PŘEHLEDNÉ ČLÁNKY
Kondiciované médium z kmenových buněk a jeho využití v bezbuněčné terapii Stem cell conditioned medium for cell-free therapies Vacková I., Kubinová Š. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i., Praha SOUHRN Kmenové buňky se stávají účinným nástrojem v léčbě řady defektů a onemocnění. V poslední době se ukazuje, že terapeutický efekt kmenových buněk spočívá nejenom v jejich integraci a diferenciaci do buněk příslušné tkáně, ale především v jejich parakrinní aktivitě, tj. schopnosti sekretovat trofické a růstové faktory, cytokiny a chemokiny, které mají regenerativní a protizánětlivé účinky. Kondiciované médium (KM) obsahující sekreční produkty kmenových buněk lze proto využít v tzv. bezbuněčné terapii, která představuje alternativu k terapii buněčné s výhodou nižších rizik, možnosti alogenního podání a velkoobjemové výroby. Výsledky preklinických studií potvrzují, že terapeutický efekt KM je srovnatelný s přímou aplikací kmenových buněk. Cílem této práce je shrnout výsledky studií využívající KM z různých typů kmenových buněk v regenerativní medicíně a současně vypracovat přehled faktorů, kterými lze modifikovat buněčnou sekreci a složení KM. Klíčová slova: kondiciované médium, sekretom, buněčná a bezbuněčná terapie, kmenové buňky, preklinické studie
SUMMARY Stem cells become an effective tool for treatment of a variety of defects and diseases. Recently, it appears that the therapeutic effect of stem cells lies not only in their integration and differentiation into cells of the tissue, but especially in their paracrine activity, i.e. the ability to secrete trophic and growth factors, cytokines and chemokines that have regenerative and anti-inflammatory effects. Conditioned medium (CM) containing secretory products of stem cells can thus be used in cell-free therapy which represents an alternative to the cell-based therapy, with advantage of lower risks, the possibility of allogenic administration and mass production. Preclinical studies confirm that the therapeutic effect of CM is comparable to the effect of the application of stem cells. The aim of this paper is to summarize the results of studies using CM from different types of stem cells in regenerative medicine and simultaneously develop an overview of the factors that can modify cellular secretion and the composition of CM. Key words: conditioned medium, secretome, cell-based and cell-free therapies, stem cells, pre-clinical studies
ÚVOD Buněčná terapie využívající kultivované kmenové buňky se stává slibným nástrojem v léčbě řady defektů a onemocnění v humánní i veterinární medicíně. Aplikace autologních, popř. alogenních kmenových buněk je však limitována jejich nízkou retenční schopností, tj. přežíváním transplantovaných buněk v místě transplantace. Studie na zvířecích modelech dokazují, že transplantované buňky přežívají v příjemci bez ohledu na způsob podání nebo typ onemocnění relativně krátkou dobu a jejich přihojení do tkání vykazuje velmi nízkou účinnost (Bollini et al., 2013). Limitujícím faktorem v případě autologní transplantace kultivovaných MSC je také počet buněk, který je nutný získat pro aplikaci, přičemž efektivní léčebná dávka představuje množství buněk v řádech desítek až stovek milionů pro jednorázové, eventuálně opakované podání. Vlivem onemocnění a s věkem pacientů klesá růstový potenciál i kvalita autologních MSC a požadovaný počet buněk v dané kvalitě tak často nelze připravit. V poslední době se potvrzuje, že mechanismus, pomocí kterého kmenové buňky zprostředkovávají opravu poškozených tkání, nespočívá pouze v jejich diferenciačním Československá fyziologie 65/2016 č. 1
potenciálu a schopnosti nahradit poškozené buňky v cílové tkáni, ale především v jejich parakrinním působení (Drago et al., 2013). Transplantované kmenové buňky uvolňují do okolní tkáně různé trofické a růstové faktory, cytokiny, chemokiny, metabolity a bioaktivní lipidy, jež potencují endogenní regeneraci, ovlivňují imunitní reakci a mají řadu dalších efektů. Analýza sekrečních faktorů a možnost jejich využití v regenerativní medicíně je v současné době intenzivně studována s cílem zavedení tohoto typu léčby do klinické aplikace (Bollini et al., 2013). Nedávné studie dokazují, že aplikace kondiciovaného média (KM), které obsahuje bioaktivní faktory uvolňované kmenovými buňkami, má stejný regenerativní účinek jako přímá transplantace buněk (Bollini et al., 2013; Camussi et al., 2013; Linero a Caparro, 2014; Bortolotti et al., 2015; Tran a Damaser, 2015). V porovnání s kultivovanými kmenovými buňkami má KM několik zásadních výhod – lze jej vyrobit ve velkém množství, zkoncentrovat nebo lyofilizovat a využít jako „off-the-shell“ produkt s nižšími nároky na skladování i transport. Jelikož KM neobsahuje buňky, lze jej alogenně aplikovat bez rizika imunitní reakce příjemce, což výrazně snižuje výrobní náklady a umožňuje využití této terapie v mnohem širším měřítku, než je zatím proveditelné u terapie kmenovými buňkami. 25
Součástí KM je tzv. buněčný sekretom obsahující mikrovezikuly a exozomy, které slouží jako rezervoáry bioaktivních faktorů. Produkci sekretomu do kultivačního média lze stimulovat a modifikovat různými kultivačními podmínkami (hypoxie, bezsérové médium) nebo stimulací pomocí různých faktorů (prozánětlivé chemokiny). Kromě využití KM se řada studií zaměřuje na terapeutické využití mikrovezikulů a exozomů izolovaných z KM. Mikrovezikuly jsou fragmenty buněčné cytoplazmy (100–1000 nm) uvolňované buňkou do extracelulárního prostředí. Dalším typem extracelulárních váčků jsou exozomy (50–100 nm), jež vznikají uvnitř buňky jako součást multivezikulárního endozomu. Po jeho splynutí s buněčnou membránou jsou exozomy uvolňovány z buňky do okolního prostředí. Oba typy vezikulů slouží jako rezervoáry proteinů, bioaktivních faktorů, RNA a mikroRNA a jsou klíčovými regulátory v mezibuněčné signalizaci (Lai et al., 2011). V humánní medicíně zatím KM běžně využíváno není a prozatím nejsou dostupné ani výsledky klinických studií. Několik pilotních studií využívajících KM bylo provedeno v dermatologických aplikacích a kosmetice. KM z kmenových buněk izolovaných z tukové tkáně (AT-MSC) bylo testováno v léčbě kožních poranění a k vlasové regeneraci (Zhou et al., 2013a). V Japonsku byl validován nový postup pro vlasovou regeneraci, který využívá KM a v něm obsažené cytokiny a růstové faktory důležité pro růst vlasů (např. VEGF, KGF, PDGF, HGF). Lokální aplikace KM (4–6×) subkutánně nebo formou gelu signifikantně zlepšila růst vlasů, přičemž účinek léčby se zvyšoval s četností aplikací (Fukuoka et al., 2012). V Koreji (Prostemics Inc, Seoul) byl studován vliv sekrečních faktorů KM získaného z lidské linie embryonálních kmenových buněk (ESC) diferencovaných do endoteliálních prekurzorových buněk (EPC) na pigmentaci a eliminaci vrásek. V této studii bylo 25 žen podrobeno pěti aplikacím KM nebo fyziologického roztoku v intervalu 2 týdnů, přičemž po podání KM došlo ke statisticky významné redukci pigmentace a vrásek (Lee et al., 2014). EPC sekretovaly cytokiny a chemokiny (např. EGF, bFGF, fraktalin, GM-CSF, IL-6, IL-8, PDGF-AA a VEGF), které jsou důležitými faktory pro angiogenezi a hojení ran. V probíhajících klinických studiích je testován efekt exozomů z mezenchymálních kmenových buněk (MSC) izolovaných z pupečníkové krve v léčbě diabetu 1. typu (NCT02138331) a efekt lyofilizovaného KM z MSC izolovaných z periferní krve (APOSEC™) v léčbě kožního poranění (NCT02284360; www.clinicaltrials.gov). FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ SLOŽENÍ KONDICIOVANÉHO MÉDIA Sekrece buněk, a tedy i složení KM je zásadně ovlivněno podmínkami a lokálním mikroprostředím, ve kterém se buňky kultivují. Vhodnou fyzikální, chemickou nebo biologickou modifikací tohoto mikroprostředí tak lze iniciovat zvýšenou nebo cílenou produkci sekrečních faktorů (Tran a Damaser, 2015). Mezi hlavní faktory, které vedou ke změně složení sekretomu, patří: 1. Hypoxie/anoxie 2. Kultivace v bezsérovém médiu 26
3. Prekondice pomocí buněčných interakcí – 3D kultury, sferoidy 4. Působení cytokinů, chemokinů a růstových faktorů 1. Hypoxie/anoxie Nejvíce studovaným faktorem stimulujícím buněčnou sekreci je kultivace za sníženého obsahu kyslíku. Běžná buněčná kultivace probíhá v podmínkách normálního 21% obsahu kyslíku v atmosféře (normoxie), což ale neodpovídá přirozenému prostředí kmenových buněk v tkáních, kde je koncentrace kyslíku přibližně 4–10× nižší. Řada studií prokázala, že snížení koncentrace kyslíku během kultivace vede k rychlejší proliferaci a vyšší produkci sekrečních faktorů do KM (Moon et al., 2012). MSC kultivované za hypoxických podmínek produkovaly signifikantně vyšší množství VEGF, FGF-2, HGF, IGF-1 a tymosinu β-4 než buňky kultivované za normoxických podmínek. Použití KM z těchto buněk v léčbě infarktu myokardu u potkanů vedlo k signifikantní redukci velikosti léze a zlepšení ventrikulární funkce ve srovnání s kontrolním nekondiciovaným médiem (Gnecchi et al., 2006). AT-MSC kultivované za hypoxických podmínek sekretovaly více IGFBP-1 a 2, M-CSF, VEGF, receptoru M-SCF a PDGF receptoru β než při kultivaci za normoxie. Subkutánní podání KM média z AT-MSC získaného za hypoxických podmínek mělo také lepší účinek na obnovu růstu srsti u myší (Park et al., 2010). Na modelu traumatického poškození mozku u potkanů vedla intravenózní aplikace KM z lidských MSC kultivovaných za podmínek hypoxie k signifikantnímu zlepšení motorických a kognitivních funkcí, vyšší stimulaci neurogeneze a nižšímu poškození mozku ve srovnání s aplikací KM získaného za normoxických podmínek (Chang et al., 2013). Další studie prokázala v hypoxickém KM vyšší obsah faktorů bFGF, VEGF-A, IL-6 a IL-10. Hypoxické KM vedlo k rychlejšímu hojení kožního poranění, neovaskularizaci, zvýšení počtu makrofágů a regulaci syntézy kolagenů v místě poranění v porovnání s médiem připraveným za normoxie (Chen et al., 2014). Podání KM z AT-MSC kultivovaných za hypoxických podmínek (1% a 5% O2) mělo také vyšší efekt na kontrakci rány u myšího modelu poranění kůže ve srovnání s KM z buněk kultivovaných za podmínek normoxie (Jun et al., 2014). Toto KM současně zvyšovalo proliferaci a migraci lidských dermálních fibroblastů in vitro. Analýza sekretomu z lidských WJ-MSC kultivovaných při hypoxických a normoxických podmínkách prokázala zvýšení sekrece důležitých neuroregulačních molekul GDN a Cys C u KM za normoxických podmínek a zvýšení sekrece proteinů thymosinu-β, EF-2, UCHL1, klusterinu a Prx1 za podmínek hypoxie (Teixeira et al., 2015). Oba druhy sekretomu indukovaly a podporovaly neuronální diferenciaci lidských neurálních prekurzorových buněk in vitro. 2. Kultivace v bezsérovém médiu Další faktor, který stimuluje sekreční aktivitu, je kultivace za stresových podmínek bez přítomnosti séra v médiu. Tyto podmínky in vitro modelují ischemii. MSC kultivované v podmínkách sérové deprivace vylučují do KM zvýšené Československá fyziologie 65/2016 č. 1
množství faktorů stimulujících přežívání buněk a angiogenezi (VEGF A, angiopoetiny, IGF1 a HGF; Oskowitz et al., 2011). U míšního poranění u potkanů měla aplikace KM z BM-MSC kultivovaných 48 hodin v bezsérovém médiu neuroprotektivní účinek a vedla k aktivaci makrofágů a zlepšení motorických funkcí (Cantinieaux et al., 2013). Vliv transplantace AT-MSC a KM z AT-MSC v sérové deprivaci byl sledován na léčbě kostních lézí u králíků (Linero a Caparro, 2014). KM bylo získáváno z bezsérových kultur kultivovaných při hypoxii (5% O2). AT-MSC i KM měly stejný pozitivní efekt na regeneraci čelistních lézí, což potvrzuje parakrinní efekt buněčné aplikace. V podmínkách hypoxie byla také vyšší sekrece faktorů IL-6, VEGF, angiogeninu, MPC-3, MPC-1, IGF-1, TGF-β, PDGF-BB, bFGF, EGF a RANTES v porovnání s normoxií.
faktorů a cytokinů (VEGF, HGF, PDGF-BB, IL-6 a IL-8) v KM a má vyšší in vivo angiogenní efekt ve srovnání s kontrolním médiem. KONDICIOVANÉ MÉDIUM Z RŮZNÝCH BUNĚČNÝCH TYPŮ
3. Prekondice pomocí buněčných interakcí – 3D kultury, sferoidy Kultivace buněk v 3D prostředí usnadňuje kontakt mezi buňkami a interakci buněk s extracelulární matrix, což umožňuje vytvořit přirozenou morfologii kultivovaných buněk a současně i ovlivňuje jejich signální aktivitu. Kultivace lidských BM-MSC ve formě 3D sferoidů měla efekt na zvýšenou sekreci protizánětlivého faktoru TSG-6, stanniokalcinu 1, proteinu, který má protizánětlivé a protiapoptotické účinky, a protirakovinných proteinů - IL-24, TRAIL a CD82 (Bartosh et al., 2010). Analýza KM získaného ze sferoidních kultur MSC prokázala i vyšší koncentraci proteinů stimulujících angiogenezi, regeneraci a remodelaci extracelulární matrix (např. fibrinogen, TIMP-1, MMP-2, TGF-β1, KGF, HGF, VEGF, EGF, bFGF, tenascin, kolagen typu VI a fibronectin1; shrnuto v Kapur et al., 2013). Na modelu iktu u myší vedla mozková kontinuální infuze KM připraveného z ATMSC kultivovaných ve formě 3D sferoidů k redukci léze a zachování motorických funkcí (Cho et al., 2012). KM získané z 3D kultivace WJ-MSC vykazovalo zvýšenou parakrinní produkci VEGF-A, MMP-2 a 9, HGF, TGF β1, G-CSF, FGF-2 a IL-6 v porovnání s 2D kulturou a díky vyššímu obsahu parakrinních faktorů urychlovalo hojení řezných ran u potkanů (Santos et al., 2015).
Embryonální kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (ESC) jsou pluripotentní buňky odvozené z blastocysty, které mají neomezenou schopnost se dělit a diferencovat do buněk různých zárodečných linií. Principiálně však transplantace ESC přináší riziko nežádoucí diferenciace a tvorby teratomů. Při terapeutickém využití sekretomů z těchto buněk jsou rizika nežádoucí diferenciace eliminována nepřítomností buněk, přičemž lze využít široké portfolio produktů ESC po jejich diferenciaci do příslušného buněčného typu. KM z lidských ESC bylo testováno v různých aplikacích na experimentálních zvířecích modelech. Například KM připravené z lidských MSC derivovaných z ESC kultivovaných v bezsérovém médiu s přídavkem ITS, FGF2 a PDGF-AB po každodenní intravenózní aplikaci po dobu 7 dnů vedlo ke zlepšení vaskularizace a snížení velikosti léze při zachování systolického a diastolického výkonu u prasat s infarktem myokardu (Timmers et al., 2011). Protektivní a protizánětlivý efekt myšího sekretomu z ESC inkorporovaného do nanovlákenného hydrogelu byl demonstrován na modelu akutního poranění ledvin u myší. Na renoprotektivní funkci se výrazně podílela přítomnost proteinů folistalinu, adiponektinu a SLPI v KM. Tento efekt nebyl pozorován při aplikaci sekretomu z myších fetálních fibroblastů (Wang et al., 2011). Na modelu indukované chronické choroby ledvin u potkanů byl studován efekt opakovaného intravenózního podání KM z MSC derivovaných z lidských ESC, přičemž došlo ke snížení progrese onemocnění a k redukci výskytu glomerulárního poranění a hypertenze (van Koppen et al., 1012). Další studie ukázala pozitivní efekt KM z lidské linie ESC diferencovaných do endoteliálních prekurzorových buněk na rychlost hojení ran u myší (Lee et al., 2011).
4. Působení cytokinů, chemokinů a růstových faktorů Prozánětlivá stimulace in vitro simuluje podmínky zánětu v tkáni hostitele, kterému jsou transplantované buňky vystavené po aplikaci pacientovi. Prozánětlivý cytokin TNF-α přidávaný 48 hodin do média in vitro kultivovaných AT-MSC zvyšoval sekreci u 187 zkoumaných proteinů (Lee et al., 2010). KM aktivované pomocí IFN-γ snížilo proliferaci mononukleárních buněk z periferní krve (DelaRosa et al., 2009). Stimulace AT-MSC pomocí TNF-α také vedla ke zvýšení hladiny IL-6, IL-8 a MCP1, o kterých je známo, že podporují migraci monocytů do místa zánětu (Heo et al., 2011). Na modelu kožního poranění u hlodavců vykazovaly rány po ošetření takto stimulovaným KM zvýšenou vaskularizaci, vyšší počet makrofágů a rychlejší kontrakci rány. De Luca et al. (2011) dále prokázal, že TGF-α přidávaný ke kultivovaným BM-MSC zvyšuje hladinu několika růstových
Extraembryonální kmenové buňky z pupečníku, placenty a amniové tekutiny Extraembryonální kmenové buňky získané po porodu z fetálních tkání představují mezičlánek mezi fetálními a dospělými kmenovými buňkami. Nejsou zatížené věkem a chorobami získanými během života, a jsou proto vhodným buněčným zdrojem pro bezbuněčnou terapii vzhledem k dobré dostupnosti zdrojových tkání, vysoké in vitro proliferační schopnosti a diferenciačnímu potenciálu. In vitro studie prokázaly, že sekretom MSC izolovaných z Whartonova gelu pupečníkové tkáně (WJ) obsahuje více faktorů podporujících angiogenezi a neurogenezi ve srovnání se sekretomem z BM-MSC (Hsieh et al., 2013). Rozdíly v expresi vybraných faktorů byly také nalezeny mezi WJ-MSC a AT-MSC. Zatímco v sekretomu MSC z tukové tkáně byla prokázána sekrece VEGF, NGF, SCF a HGF, v sekretomu WJ-MSC byl prokázán pouze VEGF a vysoká hladina NGF (Ribeiro et al., 2012).
Československá fyziologie 65/2016 č. 1
27
Vliv bezbuněčných sekretomů nebo buněčných lyzátů odvozených z WJ-MSC na lidský karcinom mléčné žlázy u imunodeficitních myších zkoumal Gauthaman et al. (2013). Injekční podání KM a buněčného lyzátu vedlo k redukci velikosti karcinomu vzhledem ke kontrolám. Zhou et al. (2013b) prokázali, že exozomy izolované z lidských pupečníkových MSC mají významný terapeutický přínos při zlepšení oxidačního stresu, zlepšují přežívání buněk a snižují apoptózu a nekrózu v proximálních tubulech ledvin u modelu nefrotoxicity potkanů. U KM získaného z kmenových buněk lidské pupečníkové krve byly prokázány mitogenní a chemotaktické účinky na keratinocyty a fibroblasty, zřejmě zprostředkované silně exprimovanými cytokiny PDGF-α, PDGF-β a KGF. Parakrinní faktory uvolňované kmenovými buňkami z pupečníkové krve měly také příznivý vliv na rychlost hojení a neovaskularizaci ran u diabetických myší (Kim et al., 2010 a Park et al., 2012). Další studie na modelu kožního poranění u myší prokázala, že aplikace KM z WJ-MSC měla podobný efekt jako přímá buněčná transplantace. Oba typy léčby stimulovaly tvorbu protizánětlivých M2 makrofágů a urychlovaly proces hojení produkcí proregenerativních cytokinů IL-10, TGF-β1, VEGF-1 a angiopoetinu-1 (Shohara et al., 2012). Srovnatelný efekt WJ-MSC a KM byl nalezen v hojení řezných poranění a diabetických ran u myší. Obě aplikace urychlovaly hojení a vykazovaly zvýšenou reepitelizaci, vaskularizaci, buněčnou denzitu a zvýšený počet vlasových folikulů v porovnání s neléčenými kontrolami (Fong et al., 2014). KM z lidských WJ-MSC vedlo ke zvýšení exprese genů podílejících se na reepitelizaci (TGF-β2), neovaskularizaci (HIF-1α) a proliferaci (PAI-1) v kultuře lidských kožních fibroblastů a podporovalo hojení ran na in vivo modelu u myší (Arno et al., 2014). Urychlení hojení kožního poranění bylo rovněž demonstrováno po aplikaci KM z kmenových buněk derivovaných z amniové tekutiny (AF-MSC; Yoon et al., 2010). KM z těchto buněk je zdrojem velkého množství cytokinů a chemokinů (IL-8, IL-6, TGF-β, TNFRI, VEGF, EGF), které hrají roli při stimulaci dermálních fibroblastů. V další studii byla v KM získaném z AF-MSC potvrzena přítomnost proangiogenních faktorů (MCP-1, IL-8, SDF-1, VEGF) a na preklinickém modelu ischemické nohy u myši bylo prokázáno, že aplikace KM z AF-MSC podporuje neoarteriogenezi a tím zabraňuje ztrátě kapilarity a nekrózy tkáně distálních svalů (Mirabella et al., 2011). U myšího modelu akutního selhání jater měla aplikace sekretomu z AF-MSC proangiogenní a protizánětlivé účinky (Zagoura et al., 2012). V sekretomu z AF-MSC bylo nalezeno zvýšené množství různých interleukinů (IL-10, 27, 17E, 12p70, 1β, 1ra) a mediátorů regenerace jater (MCP-1, SDF-1, PD-ECGF), tkáňových inhibitorů metaloproteináz, TIMP1 a 2, FGF7 a EGF. Terapeutický efekt přímé transplantace AF-MSC a z nich získaného KM byl studován v léčbě akutního infarktu myokardu u potkanů (Bollini et al., 2011). Systémové podání bylo v obou případech kardioprotektivní, zlepšovalo přežívání buněk srdečního svalu a redukovalo velikost léze. Pozitivní efekt transplantace AF-MSC nebo injekce 28
samotného KM byl demonstrován u novorozených potkanů s nekrotizující enterokolitidou, kde došlo k utlumení enzymatické aktivity cyklooxygenázy 2, snížení střevního zánětu a nekróze tkáně a k signifikantnímu zlepšení střevních funkcí (Zani et al., 2012). Imunomodulační efekt KM z MSC odvozených z lidské amniové membrány byl studován z hlediska proliferace aktivovaných lymfocytů in vitro (Rossi et al., 2012). KM inhibovalo proliferaci lymfocytů i bez předchozí externí stimulace prozánětlivými faktory. Tento jev nebyl pozorován u KM získaného z BM-MSC, které inhibovalo proliferaci lymfocytů pouze po předchozí stimulaci prozánětlivými faktory. Další studie prokázala, že alogenní podání koňských MSC odvozených z amnionu je účinné při léčbě poranění šlach u koní (Lange-Consiglio et al., 2013a). K úplnému zhojení bez opětovného poškození šlachy po návratu k původní zátěži došlo u 85 % koní, což byl signifikantně vyšší výsledek než u koní léčených konvenčními metodami s úspěšností léčby asi 10–20 %. Léčba pomocí KM z amniových MSC vykazovala lepší výsledky než léčba pomocí autologních BM-MSC s úspěšností léčby 76 % (Lange-Consiglio et al., 2013b). U žádného z koní nebyly při podání alogenních MSC nebo KM pozorovány nežádoucí účinky, tvorba nežádoucí tkáně nebo tumoru. MSC izolované z dospělých tkání Transplantace dospělých MSC izolovaných z kostní dřeně nebo tukové tkáně je nejrozšířenějším typem buněčné terapie využívaným v klinické praxi. Příznivý účinek transplantace MSC byl prokázán v klinických studiích u různých modelů poranění a onemocnění. Vzhledem k nízké schopnosti přežívání MSC ve tkáni i jejich omezené in vivo diferenciaci spočívá hlavní terapeutický efekt MSC v jejich schopnosti sekretovat trofické faktory podporující lokální neovaskularizaci, inhibující buněčnou smrt a potlačující imunitní odpověď (Bollini et al., 2013). Na modelu ischemie zadních končetin u myší bylo prokázáno, že faktory sekretované BM-MSC do KM zvyšují ve srovnání s kontrolním nekondiciovaným médiem obnovu a remodelaci krevního toku, zlepšují funkci končetin a tlumí svalovou atrofii (Kinnaird et al., 2004). Studie porovnávající angiogenní efekt podkožně injikovaných lidských AT-MSC a jejich KM na modelu ischemické nohy u myší prokázala angiogenní efekt jak AT-MSC, tak KM, nicméně lepší obnova průtoku krve byla nalezena po přímé aplikaci kmenových buněk (Rehman et al., 2004). Vliv aplikace KM z BM-MSC kultivovaných 48 hodin v bezsérovém médiu na regeneraci poraněné míchy potkanů a angiogenezi in vitro demonstroval Cantinieaux et al. (2013). KM mělo neuroprotektivní a proangiogenní efekt, aktivovalo makrofágy a zlepšovalo motorické funkce. Funkční zotavení, neuroprotektivní efekt a zvýšená neurogeneze byly prokázány po intravenózní infuzi KM z potkaních BM-MSC nebo AT-MSC na modelu iktu u potkanů (Tsai et al., 2014; Wei et al., 2009; Egashira et al., 2012 a Cho et al., 2012). Sekretom z potkaních BM-MSC byl také studován v léčbě simulované stresové močové inkontinence, která Československá fyziologie 65/2016 č. 1
je modelem pro zranění způsobená při vaginálním porodu v humánní medicíně (Dissaranan et al., 2013). Potkani ošetření koncentrovaným KM se ze stresové močové inkontinence zotavili rychleji a histologické vyšetření močové trubice ukázalo nárůst elastinových vláken a hladké svaloviny v porovnání s kontrolami. Účinek AT-MSC, BM-MSC a KM z těchto buněk byl studován na modelu indukované chronické choroby ledvin u myší (Bi et al., 2007). Intravenózní aplikace obou typů MSC vedla ke zvýšené proliferaci tubulárních buněk a k redukci apoptózy. Histologická analýza neprokázala přítomnost transplantovaných buněk v ledvinových kanálcích, přičemž KM z obou buněčných typů mělo stejný terapeutický efekt jako přímá transplantace MSC, což potvrdilo parakrinní mechanismus jejich účinku. Opakovaná aplikace koncentrovaného KM získaného z BM-MSC a AT-MSC do modelu ischemické zadní nohy u myší měla stejné terapeutické výsledky jako aplikace samotných buněk a vedla ke zlepšení vaskularizace, snížení nekrózy a zánětu a stimulace regenerace tkáně (Bortolotti et al., 2015). Regenerativní kapacita lidských AT-MSC a jejich sekretomu byla porovnána na modelu poranění jater u myší (Lee et al., 2015). Terapeutický účinek AT-MSC a jejich sekretomu se mezi sebou statisticky nelišil, ale byl vyšší v porovnání s kontrolami. AT-MSC i KM podporovaly fosforylaci Akt, STAT3 a Erk1/2 a vykazovaly vyšší hladinu albuminu. Vliv KM z MSC byl dále testován na modelech poškození plic (Waszak et al., 2012) a jater u potkanů (Du et al., 2013 a van Poll et al., 2008). ZÁVĚR Terapeutický účinek kmenových buněk je založen zejména na jejich parakrinním působení v místě aplikace, kde aktivují protizánětlivé, protiapoptické a regenerativní procesy, modulují molekulární složení prostředí a vyvolávají reakci
endogenních kmenových buněk včetně jejich proliferace. KM získané kultivací kmenových buněk obsahuje značné množství těchto parakrinních faktorů a lze jej tak použít jako vhodnou alternativu k buněčné terapii. Na základě preklinických studií bylo prokázáno, že aplikace KM má podobné léčebné účinky jako přímá aplikace kmenových buněk. Použití sekretomu kmenových buněk v regenerativní medicíně tak otevírá nové možnosti v léčbě řady onemocnění, zejména kožních poranění, ischemických stavů, jako je například infarkt myokardu, iktus nebo onemocnění periferních tepen. Léčebný efekt KM byl v preklinických modelech demonstrován také v léčbě chorob a poranění ledvin, jater, plic, střev, míchy, šlach, močové inkontinence, kostních lézí a diabetu. Použití KM v bezbuněčných terapiích eliminuje problémy spojené s transplantací buněk, jako je nízká schopnost přežívání buněk po transplantaci, imunitní kompatibilita, tvorba nádorů a přenos infekcí spojených s buněčnými terapiemi. Výroba KM nabízí ve srovnání s izolací a kultivací kmenových buněk výraznou redukci výrobních nákladů a nároků na skladování. Další výhodou KM je také možnost okamžitého podání v případě potřeby jako „off-the-shelf“ produkt, což umožňuje aplikaci KM v době, kdy je léčba nejúčinnější. Kromě toho je možné optimalizovat zastoupení proteinů obsažených v sekretomu pro různé terapeutické aplikace. Slibné výsledky preklinických studií naznačují, že kondiciované médium představuje do budoucna slibnou alternativu k buněčným terapiím. Nicméně jeho skutečný léčebný potenciál je nutné ověřit v klinickém testování. Podporováno: MŠMT: NPU I (LO 1309)
Ing. Irena Vacková, CSc. Oddělení neurověd Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Vídeňská 1083 142 020 Praha 4 e-mail:
[email protected]
SEZNAM ZKRATEK CYTOKINŮ A RŮSTOVÝCH FAKTORŮ CD 82 – cluster of differentiation 82 (diferenciační skupina 82) Cys C – cystatin C EF-2 – elongation factor 2 (elongační faktor 2) EGF – epidermal growth factor (epidermální růstový faktor) Erk1/2 – extracellular-signal-regulated kinases 1/2 (extracelulárním signálem regulovaná kináza 1/2) FGF-2/bFGF – fibroblast growth factor 2/basic (fibroblastový růstový faktor 2/základní) GDN – glia-derived nexin (gliový nexin) GM-CSF – granulocyte-macrophage colony stimulating factor (granulocytární makrofágové kolonie stimulující faktor) HGF – hematopoietic growth factor (hematopoetický růstový faktor) HIF-1α – hypoxia-inducible factor 1α (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa) IFN-γ – interferon gama IGF-1,2 – insulin-like growth factor 1,2 (inzulinu podobný růstový faktor 1, 2) IGFBP-1, 2 – insulin-like growth factor-binding protein 1, 2 (IGF vazebné bílkoviny 1, 2) IL-1β, 1ra, 6, 8, 10, 12p70, 17E, 24 a 27 – interleukin 1β, 1ra, 6, 8, 10, 12p70, 17E, 24 a 27 ITS – insulin-transferrin-selenium (inzulin-transferin-selen)
Československá fyziologie 65/2016 č. 1
KGF – keratinocyte growth factor (keratinocytový růstový faktor) M-CSF – macrophage colony-stimulating factor (makrofágové kolonie stimulující faktor) MPC-1 a 3 – mitochondrial pyruvate carrier 1 a 3 (mitochondriální pyruvátový nosič 1 a 3) MMP-2 a 9 – matrix metalloproteinase 2 a 9 (matrixová metaloproteináza 2 a 9) NGF – nerve growth factor (nervový růstový faktor) PAI-1 – plasminogen activator inhibitor-1 (inhibitor plasminogenového aktivátoru 1) PD-ECGF – platelet-derived endothelial cell growth factor (destičkový endoteliální růstový faktor ) PDGF-α, β, AA, BB – platelet derived growth factor-α, β, AA, BB (destičkový růstový faktor) PDGF receptor – platelet derived growth factor receptor (receptor pro růstový faktor PDGF) Prx1 – peroxiredoxin-1 RANTES – regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (regulovaný po aktivaci, normálně exprimovaný a sekretovaný T-buňkami) SCF – stem cell factor (faktor kmenových buněk) SDF-1 – stromal cell-derived factor 1 (faktor odvozený ze stromálních buněk 1)
29
SLPI – secretory leukocyte protease inhibitor, antileukoproteinase (inhibitor proteáz sekrečních lymfocytů, antileukoproteináza) STAT3 – signal transducer and activator of transcription 3 (signál snímače a aktivátor transkripce 3) TGF-β – transforming growth factor-β (transformující růstový faktor beta) TIMP-1 – tissue inhibitor of matrixmetalloproteinase (tkáňový inhibitor matrixové metaloproteinázy)
TNF-α – tumor necrosis factor- α (nádory nekrotizující faktor alfa) TNFRI – tumor necrosis factor receptor type I (TNF receptor typu I) TRAIL – TNF-related apoptosis-inducing ligand (TNF odvozený apoptózou indukovaný ligand) UCHL1 – ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (ubikvitin hydroláza L1) VEGF/ VEGF-A – vascular endothelial growth factor/A (vaskulární endoteliální růstový faktor/A)
LITERATURA
1.
2.
3. 4. 5.
6.
7. 8.
9.
10.
11.
12. 13.
14.
15.
30
Arno AI, Amini-Nik S, Blit PH, Al-Shehab M, Belo C, Herer E, Tien CH, Jeschke MG. Human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells promote skin wound healing through paracrine signaling. Stem Cell Res Ther, 5, 2014, s. 28. Bartosh TJ, Ylostalo JH, Mohammadipoor A, Bazhanov N, Coble K, Claypool K, Lee RH, Choi H, Prockop DJ. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. P Natl Acad Sci USA, 107, 2010, s. 13724– 13729. Bi B, Schmitt R, Israilova M, Nishio H, Cantley LG. Stromal cells protect against acute tubular injury via an endocrine effect. J Am Soc Nephrol, 18, 2007, s. 2486–2496. Bollini S, Gentili C, Tasso R, Cancedda R. The Regenerative Role of the Fetal and Adult Stem Cell Secretome. J Clin Med, 2, 2013, s. 302– 327. Bollini S, Cheung KK, Riegler J, Dong X, Smart N, Ghionzoli M, Loukogeorgakis SP, Maghsoudlou P, Dube KN, Riley PR, Lythgoe MF, De Coppi P. Amniotic Fluid Stem Cells Are Cardioprotective Following Acute Myocardial Infarction. Stem Cells Dev, 20, 2011, s. 1985–1994. Bortolotti F, Ukovich L, Razban V, Martinelli V, Ruozi G, Pelos B, Dore F, Giacca M, Zacchigna S. In Vivo Therapeutic Potential of Mesenchymal Stromal Cells Depends on the Source and the Isolation Procedure. Stem Cell Rep, 4, 2015, s. 332–339. Camussi G, Deregibus MC, Cantaluppi V. Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells. Biochem Soc T, 41, 2013, s. 283–287. Cantinieaux D, Quertainmont R, Blacher S, Rossi L, Wanet T, Noel A, Brook G, Schoenen J, Franzen R. Conditioned Medium from Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Recovery after Spinal Cord Injury in Rats: An Original Strategy to Avoid Cell Transplantation. Plos One, 8, 2013, e69515. De Luca A, Gallo M, Aldinucci D, Ribatti D, Lamura L, D’Alessio A, De Filippi R, Pinto A, Normanno N. Role of the EGFR Ligand/Receptor System in the Secretion of Angiogenic Factors in Mesenchymal Stem Cells. J Cell Physiol, 226, 2011, s. 2131–2138. DelaRosa O, Lombardo E, Beraza A, Mancheno-Corvo P, Ramirez C, Menta R, Rico L, Camarillo E, Garcia L, Luis Abad J, Trigueros C, Delgado M, Buscher D. Requirement of IFN-gamma-Mediated Indoleamine 2,3-Dioxygenase Expression in the Modulation of Lymphocyte Proliferation by Human Adipose-Derived Stem Cells. Tissue Eng Part A, 15, 2009, s. 2795–2806. Dissaranan C, Cruz MA, Kiedrowski MJ, Balog BM, Gill BC, Penn MS, Goldman HB, Damaser MS. Rat Mesenchymal Stem Cell Secretome Promotes Elastogenesis and Facilitates Recovery From Simulated Childbirth Injury. Cell Transplant, 23, 2014, s. 1395–1406. Drago D, Cossetti C, Iraci N, Gaude E, Musco G, Bachi A, Pluchino S. The stem cell secretome and its role in brain repair. Biochimie, 95, 2013, s. 2271–2285. Du Z, Wei C, Cheng K, Han B, Yan J, Zhang M, Peng C, Liu Y. Mesenchymal stem cell-conditioned medium reduces liver injury and enhances regeneration in reduced-size rat liver transplantation. J Surg Res, 183, 2013, s. 907–915. Egashira Y, Sugitani S, Suzuki Y, Mishiro K, Tsuruma K, Shimazawa M, Yoshimura S, Iwama T, Hara H. The conditioned medium of murine and human adipose-derived stem cells exerts neuroprotective effects against experimental stroke model. Brain Res, 1461, 2012, s. 87–95. Fong C-Y, Tam K, Cheyyatraivendran S, Gan S-U, Gauthaman K, Armugam A, Jeyaseelan K, Choolani M, Biswas A, Bongso A. Human Wharton’s Jelly Stem Cells and Its Conditioned Medium Enhance He-
16. 17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25. 26.
27.
28. 29.
aling of Excisional and Diabetic Wounds. J Cell Biochem, 115, 2014, s. 290–302. Fukuoka H, Suga H, Narita K, Watanabe R, Shintani S. The latest advance in hair regeneration therapy using proteins secreted by adipose-derived stem cells. Am J Cosmet Surg, 29, 2012, s. 273–282. Gauthaman K, Fong C-Y, Arularasu S, Subramanian A, Biswas A, Choolani M, Bongso A. Human Wharton’s Jelly stem cell conditioned medium and cell-free lysate inhibit human osteosarcoma and mammary carcinoma cell growth in vitro and in xenograft mice. J Cell Biochem, 114, 2013, s. 366–377. Gnecchi M, He H, Noiseux N, Liang OD, Zhang L, Morello F, Mu H, Melo LG, Pratt RE, Ingwall JS, Dzau VJ. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. Faseb J, 20, 2006, s. 661–669. Heo SC, Jeon ES, Lee IH, Kim HS, Kim MB, Kim JH. Tumor Necrosis Factor-alpha-Activated Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Accelerate Cutaneous Wound Healing through Paracrine Mechanisms. J Invest Dermatol, 131, 2011, s. 1559–1567. Hsieh J-Y, Wang H-W, Chang S-J, Liao K-H, Lee IH, Lin W-S, Wu C-H, Lin W-Y, Cheng S-M. Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Express Preferentially Secreted Factors Related to Neuroprotection, Neurogenesis, and Angiogenesis. Plos One, 8, 2013, e72604. Chang C-P, Chio C-C, Cheong C-U, Chao C-M, Cheng B-C, Lin M-T. Hypoxic preconditioning enhances the therapeutic potential of the secretome from cultured human mesenchymal stem cells in experimental traumatic brain injury. Clin Sci, 124, 2013, s. 165–176. Chen L, Xu Y, Zhao J, Zhang Z, Yang R, Xie J, Liu X, Qi S. Conditioned Medium from Hypoxic Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Enhances Wound Healing in Mice. Plos One, 9, 2014, e96161. Cho YJ, Song HS, Bhang S, Lee S, Kang BG, Lee JC, An J, Cha CI, Nam D-H, Kim BS, Joo KM. Therapeutic effects of human adipose stem cell-conditioned medium on stroke. J Neurosci Res, 90, 2012, s. 1794–1802. Jun EK, Zhang Q, Yoon BS, Moon J-H, Lee G, Park G, Kang PJ, Lee JH, Kim A, You S. Hypoxic Conditioned Medium from Human Amniotic Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells Accelerates Skin Wound Healing through TGF-beta/SMAD2 and PI3K/Akt Pathways. Int J Mol Sci, 15, 2014, s. 605–628. Kapur SK, Katz AJ. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie, 95, 2013, s. 2222–2228. Kim JY, Song S-H, Kim KL, Ko J-J, Im J-E, Yie SW, Ahn YK, Kim D-K, Suh W. Human Cord Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells and Their Conditioned Media Exhibit Therapeutic Equivalence for Diabetic Wound Healing. Cell Transplant, 19, 2010, s. 1635–1644. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Lee CW, Barr S, Fuchs S, Epstein SE. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. Circ Res, 94, 2004, s. 678–685. Lai RC, Chen TS, Lim SK. Mesenchymal stem cell exosome: a novel stem cell-based therapy for cardiovascular disease. Regen Med, 6, 2011, s. 481–492. Lange-Consiglio A, Rossi D, Tassan S, Perego R, Cremonesi F, Parolini O. Conditioned Medium from Horse Amniotic Membrane-Derived Multipotent Progenitor Cells: Immunomodulatory Activity In Vitro and First Clinical Application in Tendon and Ligament Injuries In Vivo. Stem Cells Dev, 22, 2013a, s. 3015–3024.
Československá fyziologie 65/2016 č. 1
30. Lange-Consiglio A, Corradetti B, Meucci A, Perego R, Bizzaro D, Cremonesi F. Characteristics of equine mesenchymal stem cells derived from amnion and bone marrow: In vitro proliferative and multilineage potential assessment. Equine Vet J, 45, 2013b, s. 737–744. 31. Lee HJ, Lee EG, Kang S, Sung J-H, Chung H-M, Kim DH. Efficacy of Microneedling Plus Human Stem Cell Conditioned Medium for Skin Rejuvenation: A Randomized, Controlled, Blinded Split-Face Study. Ann Dermatol, 26, 2014, s. 584–591. 32. Lee MJ, Kim J, Kim MY, Bae Y-S, Ryu SH, Lee TG, Kim JH. Proteomic Analysis of Tumor Necrosis Factor-alpha-Induced Secretome of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells. J Proteome Res, 9, 2010, s. 1754–1762. 33. Lee SK, Lee SC, Kim SJ. A novel cell-free strategy for promoting mouse liver regeneration: utilization of a conditioned medium from adipose-derived stem cells. Hepatol Int, 9, 2015, s. 310–320. 34. Lee MJ, Kim J, Lee KI, Shin JM, Chae JI, Chung HM. Enhancement of wound healing by secretory factors of endothelial precursor cells derived from human embryonic stem cells. Cytotherapy, 13, 2011, s. 165–178. 35. Linero I, Chaparro O. Paracrine Effect of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Adipose Tissue in Bone Regeneration. Plos One, 9, 2014, e107001. 36. Mirabella T, Cilli M, Carlone S, Cancedda R, Gentili C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials, 32, 2011, s. 3689–99. 37. Moon KM, Park Y-H, Lee JS, Chae Y-B, Kim M-M, Kim D-S, Kim B-W, Nam S-W, Lee J-H. The Effect of Secretory Factors of Adipose-Derived Stem Cells on Human Keratinocytes. Int J Mol Sci, 13, 2012, s. 1239–1257. 38. Park B-S, Kim W-S, Chor J-S, Kim H-K, Won J-H, Ohkubo F, Fukuoka H. Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia: evidence of increased growth factor secretion. Biomed Res-Tokyo, 31, 2010, s. 27–34. 39. Park JH, Hwang I, Hwang SH, Han H, Ha H. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells prevent diabetic renal injury through paracrine action. Diabetes Res Clin Pr, 98, 2012, s. 465–473. 40. Oskowitz A, McFerrin H, Gutschow M, Carter ML, Pochampally R. Serum-deprived human multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are highly angiogenic. Stem Cell Res, 6, 2011, s. 215–225. 41. Rehman J, Traktuev D, Li JL, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation, 109, 2004, s. 1292–1298. 42. Ribeiro CA, Fraga JS, Graos M, Neves NM, Reis RL, Gimble JM, Sousa N, Salgado AJ. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther, 3, 2012, 18. 43. Rossi D, Pianta S, Magatti M, Sedlmayr P, Parolini O. Characterization of the Conditioned Medium from Amniotic Membrane Cells: Prostaglandins as Key Effectors of Its Immunomodulatory Activity. Plos One, 7, 2012, s. 46956. 44. Santos JM, Camoes SP, Filipe E, Cipriano M, Barcia RN, Filipe M, Teixeira M, Simoes S, Gaspar M, Mosqueira D, Nascimento DS, Pinto-do-O P, Cruz P, Cruz H, Castro M, Miranda JP. Three-dimensional spheroid cell culture of umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells leads to enhanced paracrine induction of wound healing. Stem Cell Res Ther, 6, 2015, s. 90. 45. Shohara R, Yamamoto A, Takikawa S, Iwase A, Hibi H, Kikkawa F, Ueda M. Mesenchymal stromal cells of human umbilical cord Wharton’s jelly accelerate wound healing by paracrine mechanisms. Cytotherapy, 14, 2012, s. 1171–1181.
Československá fyziologie 65/2016 č. 1
46. Teixeira FG, Panchalingam KM, Anjo SI, Manadas B, Pereira R, Sousa N, et al. Do hypoxia/normoxia culturing conditions change the neuroregulatory profile of Wharton Jelly mesenchymal stem cell secretome? Stem Cell Res Ther, 6, 2015, s. 133 47. Timmers L, Lim SK, Hoefer IE, Arslan F, Lai RC, van Oorschot AAM, Goumans MJ, Strijder C, Sze SK, Choo A, Piek JJ, Doevendans PA, Pasterkamp G, de Kleijn DPV. Human mesenchymal stem cell-conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction. Stem Cell Res, 6, 2011, s. 206–214. 48. Tran C, Damaser MS. Stem cells as drug delivery methods: Application of stem cell secretome for regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews, 82–83, 2015, s. 1–11. 49. Tsai M-J, Tsai S-K, Hu B-R, Liou D-Y, Huang S-L, Huang M-C, Huang W-C, Cheng H, Huang S-S. Recovery of neurological function of ischemic stroke by application of conditioned medium of bone marrow mesenchymal stem cells derived from normal and cerebral ischemia rats. J Biomed Sci, 21, 2014, s. 5. 50. van Koppen A, Joles JA, van Balkom BWM, Lim SK, de Kleijn D, Giles RH, Verhaar MC. Human Embryonic Mesenchymal Stem Cell-Derived Conditioned Medium Rescues Kidney Function in Rats with Established Chronic Kidney Disease. Plos One, 7, 2012, s. 38746. 51. van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, Berthiaume F, Nahmias Y, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology, 47, 2008, s. 1634–1643. 52. Wang Y, Bakota E, Chang BHJ, Entman M, Hartgerink JD, Danesh FR. Peptide Nanofibers Preconditioned with Stem Cell Secretome Are Renoprotective. J Am Soc Nephrol, 22, 2011, s. 704–717. 53. Waszak P, Alphonse R, Vadivel A, Ionescu L, Eaton F, Thebaud B. Preconditioning Enhances the Paracrine Effect of Mesenchymal Stem Cells in Preventing Oxygen-Induced Neonatal Lung Injury in Rats. Stem Cells Dev, 21, 2012, s. 2789–2797. 54. Wei X, Du Z, Zhao L, Feng D, Wei G, He Y, Tan J, Lee W-H, Hampel H, Dodel R, Johnstone BH, March KL, Farlow MR, Du Y. IFATS Collection: The Conditioned Media of Adipose Stromal Cells Protect Against Hypoxia-Ischemia-Induced Brain Damage in Neonatal Rats. Stem Cells, 27, 2009, s. 478–488. 55. Yoon BS, Moon JH, Jun EK, Kim J, Maeng I, Kim JS, Lee JH, Baik CS, Kim A, Cho KS, Lee JH, Lee HH, Whang KY, You S. Secretory Profiles and Wound Healing Effects of Human Amniotic Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev, 19, 2010, s. 887–902. 56. Zagoura DS, Roubelakis MG, Bitsika V, Trohatou O, Pappa KI, Kapelouzou A, Antsaklis A, Anagnou NP. Therapeutic potential of a distinct population of human amniotic fluid mesenchymal stem cells and their secreted molecules in mice with acute hepatic failure. Gut, 61, 2012, s. 894–906. 57. Zani A, Cananzi M, Fascetti-Leon F, Lauriti G, Smith VV, Bollini S, Ghionzoli M, D’Arrigo A, Pozzobon M, Piccoli M, Hicks A, Wells J, Siow B, Sebire NJ, Bishop C, Leon A, Atala A, Lythgoe MF, Pierro A, Eaton S, De Coppi P. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut, 63, 2014, s. 300–309. 58. Zhou B-R, Xu Y, Guo S-L, Xu Y, Wang Y, Zhu F, Permatasari F, Wu D, Yin Z-Q, Luo D. The Effect of Conditioned Media of Adipose-Derived Stem Cells on Wound Healing after Ablative Fractional Carbon Dioxide Laser Resurfacing. Biomed Res Int, 2013, s. 9. 59. Zhou Y, Xu H, Xu W, Wang B, Wu H, Tao Y, Zhang B, Wang M, Mao F, Yan Y, Gao S, Gu H, Zhu W, Qian H. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Res Ther, 4, 2013, s. 34.
31
