara invitro dengan menggunakan bantuan enzim Taq-Polymerase Prinsip Kerja Mesin PCR: menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi ds-DNA, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer dengan menggunakan molekul dNTPs bebas melalui bantuan enzim Taq-Polymerase.



PCR Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun 1984-5 (USA)

Gambar: T-Gradient PCR produksi BiometraGmbh.-Jerman



PCR Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.

Prasyarat: 1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi 2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik, arbitrary). 3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik. 4. dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP, dATP), baik yang mixed atau single 5. MgCl2



PCR

Siklus 3

Siklus 2

5‘

3‘

3‘

5‘

Primer / Oligonukleotid

Templet

5‘

3‘

3‘

5‘

Siklus 1



PCR



PCR Suhu Annealing Tm = ((G+C) x 4°C) + ((A + T) x 2°C). Contoh:

CATAAGTCTGATACTTGCTG dimana: jumlah basa C = 4, G = 4, A = 5, T = 7,

maka besarnya Tm adalah: Tm = ((4+4)x4) + ((5+7)x2) = 32 + 24 = 56°C

suhu annealing sekitar 54-58°C Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


PCR Primer yang ideal : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Memiliki panjang sekitar 15-35 nukleotid Memiliki titik didih yang relatif tinggi Sekuens primer hanya hadir satu kali pada templet DNA Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya Memiliki proporsi GC dan AT yang seimbang Primer pasangannya memiliki titik didih yang relatif sama

Oligos V. 3.0 Universitas di Helsinki, Finlandia (Kalendar, 2002 )



PCR Jumlah perbanyakan molekul DNA sintetis

X = 2n Dimana: X = Jumlah molekul yang dihasilkan setelah n siklus n = Jumlah siklus yang digunakan Contoh :

Jika n = 30, maka jumlah molekul yang dihasilkan adalah:

1.024.000.000 Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Sekuensing Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA

Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger et al (Nobel, 80-an)

Teknik Maxam dan Gilbert disamping sangat complicated juga banyak menggunakan bahan kimia yang toxic, karena itu teknik dari Sanger dianggap lebih efisien dan berkembang sampai saat ini

Prinsip Sekuensing Metode Sanger Chain termination method • Menggunakan ddNTPs sebagai DNA chain terminator • Komponen yang dibutuhkan: 1. single-stranded DNA template, 2. DNA primer, 3. DNA polymerase, 4. radioactively or fluorescently labeled nucleotides 5. modified nucleotides that terminate DNA strand elongation (ddNTPs)

Semi Automated Sekuensing 5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘ 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ +

TGCATTG

5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘ 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTG + Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAAT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATAT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATAAGACGT … dst …

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT

Full Automated Sequencing (Dye-Terminator Sequencing)

Sumber: Charoen Phokphand

Perbandingan penampilan antara sekuensing manual dengan sekuensing automatis

Sumber: Charoen Phokphand

Contoh data sekuens dan elektrophoregram utk kontrol kualitas Tampilan Elektrophoregram dari sekuenser automatis

A

B

Megabace1000 produced by Amersham &MolecularDynamic.

Automated Sequencer • ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). • 4-Capillary Systems

Beckmann Coulter-Ge XP System

Sekuensing Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software DNAstar. DNA template berasal beet gula

Sumber: Jamsari

Sekuens Analisis Gen databank (Genbank), DNA databank

http:// www.ncbi. http:// www.embl-heidelberg.de. http:// www.ebi.ac.uk. http:// www.expasy.org. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLASTn, BLASTp

Sekuens Analisis Asp12-SP6 ATTGATTCCTGATCTCTGGACGAAACCTGCGTTGTTGCTGTTTAACGGGTTTTACATCCGGATCGATGTTGAGACGGTGCA TGGCCACCTTCGGGTCAAGGCCAGACATATCTTCATAATTCCAAGCGAAGACATCTATATATTCTCGGATGAGAGATATAA GGTCTTCCTTCTCGGATGATGATAGGTCTTCAGCTATAAAGATAGGCTTGGGATCAGATTCATCTCCCATGTTGACCTGAA TTACTTTATCTTCAGTGGGTGGTTCGCGTTGTTCGAATCGCATATCCCATAAAGTGTTAAGACGTTTGATCCAAGGATCGT TGGGTGACTCGATTAACTCTTCGTCACCCCCTGCATCTTCATCAGGATGACTAGTTGAAACCATGTTCACAGTCAAATCTT TAAAGAAAGGTCCGACACTGACGTCGGATTCCCAAGAAGAGGTTCCGGACGAATGATCCTGACGCAGATAATTACTGGTT TCATTTTCTGAGGCAGGGGGAGTTGTGACATAACCTAAGCCCCTTCCGGTTTTTTGATAATAATCCGGAGGTTTTCCTTCA GGGGTTAGAGACATCCGGATTGGGGTTCGTCTACCTTTTCCGAAGTTCAGACCATGTTTCTCATTAAAGTTATACCCCATT TGGCTTTATTAAGTATATAGAATTGGGTTCGTGATAATGGAATTGGGGAACTCCGTCGTCTTCCTCTGAACTTCCTCGT Query= user-submitted sequence (726 letters)Database: PlantDNA 1,993,818 sequences; 1,842,947,813 total letters Score Sequences producing significant alignments: (bits) E-Value gi|17638710|gb|BH452999.1|BH452999 BOGBG11TR BOGB Brassica oler... 42 0.27gi|16282742|gb|BI945182.1|BI945182 sb30h05.y1 Gm-c1009 Glycine ... 38 4.1gi|19927330|gb|AAAA01003021.1| Oryza sativa (indica cultivar-gr... 38 4.1gi|19930894|gb|AAAA01006584.1| Oryza sativa (indica cultivar-gr... 38 4.1gi|17643069|gb|BH457358.1|BH457358 BOGXJ15TR BOGX Brassica oler... 38 4.1gi|19893587|gb|BH794948.1|BH794948 ME_MBa0003L17r Manihot escul... 38

SELESAI

Pengantar Bioteknologi Pertanian

SISTEM VEKTOR – INANG

Plasmid




SISTEM VEKTOR - INANG

? VEKTOR: Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA



SISTEM VEKTOR - INANG PERSYARATAN SUATU VEKTOR: 1. REPLIKASI AUTONOM DALAM INANG 2. BERPENANDA UNTUK SELEKSI 3. BERPOSISI KLONING TUNGGAL 4. BERBERAT MOLEKUL KECIL 5. MEMILIKI BEBERAPA KOPI PADA SETIAP SEL

6. TIDAK BERKONJUGASI Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


SISTEM VEKTOR - INANG JENIS VEKTOR: 1. PLASMID 2. FAG  (FAG M13) 3. KOSMID 4. P1- (PAC) (Plasmide artificial chrom.) 5. BAC (Bacterial artificial chromosome)

6. YAC (Yeast Artificial Chromosome) Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


SISTEM VEKTOR - INANG KAPASITAS TAMPUNG BEBERAPA VEKTOR Vektor

Inang

Kapasitas kloning

Plasmid

Escherichia coli

~ 5000 bp

Plasmid

Saccharomyces cerevisiae

~ 5000 bp

Plasmid

Bacillus subtilis

~ 5000 bp

-Phage

Escherichia coli

9 – 23 kb

Cosmid

Escherichia coli

30 – 48 kb

P1-(PAC)

Escherichia coli

85 – 110 kb

BAC

Escherichia coli

30 – 350 kb

YAC

Saccharomyces cerevisiae

50 kb – 2 Mb



SISTEM VEKTOR - INANG PLASMID: DNA EKSTRAKROMOSOMAL BERBENTUK SIRKULAR TERTUTUP, BERPITA GANDA, UKURAN 1 – 200 kb.

KROMOSOMAL DNA

PLASMID




Kendali replikasi plasmid - Kontrol ketat (stringed control)

- Kontrol longgar (relaxed control) (10-200 kopi)



SISTEM VEKTOR - INANG Eco RI

Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III MCS = Multicloning Site

P O Z lac

Km®

pBin19 10 kb



SISTEM VEKTOR - INANG KLONING DALAM PLASMID Bam HI Eco RI

Bam HI

Bam HI

Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III MCS = Multicloning Site

DNA Asing P O Z lac

Km®

pBin19 10 kb



SISTEM VEKTOR - INANG DNA Asing

Km®

DNA Ligase




DNA Asing

Km®



SISTEM VEKTOR - INANG PENYUSUNAN PUSTAKA DNA

1

Km®

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

A B C D E F G H Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


SISTEM VEKTOR - INANG ISOLASI DNA PLASMID

+

CENTRIFUSE

Tris, Buffer EDTA NaOH dan SDS

PELLET

Km®

CENTRIFUSE

Km® Km®

Km®

Km®

Km®

Km®

Km®



SISTEM VEKTOR - INANG Analisis DNA Plasmid dan insersi

Sumber: Jamsari


PENAMPILAN DNA PLASMID STLH DIISOLASI


SELESAI


PENYISIPAN GEN/FRAGMEN DNA ASING KEDALAM SEL SUATU ORGANISME




TRANSFORMASI GENETIK

?


Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman

Beberapa Tanaman Budidaya Transgenik. Buah

Sayuran

Butiran

Tanaman lain

Bunga2an

Apel

Kol Bunga

Jagung

Kapas

Krisantemum

Pisang

Brokolli

Padi

Luzerne

Kalankoa

Peer

Chikori

Gandum

Raps

Pelargonia

Strawberry

Timun

Lada

Petunia

Kiwi

Kentang

Kol liar

Mawar

Melon

Wortel

Kedelai

Jeruk

Kol

Bg Matahari

Pepaya

Selada

Tembakau

Plum

Oliv

Tebu

Anggur

Asparagus

Beet gula

Ubi Jalar Tomat Zucchini


Penyisipan gen/fragmen DNA Asing • Transformasi genetik • Bisa berupa Gen fungsional ataupun Fragmen struktural.


TRANSFORMASI GENETIK METODE TRANSFORMASI 1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens 2. Transformasi dengan Biolistik 3. Transformasi dengan fusi protoplasma

4. Transformasi dengan mikroinjeksi 5. Transformasi dengan elektrophorasi (Electrophoration) 6. Transformasi dengan chemical (heat shock)



TRANSFORMASI GENETIK 1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens

Agrobacterium tumifaciens

adalah bakteri tanah penyebab tumor pada tanaman dikotiledon. Pertama ditemukan tahun 1907, dilanjutkan dengan penemuan plasmidnya yang berukuran 200-800 kb.



TRANSFORMASI GENETIK Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid) tms

tmr nos

T-DNA = DNA transfer noc = katabolisme Nopalin

T-DNA

nos = sinthesis Nopalin

LB

tmr = sintesis Sitokinin

RB

tms = sintesis Auxin noc vir

Ti-Plasmid

vir = daerah virulen ori = asal replikasi LB = batas kiri

tra

RB = batas kanan

ori Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman Kromosom dalam inti sel tumbuhan Agrobacterium

Pelukaan Sel tumbuhan

Infeksi pada sel tumbuhan dan transfer T-DNA

Tumor T-DNA didalam kromosom inti sel

Agrobacterium di dalam tumor

Infeksi pada sel tumbuhan dan transfer T-DNA

Tumor T-DNA didalam kromosom inti sel

Agrobacterium di dalam tumor Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman LB

RB

1 T-DNA LB

RB

2 T-DNA

virD2 LB

RB

3 virD2

virE2

virD2 LB

RB

4

Komplek T-DNA-Protein Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI GENETIK LB

T2 Gen P2

T1 SMG P1 RB

T-DNA dimodifikasi

LB

vir

Ti-Plasmid tanpa T-DNA

A.t. ori

RB

E. coli - plasmid dengan T-DNA

E.c. ori

Kan®

SKEMA SISTEM VEKTOR BINER Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI GENETIK TRANSFORMASI BIOLISTIK = PARTIKEL BOMBARDEMEN = MIKROPROJEKTIL

KELEBIHAN: 1. TIDAK MEMERLUKAN PENGHILANGAN DINDING SEL 2. TEORITIS SETIAP SEL ATAU JARINGAN BISA DITRANSFORMASI 3. CARA TRANSFORMASI TIDAK SEKOMPLEKS A. TUMIFACIENS 4. VEKTOR YANG DIPERLUKAN UNTUK TRANSFORMASI SEDERHANA 5. DAPAT MENGAKOMODASI LEBIH DARI 10 GEN SEKALIGUS PADA PLASMID YANG BERBEDA 6. METODENYA DAPAT DITERAPKAN PADA SETIAP ORGANISME DAN GENOTIP Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI BIOLISTIK Hind III Eco RI

Sma I

T

Plasmid untuk transformasi biolistik

P

Amp® = gen resistensi ampicilin Amp®

SMG

= Gen penanda untuk tumbuhan

P

= promotor

T

= terminator

SMG

E.c. ori



TRANSFORMASI BIOLISTIK

KAMAR TEKANAN

PEMEGANG MAKRO

DNA BERLAPIS PARTIKEL EMAS

CAWAN PETRI DGN JARINGAN TANAMAN

BIORAD

PRINSIP ALAT TRANSFORMASI BIOLISTIK Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI BIOLISTIK

KELEMAHAN: 1. EFISIENSI RENDAH (0,05%) 2. TIDAK SETIAP DNA YG DITRANSF. STABIL TERINTEGRASI DIDALAM INTISEL 3. KEBANYAKAN HARUS MENGGUNAKAN JARINGAN MERISTEM



Transf. potongan daun dgn A. tumifaciens Potongan daun dengan A. tumifaciens dikokultivasi 1-2 hari Potongan daun dicuci Perlakuan antibiotik untuk mematikan Bakteri dan menseleksi sel-sel transformant 2-4 minggu Transfer potongan daun ke medium regenerasi dan seleksi (pembentukan kalus dan tunas) 6-10 minggu Potongan daun diletakkan pada medium tanpa phytohormon untuk pembentukan akar 4-6 minggu Regenerasi tanaman transgenik

Transformasi kalus dengan biolistik

Embrio/Kallus diinisiasi dan dikultivasi

8-12 minggu Transformasi biolistik

Pertumbuhan kallus tanpa seleksi 4 hari

Pertumbuhan kallus dengan media seleksi 8-12 minggu Regenerasi dan seleksi lanjutan 8-12 minggu Regenerasi tanaman transgenik



3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma LANGKAH PERTAMA: MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI DINDING SEL (ENZIMATIS) :

UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM MEDIUM: ISO-OSMOSIS VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL) ELECTROPHORATION

PROBLEM: REGENERASI TRANSFORMANT Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


SISTEM SELEKSI DAN REPORTER NH2

1. SELEKSI DOMINAN:

CH2

ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID:

O

OH

Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO

HO

Gentamycin dari Micromonospora purpurea Neomycin dari Streptomyces fradiae

HO

O NH2

Streptomycin dari Streptomyces griseus CH2O O O

NH2

HO NH2 OH STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma LANGKAH PERTAMA: MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI DINDING SEL (ENZIMATIS) :

UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM MEDIUM: ISO-OSMOSIS Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL) ELECTROPHORATION

PROBLEM: REGENERASI TRANSFORMAN

Mikroinjeksi Injeksi materi genetik yang mengandung gen baru kedalam sel resipien. Mekanisme ilmiah mikroinjeksi belum difahami secara baik, terutama bagaimana gen yang diinjeksikan dapat menemukan sel inangnya dan beintegrasi dalam struktur genom mereka.

Mikroinjeksi • Pada sel-sel berukuran besar seperti tumbuhan dan hewan, mikroinjeksi dapat dilakukan menggunakan jarum mikro yang sangat halus.

Transformasi dengan Microinjeksi

SISTEM SELEKSI DAN REPORTER NH2

1. SELEKSI DOMINAN:

CH2

ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID:

O

OH

Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO

HO

Gentamycin dari Micromonospora purpurea Neomycin dari Streptomyces fradiae

HO

O NH2

Streptomycin dari Streptomyces griseus CH2O O O

NH2

HO NH2 OH STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

SISTEM SELEKSI DAN REPORTER

SELEKSI DOMINAN: • RESISTEN GEN dengan promotor dan terminator tanaman: • Neomycin-Phosphotransferase (nptII-gen) • Hygromycin-B-Phosphotransferase

• 3-Enolpyruvylshikimat-5-Phosphatsynthase (EPSPSynthase)


SISTEM SELEKSI DAN REPORTER SISTEM REPORTER (INDIKATOR): luciferase, green fluorescent protein (GFP) Cahaya (562 nm)

O2 + Luciferin

Lalat api-Luciferase

ATP

Oxyluciferin

+ CO2

AMP + PP1



SISTEM SELEKSI DAN REPORTER SISTEM REPORTER (INDIKATOR): β-D-Glucuronidase Cl COOH HO O OH

Br O N H

HO

COOH OH HO O OH + HO

5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronid (X-GlcA)

β-Glucuronidase

OH

Cl

Cl Br Oksidasi udara

N H

O

O

Cl

Br

Br N N H H Bahan pewarna indigo


Ekspressi GUS

Sumber: Abdullah, et al., 2005. Immature embryo: A useful tool for oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) genetic transformation studies. Electronic Journal of Biotechnology (28): 24-34.

Analisis Reporter

Fluorescent protein for marker

Plasmid

REGENERASI SEL-SEL TRANSFORMANT TEKNIK KULTUR JARINGAN (KULTUR IN-VITRO) POTENSI: • SIFAT TOTIPOTENSI SEL TUMBUHAN • KOMPOSISI MEDIA BERSIFAT GENOTYPE SPESIFIK • PHYTOHORMON BERSIFAT SPESIFIK; CYTOKININ-TUNAS AUXIN – KALLUS DAN AKAR • VARIASI SOMAKLONAL


REGENERASI SEL-SEL TRANSFORMANT

REGENERASI KALLUS TANAMAN TEMBAKAU MEMBENTUK TUNAS DAN DAUN SUMBER KEMPKEN DAN KEMPKEN


PENGUJIAN ADANYA PERUBAHAN GENETIS MANFAAT: 1. MEMBEDAKAN ANTARA TRANSFORMANT DARI MUTANT 2. FIHAK BERWENANG DALAM PENANGANAN MATERIAL/PRODUK TRANSGENIK DNA dng. XhoI dipotong TL

T1

T2

T3

Pengujian dengan hibridisasi

T4 6,6 kb 4,4 kb

Probe untuk hibridisasi adalah DNA vektor yang digunakan dalam transformasi TL = TIPE LIAR T1-T2 = Transformant 1-2

2,0 kb



PENGUJIAN ADANYA PERUBAHAN GENETIS Pengujian dengan PCR

- 828 bp

- 266 bp

Pengujian jagung transgenik dengan menggunakan primer spesifik yang didesain dari gen amp®, herbisida resisten (bar), 35Sbar (promotor untuk herbisida resisten, cry1A (gen dari Bt-resisten), ivr1 (gen invertase)


PENGUJIAN ADANYA PERUBAHAN GENETIS METHODE LAIN: EKSPRESSI REPORTER GEN ( GUS; β-Glucuronidase)

GMO Soya Test-Kit

TM :

Strategic Diagnostic Inc & Monsanto Co.


EKSPRESSI GEN YANG DITRANFORMASI EKSPRESSI GEN 1. EKTOPIK : BEREKSPRESSI PADA SETIAP SEL 2. SPESIFIK SEL/JARINGAN: HANYA PADA SEL/ JARINGAN TERTENTU EKTOPIK : MENGGUNAKAN PROMOTOR KONSTITUTIF 35S-Promotor DIISOLASI DARI Cauliflower Mosaik Virus-Kol Bunga (CaMV): COCOK UNTUK EKSPRESSI: GEN MARKER DAN REPORTER TIDAK COCOK UNTUK EKSPRESSI GEN-GEN DALAM FUNGSI METABOLIK


EKSPRESSI GEN-GEN YANG DITRANFORMASI EKSPRESSI SPESIFIK SEL/JARINGAN Tipe sel atau jaringan

Nama gen/promotor

Tumbuhan

Jaringan phloem daun dan akar

Asus 1

Arabidopsis thaliana

Bunga dan ujung akar

CHS15

Kacang-kacangan

Meristem

Cyc07

Arabidopsis thaliana

Phloem

Fragment dari RTBV

Padi

Pollen

PLAT4912

Tembakau

Biji

Puroindolin-b

Gandum

Sel pada tapetum

TA29

Tembakau


EKSPRESSI GEN YANG DITRANFORMASI Protein Transport: Signal sequences atau Adress sequences Fungsi: Melokalisasi protein yang sudah dibentuk Ribosom pada tempat yang semestinya.


EKSPRESSI GEN YANG DITRANFORMASI PENGARUH EKSPRESSI-RNA ANTISENSE

RNA-ANTISENSE: RNA MOLEKUL YANG BERKOMPLEMENTER DNG. SEKUENS TRANSKRIP SUATU GEN


STABILITAS TANAMAN TRANSGENIK INAKTIFASI GEN ASING SEBAGAI SUATU BENTUK MEKANISME PERTAHANAN SEL TANAMAN MEKANISME: 1. METILASI. •

Terjadi pada atom 5 dari basa Cytosin dengan urutan

kebanyakan CpG (p = C, G, A, T). •

banyak ditemukan pada transformasi biolistik

•

umumnya terjadi pada cluster gen (gen yang

menggerombol) cis-inactivation (cluster, tempat yang sama), trans-inactivation tempat yang jauh Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

EKSPRESSI GEN YANG DITRANFORMASI 2.Co-suppressi Terjadi akibat penurunan jumlah RNA hasil transkripsi, yang disebabkan oleh peningkatan laju degradasi RNA bukan karena aktifitas transkripsi yang menurun.


SELESAI


Kuliah I. Sejarah, Pengertian dan Kontribusi Bioteknologi dalam bidang Pertanian: Konsep sel sebagai produsen dalam Bioteknologi

Recommend Documents