Kožní kryty Jana Horáková 2.1.2017
Literatura • Wound Healing Biomaterials, Volume 1: Therapies and Regeneration, Edited by: Magnus Ågren, ISBN: 978-1-78242455-0. • Krchová et al. Nanovlákna v hojení kožních ran. Česká dermatovenerologie, 2014. • Abrigo et al. Electrospun Nanofibers as Dressings for Chronic Wound Care: Advances, Challenges, and Future Prospects. Macromolecular Bioscience, 2014.
• Zahedi et al. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polymers Advanced Technologies, 2009. • Gao et al. Electrospun Antibacterial Nanofibers: Production, Activity, and In Vivo Applications. Journal of Applied Polymer Science, 2014. 2
Úvod Regenerace ztracených částí těla a zraněných orgánů dráždila lidskou představivost od dob starých Řeků. Kořeny tohoto okouzlení nalezneme v řecké mytologii: Mnohohlavá Hydra vzdorovala Heraklovi tím, že jí vyrostly dvě nové hlavy za každou, kterou Herakles uťal.
Prométheova játra, pohlcená každou noc orlem znovu dorůstala/regenerovala.
http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0020232
3
Úvod Aristoteles, který žil v letech 384-322 před naším letopočtem, pozoroval, že ocasy ještěrů a hadů, stejně jako oči vlaštovčích mláďata, mohou regenerovat (Aristoteles 1965). Odelberg SJ (2004) Unraveling the Molecular Basis for Regenerative Cellular Plasticity. PLOS Biology 2(8): e232. doi:10.1371/journal.pbi o.0020232 http://journals.plos.org /plosbiology/article?id= 10.1371/journal.pbio.0 020232
4
Úvod Zkoumání regenerace tkání se stalo předmětem vědeckého bádání v roce 1712, kdy Francouz René-Antoine Ferchault de Réaumur publikoval svou seminární práci na téma regenerace končetin krabů a drápů (Réaumur 1712).
Poté Abraham Trembley, Charles Bonnet, Peter Simon Pallas a Lazzaro Spallanzani, objevili pozoruhodné regenerační schopnosti různých organismů: • žížala a červi ploštěnci (planaria) mohou regenerovat přední i zadní část těla, • mloci mohou regenerovat své končetiny, ocas a čelisti; • žáby a ropuchy mohou regenerovat své ocasy a nohy; • slimáci mohou regenerovat jejich růžky; • hlemýždi mohou regenerovat i přední část těla 5
Úvod 1. Savci jsou v principu neschopní úplné regenerace tkání. 2. „Oprava“/hojení jejich poraněných orgánů závisí na nesmírně složitém procesu sestávajícího ze: • • • • •
zánětu, migrace buněk, signalizace pomocí cytokinů, produkce kolagenu a mimobuněčné hmoty a vytvoření jizvy.
3. Proces hojení rány se jen nevýrazně liší podle druhu zraněné tkáně.
4. Proces hojení je téměř nezávislý na příčině zranění (popálenina, řezná rána, tržná rána, …) 6
Úvahy k zamyšlení Jak to, že někteří živočichové jsou schopni úplné regenerace orgánů a jiní ne? Kde/kdy ve vývoji ztratili savci tuto schopnost? Je možné tuto schopnost navrátit nebo uměle vyvolat?
Kůže • Největší orgán lidského těla (1,6-1,8 m2, 7% celkové hmotnosti) • Tloušťka 0,4-4 mm
Funkce kůže Ochranná Smyslová (receptory reagující na teplo, chlad, tlak, poranění)
Termoregulační (cévy, potní žlázy) Skladovací (podkožní tuk) Vylučovací Resorpční (látky rozpustné v tucích, plyny) Estetická
Vrstvy kůže
Epidermis (pokožka) • Tvořena mnoha vrstvami buněk dlaždicovitého epitelu • Buňky ve spodních vrstvách se neustále dělí • Horní vrstvy rohovatí, odumírají (nedostatek živin) • Obměna pokožky za 3 týdny • Melanin – pigmentové barvivo, chrání před UV zářením • Bez cévního zásobení – výživa z dermis
Epidermis (pokožka)
Dermis (škára) • Pevná, pružná vazivová vrstva kůže (kolagenová, elastická vlákna) • Na hranici dermis a epidermis papily – cévní a nervová zakončení (zvlnění – větší plocha; daktyloskopie) • Stárnutí pokožky – ztráta pružnosti • Nervová tělíska – hmatová (Meissnerova), receptory chladu (Krauseho), tepla (Ruffiniho) • Kožní a mazové žlázy, vlasové folikuly
Hypodermis (podkožní vazivo) • Tukové buňky – konstantní počet, zásoba energie (izolace a ochrana svalů), vitaminy rozpustné v tucích • Liposukce – možný zdroj kmenových buněk • Nervová tělíska - receptory tlaku, vibrací a tahu (Vater-Paciniho)
Poranění kůže Definice = porušení integrity kůže Dle průběhu hojení – akutní x chronické rány Dle způsobu hojení – primární (sešití) x sekundární (nově tvořená tkáň)
Dle množství choroboplodných zárodků – aseptické x kontaminované x infikované Dle rozsahu – povrchové (pokožka) x hluboké (podkoží) x komplikované (cévy, nervy, kosti, svaly)
Popáleniny • Poranění kůže způsobené teplem, elektřinou, chemickými látkami, třením, ozářením • Rozsah se měří dle celkové plochy povrchu těla (TBSA = total body surface area) lehké popáleniny < 10% těžké popáleniny > 20%
Dostupné z: https://cs.wikipedia.org/wiki/Pop%C3%A1lenina, 28.12.2016
Akutní rány • Primární hojení v krátkém čase (do 6ti týdnů) Průběh hojení 1. slepení okrajů rány fibrinem, zánět (otok, překrvení) 2. fagocytóza (odstranění mikroorganismů a poškozených tkání) 3. prorůstání kapilár, migrace fibroblastů, produkce kolagenu 4. obnovení funkce kůže Působení zevního činitele: Mechanické (traumatické) – odřeniny, řezné, tržné, střelné Termické – popáleniny, omrzliny Chemické Radiační
Chronické rány • Hojení déle než 6-9 týdnů (dle České společnosti pro léčbu rány) • Příčina – infekce, základní stav pacienta, přidružené onemocnění • Bércové vředy (nedostatečná výživa tkáně), dekubity • Kožní vřed = stav, kdy chybí kůže v celém rozsahu až do podkoží
Fáze hojení ran
1. Čistící (zánětlivá fáze) • 3-5 dní • Rozvoj zánětu (otok, zarudnutí, bolest, zvýšená teplota) • Pokrytí povrchu fibrinem • Migrace fagocytů → odstranění nežádoucích složek • Nekróza, fibrinový povlak – zhoršují hojení rány → nutné odstranění
2. Granulační fáze • 3-24 dní • Neoangiogeneze • Tvorba granulační tkáně (kolagen – produkován fibroblasty) • Ideální vlhké prostředí • Nebezpečí hypergranulace → zpomalení epitelizace
3. Epitelizační fáze • Epitelizace z okrajů rány nebo z epitelizačních ostrůvků rány → migrace buněk po vlhké spodině • Navazuje fáze kontrakce a remodelace
Faktory ovlivňující hojení ran • Chronická žilní insuficience (bércový vřed) • Ischemická choroba dolních končetin • Ateroskleróza a hypertenze • Diabetes mellitus (sy diabetické nohy) • Neuropatie • Podvýživa (nedostatek vitaminů C, B A, K) • Krevní poruchy • Autoimunitní poruchy
Komplikace hojení • Infekce – hnisavý povlak, sekrece z rány, zápach, zpomalení hojení; rozvoj vzniku infekce závisí na virulenci patogenu, bakteriální zátěži, agresivitě bakteriálních toxinů, vnímavosti organismu pacienta • Macerace rány – rozmáčení okrajů rány zánětlivým výtokem (nesprávná péče o chronické rány)
Kožní kryty – ideální vlastnosti Udržují vlhké prostředí Odvádí exsudát Umožňuje výměnu plynů Zamezuje průniku bakterií Snadná výměna bez narušení hojení Netoxický, nealergenní Dostupný v několika velikostech Cena
Typy kožních krytů Primární krytí Sekundární krytí Pasivní (ochrana) Aktivní (vlhké hojení) Interaktivní (vlhké hojení + přídavná podpora procesu hojení – přídavek antimikrobiálních látek, podpora tvorby kolagenu, snížení tvorby exsudátu, podpora epitelizace)
Typy kožních krytů • Hydrogely • Transparentní filmy • Hydrokoloidy • Semipermeabilní pěny • Algináty • Gáza • Produkty připravené postupy tkáňového inženýrství • Nanovlákenné kožní kryty
Hydrogely • Polymery obsahující 80-90% vody + Propouští vodu a plyny + Udržení vlhkého prostředí + Výborná absorpce exsudátu + Chladivý účinek + Neadhezivní - Nutnost použití sekundárního krytí - Dehydratace - Nevhodné pro infikované rány
Transparentní filmy • Polyuretanové filmy propustné pro plyny, nepropustné pro vodu a bakterie + Udržení vlhkosti + Voděodolné + Kontrola hojení (průhledné) - Narušení hojení při výměně - Nevhodné pro infikované rány
Hydrokoloidy • Obsahují hydrofilní koloidní částice • Pomalu a omezeně adsorbují exsudát – přeměna na gel • Nepropustné pro vodu a bakterie + Udržení vlhkosti + Voděodolné + Nepropustné pro baterie - Narušení hojení při výměně (části zůstávají v ráně) - Hypergranulace - Nevhodné pro infikované rány
Semipermeabilní pěny • Polyuretany – na povrchu hydrofilní, uvnitř hydrofobní + Udržení vlhkosti + Mechanická ochrana + Vysoká absorpční kapacita + Podpora čištění rány + Nepropustný pro bakterie - Možné narušení hojení při výměně - Nevhodné pro infikované rány, případně výměna každý den
Algináty • Polysacharidy vyrobené z mořských řas • Neadhezivní + Bezbolestná výměna a aplikace + Adsobuje exsudát – přeměna na gel + Použití na infikované rány - Nutnost použití sekundárního krytí
Gáza • Lze použít jako primární či sekundární krytí • Vysoce permeabilní • Sterilní x nesterilní • Tkané x netkané - Mohou adherovat k ráně - Nebezpečí infekce • Impregnace antibakteriálními látkami, antiseptickými látkami, hydrogelem
Produkty připravené postupy tkáňového inženýrství
Apligraf Video: https://www.youtube.com/watch?v=c87iBUvxkbM Organogenesis, Canton, MA
Dermagraft
Advanced Tissue Sciences, LaJolla, CA
Nanovlákenné kožní krytí • Morfologií napodobují složení mezibuněčné hmoty • Velký měrný povrch • Možnost funkcionalizace • Vysoká porozita • Vhodné mechanické vlastnosti
Porovnání vlákenných struktur Vyčiněná vepřová PCL kůže Kenco
Nanovlákenná vrstva PCL
Mimobuněčná hmota lidské kůže C. E. H. Schmelzer et al., FEBS Journal 279 (2012) 4191–4200, 2012
Nanovlákenné kožní krytí • TUL – vývoj zdravotnického prostředku NANOTARDIS na bázi biodegradabilních nanovláken
Vlastnosti NANOTARDIS • snadná aplikace zdravotnického prostředku • dobrá snášenlivost pacienty • dobrá adheze zdravotnického prostředku ke kožním poranění • dobrá splývavost materiálu • prostředek je dodáván ve sterilním balení a není možná jeho další resterilizace • balení zdravotnického prostředku NANOTARDIS je po jednotlivých kusech • zdravotnický prostředek NANOTARDIS lze vyrobit v libovolných rozměrech, pro klinické zkoušky bude dodáván o rozměrech 7 x 7 cm2 • zdravotnický prostředek NANOTARDIS může být poškozen (ztratí svoji nanovlákennou podobu) při vystavení teplotě nad 45o C • expirační doba prostředku po sterilizaci je 12 týdnů
Hodnocení bezpečnosti • Dle ISO 10993-1 • Zařazení ZP: kategorie IIb Chemická charakterizace – údaje od dodavatele polymeru, stanovení zbytkových rozpouštědel Rezidua ethylen oxidu po sterilizaci (ISO 10993-7) Zkoušky na akutní systémovou toxicitu (ISO 10993-11) Zkouška nitrokožní (intradermální) reaktivity na zvířatech (ISO 10993-10) Test kožní dráždivosti in vitro (EpiDermTM Model, OECD Test Guideline 439) Bakteriální test genových mutací (ISO 10993-3) Literární rešerše
Kazuistika I
Krchová et al., Nanovlákna v hojení kožních ran, 2014.
Kazuistika II
Krchová et al., Nanovlákna v hojení kožních ran, 2014.
Testování adheze
Klode et al. Investigation of adhesion of modern wound dressings: a comparative analysis of 56 different wound dressings, 2010.
Testování adheze TUL Experimentální uspořádání použitá pro měření tření a adheze. (A) Fotografie testu tření. (B) Schéma testu tření (1) Spodní čelist dynamometru (2) Sklo-karbonátová deska (3) KENCO kůže použitá jako vlhký model rány slouží jako dráha (4) testovaná vláknitá vrstva jako jezdec. (C) Fotografie testu adheze. (D) Schematický náčrtek zkoušky adheze.
Video – smyk, odtrh
A
B
C
D
Testy přilnavosti
Testování prostupnosti bakterií • VŠCHT Ústav biochemie a mikrobiologie
Vybrané bakteriální kmeny • Bacillus subtilis CCM 1999 (G+ tyčinka) • Escherichia coli CCM 3954 (G- tyčinka) • Staphylococcus epidermidis CCM 4418 (G+ kok) • Suspenze byly připraveny inokulací populace MO do tekutého média TSB. V navazujících pokusech bude upravena koncentrace MO dle OD.
Vybrané testy 1. Filtrace bakteriální suspenze přes složený filtr. Získaný filtrát byl následně: rozetřen na povrch agarové půdy kultivován v tekutém médiu
2. Aplikace bakteriální suspenze přímo na povrch nanotextilie. 3. Položení nanotextilie na povrch předem inokulované agarové plotny.
1. Filtrace • Hladký filtr propustil všechny tři testované bakterie. • V dalším experimentu by bylo vhodné vyzkoušet propustnost větších MO, např. kvasinky Saccharomyces. Roztěr filtrátu, 37°C, 24 h
Bacillus subtilis 100 ul
Escherichia coli 100 ul
Staphylococcus epidermidis 100 ul
2. Aplikace suspenze bakterií na povrch NT
B. subtilis
E. coli
S. epidermidis
2. Aplikace suspenze bakterií na povrch NT 24h, 37°C
3. Položení NT na povrch inokulované plotny • roztěr 100 ul suspenze bakterií
B. subtilis – 24 h, 37°C
E. coli – 24 h, 37°C
S. epidermidis – 24 h, 37°C
S. epidermidis – 48 h, 37°C
Závěry mikrobiologického testování • Sterilace nanotextílií • Bakterie byly částečně zachyceny na filtru a částečně přes filtr prošly → Kvantifikace míry propustnosti bakterií • Mikroksopická kontrola nanovlákenných vrstev po inokulaci MO • Testování degradace nanotextílie v tekutém médiu (v přítomnosti MO i v čistém médiu) – změna rychlosti degradace • Aparatura
Děkuji za pozornost!!!
