Smrt srdeční a nervové buňky:
Ischemicko-reperfusní poškození Excitotoxicita Neurodegenerace MUDr. Jan Pláteník, PhD.
Ischemické poškození srdce nebo mozku je celosvětově nejčastější příčinou smrti
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/19314.htm
1
Rozlišujte: • HYPOXIE (ANOXIE) – Nedostatek kyslíku
• ISCHEMIE – Nedostatek kyslíku – Průtok krve tkání omezen/zastaven → porucha dodávky živin → porucha odstraňování zplodin metabolismu
Metabolické změny při hypoxii/ischemii • Zvýšení degradace glykogenu a glycolysy → Laktát se hromadí, pH klesá (acidosa) • ATP ubývá – buňka má nedostatek energie – Adenylátkinasa: ADP + ADP → ATP + AMP – AMP odbouráván až na Pi a hypoxanthin • Iontové gradienty rozvráceny: – H+ ⇑ (laktát) – Na+ ⇑ (směna Na/H na buněčné membráně) – Ca2+ ⇑ (selhání ATP-dep. čerpání do ECT a ER, porucha směny Na/Ca na buněčné memrbáně)
2
Degradace purinů Vasodilatační účinek
Xanthinoxidasa /dehydrogenasa: D forma (dehydrogenasa): NAD-dependentní, fyziologicky převládá O forma (oxidasa): O2 -dependentní, generuje ROS
Hromadí se při ischemii
Schema z: Harper‘s Illustrated Biochemistry, 27th edition, McGraw Hill Co., 2006
Zdravá buňka udržuje velmi strmý Ca2+ gradient na buněčné/ER membráně ECT: Ca2+ 2.5 mM
ICT: Ca2+ 0.0001-0.001 mM ATP
Ca2+ ADP ATP
K+
Na+ ADP
Ca2+ Na+ H+ Na+
3
Rozvrat iontových gradientů při ischemii: ICT:
ECT: ATP
Ca2+ ADP ATP
K+
(protože chybí ATP) Na+
ADP
Ca2+ Na+ H+ Na+
(vysoké Na v cytosolu) (laktátová acidosa)
Proč je vápník tak důležitý?
4
Calcium v buňce: • ‚Second messenger‘ důležitý v naprosto všech životních projevech buňky • V cytoplasmě jen 0.1-0.2 µM, cca 1 µM je již signál • Zdroj signálu je: – zvnějšku: • ligandem aktivované Ca2+ kanály • napětím řízené Ca2+ kanály – ze zásob v ER: • PI3 receptor/kanál • ryanodinový receptor/kanál – závislý na membránovém potenciálu (kosterní sval) – závislý na Ca2+ (srdce, CNS)
Confocal images taken at five-second intervals of a fertilization-induced calcium wave in a Pisaster ochraceus starfish oocyte that was microinjected with 10,000 MW Calcium Green-1 dextran (C-3713). The image was contributed by Stephen A. Stricker, Department of Biology, University of New Mexico.
5
• O tom jakou informaci Ca2+ signál nese, rozhoduje jeho – LOKALIZACE – FREKVENCE – AMPLITUDA (Berridge et al., Nature 1998, 395: 645-648)
Kalmodulin (148 AMK)
6
(Pato)biochemické účinky zvýšení intracelulárního kalcia: • Aktivace mnoha enzymů: – Ca/kalmodulin-dependentní proteinkinasy – Některé fosfatasy (calcineurin) – Endoteliální a neuronální NO synthasy – Kalpainy (Ca-aktivované non-lysosomální proteasy) – Fosfolipasy (→ poškození membrán, synthesa prostanoidů) – Endonukleasy (→ fragmentace DNA při apoptose) • Svalová kontrakce • Uvolnění hormonů a neurotransmitterů • Regulace genové exprese • Skladba cytoskeletu (vysoké Ca → „membrane blebbing“) • Mitochondrie: – Regulace respirace – Indukce MPT (mitochondrial permeability transition)
Import Ca2+ do mitochondrie • Ca2+ uniporter: facilitovaná difuse po spádu elektrochemického gradientu, kapacita obrovská • Metabolická regulace: Kritické mitochondriální dehydrogenasy jsou stimulovány Ca2+: – Pyruvátdehydrogenasa – Isocitrátdehydrogenasa – 2-oxoglutarátdehydrogenasa
Takto srdeční mitochondrie reaguje na změny spotřeby ATP (nikoliv deplece ATP!)
• Sekvestrace/pufrování cytoplazmatického kalcia za určitých okolností
7
Mitochondrial Permeability Transition (MPT)
Perseus vs The Kraken by VegasMike (http://www.whiskeyandbeans.com/things-of-interest/release-the-kraken)
Mitochondrial Permeability Transition Pore (MPT) • Otevření “megakanálu” ve vnitřní mitochondriální membráně • Propustnost pro všechny molekuly < 1500 Da • Kolaps potenciálu vnitřní membrány, vyrovnání protonového gradientu a rozpřažení nebo inhibice respirace • Zbobtnání mitochondrie
8
3000000
+ JC-1
+Ca 500 uM
Signal intensity (cps)
2500000
2000000
1500000
1000000
630/625 nm 488/593 nm (cps/2.5)
500000
0 200
400
600
800
Time (sec)
Speer O et al. J. Biol. Chem. 2003;278:34757-34763
©2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
9
Otevření “megakanálu” (MPT) • Spouští: matrix Ca2+ • Stimulují: • Oxidanty • Depolarizace • Anorganický fosfát
• Inhibují: • Protony (nízké pH matrix) • Magnesiové ionty • ATP a ADP • Cyklosporin A
Struktura megakanálu: hypotetická
(Miller RJ; TINS 21, 1998, 95-97)
10
Funkce MPT: • Fyziologické (reversibilní) otevření MPT: – Energeticky výhodný eflux Ca2+ z mitochondrie – Kalciová signalizace: Uvolnění Ca2+ indukované kalciem ....mitochondrie jako “Ca2+ signalling storing memory device”
• Patologické (ireversibilní): – Buněčná smrt (nekróza a apoptóza) – Mechanismus jak jsou staré mitochondrie označeny pro autofagii
Reoxygenační poškození
11
Reoxygenační poškození • Další poškození ischemické tkáně nastávající až po obnovení průtoku krve • Významné zejména po krátké ischemii • Pokud je tkáň ischemií zcela zničena, reperfuse už nemůže lokální stav zhoršit, ale může vyplavit toxiny z mrtvé tkáně do cirkulace – Multiple organ dysfunction syndrome (MODS) – Systemic inflammatory response syndrome (SIRS)
• Záplava kyslíkových radikálů, NO a eikosanoidů
Reoxygenační poškození: Kde je významné? • Střevo: trombosa, torze, uskřinuté kýly • Srdeční infarkt: trombolytická léčba, angioplastika – … arytmie, porucha kontraktility („stunning“)
• • • • •
Perinatální asfyxie Hemoragický šok po doplnění krevního objemu Otrava oxidem uhelnatým léčená kyslíkem Spánková apnoe Orgány před transplantací
12
Nedostatek kyslíku
Xanthindehydrogenasa
ATP → ADP → AMP → adenosin
-SH oxidace, nebo Ca-aktivovaná proteolýza
inosin Hypoxanthin
Klasické schema ischemicko-reperfusního poškození
Xanthinoxidasa Reperfuse obnovuje O2
O2•− , H2O2, kyselina močová Uvolnění Fe, Cu
OH•
Podle: J.M.McCord Fed. Proc. 46, 2402, 1987 (upraveno)
• Xanthinoxidasový model dobře vysvětluje ischemicko-reperfusní poškození střeva u koček • Ale lidské srdce neobsahuje žádnou xanthinoxidasu – Enzym se nachází pouze v játrech, střevě a laktující mléčné žláze, v malém množství je v cévách vázán na povrchu endotelu – Přeměna na O formu je v lidském střevě příliš pomalá
• Tvorba ROS během reperfuse má jiné zdroje: – Mitochondrie (po ischemii jsou více „děravé“) • …Mitochondrial permeability transition (MPT)
– Leukocyty • … no-reflow fenomén (ucpání kapilár adherovanými bílými krvinkami
13
MPT je zřejmě hlavní mechanismus reoxygenačního poškození myokardu • Ischemie: nízké pH chrání před MPT • Reperfuse: v myokardu nastávají podmínky pro MPT koincidencí těchto faktorů: – Nadprodukce oxidantů – Deplece adeninových nukleotidů – Vysoká koncentrace Pi (z degradace ATP) – Vysoká koncentrace Ca2+ – Normalizace pH
ATP synthasa může fungovat i obráceně…
14
Poly(ADP-ribosa)polymerasa (PARP-1) • Enzym vázaný na chromatin, aktivovaný (oxidačním) poškozením DNA • Štěpí NAD+, přenáší poly(ADP-ribosa) na jaderné proteiny • Pomáhá v opravách DNA a podporuje přežití buňky • Ale je-li DNA poškozena příliš, enzym způsobí depleci NAD+ která urychlí buněčnou smrt („suicide response“) – Deplece NAD+ je usnadněna jeho uvolněním z mito v důsledku MPT
Zdroj obr.: Miwa M et al:Roles of Poly(ADP-Ribose) Metabolism in the Regulation of Centrosome Duplication and in the Maintenance of Neuronal Integrity, DNA Surveillance and Repair, Madame Curie Bioscience Database, Landes Biosciences
15
Prevence ischemicko-reperfusního poškození? • ŘÍZENÁ HYPOTERMIE • MPT inhibitory – Cyklosporin A: váže cyklofilin D (součást MPT póru)
• Antioxidanty • PARP-1 inhibitory
Imunosupresivní účinek cyklosporinu A není způsoben inhibicí MPT
Katzav S, Blood 2004, 103 (7), 2443-51.
16
MPT a apoptosa: Rozšířený omyl ?
Jak mitochondrie zabíjí buňku • Uvolnění proapoptotických faktorů z intermembránového prostoru: • • • • • •
cytochrom c AIF (apoptosis inducing factor) endonukleasa G Smac/Diablo (inhibitor IAPs) Htra2/Omi (serinová proteasa, štěpí IAPs) prokaspázy
• Narušení buněčné energetiky a produkce ATP (uvolnění cytochromu c, depolarizace) • Nadprodukce kyslíkových radikálů
17
Obrázek z: M.O.Hengartner: The biochemistry of apoptosis, Nature 407, 2000, 770-776.
Bcl proteiny: • Rodina >10 proteinů, prototypický člen: Bcl-2 (B-cell lymphoma... onkogen) • Proteiny s antiapoptotickou aktivitou (Bcl-2, Bcl-xL), nebo naopak proapoptotické (Bad, Bax, Bid etc.) • 1-4 BH domény... homo/hetero-oligomerizace • C-terminální hydrofobní úsek ... lokalizace do membrán (vnější mito, jaderná m., ER) • Schopnost agregovat a tvořit kanály v membránách - podobnost s bakteriálními toxiny koliciny
18
Bcl-2 Bax
Bcl-xL
Bak CytC
+dATP
Apaf-1
apoptosom
Casp-9
Casp-3
Uvolnění cytochromu c z mitochondrie ? MOMP (Mitochondrial Outer Membrane Permeabilisation)
19
Mechanismus uvolnění cytochromu c z mitochondrie ?
proapoptotické Bcl proteiny (Bax, Bak)
MPT
zbobtnání matrix translokace do mito a tvorba kanálů ve vnější membráně
ruptura vnější membrány
Apoptotický signál, stress, poškození buňky atd.
MPT
Bax, Bak translokace
? (MPT reversib., další zdroje energie)
ATP
MOMP ATP
NEKRÓZA
APOPTÓZA
20
Patogeneze chorob jako dysregulace apoptózy ? • Neurodegenerace, ischemie, AIDS: buňky umírají když nemají... • Autoimunita, nádory: neumírají buňky, které by měly...
• Nádorové buňky žijí z glykolýzy a mitochondrie „vypínají“ …. • Dichloracetát: inhibice PDH kinasy → aktivace PDH → aktivace mito respirace a produkce oxidantů → aktivace apoptotického programu → a nádorové buňky hynou …
(Bonnet S et al.Cancer Cell. 2007 Jan;11(1):37-51).
21
Excitotoxicita
Většina excitačních synapsí v lidském mozku používá glutamát
22
Ionotropní glutamátové receptory: Ligandem-řízené iontové kanály glutamate
Metabotropní glutamátové receptory: „Seven-spanning“ Spřažené s G proteiny
23
Ionotropní glutamátové receptory: Ligandem-řízené iontové kanály glutamate
Non-NMDA receptory (AMPA, kainát): Rychlá synaptická transmise, propustné pro Na+
NMDA receptory: Dlouhodobé změny v síle synaptického přenosu, propustné pro Na+ a Ca2+
Glutamátové receptory a indukce LTP (long-term potentiation) 1. Nízká frekvence impulzů: pouze AMPA receptory aktivní
Bliss & Collingridge, Nature 1993, 361: 31-39)
24
Glutamátové receptory a indukce LTP (long-term potentiation) 2. Vysoká frekvence: AMPA i NMDA receptory aktivní
...NMDA receptor: “coincidence detector” Bliss & Collingridge, Nature 1993, 361: 31-39)
Synaptická plasticita: Síla synaptického spojení Synaptická aktivita Kovalentní modifikace stávajících proteinů Genová exprese a syntéza nových proteinů (Finkbeiner & Greenberg, J. Neurobiol. 1998, 37: 171-189).
25
Excitotoxicita při mozkové ischemii-reperfusi • Deplece ATP → kolaps iontových gradientů → Ca2+ ⇑ → nadměrné uvolňování glutamátu • Do postsynaptických neuronů proudí Na+ a Ca2+ • Na+ ⇑: osmotické bobtnání, nekróza • Ca2+ ⇑: → Mitochondriální ROS ⇑ Poškození → Oxid dusnatý ⇑ pokračuje Později → Ca2+ -stimulované proteasy ⇑ buněčná smrt → Ca2+ -stimulované fosfolipasy ⇑ (apoptóza → eikosanoidy ⇑
nebo nekróza)
Glu transportery využ né membrá využívají vají iontových gradientů gradientů na buněč buněčn membráně Depolarizace membrá membrány → transport glutamá glutamátu se můž můžee obrá obrátit !
Glu
3Na+ H+
K+
Zdroj obr.: Liu Y-P et al: A possible therapeutic strategy for CNS repair: To blockade calcium regulation of glutamate aspartate transporter regulation in astrocytes (http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20081128/3.html)
26
Zdroj obr.: B. Halliwell & J.M.C. Gutteridge: Free Radicals in Biology and Medicine, 4th edition, Oxford University Press 2007
Obecné mechanismy neurodegenerace
27
Alzheimerova Nemoc (AN) • Demence = získaná a progresivní porucha všech vyšších kognitivních funkcí • Nejčastější ze všech neurodegenerativních chorob (USA: 30% ve věku 65 let nebo víc) • Nejasné oddělení od vaskulární demence (chronická ischemie mozku) a změn při normálním stárnutí mozku • Difúzní ztráta neuronů, v patologii je charakteristické: – Senilní plaky: extracelulárně, jádro z agregovaného β-amyloid peptidu (Aβ) – „Tangles“: vlákna uvnitř neuronů tvořená z hyperfosforylovaného proteinu tau
• Epidemiologie: – Většina případů sporadická, ale dědičnost silně ovlivňuje predispozici (např. polymorfismy apolipoproteinu E) – Familiární formy (s časným začátkem): mutace v APP nebo v presenilinech (ovlivňují tvorbu Aβ z APP), také M. Down (trisomia 21 – kde je gen pro APP) – Negativní asociace s dosaženou úrovní vzdělání a pravidelnou fyzickou aktivitou
• Účinná léčba dosud není
Parkinsonova nemoc (PN) • Progresivní porucha hybnosti, pomalost pohybů (bradykinesia), klidový třes, obtížný začátek pohybu (akinesia), svalová rigidita • Druhá nejčastější neurodegenerativní choroba (5% ve věku 85 let nebo víc) • Selektivní smrt neuronů v substantia nigra (SN) → nedostatek dopaminu ve striatu → symptomy • Pathologická anatomie: Lewyho tělíska (ve zbývajících SN neuronech, obsahují agregovaný α-synuklein), ale není specifické • Epidemiologie: téměř vždy sporadické, familiární formy s časným začátkem jsou velmi vzácné, někdy též způsobeno toxiny (např. MPTP) • Léčba: modulace dopaminergní transmise (LDOPA+Carbidopa atd.) – v zásadě funguje, ale s vedlejšími účinky a účinek léčby se s časem vytrácí. Experimentální terapie transplantací dopaminprodukujících buněk do mozku pacienta
28
Mechanismy smrti neuronů u AN, PN a dalších neurodegenerativních chorob jsou komplexní a jen částečně probádané, přesto lze uvést několik obecnějších rysů: • • • • • • •
Porucha funkce mitochondrií Zvýšení oxidačního poškození Poruchy ubiquitin-proteasomového systému Hromadění abnormálních agregovaných proteinů Změny v metabolismu železa Excitotoxicita Zánět
Podle: B. Halliwell & J.M.C. Gutteridge: Free Radicals in Biology and Medicine, 4th edition, Oxford University Press 2007
Obecné mechanismy neurodegenerace 1: Porucha funkce mitochondrií • Alzheimer: – Mito poruchy popsány: ⇓ aktivit cytochromoxidasy, pyruvátdehydrogenasy a α-ketoglutarátdehydrogenasy • …Mitochondrie jsou jedním z cílů toxicity Aβ
• Parkinson: – Poruchy v Komplexu I nalezeny specificky v nemocné SN – v současné době považováno za jeden z hlavních mechanismů patogenese PN – SN neurony jsou zřejmě zvlášť citlivé k působení Komplex I toxinů: • MPTP (příměs v heroinu, v neuronech metabolizován na MPP+) u narkomanů • Pokusy na zvířatech s rotenonem (pesticid) – … takové toxiny mohou být v prostředí velmi rozšířeny (MPTP: 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin, MPP+: 1-methyl-4-fenylpyridinium)
29
Obecné mechanismy neurodegenerace 2: Zvýšení oxidačního poškození • Alzheimer: – Přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres již na počátku onemocnění – Původ ROS: • Aβ peptid (základní mechanismus jeho toxicity) – jak přímo, s katalýzou přechodnými kovy, tak nepřímo (indukce ROS-generujících enzymů, účinek na mito…) • Aktivace mikroglie senilními plaky, včetně AGE-RAGE interakce
• Parkinson: – Přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres, ale vztah příčina/důsledek poněkud nejasný. Deplece GSH může být jeden důležitý a časný děj. – Původ ROS: • Metabolismus dopaminu (jak jeho neřízená kovy-katalyzovaná autoxidace, tak katabolismus monoaminooxidasami generuje radikály) … proto asi jsou SN neurony zvláště náchylné k oxidačnímu stresu ! • Porucha mitochondrií (např. způsobená MPP+) • Možnost uvolnění železa z neuromelaninu • Aktivace glie
Obecné mechanismy neurodegenerace 3: Poruchy ubiquitin-proteasomu • Alzheimer: – Aktivita proteasomu nízká • Mutantní ubiquitin (generovaný chybami transkripce) • Některé oxidované/abnormální proteiny (vč. Aβ a tau) mohou proteasom „zacpávat“
• Parkinson: – Některé vrozené formy: • Mutace v genu pro parkin (E3 ligasa pro ubiquitinaci α-synukleinu) • Mutace v UCHL1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1) – enzym důležitý pro recyklaci ubiquitinu
– Aktivity proteasomu a UCHL1 jsou nízké i u sporadických forem PN •
…Takové poruchy obecně podporují hromadění vadných proteinů a také oxidační stres (porucha odstraňování oxidovaných proteinů)
30
Obecné mechanismy neurodegenerace 4: Abnormální agregované proteiny • Alzheimer: – Amyloid β peptid (Aβ) je aberantní produkt štěpení APP – jeho hromadění je považováno za základní mechanismus patogenese AD – Neurotoxické jsou především rané, ještě rozpustné Aβ agregáty – Produkce ROS je hlavním mechanismem neurotoxicity – Zralé plaky nejsou přímo neurotoxické, ale indukují zánětlivou odpověď mikroglie
• Parkinson: – Hromadění α-synukleinu přispívá ke smrti neuronů: • Mutace v genu pro α-synuklein způsobuje jednu formu familiární PN • Zvýšená exprese normálního α-synukleinu také vede k PN (pokusy na zvířatech, též jedna vzácná familiární forma)
– …Ale: ne každý případ PN má Lewyho tělíska, a existuje také stav s Lewyho tělísky, ale bez PN
Obecné mechanismy neurodegenerace 5: Změny v metabolismu železa • Alzheimer: – Stopy Cu nebo Fe jsou nezbytné jako katalyzátory agregace Aβ jak ve zkumavce, tak in vivo – Aβ s vázanou mědí přímo generuje ROS – Plaky hromadí Cu, Fe (také Zn, snad i Al) v redoxně aktivních formách
• Parkinson: – Fe se hromadí v nemocné SN, ale je to relativně pozdní děj – Kovy katalyzují autoxidaci dopaminu → ROS + neuromelanin bohatý na Fe – Možné uvolnění redoxně aktivního Fe z neuromelaninu (stará, zajímavá ale nepotvrzená teorie)
31
Obecné mechanismy neurodegenerace 6: Excitotoxicita
• Myšlenka ‚pomalé excitotoxicity‘: – I fyziologická stimulace glutamátem může být toxická pro neuron pokud je porušena jeho produkce energie – Pokud formulováno tímto způsobem, může být významné v patogenesi mnoha chronických neurodegenerativních chorob
Příliš málo glutamátu ale škodí také • Určitá úroveň nervové aktivity je nezbytná pro přežití nervových buněk • Kultivace neuronů in vitro: přídavky glutamátu/KCl v určité (rané) fázi vývoje kultury brání apoptóze • NMDA receptor je napojen na signalizaci růstových faktorů (Ras/MAPK etc.) • Antiapoptotické signální dráhy se překrývají se signalizací synaptické plasticity
32
Ontogenese nervového systému
© JP
33
Mozkový infarkt Centrální léze (anoxie): Rychlá nekróza, příliš mnoho glutamátu
Penumbra (hypoxie): Opožděná buněčná smrt, spíše apoptotická Příliš málo glutamátu v důsledku ztráty aferentace? A proto všechny klinické testy s inhibitory NMDAR selhaly?
Young et al., Nature Med., 1999, 5: 448-453 : • Krysy chované v obohaceném prostředí: – stimulace neurogenese a pokles spontánní apoptosy v hippokampu (o 45 %) – v hippokampu vyšší exprese neurotrofických růstových faktorů GDNF a BDNF – po podání kainátu méně křečí, vyšší odolnost proti jeho excitoxicitě
34
USE IT
http://www.ximnet.com.my/thelab/archive/archive_post_d.asp?mth=8&yr=2005
… OR LOSE IT
35
