KOMBINASI EKSTRAK ETANOL RIMPANG JAHE GAJAH DENGAN Zn SEBAGAI ANTIATEROMA
PRIYANTO
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi dengan judul Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Gajah dengan Zn sebagai Antiateroma adalah karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juni 2013
Priyanto B161090071
PRIYANTO. The Combinations Ethanol Extract of the Ginger with Zn as Antiatheroma. Supervised by AGIK SUPRAYOGI, NASTITI KUSUMORINI, and DEWI RATIH AGUNGPRIYONO
ABSTRACT Hypercholesterolemia and LDL oxidation are the major factors of atherosclerosis. The ethanol extract of the ginger (EEG) and Zn each posses effect reduce cholesterol and antioxidant. These research combined EEG and Zn as antihypercholesterolemia and antioxidant to prevent atheroma in New Zealand white fed rabbits atherogenic diet and hypercholesterolemia rabbits. Twenty eight male rabbits were divided into seven groups. For 6 weeks, group 1 was fed with a normal diet and group 3 was fed with an atherogenic diet. Beside the atherogenic diet, group 2,4,5,6, and 7 were also treated by supplementary treatment. Second phase research, 24 male hypercholesterolemia rabbits were divided into 6 groups. For 6 weeks, group 1 was fed with a normal diet. Fed rabbits atherogenic diet group 2,4,5,6, and 7 and hypercholesterolemia rabbits group 2,3,4,5, and 6 were treated by supplementary treatment, which are Zn 6.67 mg/kg, EEG 200 mg/kg, combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg, combination EEG 100 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg, and atorvastatin (positive control) 1.9 mg/kb BW per day. Combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg and combination EEG 100 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg treatment impeded the increase of total cholesterol, LDL, and prevent atheroma equal to the positive control. Based on the ability to restrain the increase of MDA (lipid peroxidation) in fed rabbits atherogenic diet the treatment with combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg resulted higher than positive control or the other treatment. Based on reduced plaque atheroma in hypercholesterolemia rabbits, combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/ kg treatment also the best result. These researches concluded that combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg BW per day treatment exhibited the highest atheroma prevention effect in fed rabbits atherogenic diet or hypercholesterolemia rabbits as compared to the positive control or the other treatments. Keywords: hypercholesterolemia, atheroma, ethanol extract of ginger (EEG), lipid peroxidation, and atherogenic diet.
RINGKASAN PRIYANTO. Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Gajah dengan Zn sebagai Antiateroma. Dibimbing oleh AGIK SUPRAYOGI, NASTITI KUSUMORINI, dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Hiperkolesterolemia adalah suatu kondisi terjadinya kenaikkan kadar kolesterol plasma darah ≥ 250 mg/dL dan merupakan faktor risiko utama terjadinya aterosklerosis. Pengobatan pasien hiperkolesterolemia bertujuan mengurangi dan menjaga agar kadar kolesterol total dan LDL tetap optimal sehingga bermanfaat mencegah aterosklerosis. Kadar LDL merupakan parameter yang lebih tepat untuk memprediksi terjadinya aterosklerosis dibandingkan dengan kadar kolesterol total. LDL teroksidasi dapat menyebabkan stres oksidatif, disfungsi endotel, inflamasi, koagulasi, hipofibrinolisis, dan aktivasi platelet yang semuanya dapat menyebabkan aterosklerosis. Aterosklerosis menyebabkan lumen pembuluh darah menyempit, elastisitas berkurang, aliran darah tidak normal, dan suplai oksigen ke jaringan berkurang. Obat antihiperkolesterolemia sudah banyak tersedia, antara lain golongan resin, statin, fibrat, niasin, dan probukol. Obat antihiperkolesterolemia yang ada umumnya tidak efektif untuk hiperkolesterolemia familial (tipe IIa) dan hiperkolesterolemia familial kombinasi (tipe III). Hiperkolesterolemia familial adalah hiperkolesterolemia yang disebabkan oleh berkurang atau tidak adanya reseptor LDL, sedangkan hiperkolesterolemia familial kombinasi karena adanya polimorfisme gen. Baik hiperkolesterolemia familial atau familial kombinasi menyebabkan kliren LDL berkurang sehingga kadarnya meningkat. Pencegahan aterosklerosis pada hiperkolesterolemia familial atau familial kombinasi akan lebih efektif dengan obat yang bekerja menghambat absorpsi kolesterol dan antioksidan. Fakta menunjukkan bahwa terapi untuk menurunkan kadar kolesterol total dan LDL menggunakan obat yang sudah ada sampai sekarang hasilnya belum memuaskan. Hasil survei Centralized pan-Asia survey on the under treatment of hypercholesterolemia (CEPHUS) yang dilakukan di delapan negara Asia, termasuk Indonesia, memberikan gambaran sulitnya menurunkan kadar kolesterol total dan LDL. Survei yang melibatkan 7.281 pasien menunjukkan 49,1% pasien berhasil menurunkan kadar kolesterol total dan LDL sampai normal, dan khusus untuk pasien dari Indonesia keberhasilannya hanya 31,3%. Banyak faktor penyebab kegagalan terapi, antara lain kepatuhan (compliance), dosis yang tidak tepat, pengetahuan tenaga kesehatan dan pasien, efektivitas, dan adanya efek samping obat. Untuk meningkatkan keberhasilan terapi perlu dicari obat baru sebagai alternatif dari obat yang sudah ada. Pencarian obat baru melalui jalur skrining farmakologi dan pemurnian senyawa yang diduga efektif sebagai obat ternyata banyak mengalami kegagalan. Pemurnian senyawa yang terdapat dalam tanaman tidak selalu tepat dilakukan dalam mencari obat baru karena mengabaikan aspek bioaktif senyawa lain, sinergisme, dan sifat komplementer antarkomponen. Adanya sifat sinergisme dan komplementer antarkomponen dalam tanaman menjadikan peluang senyawasenyawa dalam bentuk ekstrak sebagai obat masih terbuka lebar. Kendala
penggunaan ekstrak sebagai obat, antara lain adalah dosisnya yang relatif besar, mahal, tidak praktis, dan konsistensi efek yang rendah. Berdasarkan hipótesis mekanisme terjadinya aterosklerosis, obat yang efektif sebagai antiaterosklerosis minimal harus mempunyai dua aktivitas, yaitu menurunkan kadar kolesterol dan antioksidan. Antiaterosklerosis akan lebih efektif jika dapat mengurangi faktor risiko yang lain, seperti hipertensi, diabetes mellitus, dan antiinflamasi. Obat-obat yang tersedia kebanyakan hanya mempunyai satu efek, yaitu mengurangi kadar kolesterol atau sebagai antioksidan. Berbagai penelitian membuktikan bahwa ekstrak etanol rimpang jahe (EERJ) dan Zn potensial sebagai antiaterosklerosis karena keduanya dapat menurunkan kadar kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi, dan EERJ juga dapat menurunkan kadar gula darah. Dosis EERJ yang efektif untuk menurunkan kolesterol dan antioksidan pada hewan coba cukup besar dan jika dikonversi ke manusia dengan BB 70 kg adalah 2840-7100 mg per hari sehingga tidak aplikatif dan tidak ekonomis untuk terapi. Efek EERJ dalam menurunkan kadar kolesterol melalui berbagai mekanisme, antara lain aktivasi kolesterol-7α-hidroksilase hepatik, suatu rate limiting enzyme pada biosintesis asam empedu, meningkatkan reseptor LDL, dan menurunkan HMG-CoA reduktase, suatu enzim untuk sintesis kolesterol. Efek antioksidan EERJ karena mengandung senyawa polifenol yang berfungsi sebagai scavenger radikal bebas. Peningkatan aktivitas kolesterol-7α-hidroksilase hepatik juga meningkatkan radikal bebas, akibatnya efektivitas EERJ dalam mencegah aterosklerosis dapat berkurang jika tubuh kekurangan antioksidan. Untuk meningkatkan efektivitas EERJ dalam mencegah aterosklerosis diperlukan penambahan antioksidan. Pada penelitian ini untuk meningkatkan efektivitas EERJ ditambahkan Zn karena Zn bersifat antioksidan, menurunkan kolesterol, antiinflamasi, aman pada pemakaian jangka panjang, murah, dan mudah didapat. Selain itu, kondisi hiperlipidemia dapat menyebabkan defisien Zn yang sangat diperlukan untuk stabilisasi membran sel. Kombinasi EERJ dengan Zn kemungkinan akan sinergis dalam mencegah aterosklerosis. Pembuktian efektivitas kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antiateroma telah dilakukan pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan kelinci hiperkolesterolemia. Kelinci dipilih sebagai hewan coba karena mudah mengalami hiperkolesterolemia yang cepat diikuti ateroma yang sama seperti ateroma pada manusia. Ateroma dapat sebagai indikator terbentuknya aterosklerosis. Perlakuan yang diberikan adalah Zn 6,67 mg/kg, EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg dengan kontrol positif atorvastatin 1,9 mg/kg BB per hari. Parameter ateroma yang diukur adalah kadar kolesterol total, LDL, luas dan tebal plak ateroma, kadar molonaldialdehid (MDA), dan aktivitas superoxide dismutase (SOD). Pada penelitian ini senyawa uji dan atorvastatin diberikan selama 6 minggu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan perlakuan EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, dan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari dapat menghambat peningkatan kolesterol total, LDL, dan mencegah akumulasi lemak/plak ateroma dalam tunika intima sama dengan atorvastatin (p>0,05). Kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg dalam
menghambat peningkatan kolesterol total, LDL, dan luas plak aterosklerosis mempunyai kecenderungan lebih baik dibandingkan perlakuan yang lain. Kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg sebagai antioksidan dalam menghambat peroksidasi lipid (MDA) pada kelinci yang diberi diet aterogenik lebih baik dibandingkan atorvastatin dan perlakuan lain (p<0,05). Pada kelinci hiperkolesterolemia perlakuan EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg efeknya sama dengan atorvastatin dalam menurunkan kadar kolesterol total, LDL, dan luas plak ateroma. Akan tetapi, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg memberikan kecenderungan hasil yang lebih baik dalam menurunkan LDL dan luas plak ateroma. Pada kelinci hiperkolesterolemia, efek antioksidan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg lebih baik dari atorvastatin (p<0,05) dan sama dengan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg (p>0,05). Kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg dalam meningkatkan SOD sama dengan perlakuan EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan atorvastatin, baik pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun kelinci hiperkolesterolemia. Dapat disimpulkan bahwa kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg lebih baik dibandingkan perlakuan lain dan atorvastatin dalam mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun untuk pengobatan ateroma pada kelinci hiperkolesterolemia. Efek antiateroma kombinasi EERJ dengan Zn terjadi karena keduanya memiliki efek terhadap penurunan kadar kolesterol, antioksidan, dan antiiflamasi. Kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antiateroma bersifat sinergis pada dosisdosis tertentu karena kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg lebih baik dibandingkan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg atau peningkatan dosis tidak diikuti dengan peningkatan respon, baik pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun kelinci hiperkolesterolemia. Kata kunci: hiperkolesterolemia, atorvastatin, antiateroma, antioksidan, dan malonaldialdehid (MDA).
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2013
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
KOMBINASI EKSTRAK ETANOL RIMPANG JAHE GAJAH DENGAN Zn SEBAGAI ANTIATEROMA
PRIYANTO
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Faal dan Khasiat Obat
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PENGUJI LUAR KOMISI: Ujian Tertutup: 1. Prof. Wasmen Manalu, PhD 2. Dr. drh. Eva Harlina, M.Si
Ujian Terbuka: 1. Prof. Dr. Dyah Iswantini Pradono 2. Dr. dr. Nafrialdi, Sp. PD
Judul Disertasi Nama NIM Program Studi
: Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Gajah dengan Zn sebagai Antiateroma Priyanto B 161090071 Ilmu Faal dan Khasiat Obat
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Drh. Agik Suprayogi, M. Sc, AIF.
Ketua
Dr. Nastiti Kusumorini, AIF. Anggota
drh. Dewi Ratih A, PhD., APVet. Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Faal dan Khasiat Obat IPB
~---------~
~.
Prof. Dr. Drh. Agik Suprayogi, M. Sc, AIF.
Tanggal Ujian: 8 Juli 2013
Tanggal Lulus:
2 9 JUl 2D13
Judul Disertasi Nama NIM Program Studi
: Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Gajah dengan Zn sebagai Antiateroma : Priyanto : B 161090071 : Ilmu Faal dan Khasiat Obat
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Drh. Agik Suprayogi, M. Sc, AIF. Ketua
Dr. Nastiti Kusumorini, AIF. Anggota
drh. Dewi Ratih A, PhD., APVet. Anggota
Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Faal dan Khasiat Obat IPB
Prof. Dr. Drh. Agik Suprayogi, M. Sc, AIF.
Tanggal Ujian: 8 Juli 2013
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. H. Dahrul Syah, M. Sc. Agr
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT karena berkat rahmat dan karunia-Nya
penelitian dan penulisan disertasi ini dapat diselesaikan.
Dengan ridho-Nya penelitian dan penulisan disertasi dengan judul “Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Gajah dengan Zn sebagai Antiateroma” dapat selesai dan disetujui oleh Komisi Pembimbing. Penelitian dan penulisan disertasi disusun guna memenuhi persyaratan untuk memperoleh
gelar doktor pada Sekolah Pascasarjana IPB. Penelitian dan
penulisan disertasi ini tidak lepas dari bimbingan dan dorongan berbagai pihak, terutama Komisi Pembimbing. Untuk itu ucapan terima kasih dan hormat saya kepada Bapak Prof. Dr. Drh. Agik Suprayogi, M. Sc, AIF (Ketua Komisi Pembimbing), Ibu Dr. Nastiti Kusumorini, AIF, dan Ibu drh. Dewi Ratih A, PhD., APVet (Anggota Komisi Pembimbing) atas dorongan, arahan, dan kerja kerasnya dalam membimbing penelitian dan penulisan disertasi ini. Selain itu, saya juga mengucapkan terima kasih kepada Dekan Sekolah Pascasarjana IPB, Sekretaris Program Sekolah Pascasarjana IPB, Dekan FKH IPB, dan Ketua Program Studi Ilmu Faal dan Khasiat Obat IPB atas izin dan kesempatan yang diberikan kepada saya untuk dapat menempuh studi Pascasarjana di Program Studi Ilmu Faal dan Khasiat Obat IPB. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada karyawan dan pimpinan laboratorium di lingkungan FKH IPB, Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA, Balitnak Ciawi Bogor atas segala kemudahan dalam penggunaan alat-alat penelitian, bantuan penyediaan material dan waktu yang disediakan untuk membantu jalannya penelitian sehingga disertasi ini dapat selesai. Ucapan terima kasih dan penghargaan penulis persembahkan untuk istri, anak-anak (Farhana, Farhan, Faricha), dan keluarga besar atas dukungan dan doa yang tiada henti selama saya menempuh pendidikan di Pascasarjana IPB. Dengan segala kerendahan hati, saya menyadari bahwa masih banyak kelemahan dan kekurangan dalam penulisan disertasi ini. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan dan penyempurnaan disertasi ini. Harapan saya, semoga karya tulis ini dapat
bermanfat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, kesehatan, serta kemaslahatan umat. Amin.
Bogor, Juni 2013 Priyanto
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sragen Jawa Tengah pada tanggal 12 Juli 1963 sebagai anak ke-3 dari pasangan Citro Dimejo dan Widjiati. Pendidikan sarjana dan apoteker di Fakultas Farmasi UGM dan lulus tahun 1989. Pada tahun 1996 penulis diterima di Program Studi Biomedis peminatan Farmakologi Pascasarjana UI dan menamatkannya pada tahun 1999. Kesempatan melanjutkan ke program doktor pada prodi Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat di Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun 2009. Sebelum menempuh pendidikan doktoral, penulis bekerja sebagai anggota Polri dan ditempatkan di Mabes Polri selama 17 tahun dan pensiun dini tahun 2006. Pada tahun 2006-2008 bekerja sebagai manajer operational PT. Pharmametric Lab (Kalbe Farma group). Pada tahun 2009 sampai sekarang bekerja sebagai dosen di Fakultas Farmasi dan Sains dan pekerja lepas pada PT. Pertamina Medical dan PT. Indofarma. Selama mengikuti program S-3, penulis menjadi anggota Ikatan Farmakologi Indonesia dan Ketua Forum Pendidikan Farmasi Muhammadiyah pada Asosiasi Pendidikan Kedokteran dan Kesehatan Muhammadiyah (APKKM). Karya ilmiah berupa buku dengan judul: Memantapkan Farmakologi dan Terapi Melalui 600 Soal, Jawab, dan Pembahasan telah diterbitkan oleh Leskonfi. Bab 3 dari disertasi berjudul Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) dengan Zn Sebagai Antiateroma pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik, dibagi dalam 2 makalah dan telah diterbitkan oleh Jurnal Bahan Alam Indonesia dan Farmasains. Bab 4 berjudul: Kombinasi Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) dengan Zn Sebagai Antiateroma pada Kelinci Hiperkolesterolemia, telah dikirim ke International Journal Pharmacotherapy and Clinical Science dan dalam tahap revisi ke-2.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL
xxiii
DAFTAR GAMBAR
xxiv
DAFTAR LAMPIRAN
xxv
BAB 1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Rumusan Masalah
6
Tujuan Penelitian
7
Manfaat Penelitian
7
Hipotesis
7
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
9
Aterosklerosis
9
Transpor Lemak dan Kolesterol
15
Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (EERJ)
18
Zink (Zn)
20
Kombinasi EERJ dengan Zn dalam Mencegah Aterosklerosis
23
Atorvastatin
24
Hewan Coba untuk Penelitian Aterosklerosis
25
BAB 3 KOMBINASI
EKSTRAK
(Zingiber
Roscoe)
officinale
ANTIATEROMA
PADA
ETANOL RIMPANG JAHE DENGAN
KELINCI
YANG
Zn
29
SEBAGAI
DIBERI
DIET
ATEROGENIK Abstrak
29
Pendahuluan
30
Bahan dan Metode
33
Hasil dan Pembahasan
39
Simpulan dan Saran
53
Daftar Pustaka
54
BAB 4 KOMBINASI
EKSTRAK
(Zingiber
Roscoe)
officinale
ETANOL RIMPANG JAHE DENGAN
Zn
SEBAGAI
ANTIATEROMA PADA KELINCI HIPERKOLESTEROLEMIA
57
Abstrak
57
Pendahuluan
58
Bahan dan Metode
61
Hasil dan Pembahasan
64
Simpulan dan Saran
71
Daftar Pustaka
73
BAB 5 PEMBAHASAN UMUM
75
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik
75
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci Hiperkolesterolemia
78
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan
80
pada Kelinci Hiperkolesterolemia BAB 6 SIMPULAN DAN SARAN
82
DAFTAR PUSTAKA
83
DAFTAR TABEL No.
Halaman
2.1
Senyawa Aktif yang Terdapat dalam Jahe dan Efeknya
19
2.2
Konsentrasi LDL pada Berbagai Spesies Hewan
27
3.1
Skema Penelitian Antiateroma pada Kelinci yang Diberi Diet
36
Aterogenik 3.2
Rerata
Lemak Feses (%) pada Minggu ke Tiga Perlakuan dan
40
Luas Plak Ateroma Tunika Intima (%) dengan Pewarnaan Oil Red O 3.3
Rerata Kenaikkan Kadar KT dan LDL (%)
pada Kelinci yang
43
Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan 3.4
Rerata Kenaikkan Bobot Badan Kelinci (%) Setelah Perlakuan
45
3.5
Kadar MDA (nmol/mL) dan Aktivitas SOD (Unit/mg protein)
49
pada Kelinci karena Perlakuan 4.1
Skema Penelitian Antiateroma pada Kelinci Hiperkolesterolemia
63
4.2
Rerata Penurunan Kadar Kolesterol Total (KT) dan LDL (%)
65
pada Kelinci Hiperkolesterolemia Setelah 6 Minggu Perlakuan 4.3
Rerata Luas Plak Ateroma Tunika Intima (%) pada Kelinci
66
Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 6 Minggu 4.4
Kadar MDA (nmol/ml) dan Aktivitas SOD (Unit/mg Protein) Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan
70
DAFTAR GAMBAR No.
Halaman
2.1
Perkembangan Plak Aterosklerosis
2.2
Kerusakan Endotel yang Menyebabkan Aterosklerosis
11
2.3
Peran Akumulasi LDL pada Aterosklerosis
12
2.4
Aterosklerosis karena Modifikasi Oksidatif
14
2.5
Struktuk Kimia Senyawa Aktif Zingiber officinale Roscoe
19
2.6
Mekanisme
Protektif
Zn
9
δ-Aminolivulinate
pada
Acid
21
Dehydratase Sulfhidryl 2.7
Mekanisme EERJ dan Zn dalam Menghambat Aterosklerosis
23
2.8
Struktur Kimia Atorvastatin
24
3.1
Histologi Aorta Normal (Pewarnaan HE)
46
3.2
Plak Aorta dengan Pewarnaan HE pada Hewan Coba yang
47
Diberi Diet Aterogenik 3.3
Plak Aorta yang Terjadi pada Hewan Coba yang Diberi Diet
47
Aterogenik dan Perlakuan Zn 3.4
Reaksi antara MDA dengan TBA
49
4.1
Histologi Aorta Normal dengan Permukaan Kasar
67
4.2
Plak Ateroma
68
pada Kelinci Hiperkolesterolemia yang
Mendapatkan Perlakuan Zn 4.3
Plak
Ateroma
pada
Kelinci
Hiperkolesterolemia
yang
69
Kurva Kalibrasi Hubungan antara Konsentrasi TEP dan
95
Mendapatkan Perlakuan Diet Standar 5
Absorbans pada λ 532 nm
DAFTAR LAMPIRAN
No.
Halaman
1
Skema Pembuatan Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (EERJ)
89
2
Penetapan Kadar Air EERJ (PAU IPB)
90
3
Penetapan Kadar Lemak Total dalam Feses
91
4
Penetapan Kadar Kolesterol Total dan LDL (CHOD-PAP)
92
5
Persiapan Sampel untuk Pengukuran MDA dan Aktivitas SOD
93
6
Pengukuran Kadar MDA
94
7
Pengukuran Aktivitas SOD
97
8
Penentuan Luas Plak Ateroma di Aorta
98
9
Perhitungan Rendemen dan Kadar Abu EERJ
99
10
Perhitungan Volume Cekok Senyawa Uji dan Pembanding
100
11
Perhitungan Jumlah Kuning Telur
102
dan Minyak Kelapa untuk
Membuat Pakan Aterogenik 12
Komposisi Pakan Standar, Pakan Aterogenik, dan Nilai Kalori
103
13
Gambar Hewan Coba
104
14
Bahan Penelitian: Rimpang Jahe, EERJ, dan Pakan
105
15
Gambar Beberapa Alat untuk Penelitian
106
16
Tabel Konversi Dosis pada Berbagai Jenis Hewan (Paget dan
107
Barnes) 17
Tabel Kadar Lemak Feses (%)Kelinci yang Diberi Diet
108
Aterogenik pada Minggu ke-3 Perlakuan 18
Tabel Kenaikkan Kadar Kolesterol Total (%) pada Kelinci yang
109
Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan 19
Tabel Kenaikkan Kadar LDL (%) pada Kelinci yang Diberi Diet
110
Aterogenik dan Perlakuan 20
Bio-imaging Rerata Luas Plak Ateroma dalam Tunika Intima (%)
111
Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan 21
Tabel Kadar MDA (nmol/mL) pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan
112
22
Tabel Aktivitas SOD (unit/mg Protein) Kelinci yang Diberi Diet
113
Aterogenik dan Perlakuan 23
Tabel Kenaikkan BB (%) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan
114
Perlakuan 24
Tabel Penurunan
Kolesterol Total (%) pada Kelinci
115
Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 25
Tabel
Penurunan
Kadar
LDL
(%)
pada
Kelinci
116
Bio-imaging Rerata Luas Plak dalam Tunika Intima (%) Kelinci
117
Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 26
Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 27
Tabel Kadar MDA
(nmol/mL) Kelinci Hiperkolesterolemia
118
karena Perlakuan 28
Tabel
Aktivitas
SOD
(unit/mg
Protein)
pada
Kelinci
119
Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 29
Hasil Identifikasi Tanaman Zingiber officinale Roscoe
120
BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang
Hiperkolesterolemia adalah suatu kondisi terjadinya kenaikkan kadar kolesterol plasma lebih dari 250 mg/dL dan merupakan faktor risiko utama terjadinya aterosklerosis dan penyakit jantung koroner (PJK). Terapi pada pasien hiperkolesterolemia bertujuan untuk mengurangi dan menjaga agar kolesterol total dan low-density lipoprotein (LDL) berada pada kadar optimal. Kadar kolesterol total optimal adalah < 150 mg/dL (3,88 mmol/L) dan LDL < 100 mg/dL (2,58 mmol/L) (Kimble et al. 2007)). Berdasarkan penelitian, 12,4% penduduk
Indonesia
yang
bermukim
di
kota
besar
mengalami
hiperkolesterolemia. World Health Organization (WHO) memprediksi bahwa jumlah penderita PJK di negara berkembang, seperti Indonesia, akan mengalami peningkatan sebesar 137% pada tahun 2020, sedangkan di negara-negara maju hanya 48% (Anonim 2012). Kondisi tersebut terjadi kemungkinan karena perubahan gaya hidup, terutama mengkonsumsi makanan tinggi kolesterol yang tidak diikuti dengan pengetahuan yang cukup pada sebagian besar masyarakat di negara berkembang. Kadar LDL merupakan parameter yang lebih baik untuk memprediksi kemungkinan timbulnya PJK dibandingkan kolesterol total (Kimble et al. 2007). PJK merupakan penyebab kematian utama di dunia. Oleh karena itu, baik pedoman nasional maupun internasional tentang terapi hiperkolesterolemia menekankan pentingnya terapi menurunkan kadar LDL hingga mencapai kadar optimal. Kadar LDL yang tinggi akan mudah teroksidasi dan akan mempercepat terjadinya aterosklerosis. LDL teroksidasi dapat menyebabkan stres oksidatif, disfungsi endotel, inflamasi, koagulasi, hipofibrinolisis, dan aktivasi platelet yang semuanya merupakan faktor risiko aterosklerosis (Shen 2006).
Aterosklerosis
adalah suatu penyakit pada arteri sedang dan besar yang ditandai dengan disfungsi endotel, inflamasi vaskuler, penumpukan lemak, dan kalsium pada tunika intima pembuluh darah (Price dan Wilson 2006). Aterosklerosis menyebabkan lumen pembuluh darah menyempit, elastisitas berkurang, respons
2
perbaikan vaskular yang berlebihan, obstruksi luminal akut atau kronis, aliran darah tidak normal, dan suplai oksigen ke jaringan berkurang (Madhumati et al. 2006). Untuk mengurangi angka kematian akibat aterosklerosis, upaya yang dapat dilakukan di antaranya ialah mengurangi kadar LDL dan mencegahnya teroksidasi. Usaha-usaha yang telah dilakukan untuk menurunkan kadar kolesterol di antaranya adalah perbaikan pola hidup, pola konsumsi makanan, dan pemberian obat, baik alamiah atau sintetik. Obat antihiperkolesterolemia yang sudah tersedia antara lain, golongan resin, statin, fibrat, niasin, dan probukol. Efektivitas obat golongan statin yang diklaim berfungsi sebagai antioksidan tidak sepenuhnya benar. Obat golongan statin yang terdiri atas pravastatin, simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin hanya atorvastatin yang bersifat antioksidan (Singh and Jialal 2006). Bahkan pravastatin dapat menurunkan HDL sehingga efektivitasnya mencegah aterosklerosis akan berkurang (Welson 2006). Uji klinik membuktikan bahwa atorvastatin dapat menurunkan kadar kolesterol dan bersifat antioksidan sehingga dapat mencegah aterosklerosis lebih efektif dibandingkan yang lain. Penggunaan atorvastatin dalam jangka panjang untuk mencegah aterosklerosis dapat menimbulkan miopati, masih terlalu mahal, dan hanya sesuai untuk penderita hiperkolesterolemia. Atorvastatin dosis 20-80 mg/kg BB pada tikus menyebabkan miopati dan bersifat prooksidan karena menurunkan aktivitas superoxide dismutase
(SOD), katalase, meningkatkan
malonaldialdehid (MDA) (Heeba and Abdelghany 2010). Berdasarkan uraian di atas, perlu dicari obat alternatif untuk mencegah aterosklerosis yang efektif menurunkan kolesterol, bersifat antioksidan, dan antiinflamasi yang aman dan murah. Sejak tahun 2002, munculnya obat baru dari senyawa tunggal atau senyawa murni (single entity), baik dari senyawa sintetik maupun hasil isolasi dari bahan alam sangat sedikit. Sebanyak 500.000 senyawa murni atau yang dimurnikan ternyata tidak menjadi obat baru. Kegagalan senyawa murni atau senyawa tunggal sebagai obat diduga karena mengabaikan aspek bioaktif antarsenyawa, sinergisme, dan sifat komplementer antarkomponen dalam tumbuhan (Saifudin 2011). Kegagalan senyawa tunggal hasil isolasi dan pemurnian sebagai obat
3
menyebabkan peluang ekstrak sebagai sumber obat masih terbuka lebar. Kendala penggunaan ekstrak sebagai bahan
obat, antara lain, dosisnya relatif besar
sehingga mahal dan tidak praktis serta konsistensi efek yang sulit dijaga. Untuk mencegah timbulnya aterosklerosis diperlukan menjaga kadar kolesterol
total
dan
LDL
tetap
optimal,
terutama
bagi
penderita
hiperkolesterolemia. Fakta menunjukkan bahwa hasil terapi menggunakan obatobat yang sudah ada, seperti statin, fibrat, dan probukol untuk menurunkan kadar kolesterol total dan LDL masih banyak mengalami kegagalan. Hasil survei dari Centralized pan-Asia survey on the under treatment of hypercholesterolemia (CEPHUS) yang dilakukan di delapan negara Asia, termasuk Indonesia, memberikan bukti sulitnya menurunkan kadar kolesterol total dan LDL pada penderita hiperkolesterolemia. Survei yang melibatkan 7.281 penderita hiperkolesterolemia yang sedang melakukan pengobatan ternyata hanya 49,1% yang berhasil dan sisanya 50,9% gagal. Khusus pasien dari Indonesia, hanya 31,3% yang berhasil dan 68,7% gagal (Park et al. 2012). Banyak faktor yang menyebabkan kegagalan terapi, antara lain kepatuhan (compliance), dosis yang tidak tepat, pengetahuan tenaga kesehatan dan pasien yang kurang memadai, efektivitas, dan efek samping obat yang timbul. Obat-obat antihiperkolesterolemia yang ada juga kurang efektif untuk hiperkolesterolemia familial (tipe IIa) dan hiperkolesterolemia familial kombinasi (tipe III). Pada hiperkolesterolemia familial kenaikkan kolesterol terjadi karena berkurang atau tidak adanya reseptor LDL sedangkan pada hiperkolesterolemia familial kombinasi karena adanya polimorfisme gen yang menyebabkan kliren LDL berkurang (Stapleton et al. 2010). Pada tipe hiperkolesterolemia di atas, pencegahan aterosklerosis akan lebih efektif
dilakukan dengan menghambat
absorpsi lemak dan kolesterol serta pemberian obat yang bersifat antioksidan. Berbagai penelitian membuktikan bahwa baik ekstrak etanol rimpang jahe (EERJ) (Zingiber officinale Roscoe) maupun Zink (Zn) berpotensi sebagai antiaterosklerosis. EERJ dosis 250 µg/hari pada mencit yang defisien apolipoprotein E dapat mengurangi luas lesi 44%, menurunkan trigliserida 27%, dan menurunkan kadar kolesterol 29% dibandingkan kontrol normal. EERJ dapat menurunkan LDL teroksidasi sebanyak 62% dan menghambat agregrasi LDL
4
sebanyak 33% (Fuhrman et al. 2000). EERJ dosis 100-400 mg/kg yang diberikan pada tikus diet tinggi kolesterol selama enam minggu dapat menurunkan kadar glukosa, kolesterol total, LDL, trigliserida, dan asam lemak bebas secara signifikan (Nammi et al. 2009). Pada penelitian lain, EERJ dosis 200 mg/kg BB yang diberikan selama 20 hari secara signifikan menurunkan glukosa, kolesterol total, LDL, dan menaikkan HDL pada tikus diabetik karena streptozotosin (Bhandari et al. 2005). EERJ mengandung senyawa polifenol, seperti gingerol dan shogaol, yang efektif sebagai penurun kolesterol, antioksidan, antiinflamasi, dan antidiabetes (Kemper 1999; Yiming Li et al. 2012). EERJ mengandung gingerol dan analognya sebanyak 40 mg/g atau sebesar 4% (Barnes et al. 2007) EERJ
0,5–2 mg/mL dapat melindungi lebih dari 92% homogenat otak,
homogenat hepar, dan mitokondria hepar
dari stres oksidatif karena radikal
hidroksil (OH*-) (Ajith 2010). Ekstrak diklormetan rimpang jahe 430 µg/mL dapat menghambat reaksi pembentukan peroksidasi lipid (LOOH) atau penghambatan pembentukan konjugat diena dan pembentukan malonaldialdehid (MDA) yang lebih baik dibandingkan dengan vitamin E. Suplementasi EERJ pada isolat
LDL yang diinkubasi bersama makrofag dapat menghambat
akumulasi kolesterol ester pada makrofag (Septiana 2002). Berkurangnya akumulasi kolesterol ester kemungkinan disebabkan oleh hambatan oksidasi LDL oleh EERJ sehingga tidak mudah difagositosis oleh makrofag. Pemberian dekoh (rebusan) rimpang jahe 0,2 mL/kg BB pada tikus albino diet tinggi kolesterol dapat menurunkan kadar kolesterol sebanyak 8,6 mg/dL dan juga menurunkan gula darah secara bermakna (Agoreyo et al. 2008). EERJ yang diberikan selama 6 minggu dapat menurunkan kadar kolesterol, gula darah, peroksidasi lipid, dan menghambat perkembangan aterosklerosis pada tikus yang diinduksi dengan aloksan (Elshater et al. 2009). Pada penelitian kinetika senyawa aktif EERJ seperti 6-gingerol, 8gingerol, 10-gingerol, dan 6-shogaol yang diberikan per oral dapat diabsorpsi dan keberadaannya dapat dideteksi di dalam tubuh dalam bentuk terkonjungasi dengan glukoronat dan sulfat (Zick
et al. 2008). Hasil penelitian kinetika
tersebut dapat sebagai dasar bahwa EERJ dapat diberikan melalui oral.
5
Zn telah terbukti sebagai antioksidan, menurunkan kadar kolesterol, dan trigliserida pada penelitian yang menggunakan tikus knock-out (LDL-R-/-) yang diberi diet tinggi lemak. Pada tikus knock-out (LDL-R-/-), defisien Zn menyebabkan kenaikkan kadar kolesterol, trigliserida, dan glutation reduktase (GSSH). Defisien Zn juga meningkatkan
marker inflamasi, seperti nuclear
factor-kB dan vascular cell adhesion molecule-1 (NF-kB, VCAM-1) secara signifikan dibandingkan dengan
kontrol dan kelompok yang mendapatkan
suplementasi Zn (Reiterer et al. 2005). Zn karbonat yang ditambahkan pada diet (1 g/kg) selama 8 minggu dapat menurunkan aterogenesis pada kelinci yang diberi diet tinggi kolesterol (Ren et al. 2006). Zn dapat melindungi kerusakan seluler dan melindungi gugus sulfihidril (-SH) dari radikal bebas (Zelikoff and Thomas 1998). Uji klinik suplementasi Zn sebagai antioksidan selama 7 tahun tidak menyebabkan metabolic syndromes (Czernichow et al. 2009) sehingga aman untuk terapi atau pencegahan aterosklerosis yang memerlukan pengobatan jangka panjang. Efek EERJ dalam menurunkan kolesterol melalui berbagai mekanisme antara lain meningkatkan aktivasi
kolesterol-7α-hidroksilase hepatik, suatu rate
limiting enzyme pada biosintesis asam empedu, meningkatkan reseptor LDL, dan menghambat HMG CoA reduktase (Fuhrman et al. 2000; Yiming Li et al. 2012; Sanghal et al. 2012). Peningkatan aktivitas kolesterol-7α-hidroksilase hepatik juga akan meningkatkan radikal bebas (Murray et al. 2003). Peningkatan radikal bebas dapat mengurangi efektivitas EERJ dalam mencegah aterosklerosis jika tubuh kekurangan antioksidan. Untuk meningkatkan efektivitas EERJ dalam mencegah
aterosklerosis diperlukan penambahan
antioksidan.
Zn dapat
ditambahkan untuk meningkatkan efek EERJ dalam mencegah aterosklerosis karena selain bersifat antioksidan, menurunkan kolesterol, dan antiinflamasi, selain itu, pada kondisi hiperkolesterol juga terjadi defisien Zn (Ramalingam and Subrahmayam 2012). Kombinasi EERJ dengan Zn kemungkinan akan sinergis dalam mencegah aterosklerosis. Atas dasar berbagai alasan di atas maka tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan efektivitas dan sinergisme kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antiateroma
pada
kelinci
yang
diberi
diet
tinggi
kolesterol
dan
6
hiperkolesterolemia. Selain itu, penelitian ini juga ditujukan untuk mencari prototipe obat yang berfungsi untuk pencegahan dan pengobatan aterosklerosis yang sampai sekarang belum tersedia.
Rumusan Masalah Penyakit jantung koroner (PJK) merupakan penyebab kematian utama dan kecenderungannya terus meningkat di Indonesia. Untuk mengurangi kematian akibat PJK yang disebabkan oleh aterosklerosis dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu menurunkan kadar kolesterol dan mencegah oksidasi LDL. Menurunkan kadar kolesterol 1% dapat menurunkan risiko kemungkinan terkena PJK sebanyak 2%. Aterosklerosis dapat timbul pada orang dengan kadar kolesterol yang belum mencapai
hiperkolesterolemia tetapi mengalami stres oksidatif,
dengan demikian mencegah oksidasi LDL secepatnya memungkinkan untuk mencegah aterosklerosis. Obat yang berefek sebagai antihiperkolesterolemia dan antioksidan sudah tersedia.
Kebanyakan obat yang tersedia hanya menurunkan kolesterol atau
bersifat antioksidan saja sehingga kurang efektif dalam mencegah aterosklerosis. Untuk lebih efektif dalam mencegah aterosklerosis sebaiknya obat yang digunakan dapat mengurangi berbagai faktor risiko aterosklerosis, seperti menurunkan kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi. Atorvastatin dapat menurunkan kadar kolesterol dan bersifat antioksidan, tetapi pada dosis relatif besar bersifat prooksidan. Atorvastatin tidak dapat digunakan untuk mencegah aterosklerosis pada seseorang dengan kadar kolesterol normal-tinggi karena menurunkan kadar kolesterol sangat besar dan
penggunaan jangka panjang
menyebabkan miopati. Berdasarkan alasan di atas,
dilakukan penelitian untuk membuktikan
efektivitas kombinasi dua senyawa yang berefek menurunkan kadar kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi dalam mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan hiperkolesterolemia. Kedua senyawa yang digunakan adalah EERJ dan Zn, pilihan kedua senyawa di atas karena banyak tersedia, terbukti efektif pada hewan coba pada berbagai penelitian, dan aman. Penambahan Zn
7
pada EERJ diharapkan dapat meningkatkan efektivitas dan memperkecil dosis EERJ dalam mencegah dan mengobati aterosklerosis.
Tujuan Penelitian Penelitian bertujuan untuk: 1. Membuktikan efektivitas dan sinergisme kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antiateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan hiperkolesterolemia melalui pengukuran kadar kolesterol total, LDL, luas dan tebal plak ateroma pada tunika intima, peroksidasi lipid (kadar MDA), dan SOD. 2. Mencari kombinasi dosis yang efektif antara EERJ dengan Zn sebagai antiaterosklerosis. 3. Mencari prototipe obat yang berfungsi sebagai pencegahan dan pengobatan aterosklerosis yang efektif, aman, dan murah.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pemahaman yang lebih baik tentang pencegahan dan pengobatan aterosklerosis dan mendapatkan obat aterosklerosis yang efektif, aman, dan murah. Memberi informasi pada masyarakat tentang peran EERJ dan Zn sebagai penurun kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi dalam mencegah dan mengobati aterosklerosis. Manfaat lain penelitian ini diharapkan dapat mendorong penelitian lain yang menggunakan bahan alam, seperti daun teh dan bawang putih, dan trace element, seperti Mg dan selenium (Se), sebagai penurun kolesterol serta antioksidan untuk mencegah aterosklerosis dengan biaya yang lebih murah.
Hipotesis 1. Kombinasi EERJ dengan Zn dapat mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik dengan parameter kadar kolesterol total, LDL, luas dan tebal plak ateroma, MDA, dan SOD.
8
2. Kombinasi EERJ dengan Zn dapat mengurangi pembentukan ateroma pada kelinci hiperkolesterolemia dengan parameter kadar kolesterol total, LDL, luas dan tebal plak ateroma, MDA, dan SOD. 3. Kombinasi EERJ dengan Zn dalam mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan kelinci hiperkolesterolemia bersifat sinergis.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Aterosklerosis Aterosklerosis adalah terbentunya plak di dinding arteri besar dan sedang sehingga mempersempit lumen, menurunkan elastisitas pembuluh darah, dan aliran darah terganggu. Plak tersusun dari sel busa, sel otot polos, jaringan ikat, lemak, dan senyawa lain yang tertimbun di tunika intima dinding arteri. Penelitian pada manusia dan hewan menunjukkan bahwa pembentukan plak meningkat seiring dengan pertambahan usia yang proses berkembangnya sangat kompleks, seperti ditunjukkan Gambar 2.1.
infark
Usia Gambar 2.1 Perkembangan Plak Aterosklerosis (Price dan Wilson 2006)
Meskipun penyempitan lumen berlangsung progresif, manifestasi klinis penyakit belum tampak sampai proses aterogenesis mencapai tingkat lanjut. Fase praklinis dapat berlangsung 20-40 tahun. Plak bermakna secara klinis dan mengakibatkan iskemia dan disfungsi miokardium setelah menyumbat lebih dari 75% lumen pembuluh darah. Sebagaimana gambar di atas, proses patologis yang menimbulkan gangguan klinis dapat terjadi melalui penyempitan lumen progresif akibat pembesaran plak, perdarahan pada plak, pembentukan trombus yang
10
diawali agregasi trombosit, embolisasi trombus karena serpihan
plak, dan
spasmus arteri (Price dan Wilson 2006). Telah lebih dari 150 tahun penelitian dilakukan untuk menjelaskan proses perkembangan aterosklerosis. Penelitian menyimpulkan bahwa ada 3 hipotesis tentang terjadinya aterosklerosis, yaitu akibat respons terhadap kerusakan endotel, respons terhadap retensi lipid, dan akibat modifikasi oksidatif (Stocker and Keaney 2003). Tiga hipotesis tersebut dapat diuraikan sebagai berikut: 1. Respons Terhadap Kerusakan Endotel Berdasarkan hipotesis ini, awal aterosklerosis terjadi karena kerusakan endotel yang menyebabkan timbulnya berbagai respons kompensasi yang mengubah sifat-sifat normal homeostasis. Kerusakan baik mekanis maupun kemis meningkatkan perlekatan leukosit, platelet, dan mengubah lingkungan kerja antikoagulan. Leukosit dan platelet kemudian melepaskan sitokin, senyawa vasoaktif, dan faktor pertumbuhan yang mendorong respons inflamasi yang ditandai dengan migrasi sel otot polos ke dalam tunika intima yang akan berproliferasi membentuk lesi. Komponen lain dari respons peradangan akan menarik makrofag ke dalam dinding arteri. Respons monosit/makrofag terhadap berbagai rangsangan yang utama adalah memproduksi radikal superoksid (O 2 *-). Ezim utama yang berperan dalam produksi O 2 *- adalah NADPH oksidase. Studi pada mencit yang defisien NADPH oksidase
menunjukkan bahwa mencit jenis ini resisten terhadap
aterosklerosis. Berdasarkan alasan tersebut, sangat penting mengetahui regulasi dan aktivitas NADPH oksidase guna mencari cara yang efektif untuk mencegah aterosklerosis.
Makrofag
akan
meningkatkan
kerusakan
jaringan
dan
mengakumulasi LDL untuk membentuk sel busa yang merupakan tanda awal dari lesi aterosklerosis. Proses
akumulasi lipid dan pembentukan sel busa sebagai respons
peradangan selanjutnya akan menarik makrofag dan limfosit lebih banyak. Peradangan yang berlanjut memungkinkan terbentuk sel nekrosis yang disertai pelepasan sitokin, kolagen, elastin, dan glikosaminoglikan membentuk tudung fibrosa
yang akan
(fibrous cap) dan terbentuknya kristal kolesterol
11
di tengah plak. Sel yang terperangkap dalam plak akan mati membentuk bercak dan akan mengalami kalsifikasi. A
B
C
tudung fibrosa
Gambar 2.2 Kerusakan Endotel yang Menyebabkan Aterosklerosis (Stocker and Keaney 2003) Kerusakan arteri karena aterosklerosis dapat dibagi menjadi 4 tingkatan sebagaimana Gambar 2.2, yaitu a) tingkat fatty streak (garis lemak) mulai terlihat
12
dengan menumpuknya lipid dalam sel di tunika intima, b) tingkat proliferasi, yaitu terjadinya penumpukan lipid di luar dan di dalam tunika intima, c) tingkat pembentukan jaringan ikat oleh lipid ekstrasel, dan d) tingkat pengerasan jaringan ikat atau kalsifikasi. 2. Respons Terhadap Retensi Lipid Hiperlipidemia sedang atau tinggi dapat menyebabkan aterosklerosis. Transpor lipoprotein subendotel diperkirakan 85% melalui transitosis dan itu terjadi pada partikel berukuran di bawah 70 nm. Pembatasan ukuran ini menunjukkan pentingnya peran lipoprotein lipase (LPL) dalam membantu acylglycerol-rich lipoprotein masuk ke endotel. Penumpukan lipoprotein dalam dinding arteri tampaknya juga berhubungan erat dengan adanya matriks ekstraseluler.
Gambar 2.3 Peran Akumulasi LDL pada Aterosklerosis (Stocker and Keaney 2003) Apolipoprotein-B, suatu protein yang terdapat pada LDL dapat terikat oleh proteoglikan arteri dan tertahan dalam dinding arteri. Hal yang sama juga dapat terjadi pada apolipoprotein B-48. Beberapa data mendukung peran penting proteoglikan dalam mengikat apolipoprotein-B yang terdapat pada lipoprotein sebagai awal dari terbentuknya aterosklerosis karena dapat memicu peradangan
13
dan lipoprotein tanpa apo-B mudah difagosit oleh makrofag. Selain ikatan proteoglikan, enzim lisosomal dan lipolitik pada matriks ekstraseluler juga berperan penting. Sebagai contoh LPL meningkatkan “perlekatan” LDL in vitro yang tidak terkait pada aktivitas enzimatiknya. Karena LDL tertahan dalam dinding arteri maka dapat membentuk gumpalan lipid dan dengan mudah difagosit oleh makrofag untuk membentuk sel busa. Jadi, aterosklerosis dapat dipicu karena retensi LDL di dalam dinding arteri, sebagaimana Gambar 2.3. 3. Modifikasi Oksidatif Studi klinis dan epidemiologi menunjukkan bahwa peningkatan kadar LDL memicu terjadinya aterosklerosis lebih dini. Berdasarkan hipotesis modifikasi oksidatif dikatakan bahwa LDL yang tidak teroksidasi tidak bersifat aterogenik dan bersifat aterogenik setelah mengalami oksidasi. LDL dapat teroksidasi dan termodifikasi karena perubahan sel-sel utama pada dinding arteri. Pada tahap sangat dini, oksidasi ringan LDL akan menghasilkan bentuk minimally modified LDL (MM-LDL) pada sub endotel. MM-LDL ini sangat berbeda dari segi komposisi dibandingkan LDL yang sudah teroksidasi dengan kuat. Kolesterol masih menjadi sterol predominan, apo-B dari MM-LDL masih berikatan dengan reseptor LDL (LDL-R) dan inkubasi makrofag dengan MM-LDL tidak menbentuk sel busa (foam cell) (MacDonald-Wicks and Garg 2006). LDL teroksidasi tidak dikenali oleh reseptor LDL tetapi dikenali oleh reseptor scavenger makrofag dan memicu akumulasi kolesterol dan membentuk sel busa. Berbeda dengan sifat reseptor LDL, reseptor scavenger makrofag (reseptor pembersih) tidak mengalami umpan-balik atau down regulation
sehingga
makrofag terus-menerus menumpuk kolesterol dan akhirnya membentuk sel busa yang lebih besar. LDL teroksidasi memiliki beberapa efek biologi yang merugikan di antaranya pro-inflamasi, menghambat sintesis
oksida nitrit di
endotel (eNOS), memicu vasokonstriksi dan adhesi, menstimulasi sitokin seperti interleukin-1 (IL-1), dan meningkatkan agregasi platelet (MacDonald-Wicks and Garg 2006). Sifat antigenik LDL teroksidasi merangsang pembentukan antibodi, antibodi ini menyebabkan banyak limfosit masuk ke tunika intima karena ada peningkatan intracellular
cell adhesion molecule (ICAM) dan platelet-activating factor
14
(PAF). Antibodi tersebut akhirnya berikatan dengan LDL teroksidasi membentuk kompleks imun (ox-LDL immune complex, ox-LDL-IC). Kompleks imun selanjutnya akan difagositosis oleh makrofag
karena makrofag mempunyai
reseptor untuk itu sehingga juga memicu terbentuknya sel busa (Singh and Jialal 2006). Terjadinya aterosklerosis dimulai dengan masuknya LDL ke dalam bagian subendotel (intima) dan selanjutnya LDL mengalami oksidasi. Modifikasi LDL akan menstimulasi sel endotel untuk mensekresikan beberapa molekul, yaitu molekul adhesi intracellular adhesion molecul (ICAM), vascular cell adhesion (VCAM), monocyte chemotactic protein I (MCP I), granulosit, dan macrophage colony stimulating factor (MCSF). Molekul-molekul tersebut menyebabkan terjadinya adhesi monosit pada endotel yang diikuti dengan kemotaksis ke dalam subendotel dan terjadi aktivasi serta berdiferensiasi menjadi makrofag. Produk reaksi ini membuat komponen LDL (apolipoprotein B-100) lebih bermuatan negatif, selanjutnya LDL yang telah teroksidasi sempurna difagosit oleh reseptor scavenger makrofag untuk membentuk sel busa (Diaz et al. 1995).
Gambar 2.4 Aterosklerosis karena Modifikasi Oksidatif (Diaz et al. 1995)
LDL yang telah teroksidasi bersifat sitotoksik pada sel vaskuler, merangsang lipid dan enzim lisosom ke dalam tunika intima, dan akhirnya menghasilkan lesi aterosklerosis. Kerusakan, baik mekanis atau kemis, oleh senyawa seperti LDL teroksidasi dapat meningkatkan adhesi leukosit dan platelet serta mengubah
15
lingkungan kerja antikoagulan. Leukosit dan platelet kemudian melepaskan sitokin, senyawa vasoaktif, dan faktor pertumbuhan yang mendorong respons inflamasi ditandai dengan migrasi sel otot polos ke dalam tunika intima dan berproliferasi membentuk plak. Peranan modifikasi LDL dalam pembentukan sel busa dan aterosklerosis digambarkan pada Gambar 2.4. Tiga hipotesis tentang terjadinya aterosklerosis yang terdiri atas respons terhadap kerusakan endotel, respons terhadap akumulasi kolesterol, dan terjadinya oksidasi LDL semua berkaitan dengan radikal bebas. Radikal bebas menyebabkan LDL teroksidasi sehingga LDL tidak dikenali oleh reseptor normalnya dan hanya dikenali oleh reseptor scavenger makrofag yang tidak bersifat down regulated, sehingga menyebabkan terjadinya akumulasi kolesterol dan membentuk sel busa. Sel-sel busa akan merangsang ekspresi gen sejumlah sitokin dan faktor pertumbuhan yang menyebabkan terjadinya proliferasi sel otot polos yang kemudian berkembang menjadi plak yang kompleks.
Transpor Lemak dan Kolesterol Hiperlipidemia
adalah
suatu
keadaan
patologis
akibat
kelainan
metabolisme lemak yang ditandai dengan meningkatnya kadar kolesterol, trigliserida atau keduanya. Terapi awal untuk hiperlipidemia adalah perubahan gaya hidup, diet rendah lemak, diet rendah kalori, mengurangi bobot badan, dan olah raga. Pada kasus berat atau herediter, perubahan perilaku dan diet tidak cukup sehingga diperlukan pemberian obat yang mampu menurunkan kolesterol, trigliserida atau keduanya (Wells et al. 2006). Penyebab hiperlipidemia adalah kegagalan transportasi dan pengelolaan lipid yang terdiri atas kolesterol, trigliserida, fosfolipid, dan asam lemak bebas. Transportasi kolesterol dan trigliserida memegang peran utama karena pengaturan kadar fosfolipid dan asam lemak bebas bergantung padanya, selain itu pada aterosklerosis ditemukan timbunan kolesterol. Kadar LDL yang tinggi selalu ditemukan pada aterosklerosis. Oleh sebab itu, pemahaman metabolisme, transportasi, dan
terapi untuk menurunkan LDL sangat diperlukan dalam
mencegah aterosklerosis. Transportasi lipid dalam darah terjadi dalam bentuk
16
ikatan dengan protein (apoprotein) membentuk kompleks yang memiliki berbagai densitas dan sifatnya yang disebut lipoprotein (Marks et al. 2002) Lipoprotein berbentuk lonjong dengan inti trigliserida atau kolesterol. Permukaan lipoprotein terdiri atas fosfolipid, kolesterol dan apoprotein (apo-). Dari bermacam-macam apoprotein, hanya apo B-100 dan apo E yang dapat dikenali oleh reseptor membran sel yang memungkinkan lipoprotein berikatan dan masuk ke dalam sel atau jaringan (Murray et al. 2003). Dalam keadaan normal, konsumsi lemak adalah sekitar 80-120 g/hari. Lemak akan dihidrolisis oleh enzim lipase pankreas, diserap oleh sel mukosa usus halus dan disekresikan ke dalam saluran limfe dalam bentuk kilomikron. Trigliserida (TG) pada kilomikron dihidrolisis menjadi asam lemak, gliserol, dan kolesterol dengan perantara enzim lipoprotein lipase (LPL) yang terdapat pada permukaan endotel kapiler sehingga menjadi kilomikron remnan. Permukaan kilomikron remnan mengandung apo B-48 dan apo E yang mempunyai afinitas tinggi terhadap reseptor hepatosit, maka kilomikron remnan akan terikat pada hepatosit, mengalami internalisasi, dan degradasi oleh enzim lisosom dan akan melepaskan kolesterol. VLDL dalam sirkulasi berasal dari hepatosit dan berfungsi mengangkut TG dan sejumlah kolesterol (sintesis
de novo). TG
terdegradasi oleh LPL dan dilepaskan ke jaringan tepi menyebabkan VLDL berubah menjadi VLDL remnan (β VLDL) atau IDL. Permukaan IDL mengandung apo B-100 dan apo E yang mempunyai afinitas tinggi terhadap hepatosit. IDL yang mengalami internalisasi hanya sedikit,
sebagian besar
diubah menjadi LDL dan tetap beredar dalam sirkulasi. VLDL dalam keadaan normal beredar dalam darah dengan kadar yang rendah, namun adanya kelainan pada apo E menyebabkan kadarnya meningkat dan bersifat aterogenik (hiperlipoproteinemia tipe III) (Nelson et al. 2004). LDL mengandung kolesterol dan apo B-100 yang afinitasnya tinggi terhadap reseptor LDL hepar dan nonhepar, sehingga dapat masuk dan melepaskan kolesterol ke sel-sel tersebut. Kekurangan reseptor LDL akan menyebabkan bersihan kolesterol berjalan lambat karena sebagian besar kolesterol yang beredar terikat pada LDL. Pada keadaan kekurangan reseptor LDL akan timbul kelainan hiperlipoproteinemia tipe IIa yang bersifat aterogenik.
17
Prekursor HDL yang dibentuk oleh hepatosit menjadi matang selama memasuki sirkulasi dengan mengikat kolesterol dan apoprotein (C-II). Terikatnya Apo C-II menyebabkan peruraian TG kilomikron dan VLDL dalam hepatosit oleh LPL. HDL berfungsi mengangkut kolesterol dari jaringan tepi (terutama dari dinding arteri) kembali ke hepar, sehingga HDL berguna untuk mencegah timbulnya aterosklerosis (Wells et al. 2006). Sifat aterogenik LDL dan VLDL telah banyak dibuktikan. Peningkatan kadar LDL atau VLDL atau keduanya berkorelasi positif dengan terjadinya aterosklerosis. Kadar LDL yang tinggi disebabkan defisiensi reseptor LDL pada hepatosit atau sel lainnya, sehingga LDL tetap bebas beredar dalam plasma. Pada keadaan normal, pembentukan reseptor LDL diatur secara langsung oleh kadar kolesterol. Apabila kadar kolesterol meningkat akan menghambat transkripsi messenger RNA (m-RNA) yang akan membentuk reseptor LDL, demikian pula sebaliknya (Murray et al. 2003). Kadar lipid dalam plasma bergantung
pada kecepatan transpor
lipoprotein ke dalam sirkulasi dan kecepatan pengambilan kembali dari sirkulasi. Jumlah dan kecepatan kolesterol atau TG dari hepar atau usus halus masuk ke dalam sirkulasi bergantung pada suplai lipid dan apoprotein. Lipid dapat berasal dari diet atau sintesis de novo di dalam hepar atau usus halus, sedangkan apoprotein berasal dari
sintesis. Manipulasi diet atau obat yang dapat
menghambat sintesis lipid atau apoprotein akan dapat menurunkan
kadar
lipoprotein yang masuk ke dalam sirkulasi. Sekresi lipoprotein dipengaruhi oleh aktivitas enzim lipoprotein lipase (LPL). Perangsangan LPL dapat meningkatkan bersihan kilomikron dan trigliserida-VLDL dari sirkulasi. Faktor-faktor yang meningkatkan katabolisme dan ekskresi kolesterol dari tubuh akan menurunkan kadar kolesterol. Menurunnya jumlah kolesterol dalam sel hepar merangsang pembentukan reseptor LDL hepatosit yang berakibat pada peningkatan ambilan LDL plasma ke dalam hepar (Murray et al. 2003). Berdasarkan penyebabnya, hiperlipidemia dapat dibagi menjadi 2, yaitu hiperlipidemia primer yang disebabkan oleh faktor genetik dan hiperlipidemia sekunder. Hiperlipidemia primer dapat disebabkan antara lain oleh defisien LPL
18
(tipe I), hiperkolesterol familial (tipe II a, IV), dan familial lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) deficiency. Hiperlipoproteinemia sekunder adalah terjadinya peningkatan kadar lemak dan atau lipoprotein darah yang disebabkan oleh penyakit dan obat yang mempengaruhi metabolisme lemak. Penyebab terjadinya kelainan metabolisme lemak sekunder dapat terjadi antara lain karena konsumsi etanol yang berlebihan, gagal ginjal, diabetes mellitus, dan penggunaan kontrasepsi hormonal (Murray et al. 2003; Wells et al. 2005).
Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (EERJ) Jahe atau Zingiber officinale Roscoe merupakan salah satu jenis rempah yang sejak dulu dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia. Jahe merupakan bagian dari makanan atau minuman kesehatan, seperti susu telur madu jahe (STMJ), teh jahe, kopi jahe, dan susu jahe. Jahe digunakan oleh masyarakat karena khasiat dan keyakinan bahwa jahe sangat bermanfaat untuk kesehatan. sebagai
Jahe bermanfaat
antimuntah, dispepsia, flatulen, kolik, diare, flu, merangsang napsu
makan, antagonis narkotik, dan antiinflamasi (WHO 1999). Beberapa efek jahe telah dibuktikan baik secara, in vitro maupun in vivo, pada hewan dan bahkan efek antimuntahnya telah dibuktikan melalui uji klinik. Efek jahe yang telah dibuktikan pada hewan coba antara lain efek antihiperkolesterolemia, antioksidan, antimuntah, antitrombotik, antibakteri, antikanker, antidiare, antiinflamasi, antihipertensi, menghambat agregasi platelet, dan kolagogik (Barnes et al. 2007). Bagian yang digunakan dari jahe adalah rimpang dalam bentuk serbuk, ekstrak, tablet, dan tingtur (WHO 1999). Rimpang jahe mengandung berbagai senyawa yang tercantum dalam Tabel 2.1. Besarnya dosis yang digunakan sangat bergantung pada sediaan dan tujuan pemakaian. Untuk antiemetik, serbuk dosis tunggal sekitar 1-2 g diminum 30 menit sebelum perjalanan. Untuk penggunaan lain, serbuk rimpang sebanyak 0,25 –1 g dipakai tiga kali sehari, tingtur 1,5–3 mL (1:5) tiga kali sehari atau 1,7–5 mL per hari. Ekstrak etanol dan aseton dosis 25, 50, 100, dan 200 mg/kg BB yang diberikan secara intraperitonial pada anjing dapat mencegah muntah karena pemberian cisplatin (antikanker). Ekstrak etanol dosis 500 mg/kg BB yang diberikan secara oral pada kelinci hiperlipidemik dapat
19
menurunkan konsentrasi kolesterol yang signifikan dibandingkan dengan kontrol. Pada studi lain, dosis 200 mg/kg BB diberikan kepada kelinci (oral) yang diberi diet tinggi kolesterol selama 10 minggu dapat menurunkan kadar kolesterol serum dan jaringan, kadar serum trigliserida, dan kadar serum lipoprotein (Barnes et al. 2007). Tabel 2.1 Senyawa Aktif yang Terdapat dalam Rimpang Jahe dan Efeknya No. 1
2
3
4
Jenis Senyawa Aktif Efek Senyawa Fenol Antihiperkolesterolemia, - 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, shogaol, antioksidan, antiinflamasi, ingerol, paradol antidiabetes, antivirus, antiemetik, dan antikanker Seskuiterpen Antioksidan, antiinflamasi, - α-zingeberen, β-seskuifelandren, β-bisabolen, α- dan antiemetik farnesen, ar-curcumen (zingiberol) Monoterpen Antioksidan, antiinflamasi, - camfen, β-felandren, cineol, geraniol, antiemetik curcumen, citral, terpeniol, dan borneol Lain-lain Antiaterosklerosis dan - G-dehidrogingerdion, galanolactone, asam antioksidan sulfonat, zingeron, neral, monoasil digalakton, ginger glikolipid, karbohidrat, protein, lipid, dan senyawa anorganik
(Kemper 1999; Barnes et al. 2007; Singh et al. 2010; Mishra et al. 2012).
6-gingerol
8-gingerol
10-gingerol
6-shogoal
zingeron
6-paradol
Gambar 2.5 Struktur Kimia Senyawa Aktif Zingiber officinale Roscoe (Barnes et al. 2007; Singh et al. 2010)
20
Ekstrak etanol rimpang jahe terstandar mengandung polifenol total sebanyak 90 mg/g dan kandungan gingerol, shogaol, dan zingerone sebesar 40 mg/g. Shogaol merupakan hasil dehidrasi gingerol, sedangkan zingeron merupakan hasil degradasi dari gingerol (Gambar 2.5). Berdasarkan uji toksikologi pada tikus (oral) dan kelinci (dermal), minyak atsiri dari jahe dinyatakan praktis tidak toksik dengan nilai LD 50 lebih dari 5 g/Kg BB (Barnes et al. 2007). Penelitian toksisitas akut serbuk jahe pada tikus menghasilkan LD 50 170 sampai 250 g/kg BB yang kalau diekstrapolasikan pada manusia setara dengan 25% bobot badan dan termasuk kategori praktis tidak toksik (Leonard 2006). Lebih dari 400 senyawa dalam jahe yang telah diidentifikasi dan mempunyai berbagai efek. Contoh senyawa tersebut tercantum dalam Tabel 2.1.
Zink (Zn) Zink adalah trace mineral serbaguna yang diperlukan oleh lebih dari 100 enzim dan terdapat pada hampir semua sel. Pada tulang dan otot, terdapat kadar Zn yang paling tinggi, tetapi otot tidak dapat menggunakan secara langsung deposit Zn itu sehingga seseorang tetap harus mengkonsumsi makanan yang mengandung Zn untuk mempertahankan kondisi optimal. Zn berperan mendukung kerja berbagai enzim, termasuk metalloenzim yang diperlukan untuk berbagai proses metabolisme. Metalloenzim adalah enzim yang mempunyai satu atau lebih mineral dalam strukturnya. Zn berperan serta dalam berbagai proses berikut (Bao et al. 2010): stabilisasi membran sel, antioksidan, antiinflamasi, meningkatkan immunitas, pelepasan insulin, pembekuan darah, meningkatkan efektivitas tiroid, penyembuhan luka, produksi sperma, pertumbuhan fetus, dan persepsi rasa. Sifat antioksidan Zn dapat dibagi dalam dua hal, akut dan kronis. Efek akutnya terjadi melalui dua mekanisme; yaitu melindungi protein sulfhidryl dan menghambat pembentukan radikal hidroksil (OH*-) dari H 2 O 2 pada reaksi Fenton atau reaksi Haber-Weiss
(redoks) yang dipicu oleh Cu+ dan Fe++
(Halliwel dan Gutteridge 1991). Fe2+ + H 2 O 2
Fe3+ + OH* + OH-
K= 76 L/mol detik
21
Cu+ + H 2 O 2
Cu2+ + OH* + OH-
K= 4,7 103 L/mol detik
Atau secara umum dapat ditulis Mn+n (logam) + H 2 O 2
Mn (n+1) + OH* + OH-
Salah satu contoh efek Zn dalam melindungi gugus sulfhidryl dari oksidasi telah diteliti pada δ-aminolivulinate dehydratase. δ-Aminolivulinate dehydratase adalah enzim yang mengkatalisis pembentukan pyrrole porphobilinogen dari 2 molekul δ-aminolivulinate acid. Pada manusia, keberadaan δ-aminolivulinate dehydratase sebagai suatu homo-octamer dari subunit identik dari suatu molekul yang
masing-masing
bermasa
31.000–35.000
kDa.
δ-Aminolivulinate
dehydratase adalah suatu sulfhidryl dependent yang erat kaitannya dengan oksidasi dan aktivitas enzim thiol. Penelitian menunjukkan bahwa 8 mol Zn berikatan dengan satu mol oktamer dan jumlah ikatan Zn berhubungan erat dengan aktivitas enzim. Efek perlindungan dari Zn diperkirakan karena menjaga gugus sulfhidryl esensial (Powell 2000).
Gambar 2. 6 Mekanisme Protektif Zn pada δ-Aminolivulinate Acid Dehydratase Sulfhidryl (Powell 2000) Diperkirakan Zn menstabilisasi gugus sulfhidryl melalui beberapa cara, yaitu 1). Zn berikatan langsung dengan sulfhidryl, 2), berikatan dengan beberapa tempat di protein
lain
yang
berdekatan
dengan
gugus
sulfhidryl,
menghasilkan
penghalangan sterik, dan 3), berikatan dengan beberapa tempat di protein lain menyebabkan perubahan konformasi yang menyebabkan enzim tetap aktif, seperti pada Gambar 2.6.
22
Masih banyak contoh enzim dan protein yang mempunyai gugus thiol yang dilindungi oleh Zn, seperti dihydrorotase, tubulin DNA zinc-binding proteins (zinc fingers), alanyl tRNA synthetase, class I tRNA synthetase, 5enolpyruvylshikimate-3-phosphate syntetase,
dan protein farnesyltransferase
(Bao et al. 2010). Mekanisme antioksidan kronis Zn belum jelas, kemungkinan Zn bekerja secara tidak langsung dengan menginduksi metallothionein pada berbagai organ, seperti hati, ginjal, dan usus halus. Metallothionin mempunyai efek sebagai antioksidan terhadap berbagai stres oksidatif (SO), seperti karena radiasi, doxorubicin
(antikanker),
etanol,
dan
mutagenesis
oksidatif.
Dalam
metallothionin terdapat Zn yang sangat penting fungsinya untuk redoks seluler. Kondisi SO yang berat menyebabkan perubahan redoks seluler karena Zn terlepas dari metallothionin dan terjadi perubahan ikatan sulfida. Pengaruh SO dan defisien Zn dapat meningkatkan kerusakan paru-paru, mikrosom hepar, R* pada mikrosom paru-paru, merangsang peroksidasi pada mikrosom dan mitokondria hepar, meningkatnya protein karbonil dan 8-oxo-2-deoxy-guanosine testes tikus, dan meningkatkan sensitivitas oksidasi lipoprotein (Powell 2000). Sifat Zn sebagai antioksidan, menurunkan kolesterol dan trigliserida telah terbukti pada penelitian menggunakan tikus knock-out (LDL-R-/-) yang diberi diet lemak. Pada tikus knock-out (LDL-R-/-) defisien Zn menyebabkan terjadinya kenaikan glutation reduktase (GSSH), kadar kolesterol, dan trigliserida. Defisiensi Zn pada tikus knock-out (LDL-R-/-) juga menyebabkan peningkatan marker inflamasi, seperti nuclear factor-kB dan vascular cell adhesion molecule1 (NF-kB, VCAM-1) secara signifikan dibandingkan dengan kontrol (Reiterer et al. 2005). Zn karbonat yang ditambahkan pada diet (1 g/kg) selama 8 minggu dapat menurunkan aterogenesis pada kelinci diet aterogenik (Ren et al. 2006). Zn dalam bentuk garam, baik Zn karbonat, Zn sulfat maupun Zn glukonas, mempunyai bioavailabilitas yang sebanding sehingga dapat saling menggantikan (Ghaffari and Ghiasvand 2010).
23
Kombinasi EERJ dengan Zn dalam Mencegah Aterosklerosis
Peran EERJ dan Zn sebagai antiaterosklerosis yang diadaptasi dari berbagai pustaka dapat digambarkan sebagai berikut: Homosistein R* (1) Hipertensi (2)
Diabetes (3)
Asetil KoA HMG Co-A red, NADPH (7)
Kerusakan Endotel (4)
Mevalonat 7-α-hidroksilase (8), NADPH
Disfungsi Endotel (5)
Permeabilitas LDL +
Kolesterol
LDL NO berkurang
Adhesi leukosit
A empedu
R* bertambah (10)
Usus halus
LDL intima (+)
Proliferasi dan migrasi sel otot polos
Agregasi trombosit
Oks-LDL (9)
NADPH oksidase, makrofag lipoksidase, dan myeloperoksidase
Inflamasi (6)
Monosit (+)
Makrofag (+)
Nekrosis (+)
aterosklerosis
Sel adhesi
sitokin
Sel busa
Gambar 2.7 Mekanisme EERJ dan Zn dalam Menghambat Aterosklerosis (Diadaptasi dari Berbagai Sumber). EERJ menghambat R* (1), hipertensi (2), diabetes (3), kerusakan endotel (4), disfungsi endotel (5), menghambat HMG Co-A reduktase (7), merangsang 7-αhidroksilase (8), oksidasi LDL (9), dan meningkatkan R* (10). Zn menghambat 1, 4,6, dan 9. Tanda + berarti meningkat. (Diaz et al. 1995; Marks et al. 2002; Stocker 2003; Barnes et al. 2007; Singh et al. 2010; Mishra et al. 2012; Yiming Li et al. 2012
24
Atorvastatin Atorvastatin adalah antihiperkolesterolemia golongan statin (Gambar 2.8). Golongan statin bekerja menghambat enzim HMG-CoA reduktase sehingga konversi hidroksi metil glutaril Ko enzim A (HMG-CoA) menjadi mevalonat terhambat. Mevalonat adalah prekursor pembentukan kolesterol di sel hepar. Terhambatnya enzim HMG-CoA reduktase menyebabkan jumah kolesterol dalam sel hepar berkurang. Berkurangnya kolesterol dalam sel hepar memacu peningkatan síntesis reseptor LDL yang akibatnya bersihan kolesterol dalam plasma meningkat dan menyebabkan kadar kolesterol plasma berkurang (Trevor et al. 2008). Antihiperkolesterolemia golongan statin antara lain adalah atorvastatin, rosuvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin, dan fluvastatin. Atorvastatin, rosuvastatin, dan simvastatin mempunyai kemampuan menurunkan kolesterol lebih tinggi dibandingkan dengan statin yang lain, yaitu mencapai 20-50%. Atorvastatin menurunkan LDL, kolesterol total, apolipoprotein B, dan trigliserida lebih besar dibandingkan statin yang lain. Atorvastatin dapat mengurangi aterosklerosis melalui efeknya baik menurunkan kolesterol maupun sebagai antioksidan (Srinivas et al. 2008). Beberapa alasan di atas mendasari pemilihan atorvastatin sebagai kontrol positif dalam menurunkan kadar kolesterol plasma dan mencegah terbentuknya aterosklerosis, baik pada kelinci yang diberi diet tinggi kolesterol atau kelinci hiperkolesterolemia. Dosis lazim atorvastatin sebagai penurun kolesterol pada orang dewasa adalah 10-80 mg/hari (Trevor et al. 2008).
Gambar 2.8 Struktur Kimia Atorvasatin (Trevor et al. 2008)
25
Hewan Coba untuk Penelitian Aterosklerosis Pencarian senyawa baru sebagai obat, menentukan aktivitas, dan uji toksisitas suatu senyawa memerlukan hewan coba.
Hewan coba sangat beragam
bergantung pada tujuan dan kebutuhan. Jenis hewan coba antara lain mencit, tikus, kelinci, hamster, ayam, burung merpati, ayam kalkun, kelinci, monyet, kucing, anjing, marmut, katak, dan kuda. Hewan coba harus mempunyai kemiripan metabolisme dan fisiologi dengan manusia dan banyak data penelitian menggunakan hewan tersebut. Hewan coba harus merupakan keturunan dari hewan
percobaan yang mempunyai karakteristik genetik yang jelas dan
memenuhi semua asumsi percobaan. Syarat lainnya adalah hewan coba mudah diperoleh, mudah dipelihara, murah, sehat, dan tidak merupakan hewan yang dilindungi (Frank 2001). Hewan yang sering digunakan dalam penelitian hiperkolesterolemia dan aterosklerosis di antaranya adalah monyet, tikus, ayam, ayam kalkun, burung merpati, dan kelinci. Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) merupakan hewan yang baik digunakan karena metabolismenya mirip dengan manusia. Monyet ekor panjang dapat dibuat hiperkolesterolemia dan aterosklerosis dengan diet aterogenik yang mengandung 0,5% kolesterol atau 42% sumber kalorinya berasal dari lemak.
Hewan coba ini penggunaannya sangat dibatasi karena
termasuk spesies yang dilindungi (Adriyanto 2009). Walaupun dilindungi, di Indonesia Macaca fascicularis pernah digunakan sebagai hewan coba untuk penelitian aterosklerosis (Piliang et al. 1996) Tikus
(Rattus
novergicus)
banyak
digunakan
dalam
penelitian
hiperkolesterolemia dan aterosklerosis karena merupakan satu-satunya hewan yang sekuen asam amino penyususun enzim 7α-hidroksilase telah diketahui. Enzim ini bertanggung jawab terhadap konversi kolesterol menjadi asam empedu dan mengatur keseimbangan kadar kolesterol dalam tubuh. Kesulitan yang dihadapi adalah bahwa tikus tidak memiliki kantung empedu sehingga kolesterol yang terbentuk dengan cepat diubah menjadi asam empedu. Ini menyebabkan konsentrasi kolesterol darah tikus sulit mencapai hiperkolesterolemia. Untuk memudahkan terjadinya hiperkolesterolemia, tikus dapat dibuat knock out pada
26
apo-B reseptor dan LDL reseptor (Smith 1998). Selain itu, tikus dapat dibuat hiperkolesterolemia dengan pemberian pakan tinggi kolesterol dan propiltiourasil (PTU), namun cara ini menyebabkan terbentuknya kolesterol yang tidak alamiah. Kelinci (Orytalagus cuniculus) merupakan hewan coba yang sesuai untuk penelitian hiperkolesterolemia dan aterosklerosis. Pemberian pakan aterogenik yang mengandung 0,25–1% kolesterol akan menyebabkan kenaikan konsentrasi kolesterol dan trigliserida mulai minggu ke-4 dan terus naik hingga minggu ke-7 perlakuan. Plak aterosklerosis dapat terbentuk 15,8% setelah 4 minggu pemberian pakan aterogenik yang mengandung 1% kolesterol, dan plak dapat meningkat sampai 44% dengan pemberian diet aterogenik yang mengandung 0,5% kolesterol selama 12 minggu perlakuan (Yanni 2004). Di antara hewan coba untuk penelitian aterosklerosis, hanya kelinci yang mempunyai kecenderungan hiperkolesterolemia dalam beberapa hari setelah diet aterogenik. Kadar LDL normal pada kelinci sangat rendah (17 mg/dL atau 1,3 mmol/L) (Tabel 2.2) dan dapat meningkat 2 sampai 8 kali setelah diberi pakan yang mengandung 0,1-2% kolesterol dalam 20 hari. Kadar kolesterol pada kelinci meningkat dengan cepat dan diikuti terbentuknya lesi dan sel busa. Lesi awal pada kelinci sama dengan garis lemak (fatty streaks) pada manusia, tetapi tidak berkembang menjadi plak, seperti yang terjadi pada manusia. Eksperimen jangka panjang menggunakan kelinci sebagai hewan coba yang diberi diet aterogenik tidak menguntungkan karena dapat menyebabkan hepatotoksik berat yang tidak memungkinkan hewan bertahan hidup dalam waktu lama. Karena keterbatasan ini, pemberian pakan aterogenik dapat diberikan selama 6 minggu. Penelitian menggunakan hewan model kelinci hanya untuk melihat efektivitas obat dalam menghambat pembentukan fatty streaks atau ateroma (Yanni 2004). Pada manusia, kenaikan bobot badan sebesar 15 kg atau kenaikan usia 30 tahun akan meningkatkan kolesterol plasma sebesar 25 mg/dL. Oleh karena itu, penelitian tentang aterosklerosis lebih baik dilakukan pada hewan coba dewasa karena bobot badannya relatif stabil (Adriyanto 2009). Pada penelitian ini digunakan kelinci yang sudah dewasa (> 3-4 bulan) dengan bobot sekitar 2,5-3 kg dengan tujuan kenaikan bobot badan tidak terlalu banyak saat penelitian sehingga tidak mempengaruhi kadar kolesterol dalam plasma darahnya.
27
Tabel 2.2 Konsentrasi LDL pada Berbagai Spesies Hewan (Adriyanto2009) No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Spesies Mencit Tikus Marmut Kelinci Anjing Sapi Babi Monyet Babon
Konsentrasi (mg/dL) 20 24 28 17 13 24 52 42 46
Hewan model untuk aterosklerosis dari jenis unggas antara lain, ayam, ayam kalkun, dan burung merpati (pigeon). Aterosklerosis pada ayam terjadi di aorta dan arteri koronaria yang akan berkembang secara alamiah dan akan bertambah ketika diberi makanan yang mengandung kolesterol. Aterosklerosis spontan pada ayam pertama kali terbentuk di aorta toraksik. Lesi aterosklerosis pada ayam diet tinggi kolesterol mempunyai banyak persamaan dengan lesi pada manusia, termasuk cholesterol clefts, foam cell, dan fibromuscular cap. Burung merpati ada yang mudah mengalami aterosklerosis dan ada juga yang resisten terhadap terbentuknya
aterosklerosis.
Pada
burung
merpati
yang
diternakkan,
aterosklerosis mudah terbentuk pada jenis White Carneau (WC) dan sulit terjadi pada jenis Show Racer (SH). Burung merpati jenis WC yang diberi diet normal selama 3-4 tahun hampir semua mengalami aterosklerosis. Hal yang unik dari burung merpati sebagai model ateosklerosis adalah aterosklerosis pertama kali terbentuk pada aorta bercabang dua (arteri celiac) dan selanjutnya berkembang di aorta bagian yang
lain dan ujung-ujung arteri termasuk arteria koronaria.
Sebaliknya pada manusia dan hewan model yang lain, aterosklerosis terbentuk pertama kali pada percabangan utama arteri koronaria (proximal main branches) (Bavelaar and Beynen 2004).
BAB 3 KOMBINASI EKSTRAK ETANOL RIMPANG JAHE (Zingiber officinale Roscoe) DENGAN Zn SEBAGAI ANTIATEROMA PADA KELINCI YANG DIBERI DIET ATEROGENIK The Combinations Ethanol Extract of the Ginger (Zingiber officinale Roscoe) with Zn as Antiatheroma in Fed Rabbits Atherogenic Diet Abstrak Hiperkolesterolemia dan LDL teroksidasi merupakan faktor utama penyebab aterosklerosis. Ekstrak etanol rimpang jahe (EERJ) dan Zn masing-masing dapat menurunkan kadar kolesterol dan sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan membuktikan efektivitas kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antihiperkolesterolemia dan antioksidan dalam mencegah pembentukan ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik. Parameter ateroma yang digunakan adalah kadar kolesterol total (KT), LDL, luas dan tebal plak ateroma, kadar MDA, dan aktivitas SOD. Dua puluh delapan kelinci jantan New Zealand white dibagi ke dalam 7 kelompok. Selama 6 minggu kelompok 1 hanya diberi diet standar dan kelompok 2 hanya diberi diet aterogenik. Kelompok 3,4,5,6, dan 7 selain diberi diet aterogenik secara berurutan juga diberi Zn 6,67 mg/kg, EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, dan atorvastatin 1,9 mg/ kg BB per hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan Zn 6,67 mg/kg dapat menghambat peningkatan kadar kolesterol total dan MDA, tetapi tidak efektif menghambat kenaikkan LDL dan pembentukan plak ateroma. EERJ 200 mg/kg dan EERJ kombinasi dengan Zn dapat menghambat kenaikkan kadar KT, LDL, plak ateroma sama dengan atorvastatin (p>0,05). Namun, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn dalam menghambat kenaikkan KT, LDL, dan plak ateroma kecenderunganya lebih baik dibandingkan dengan perlakuan lain. Kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn menghabat kenaikkan MDA lebih baik (p<0,05) dan meningkatkan SOD sama dengan perlakuan lain (p>0,05). Disimpulkan bahwa kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn memberikan hasil terbaik dalam mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik dibandingkan perlakuan lain. Kata Kunci: hiperkolesterolemia, diet aterogenik, ekstrak etanol rimpang jahe, dan ateroma
Abstract Hypercholesterolemia and LDL oxidation are the major factors of atherosclerosis. The ethanol extracts of the ginger (EEG) and Zn each posses effect to reduce cholesterol and antioxidant. This research combined EEG and Zn
30
as antihypercholesterolemia and antioxidant to prevent atheroma. Parameters for the atheroma were the concentrations of total cholesterol (TC), LDL, MDA, and plaque. Twenty eight male New Zealand white rabbits were divided into seven groups. For 6 weeks, group 1 was fed with a standard diet and group 2 was fed with an atherogenic diet. Beside the atherogenic diet, group 3,4,5,6, and 7 were also treated by supplementary treatment, which are Zn 6.67 mg/kg, EEG 200 mg/kg, combination EEG 50 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg, combination EEG 100 mg/kg and Zn 6.67 mg/kg, and atorvastatin 1.9 mg/kb BW per day. Zn 6.67 mg/kg treatment reduces the increase of TC but did not impede LDL, MDA, and did not prevent plaque atheroma. EEG 200 mg/kg, combination EEG 50 mg/kg and Zn, and combination EEG 100 mg/kg and Zn treatment impeded the increase of TC, LDL, MDA and prevent atheroma and increase SOD equal to the atorvastatin. Based on the ability to restrain the increase of TC, LDL, and plaque atheroma the treatment with combination of EEG 50 mg/kg and Zn resulted in higher and significant (p<0.05) reduction of MDA than atorvastatin. This research concluded that combination of EEG 50 mg/kg and Zn treatment exhibited the highest atherosclerosis prevention effect as compared to the other treatments for atherogenic diet rabbits. Keywords: hypercholesterolemia, atherosclerosis, ethanol extract of ginger, and atherogenic diet.
Pendahuluan
Aterosklerosis adalah suatu lesi pada arteri sedang atau besar yang ditandai dengan disfungsi endotel, inflamasi vaskuler, akumulasi lemak, dan kalsium serta senyawa seluler lainnya pada tunika intima dinding pembuluh darah (Price dan Wilson 2006). Aterosklerosis menyebabkan lumen pembuluh darah menyempit, elastisitas berkurang, respons vaskular
berlebihan, obstruksi luminal akut atau
kronis, aliran darah tidak normal, dan suplai oksigen ke jaringan berkurang (Madhumati et al. 2006). Aterosklerosis dapat memacu timbulnya berbagai penyakit, Berdasarkan
seperti gagal jantung, hipertensi, angina pektoris, dan survei
pemeriksaan
kesehatan
stroke.
dasar, penyebab kematian
utama pasien di Rumah Sakit pada tahun 2008 adalah stroke, hipertensi, dan penyakit sistem sirkulasi yang erat hubungannya dengan aterosklerosis (Depkes RI 2009). Berbagai penelitian menyimpulkan bahwa minimal terdapat 3 faktor utama penyebab timbulnya aterosklerosis, yaitu kerusakan endotel, hiperkolesterolemia, dan oksidasi low density lipoprotein (LDL) (Stocker and Keaney 2003).
31
Kerusakan endotel dan oksidasi LDL dapat terjadi karena radikal bebas (R*) yang berlebihan atau stres oksidatif. LDL teroksidasi toksik pada endotel dan dapat memacu migrasi monosit ke dalam tunika intima. Migrasi monosit ke tunika intima merupakan awal terjadinya aterosklerosis. Untuk mengurangi kejadian aterosklerosis dapat diberikan antihiperkolesterolemia, antioksidan, dan antiinflamasi untuk mencegah oksidasi LDL dan kerusakan endotel. Ekstrak
etanol
antihiperkolesterolemia,
rimpang
jahe
antioksidan,
(EERJ)
mempunyai
antihipertensi,
aktivitas
antidiabetes,
dan
antiinflamasi yang semuanya merupakan faktor risiko terjadinya aterosklerosis. EERJ dosis 200 mg/kg BB per hari dapat menurunkan kadar kolesterol dan antiaterosklerosis pada kelinci yang diberi diet tinggi kolesterol. EERJ dosis 200 mg/kg BB per hari yang diberikan selama 20 hari secara signifikan dapat menurunkan glukosa, kolesterol total, LDL, dan menaikkan HDL pada tikus diabetik karena induksi streptozotosin (Bhandari et al. 2005). EERJ dosis 250 µg/hari pada mencit defisien apolipoprotein E dapat mengurangi luas lesi aterosklerosis sebesar 44%, menurunkan trigliserida sebesar 27%, dan kolesterol sebesar 29% dibandingkan kontrol normal,
serta
dapat menurunkan LDL
teroksidasi (LDL-associate lipid peroxides) dan menghambat agregrasi LDL sebanyak 62% dan 33% (Fuhrman et al. 2000). EERJ dosis 100-400 mg/kg BB per hari yang diberikan pada tikus diet tinggi lemak selama 6 minggu dapat menurunkan kadar glukosa, kolesterol total, LDL, tigliserida, dan asam lemak bebas secara signifikan (Nammi et al. 2009). Efek antioksidan EERJ ditunjukkan oleh kemampuanya mencegah radiasi (radioprotektif) pada tingkat seluler dengan melindungi antioksidan enzimatik dan mengurangi lipid peroksidasi pada tikus stres oksidatif karena radiasi neutron (Nabil et al. 2009). EERJ mengandung senyawa polifenol, seperti gingerol, shogaol, dan paradol yang bersifat sebagai scavenger radikal bebas sehingga akan mengurangi peroksidasi lipid dan mencegah defisien antioksidan enzimatik (Powell 2000, Sanghal et al. 2012). EERJ yang telah distandardisasi mengandung 9% (90 mg/g) senyawa polifenol yang potensial sebagai scavenger R* (Barnes et al. 2007)
32
Zinc (Zn) sebagai antioksidan dan antihiperlipidemia telah terbukti pada penelitian menggunakan tikus knock-out (LDL-R-/-) atau tikus defisien reseptor LDL yang diberi diet tinggi lemak. Pada tikus knock-out (LDL-R-/-), defisien Zn menyebabkan kenaikkan kadar kolesterol, trigliserida, glutation reduktase (GSSH), dan marker inflamasi, seperti nuclear factor-kB (NF-kB) dan vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) (Reiterer et al. 2005). Defisien Zn juga dapat meningkatkan kerusakan sel endotel yang dipicu
stres oksidatif
(Alsuhendra 2004) sehingga mengganggu kelenturan pembuluh darah. Zn karbonat yang ditambahkan pada pakan sebanyak 1 g/kg selama 8 minggu dapat menurunkan aterogenesis pada kelinci diet tinggi kolesterol (Ren et al. 2006). Zn dapat melindungi kerusakan seluler karena radikal bebas dan dapat melindungi gugus sulfihidril (-SH) dari oksidasi (Zelikoff and Thomas 1998; Powell 2000). Zn dapat mencegah timbulnya aterosklerosis melalui efeknya sebagai antioksidan dan stabilisasi membran sel terhadap zat-zat seperti sitokin dan PUFA (Eby and Halcom 2005). Salah satu efek EERJ dalam menurunkan kadar kolesterol ialah dengan cara meningkatkan aktivitas enzim kolesterol-7α-hidroksilase hepatik, suatu rate limiting enzyme pada biosintesis asam empedu dan menghambat HMG-CoA redutase suatu enzim untuk síntesis kolesterol (Fuhrman et al. 2000; Sanghal et al. 2012). Peningkatan aktivitas kolesterol-7α-hidroksilase (CYP7A1) hepatik akan menstimuli konversi kolesterol menjadi asam empedu (Fuhrman et al. 2000).
Peningkatan
aktivitas
kolesterol-7α-hidroksilase
hepatik
dapat
meningkatkan radikal bebas dalam tubuh (Murray et al. 2003) sehingga peran EERJ dalam mencegah aterosklerosis pada hiperkolesterolemia dapat berkurang jika tubuh kekurangan antioksidan. Kekurangan antioksidan dapat diminimalisir dengan pemberian antioksidan nonenzimatik, seperti Zn, Se, dan β-karoten. Sebagai antioksidan
untuk meningkatkan efektivitas EERJ dalam mencegah
aterosklerosis dapat dipilih Zn karena beberapa alasan, antara lain, aman, telah banyak digunakan untuk keperluan lain, murah, mempunyai efek lain, menurunkan kolesterol dan antiinflamasi serta mengurangi defisien Zn pada hiperkolesterolemia.
33
EERJ maupun Zn dapat menurunkan kadar kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi
sehingga keduanya akan lebih efektif mencegah terjadinya
aterosklerosis jika dikombinasikan. Kombinasi antara EERJ dengan Zn kemungkinan akan bersifat sinergis
dalam mencegah aterosklerosis karena
berbeda dalam cara kerja dan struktur kimianya. Dosis EERJ yang efektif sebagai antiaterosklerosis pada kelinci jika digunakan sendirian adalah 200-500 mg/kg BB per hari dan jika dikonversi ke manusia (70 kg) sekitar 2840-7100 mg (Paget and Barnes 1964), dosis tersebut tidak aplikatif dan tidak ekonomis digunakan pada manusia. Besarnya dosis EERJ kemungkinan dapat diperkecil dengan penambahan senyawa yang mempunyai efek yang sama dengan mekanisme kerja yang berbeda atau menambahkan
antioksidan. Berbagai
alasan di atas,
mendorong dilakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui efektivitas, optimasi, dan mencari sinergisme penggunaan kombinasi EERJ dengan Zn untuk mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Mei 2011-Juni 2012. Penelitian dilaksanakan di Balitnak Ciawi Bogor, Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi dan Sain Uhamka, Laboratorium PAU IPB, dan Laboratorium Anatomi dan Fisiologi serta Bagian Patologi FKH IPB. Bahan dan Alat Penelitian 1. Hewan Percobaan Hewan yang digunakan adalah kelinci New Zealand white jantan (Orytolagus cuniculu) usia 3-4 bulan dengan bobot badan 2-3,5 kg yang diperoleh dari Balitnak, Departemen Pertanian RI Ciawi Bogor. Kelinci ditempatkan pada kandang terpisah yang terbuat dari galvanis. Kandang dilengkapi dengan tempat pakan, minum, dan tempat penampung feses. Kandang diletakan pada ruang tertutup dengan ventilasi dan penerangan yang
34
cukup. Lampu dinyalakan pada siang hari dan dimatikan pada malam hari agar tidak mengubah siklus hidup hewan coba. 2. Senyawa Uji dan Pembanding Rimpang jahe diperoleh dari Balai penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balitro) Departemen Pertanian Bogor. Zn sulfat dan atorvastatin diperoleh dari PT. Kalbe Farma Jakarta. 3. Senyawa Kimia dan Reagen Senyawa Kimia dan reagen yang digunakan antara lain kit kolesterol (Boehringer Mannheim), TCA, TBA, dl-epinefrin, tetraetilpropan (TEP) (Merk), berbagai pelarut dan buffer, dan Oil Red O. 4. Pakan untuk Penelitian Pakan yang digunakan ada dua macam, yaitu pakan standar dan pakan aterogenik (pakan standar yang mengandung kolesterol 0,5% dan 5% minyak kelapa). Pakan standar dan aterogenik dibuat oleh Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Deptan RI Ciawi Bogor. Nilai kalori pakan standar adalah 2600 kkal/kg dan pakan aterogenik sebesar 2900 kkal/kg (Komposisi pakan terdapat di Lampiran 12). 5. Peralatan Peralatan yang dibutuhkan antara lain, siring (spuit), kandang hewan coba yang dilengkapi tempat pakan dan minum, timbangan hewan, neraca analitik, sentrifus klinik, sentrifus dingin, spektofotometer, peralatan bedah, water bath, peralatan gelas, oven, rotari evavorator, spektrofotometer klinik, mikropipet, peralatan untuk membuat sediaan histopatologi, mikroskop olympus, kamera, kamera mikroskop digital,
program minitab 15, dan
program MacBiophotonic.
Protokol Penelitian 1. Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) menggunakan tujuh perlakuan yang diulang empat kali. Percobaan terdiri atas dua tahap, yaitu tahap adaptasi dan tahap perlakuan. Tahap adaptasi dilakukan selama dua minggu, yaitu kelinci diberi pakan standar dan
35
air minum ad libitum. Rata-rata konsumsi pakan harian selama adaptasi digunakan sebagai acuan pemberian pakan pada masa perlakuan. Jumlah pakan standar yang diberikan adalah 48, 2 g/kg BB dan pakan aterogenik 43,2 g/kg BB. Pakan standar dan pakan aterogenik yang diberikan dengan jumlah tersebut mempunyai kalori yang seimbang. Hewan coba sebanyak dua puluh delapan ekor dibagi menjadi tujuh kelompok. Selama 6 minggu kelompok 1 hanya mendapatkan diet standar, kelompok 2 mendapatkan diet aterogenik. Kelompok 3,4,5,6 dan 7 secara berturut-turut selain mendapatkan diet aterogenik juga mendapatkan perlakuan Zn 6,67 mg/kg, EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, dan atorvastatin 1,9 mg/ kg BB per hari. Kadar lemak feses diukur pada minggu ketiga. Kadar kolesterol total dan LDL diukur pada awal dan akhir perlakuan, dan plak ateroma, kadar MDA, dan aktivitas SOD ditetapkan pada akhir perlakuan. 2. Penyiapan EERJ Rimpang jahe yang telah dikeringkan diserbuk hingga diperoleh diameter 40 mesh, serbuk yang diperoleh dimaserasi dengan etanol 70% selama 2 hari atau sampai maserat menjadi jernih. Ampas disaring dan dimaserasi ulang dengan etanol 70% hingga cairan penyari jernih. Filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan evaporator pada suhu tidak lebih dari 60oC hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental dikeringkan dalam oven suhu 50oC hingga diperoleh ekstrak kering. Pemberian ekstrak pada hewan coba diberikan dalam bentuk suspensi dalam NaCMC 0,5% dan cara penyiapan suspensi sebagaimana terdapat di Lampiran 10. 3. Pengukuran Kadar Kolesterol Total dan LDL Kadar Kolesterol total dan LDL diukur dengan metode CHOD-PAP (Cholesterol Oxidase-p-aminophenozone) dengan prinsip pengujian secara enzimatis kolorimetri (Lampiran 4).
36
Tabel 3.1 Skema Penelitian Antiateroma pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik Perlakuan Diet standar
Awal Kadar KT dan LDL
Diet aterogenik Kadar KT dan (DA) LDL
DA + Zn 6,67 mg/kg BB
Kadar KT dan LDL
DA + EERJ 200 mg/kg BB
Kadar KT dan LDL
DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB
Kadar KT dan LDL
DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB
Kadar KT dan LDL
DA + Kadar KT dan atorvastatin 1,9 LDL mg/kg BB
Pemeriksaan Minggu ke 2-3 Minggu ke 6 Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar lemak Kadar KT, LDL, dan feses luas dan tebal plak tunika intima Kadar MDA dan aktivitas SOD
4. Pengukuran Peroksidasi Lipid (Kadar MDA) Kadar
MDA
ditetapkan
dengan
metode
TBA,
yang
prinsip
pengukurannya adalah adanya pengaruh asam dan panas menyebabkan dekomposisi peroksida lipid diikuti perubahan warna menjadi merah muda.
37
Warna yang terjadi diukur dengan spektrofotometri pada λ 520-532 nm. MDA merupakan senyawa aldehid terkonjugasi yang memiliki dua ikatan rangkap. Senyawa yang memiliki ikatan rangkap umumnya bersifat kromofor yang menyerap sinar pada daerah UV-Vis (Wills 1987). Cara penetapan kadar MDA secara terperinci terdapat di Lampiran 5 dan 6. 5. Pengukuran SOD Aktivitas SOD ditetapkan berdasarkan metode Adenokrom (Deby 1990). Cara penetapan kadar MDA secara terperinci terdapat di Lampiran 5 dan 7. 6. Pengukuran Lemak Feses (Hernaman et al. 2008) Labu penyari serta batu didih dicuci sampai bersih, dikeringkan dalam o
oven pada suhu 105-110 C selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator. Setelah itu ditimbang bobotnya (A). Satu gram sampel (X), dimasukkan ke dalam selongsong penyari dan ditutup dengan kapas bebas lemak. Selongsong penyari yang berisi sampel dimasukkan ke dalam alat Soxhlet dan disaring dengan petrolium eter di atas penangas air. Setelah o
penyarian selesai (4 jam), labu penyari dikeringkan dalam oven 105-110 C selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator dan beratnya ditimbang (B). Kadar lemak kasar dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Lemak Kasar (%) = ([B – A]/X) x 100% 7. Analisis Histopatologi a. Penentuan Plak Ateroma Penentuan plak dilakukan di decending aorta dengan pewarna Oil Red O. Aorta dipotong secara memanjang (longitudinal) dan
dibuka. Pada saat
pewarnaan aorta yang telah dibuka dicuci dengan bufer fosfat (PBS) sebanyak 3 kali. Aorta yang sudah dibersihkan lalu dicuci dengan larutan isopropanol
60%. Selanjutnya aorta dimasukkan ke dalam larutan Oil Red O 0,3% dalam isopropanol selama 10 menit. Aorta yang sudah direndam dalam pewarna di atas dicuci dengan larutan isopropanol 10% sebanyak 3 kali dan dilanjutkan dicuci dengan aquades. Aorta yang sudah terwarnai dibentangkan pada papan karet dengan bantuan jarum pentul lalu difoto.
38
Warna merah yang terbentuk di tunika intima merupakan hasil reaksi antara Oil Red O dengan lemak. Luas warna merah yang terbentuk selanjutnya ditentukan dengan program digital image Bio-imaging (NIH. 2009). Persentase warna merah merupakan ukuran luas ateroma yang terbentuk.
b. Pengamatan Tebal Ateroma Analisis histologi dilakukan pada decending aorta, karena di tempat tersebut sering terbentuk plak (Kolodgie et al. 1996; VanderLaan et al. 2004). Tahapan pertama
dalam pengamatan ini adalah pembuatan preparat yang mengacu
pada prosedur umum mikrotehnik dengan fiksatif larutan buffer netral formalin (BNF) 10%. Sampel difiksasi dalam larutan BNF 10% selama 24 jam lalu dipotong dengan ukuran 3–5 mm. Potongan jaringan tersebut didehidrasi yaitu dimasukkan ke dalam alkohol dengan konsentrasi 70%, 80%, 90% masingmasing selama ± 2 jam dan alkohol 95% selama 1 jam kemudian dimasukkan dalam alkohol 100% selama satu jam sebanyak 3 kali ulangan. Setelah proses dehidrasi, kemudian jaringan tersebut dimasukkan ke dalam xylol dan parafin cair suhu 56OC (proses clearing) selama satu jam sebanyak 3 kali ulangan dan setelah itu dilakukan penanaman jaringan ke dalam parafin (embedding). Jaringan yang telah ada dalam blok-blok parafin diiris dengan mikrotom. Hasil potongan jaringan setebal ± 5 mikron dibentangkan dalam water bath pada suhu 40OC. Sayatan dilekatkan di atas gelas objek, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37OC dan setelah melekat sempurna siap untuk diwarnai. Tahapan selanjutnya adalah pewarnaan. Untuk aorta dilakukan pewarnaan
dengan menggunakan hemotoxylin-eosin. Tahapan terakhir dilem dengan entelan dan ditutup dengan cover glass (mounting), kemudian diamati di bawah mikroskop dan kemudian dilakukan pengambilan gambar dengan mikroskop kamera (Olympus) dengan pembesaran 200 kali.
Analisis Data Data yang berupa kadar lemak feses, kolesterol total, LDL, MDA, SOD, bobot badan, dan luas serta tebal plak di tunika intima (ateroma) dianalisis dengan menggunakan analisis varian (ANOVA) dan kalau ada pengaruh perlakuan dilanjutkan dengan uji perbandingan berganda Tukey LSD. Analisis dilakukan dengan software Minitab 15.
39
Hasil dan Pembahasan
Kadar Lemak Feses Kadar lemak feses ditentukan dari feses yang dikumpulkan pada minggu ketiga penelitian dengan tujuan absorpsi dan ekskresi lemak sudah stabil atau relatif tidak bervariasi antarindividu (Hernaman et al. 2008). ANOVA terhadap kadar lemak total dalam feses diketahui ada pengaruh perlakuan (p=0,0427). Hasil penelitian yang tertera dalam Tabel 3.2 menunjukkan bahwa kadar lemak feses kelompok yang mendapatkan diet standar lebih kecil dan berbeda bermakna dari kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik. Ini terjadi karena kandungan lemak pada pakan standar lebih kecil dibandingkan kandungan lemak pada pakan aterogenik, yaitu 13,42% dan 28,47%. Kandungan lemak yang tinggi pada pakan aterogenik menyebabkan tidak semuanya dapat diabsorpsi oleh saluran pencernaan yang kemungkinan disebabkan oleh keterbatasan asam empedu yang disekresikan di usus halus dan singkatnya waktu absorpsi. Secara kuantitatif kadar lemak feses pada kelompok hewan yang mendapatkan diet aterogenik dan perlakuan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok yang mendapatkan diet aterogenik saja, kecuali pada perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn,
ini menunjukkan bahwa kebanyakan perlakuan tidak
menghambat absorpsi lemak. Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa EERJ secara lokal menghambat absorpsi lemak (Powell 2000). Nilai kadar lemak feses pada hewan coba yang mendapatkan diet aterogenik dan perlakuan Zn, EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin lebih kecil dibandingkan kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik, kecuali perlakuan kombinasi EERJ
50 mg/kg dengan Zn. Ini menunjukkan bahwa
perlakuan tersebut kebanyakan tidak efektif menghambat absorpsi lemak dari diet. Kadar lemak feses pada hewan coba yang mendapatkan diet aterogenik dan perlakuan kombinasi EERJ
50 mg/kg dengan Zn nilainya lebih tinggi
dibandingkan kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik saja, ini memungkinkan bahwa kombinasi tersebut berpengaruh dalam menghambat absorpsi lemak (Sanghal et al. 2012).
40
Tabel 3.2 Rerata Lemak Feses (%) pada Minggu ke Tiga Perlakuan dan Luas Plak Ateroma Tunika Intima (%) dengan Pewarnaan Oil Red O Perlakuan
Lemak Feses Luas Plak Tunika (%) Intima (%) Diet standar 4,23 ± 0,31ac 37,98 ± 0,90ad Diet aterogenik (DA) 6,24 ± 1,10bc 56,03 ± 2,66b DA + Zn 6,67 mg/kg BB 5,36 ± 1,48c 52,48 ± 3,49b c DA + EERJ 200 mg/kg BB 4,93 ± 2,61 48,98 ± 3,75c DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 7,15 ± 1,81b 42,20 ± 5,10dc c DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 4,79 ± 2,95 46,98 ± 0,88ec DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB 5,20 ± 1,99c 43,55 ± 2,42d Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Hasil
di atas terjadi kemungkinan karena baik atorvastatin, Zn, dan
pemberian kombinasi EERJ dan Zn memacu peningkatan enzim kolesterol-7αhidroksilase hepatik dan menghambat hydroxymethylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase (Sanghal et al. 2012) sehingga meningkatkan sekresi asam empedu ke dalam usus halus. Peningkatan sekresi asam empedu ke dalam usus halus akan meningkatkan emulsifikasi lemak dari diet, sehingga efektivitas absorpsi lemak meningkat.
Meningkatnya
absorpsi
lemak
inilah
yang
kemungkinan
menyebabkan tidak adanya perbedaan kadar lemak feses yang signifikan dengan diet normal. Hal ini yang kemungkinan menyebabkan perlakuan Zn dan kombinasi EERJ 100 mg dengan Zn belum dapat menghambat kenaikkan kadar kolesterol total dan LDL sebagaimana kontrol normal.
Akumulasi Lemak dalam Tunika Intima Luas plak ateroma yang ditunjukkan Tabel 3.2 membuktikan bahwa diet aterogenik menyebabkan terjadinya peningkatan akumulasi lemak pada tunika intima. Data pada Tabel 3.2 menunjukkan ada perbedaan yang signifikan antara hewan coba yang hanya mendapatkan diet stándar dengan hewan yang mendapatkan diet aterogenik dengan nilai 37,98 ± 0,9% berbanding 56,03 ± 2,66%. Pemberian Zn pada hewan coba diet aterogenik tidak dapat mencegah akumulasi lemak dalam tunika intima karena % luas plak ateroma yang terbentuk sama (p>0,05) dengan hewan coba yang hanya mendapatkan diet aterogenik. Zn
41
belum efektif mencegah akumulasi lemak dalam tunika intima karena dosis yang diberikan relatif kecil, yaitu 6,67 mg/kg BB. Menurut Ren et al. 2006, Zn yang efektif untuk mencegah aterogenik pada kelinci adalah suplementasi pakan sebesar 1g/kg yang diberikan selama 8 minggu. Jika konsumsi pakan kelinci sebesar 48,2 g/kg BB, maka besarnya dosis Zn adalah 48,2 mg/kg BB. Pemberian EERJ 200 mg/kg pada hewan coba yang diberi diet aterogenik dapat mengurangi akumulasi lemak dalam tunika intima (p<0,05) dibandingkan dengan luas lemak pada tunika intima pada hewan coba yang diberi diet aterogenik saja. Namun secara kuantitatif efektivitas dari EERJ 200 mg/kg pada hewan coba diet aterogenik masih lebih rendah dibandingkan dengan kombinasi EERJ dengan Zn serta atorvastatin (Tabel 3.2). Efektivitas kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn kecenderungannya lebih tinggi dibandingkan dengan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn serta atorvastatin dalam mencegah akumulasi lemak pada tunika intima dan sama (p>0,05) dengan akumuasi lemak pada diet standar. Hasil ini kemungkinan salah satunya karena kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn paling efektif dalam menghambat absorpsi lemak dalam saluran pencernaan (Tabel 3.2). Hambatan absorpsi lemak dari diet akan menyebabkan berkurangnya kadar lemak dalam sirkulasi sistemik yang selanjutnya akan mengurangi akumulasi lemak dalam tunika intima. Komponen
EERJ
yang
efektif
sebagai
antihiperkolesterolemia
dan
antioksidan adalah polifenol. Polifenol sering kehilangan aktivitasnya jika berada pada konsentrasi yang tinggi karena bersifat prooksidan dan terlibat dalam reaksi inisiasi degradasi membran sel (asam lemak jenuh) serta dapat menghambat enzim kolesterol-7α-hidroksilase dan memacu terbentuk MDA. Efek antioksidan senyawa fenol timbul karena kemampuannya sebagai donor hidrogen yang cepat pada radikal lemak (ROO* dan RO*) dengan reaksi sebagai berikut (Welson 2006):
ROO* + AH
ROOH +A*
RO* + AH
ROH +A*
ROO* + A*
ROOA
AH = antioksidan fenolik
42
Dalam kondisi berlebihan, A* dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas dari asam lemak dengan reaksi sebagai berikut: A* + O2
AOO*
AOO* + RH
AOOH + R*
A* + RH
AH + R*
Kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn paling efektif sebagai antiateroma karena menghambat absorpsi dan menghambat akumulasi lemak dalam tunika intima pada hewan coba yang diberi diet aterogenik. Kesimpulan ini didukung oleh kenyataan bahwa luas lemak pada tunika intima merupakan parameter kuantitatif untuk menilai adanya aterosklerosis atau kondisi pra-aterosklerosis (VanderLaan et al.2004). Berdasarkan Tabel 3.2 dapat dilihat bahwa perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg menyebabkan luas plak dalam tunika dan tidak berbeda dengan kontrol normal (p<0,05). Kenaikan Kadar Kolesterol Total dan LDL Pemberian diet aterogenik terbukti dapat meningkatkan persentase kadar kolesterol total dan LDL jika dibandingkan dengan kelompok hewan yang hanya mendapatkan diet standar (Tabel 3.3). Pemberian perlakuan Zn pada hewan coba diet aterogenik terbukti dapat menghambat peningkatan kadar kolesterol total secara signifikan dan secara kuantitatif juga menghambat peningkatan LDL. Efektivitas Zn dalam menghambat peningkatan kolesterol total atau LDL masih rendah jika dibandingkan dengan perlakuan lain maupun atorvastatin (p<0,05). Perlakuan EERJ 200 mg/kg dan kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin efektif menghambat kenaikkan kolesterol total dan LDL pada hewan coba diet aterogenik karena kenaikkannya sama dengan hewan coba yang hanya mendapatkan diet standar (p>0,05). Namun, kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan
Zn dalam menghambat kenaikkan kolesterol total dan LDL
cenderung lebih baik dibandingkan perlakuan lain dan atorvastatin. Peningkatan persentase kadar kolesterol total dan LDL pada perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg adalah terendah dengan nilai kenaikkan kolesterol total 73,57 ± 21,2% dan LDL 41,4 ± 19,2% yang berturutturut diikuti oleh atorvastatin, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/
43
kg, dan EERJ 200 mg/kg. Perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg menghambat kenaikkan kolesterol total dan LDL lebih kecil dibandingkan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, ini terjadi kemungkinan karena perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg sifat antioksidannya berlebihan sehingga berubah menjadi
prooksidan. Sifat
prooksidan ini akan menghambat konversi kolesterol menjadi asam empedu yang melibatkan cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) (Shibata et al. 2007). Hambatan enzim cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) menjadikan konversi kolesterol menjadi asam empedu berkurang dan berakibat ekskresi kolesterol melalui feses juga berkurang. Ekskresi yang berkurang akan menyebabkan kadar kolesterol dalam plasma akan relatif tinggi.
Tabel 3.3 Rerata Kenaikkan Kadar Kolesterol Total dan LDL (%) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
Diet standar Diet aterogenik (DA) DA + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 200 mg/kg BB DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB
pada
Kenaikkan Kenaikkan LDL Kolesterol Total (%) (%) 61,73 ± 11,3a 59,3 ± 9,4a 666,70 ± 201,74b 639,9 ± 299,9b 304,65 ± 84,02c 306,6 ± 74,8b a 93,25 ± 45.6 98,7 ± 38,0a 73,57 ± 21,2a 41,4 ± 19,2a a 90,80 ± 43,94 96,0 ± 57,3a 107,17 ± 25,0a 113,4 ± 32,6a
Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Tiga faktor utama yang mempengaruhi kadar kolesterol dalam darah adalah jumlah kalori yang masuk dalam tubuh, kandungan lemak jenuh, dan kandungan kolesterol dalam diet yang diberikan. Diet aterogenik meningkatkan kolesterol total dan LDL karena asupan lemak dan kolesterol yang berlebihan dalam jangka yang relatif lama akan mengurangi pembentukan reseptor LDL di sel hepar atau sel lain sehingga bersihan kolesterol dalam darah akan berkurang. Tujuh puluh persen LDL akan dibersihkan dari darah melalui reseptor yang ada di sel hepar dan sisanya melalui reseptor sel lain, seperti sel kelenjar adrenal, sel otot polos,
44
sel endotel, sel limfoid, dan sel scavenger monosit dan makrofag (Matfin dan Port 2008). Pemberian EERJ 200 mg/kg dan kombinasi EERJ dengan Zn pada hewan coba yang diberi diet aterogenik dapat mencegah kenaikkan kadar kolesterol total dan LDL karena kenaikkannya sama dengan hewan coba yang hanya mendapatkan diet standar, walaupun secara kuantitatif selisihnya cukup besar, ini terjadi karena standar deviasi (SD) yang besar. Nilai SD yang besar sulit dihindari karena data kadar kolesterol total dan LDL sebelum perlakuan sudah bervariasi dengan rentang 48,35-72,10 mg/dL
dan 36,58-67,53 mg/dL)
(Lampiran 18 dan 19). Pada kelinci yang diberi diet aterogenik atorvastatin dan kombinasi EERJ 50 mg/kg BB dan Zn 6,67 mg/kg BB memberikan hasil yang sama dengan kontrol normal baik dalam mencegah kenaikkan kolesterol total dan LDL maupun mencegah terbentuknya ateroma. Namun, kombinasi EERJ 50 mg/kg BB dengan Zn 6,67 mg/kg BB cenderung lebih baik dibandingkan atorvastatin (Tabel 3.3) dalam menghambat kenaikkan kolesterol total, LDL, dan plak ateroma. Berdasarkan data di atas, kombinasi EERJ 50 mg/kg BB dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari paling potensial untuk mencegah aterosklerosis. Perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg BB dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari dalam menghambat peningkatan kolesterol total dan LDL jika dibanding atorvastatin adalah (73,57 ± 21,2 VS 107,17 ± 25,0 mg/dL) dan (41,4 ± 19,2 VS 113,4 ± 32,6 mg/dL). Hasil ini terjadi kemungkinan karena antara EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg bersifat saling menguatkan dalam menurunkan kadar kolesterol dan sifat antioksidannya. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa EERJ dan Zn dapat menurunkan kadar kolesterol dan mencegah aterosklerosis (Nammi et al.2009; Reiterer et al. 2005).
Peningkatan Bobot Badan Selama Percobaan Pada kelompok hewan coba yang diberi diet aterogenik dan perlakuan, jumlah lemak yang diabsorpsi dari pakan lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol normal karena kadar lemak feses tidak berbeda (p>0,05), kecuali pada perlakuan dengan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn. Perbedaan jumlah
45
lemak yang diabsorpsi tidak mempengaruhi peningkatan bobot badan (Tabel 3.4). Hal ini disebabkan nilai kalori diet standar dan diet aterogenik yang diberikan pada hewan coba adalah sama. Nilai konsumsi kalori yang sama dan usia kelinci yang sudah lebih dari 3 bulan menyebabkan kenaikan bobot badan yang tidak berbeda (Tabel 3.4). Pada kelompok hewan coba yang diberi diet aterogenik dan tanpa perlakuan terjadi kenaikkan kadar kolesterol total dan LDL serta akumulasi lemak dalam tunika intima lebih tinggi (p<0,05) dibandingkan yang mendapatkan perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin, namun tidak mempengaruhi kenaikkan bobot badan. Hal tersebut terjadi kemungkinan karena pengaruh pemberian Zn yang dapat mempengaruhi distribusi LDL dan lemak dari jaringan. Kemungkinan tersebut didukung oleh pernyataan Eby and Halcomb 2005 bahwa pemberian Zn dapat mengurangi gejala angina pektoris karena menyebabkan redistribusi LDL kolesterol dari jaringan jantung.
Tabel 3.4 Rerata Kenaikkan Bobot Badan Kelinci (%) Setelah Perlakuan Perlakuan Kenaikkan Bobot Badan (%) Diet standar 9,84 ± 4,90 Diet aterogenik (DA) 7,73 ± 1,99 DA + Zn 6,67 mg/kg BB 9,49 ± 2,68 DA + EERJ 200 mg/kg BB 10,48 ± 2,43 DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 9,76 ± 1,51 DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 10,42 ± 4,03 DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB 8,28 ± 3,02 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Histologi Aorta dengan Pewarnaan HE Adanya kolesterol yang berlebihan di pembuluh darah mendorong migrasi monosit dan makrofag ke dalam tunika intima pembuluh darah. LDL yang berlebihan di sirkulasi sistemik menyebabkan ambilan LDL oleh monosit dan makrofag melalui reseptor scavenger akan meningkat. Pengambilan LDL yang meningkat oleh makrofag di dinding arteri menyebabkan akumulasi kolesterol ester dan membentuk sel busa yang dapat berkembang menjadi aterosklerosis (Matfin and Port 2008). Pada penelitian ini, plak ateroma terbentuk pada 50%
46
hewan coba yang hanya mendapatkan diet aterogenik dengan ketebalan 9-49% dan pada 25% hewan coba yang mendapatkan diet aterogenik dan perlakuan Zn dengan ketebalan 9% (Gambar 3.2 dan Gambar 3.3). Hasil ini konsisten dengan akumulasi lemak dalam tunika intima dan kenaikkan kolesterol total dan LDL pada kelompok hewan coba tersebut (Tabel 3.2 dan Tabel 3.3)
Gambar 3.1 Histologi Aorta Normal (Pewarnaan HE). Makrofag yang ada di vaskular
akan melepaskan radikal bebas (R*) dan
mengoksidasi LDL. Selain makrofag, sel lain yang dapat mengoksidasi LDL dan terlibat dalam pembentukan lesi aterosklerosis adalah sel endotel dan sel otot polos. LDL yang teroksidasi toksik terhadap endotel, mudah difagosit oleh makrofag, mendorong diferensiasi monosit menjadi makrofag, dan menghambat mobilisasi
makrofag.
Tahap
awal
terbentuknya
aterosklerosis
adalah
pembentukan fatty streak (garis lemak) yang merupakan kumpulan sel busa pada subendotel. Dalam kondisi normal, ambilan LDL melalui reseptor alamiahnya bersifat down regulated dengan peningkatan kolesterol intraseluler dan masuknya kolesterol melalui jalur ini tidak akan membentuk sel busa (Young and McEneny 2001). LDL teroksidasi hanya dikenali oleh reseptor scavenger makrofag dan mudahkan difagosit oleh makrofag, sehingga akan meningkatkan ambilan LDL oleh makrofag (Vijver et al. 1998). Ambilan LDL oleh reseptor scavenger
47
makrofag tidak bersifat down regulated menyebabkan terjadinya
akumulasi
kolesterol dan terbentuknya sel busa yang semakin lama semakin membesar (Singh and Jialal 2006).
plak
Gambar 3.2 Plak Aorta dengan Pewarnaan HE pada Hewan Coba yang Diberi Diet Aterogenik
Berdasarkan data pada Tabel 3.2, dan Gambar 3.3 dapat diketahui bahwa Zn dosis 6,67 mg/kg BB belum dapat mencegah akumulasi lemak dalam tunika intima dan kenaikkan kadar kolesterol total, maka wajar jika pada kelompok ini masih terbentuk plak ateroma. Pemberian EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin dapat menghambat akumulasi lemak pada tunika intima, kenaikkan kolerterol total, dan LDL sehingga tidak menyebabkan terbentuknya plak ateroma (Tabel 3.2 dan Gambar 3.1). Hasil ini membuktikan bahwa EERJ, kombinasi EERJ dan Zn bersifat antioksidan, penurun kolesterol, dan
antiaterogenesis dan hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya (Nabil
et al. 2009; Reiterer et al. 2005).
48
plak
Gambar 3.3 Plak Aorta yang Terjadi pada Hewan Coba yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Zn
Kadar MDA dan aktivitas SOD Kadar MDA ditetapkan dengan metode tree barbituric acid test (TBA test) dengan standar tetraetilpropan (TEP). TEP dengan nama kimiawi 1,1,3,3 tetramethoxypropan merupakan derivat MDA yang dengan mudah terhidrolisis menjadi MDA sehingga dapat sebagai pembanding penetapan kadar MDA. Kurva standar untuk penetapan kadar MDA menggunakan TEP konsentrasi 0,25; 0,5; 1; 2; dan 4 nmol/mL, diperoleh persamaan garis lurus Y = 0,00075 + 0,239 X (Lampiran 6). Kadar MDA dipilih sebagai parameter stres oksidatif karena terbentuk secara proporsional akibat reaksi radikal bebas dengan bagian sel terutama membran sel yang banyak terdapat asam lemak dengan ikatan rangkap, selain itu MDA mudah ditentukan kadarnya.
Kurva kalibrasi untuk penetapan kadar MDA
menggunakan 1,1,3,3 tetraethoxypropane (TEP) sebagai standar karena MDA tidak stabil. Prinsip TBA test adalah MDA dapat bereaksi dengan TBA pada suhu panas dan dalam suasana asam menghasilkan produk berwarna merah muda yang akan mengabsorpsi sinar pada panjang gelombang 532 nm (Gambar 3.4). Kurva standar yang dibuat dengan TEP akan menghasilkan koefisien ekstingsi sebesar 1,56 105 M-1 cm-1 yang juga dapat digunakan untuk menghitung
49
kadar MDA. TBA test sensitif mengukur kadar MDA total, yaitu MDA bebas dan MDA hasil peruraian lipid peroksidasi (Wills 1987).
MDA
TBA
Ikatan MDA-TBA (merah muda)
Gambar 3.4 Reaksi antara MDA dengan TBA (Halliwel and Gutteridge 1991)
Kadar MDA paling tinggi terjadi pada kelompok hewan coba yang hanya mendapatkan diet aterogenik, yaitu 0,93 ± 0,03 nmol/ml (Tabel 3.5). Ini membuktikan bahwa kondisi hiperkolesterolemia dapat meningkatkan radikal bebas.
Nilai ini lebih tinggi dibandingkan penelitian lain yang juga
menggunakan kelinci hiperkolesterolemia, yaitu 0,52 ± 0,02 nmol/mL (Madhumathi et al. 2005).
Tabel 3.5 Kadar MDA (nmol/mL) dan Aktivitas SOD (Unit/mg Protein) pada Kelinci karena Perlakuan Perlakuan
Kadar MDA Aktivitas SOD (nmol/mL) (Unit/mg Protein) 0,21 ± 0,02a 3,47 ± 0,68ad Diet standar 0,93 ± 0,03b 1,66 ± 0,18bc Diet aterogenik (DA) 0,64 ± 0,02c 2,79 ± 0,28c DA + Zn 6,67 mg/kg BB 0,41 ± 0,02d 3,01 ± 0,73dc DA + EERJ 200 mg/kg BB 0,29 ± 0,03e 3,22 ± 0,70d DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 3,62 ± 0,52d DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 0,37 ± 0,03fd 0,46 ± 0,02gd 3,26 ± 0,53d DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Diet aterogenik atau karena kondisi hiperkolesterolemia menyebabkan peningkatan aktivitas enzim kolesterol 7α-hidroksilase (CYP7A1) hepatik suatu rate limiting enzyme pada biosintesis asam empedu (Fuhrman et al. 2000).
50
Peningkatan radikal bebas akan memacu terjadinya peroksidasi lipid yang salah satu produknya adalah MDA. Selain itu, kondisi hiperkolesterolemia dapat meningkatkan pembentukan radikal superoksid (O 2 *-) dan mengurangi endothelia dependent relaxation (EDR) yang terkait dengan peningkatan aktivitas vaskular
NADPH oksidase (Singh dan Jialal 2006). Radikal superoksid yang
berlebihan dapat mengoksidasi lemak tidak jenuh pada membran sel dan akan menghasilkan produk akhir yang berupa aldehid seperti MDA dan 4-hidroksi etanal (4 HE) (Young and McEneny 2001). Kadar MDA yang tinggi berpotensi menimbulkan cedera pada endotel yang dapat memicu timbulnya aterosklerosis (Matfin and Port 2008). Kadar MDA yang tinggi juga menunjukkan adanya LDL teroksidasi yang tinggi pula. LDL teroksidasi berisifat pro-inflamasi, menghambat endothelial nitric oxide syntethase (eNOS), merangsang vasokontriksi dan adhesi, meningkatkan regulasi vascular endothelial growth factor (VEGF), sitotoksik, dan merangsang retensi makrofag. LDL teroksidasi tidak dikenali oleh reseptornya di hepar tetapi dikenali oleh reseptor scavenger di makrofag (reseptor pembersih) yang tidak mengalami down regulation, berakibat makrofag terus-menerus menumpuk ester kolesterol dan membentuk sel busa (Gambar 3.2) (Singh and Jialal 2006). Ilmuwan Jepang dan Amerika berpendapat bahwa efek antiaterogenik dari antioksidan (penghambat terbentuknya MDA) lebih besar dibandingkan obat-obat penurun kolesterol (Halliwel and Gutteridge 1991). Efek antioksidan lebih baik dibandingkan penurun kolesterol karena jika tidak terbentuk LDL teroksidasi maka tidak akan terbentuk sel busa karena ambilan LDL kolesterol yang tidak teroksidasi oleh makrofag bersifat down regulated. Berdasarkan kadar MDA hasil penelitian, perlakuan Zn, EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin bersifat sebagai antioksidan karena kadar MDA yang terbentuk lebih kecil (p<0,05) dibanding dengan hewan coba yang hanya mendapatkan diet aterogenik (Tabel 3.5). Hasil ini sesuai dengan berbagai penelitian yang telah dikerjakan lebih dulu. Kemampuan Zn sebagai antioksidan adalah paling lemah, ini kemungkinan karena pemberiannya yang relatif singkat dan dosisnya relatif kecil. Dalam uji klinik, Zn dosis 45 mg/hari dapat menurunkan MDA, protein C-reaktif, interleukin 6, MCP-1, VCAM 1, hydroxyl
51
alkenal (HAE) setelah diberikan selama 6 bulan (Bao et al. 2010). Pemberian kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB paling efektif sebagai antioksidan karena kadar MDA yang paling kecil dibandingkan perlakuan lain (p<0,05). Perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari masih lebih baik dibandingkan perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari. Hal ini kemungkinan terjadi karena antioksidan yang berlebihan dapat bersifat sebagai oksidan (Halliwel and Gutteridge 1991). SOD adalah antioksidan enzimatik yang mengkatalis dismutase O 2 *- menjadi H 2 O 2 . Subtrat SOD yaitu O 2 *- tidak stabil dan sukar diukur, maka aktivitas SOD diukur secara tidak langsung. Pengukuran adenokrom merupakan metode penetapan aktivitas SOD secara tidak langsung yang cukup sensitif. Pengukuran berdasarkan pada kemampuan SOD menghambat autooksidasi spontan dari epinefrin. Larutan epinefrin dalam lingkungan asam akan stabil, tetapi spontan teroksidasi dengan adanya
pH. Pada pH 10,2 dan suhu 30 0C autooksidasi
berjalan cepat dan terbentuk adenokrom dengan kecepatan linear. Adenokrom yang terbentuk mempunyai puncak-puncak absorpsi atau absorpsi maksimal pada lamda 480 nm, 325 nm, dan 295 nm. Pada lamda 325 nm dan 295 nm terbentuk adenokrom secara linear selama 4 menit, sedangkan pada lamda 480 nm akan linear selama 12 menit. Berdasarkan hal ini, SOD dapat diukur secara spektrofotometer dengan mengikuti pembentukan adenkrom (Misra 1995). Satu unit SOD adalah kemampuan atau aktivitas antioksidan yang mampu menghambat 50% peruraian epinefrin menjadi adenokrom (Halliwell and Gutteridge 1991). Hasil penelitian (Tabel 3.5) menunjukkan bahwa aktivitas SOD terendah terjadi pada kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik dan diikuti kelompok diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan dengan Zn (p>0,05). Hal ini paralel dengan terjadinya kenaikkan MDA kelompok diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan Zn saja. Hasil ini sesuai dengan pernyataan Agarwal et al. (1996), bahwa peningkatan MDA selalu diikuti dengan penurunan SOD. Pendapat Agarwal bertentangan dengan hasil penelitian atau pendapat lain, yang menyatakan
bahwa pada saat terjadinya stres oksidatif terjadi peningkatan
52
aktivitas SOD (Papas 1998). Hewan coba diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin terjadi peningkatan SOD dibandingkan kelompok diet aterogenik (p<0,05) Fenomena di atas dapat dijelaskan sebagai berikut.
Ketika terjadi stres
oksidatif karena pemberian diet aterogenik, perlindungan tubuh terhadap radikal bebas terutama oleh antioksidan enzimatik akan diinduksi, sehingga aktivitas enzim antioksidan meninggkat. Paparan radikal bebas yang terus menerus menyebabkan antioksidan enzimatik tidak selalu dapat diinduksi sampai suatu saat aktivitasnya berkurang lagi.
Berdasarkan dari penelitian-penelitaian
terdahulu, peningkatan antioksidan enzimatik karena induksi radikal bebas hanya dapat berlangsung selama empat minggu (Masaru and Ichinose 1990), dan setelah itu aktivitas antioksidan berkurang lagi diikuti kenaikkan produk peroksidasi lipid seperti MDA. Pada penelitian ini induksi stres oksidatif dilakukan dengan pemberian diet aterogenik selama enam minggu, sehingga wajar jika aktivitas SOD pada hewan yang hanya mendapatkan diet aterogenik aktivitasnya rendah. Begitu juga pada kelompok diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan dengan Zn saja. Sifat antioksidan Zn rendah karena dosisnya relatif kecil dan hanya diberikan dalam waktu yang relatif pendek dibandingkan penelitian sebelumnya. Pada perlakuan dengan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin meningkatkan aktivitas SOD sehingga aktivitasnya sama dengan kontrol normal (P>0,05). Ini dapat terjadi karena baik EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin cukup kuat sebagai antioksidan nonenzimatik, sehingga pemberian diet aterogenik pengaruhnya oksidasinya dapat diminimalisir. Tubuh dapat beradaptasi dengan sedikit gangguan atau ketidak seimbangan oksidanantioksidan dengan meningkatkan mekanisme perbaikan yang melibatkan berbagai enzim, seperti ligase, nuklease, polimerase, proteinase, dan fosfolipase (Papas 1998). Selain itu, fungsi antioksidan dalam tubuh tidak dapat dinilai sendirian atau hanya satu jenis saja, tetapi harus dinilai secara bersama-sama. Antioksidan dalam tubuh bekerja bersama-sama sebagai satu sistem yang saling terkait dan bersifat aditif atau sinergis (Halliwell and Gutteridge 1991).
53
Simpulan dan Saran
Perlakuan Zn 6,67 mg/ kg per hari dapat menghambat peningkatan kolesterol total dan LDL pada kelinci yang diberi diet aterogenik tetapi tidak efektif mencegah terbentuknya plak ateroma. Perlakuan EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, dan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg BB per hari dapat menghambat peningkatan kolesterol total, LDL, dan mencegah terbentuknya plak ateroma sama dengan atorvastatin. Namun, kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB dalam menghambat peningkatan kolesterol total,
LDL, dan plak ateroma
kecenderungannya lebih baik dibandingkan perlakuan lain. EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin dapat meningkatkan aktivitas SOD sampai kondisi normal (p>0,05). Kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn dalam menurunkan kadar MDA adalah paling baik (p<0,05) sehingga paling efektif sebagai antioksidan. Berdasarkan parameter yang ditentukan, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn paling efektif mencegah ateroma pada kelinci yang diberi diet aterogenik. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang optimasi dosis kombinasi antara EERJ dengan Zn, mengingat kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg lebih baik dari EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg dalam mencegah ateroma.
54
Daftar Pustaka Agarwal DK, Misra R, Gujrati VR, Panday S, Shanker K. 1996. Duodenal ulcer and oxyradical system a preliminary study. Asia Fasific J of Pharm 11: 3336 Alsuhendra. 2004. Daya Antiaterosklerosis Zn-turunan Klorofil dan Daun Singkong (Manihot esculenta Crantz) pada Kelinci (Disertasi). Sekolah Pascasarjana IPB. Hal: 30-32 Bao B, Prasad AS, Beck FWJ, Fitzgerald JT, Snell D, Bao GW, Singh T, Cardozo LJ. 2010. Zn decrease C-reactive protein, lipid peroxidation, and inflammatory cytokines in elderly subjects: a Potential Implication of Zn as an Atheroprotective Agent. AM J Clin Nutr 91 (6): 634-41 Barnes J, Anderson LA, Phillipson JD. 2007. Herbal Medicines. Pharmaceutical Press: 293-97 Bhandari U, Kanojia R, Pillai KK. 2005. Effect of ethanolic extract of Zingiber officinale on dyslipidemia in diabetic rats. J of Ethnopharmacol Volume 97, Issue 2, p 227-30 Deby C, Goutier R. 1990. New perspectives on the biochemistry of superoxide anion and the efficiency of SOD. Biochem Phar; 39 (3): 399-405 Depkes RI. 2009. Profil Kesehatan Indonesia 2008. Depkes RI Jakarta Eby GA, Halcomb WW. 2005. High-dose zinc to terminate angina pectoris: A review and hipotesis for action by ICAM inhibition. Medical Hypotheses 66: 169-72 Fuhrman B, Rosenblat M, Hayek T, Coleman R, Aviram M. 2000. Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol, inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic, apolipoprotein E-deficient mice. J. Nutr. 130: 1124-31 Halliwell B, Gutteridge JMC. 1991. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press Oxford, second edition: 417-22 Hernaman I, Kamil KA, Mayasari N, Salin MA, 2008. Dampak nata de coco dalam ransum mencit (Mus musculus) terhadap metabolisme lemak dan penyerapan mineral. http://pustaka. unpad. ac. id/achives/26459 (30 Mei 2011) Kolodgie FD, Katocs AS, Largis EE. 1996. Hypercholesterolemia in the rabbit induced by feeding graded amounts of low-level cholesterol. Arterioscler, Thromb, and Vasc Biol; 16: 1454-64 Madhumathi BG, Venkatarangan MV, Gopumadhavan S, Rofiq M, Mitra SK. 2006. Induction and evaluation of atheroscleroris in New Zealand white rabbits. Indian J of Experiment Biol Vol 44; 203-08 Masaru S, Ichinose T. 1990. Experimental Study on Lipid Peroxide Formation and Tumor Promoting Effect of Nitrogen Dioxide and Ozone. In: Davies AJK Ed. Oxidative Damage and Repair. Pergamon Press: 511-16 Matfin G, Port CM. 2008. Disorders of Blood Flow in the Systemic Circulation in Phatophysiology Concepts of Altered Health States. Lippincott Williams and Wilkins, 8th: 475-85 Misra PH. 1995. Adenocrom Assay. In: Greenwald RA ed. CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press Florida: 237-241
55
Murray, Robert K, Granner, Daryl K, Mayes, Peter A, Rodwell, Victor W. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry; 26th edition; McGraw-Hill, New York. 205-30 Nabil GM, Attia AMM, Elhag MA. 2009. Radio protective effect of dietary ginger (Zingiber officinale Roscoe) against fast neutron-induce oxidative stress in rats. World Applied Sciences Journal 6 (4): 494-98 Nammi S, Sreemantula s, Rounfogalis BD. 2009. Protective effect of ethanolic extract of Zingiber officinale rhizome on the development of metabolic syndrome in high-fat diet-fed rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. May; 104 (5): 366-73 NIH. 2009. MacBiophotonic imageJ 1.38e/java 1.5.0_09. http//www.rsb.info.nih.gov/ij/feature.html. (22 Mei 2012) Paget GE, Barnes JM. 1964. Toxicity Test. Di dalam: Laurence DR, Bacharah AL, editor. Evaluation of Drug Activities: Pharmacomethrics. London: Academic Press. Hlm 135-165 Papas AM, editor. 1998. Antioxidant Status, Diet, Nutrition, and Health. CRC Press Boca Raton: 21-22 Powell SR. 2000. The antioxidant properties of zinc. J Nutr. 130: 1447s-54s Price SA, Wilson LM. 2006. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit. Penerbit Kedokteran, EGC, edisi 6 Vol. 1: 576-87 Reiterer G, MacDonald R, Browning JD, Morrow J, Matveev SV, Daugherty A, Smart E, Toborek M, Hennig B. 2005. Zinc deficiency increase plasma lipids and atherosclerosis markers in LDL-reseptor-deficient mice. J Nutr. 135: 2114-18 Ren M, Rajendran R, Ning P, Huat BTK, Nam OC, Watt F, Jenner A, Halliwell B. 2006. Zinc supplementation decreases the development of atherosclerosis in rabbits. Free Rad Biol & Med 41: 222-25 Sanghal A, Pant KK, Natu SM, Nischal A, Khattri S, Nath R. 2012. An Experimental study to evaluate the preventive effect of Zingiber officinale (ginger) on hypertension and hyperlipidemia and its comparison with Allium sativum (garlic) in rats. J of Med Plants Research; Vol. 6(25), p. 4231-4238 Shibata S, HakayawaK, Egashira Y, Sanada H. 2007. Hypocholesterolemic mechanism of chlorella: chlorella and its indigestible fraction enhance hepatic cholesterol catabolism trough up-regulation of cholesterol 7αhydroxylase in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(4), 916-925 Singh U, Jialal I. 2006. Review oxidative stress and atherosclerosis. Pathophysiol 13: 129-42 Stocker R, Keaney JF. 2003. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84: 1381-78 VanderLaan PA, Reardon CA, Getz GS. 2004. Site specificity of atherosclerosis site-selective responses to atherosclerotic modulator. Arterioscler Tromb Vasc Biol, 24: 12-22 Vijver LPLV, Kardinal AFM, Voorde WDV, Kruijssen DACM.1998. LDL oxidation and extent of coronary atherosclerosis. Atherioscler Thromb Vasc Biol. 18:193-99 Welson LT. 2006. Triglycerides and Cholesterol Research. Nova Biomedical Books, New York: 69-96
56
Wills ED 1987. Evaluation of Lipid Peroxidation in Lipid and Biological Membranes. In: Snell K, Mullock B eds. Biochemical Toxicology. IRL Press Oxford: 127-37 Young IS, McEneny J. 2001. Lipoprotein oxidation and atherosclerosis. Biochem Society, 29: 358-62 Zelikoff JT, Thomas TP. 1998. Immunotoxicology of Enviromental and Occupational Metals. Taylor Francis 1798-1998. P: 239-42
BAB 4 KOMBINASI EKSTRAK ETANOL RIMPANG JAHE GAJAH (Zingiber officinale Roscoe) DENGAN Zn SEBAGAI ANTIATEROMA PADA KELINCI HIPERKOLESTEROLEMIA The Combinations Ethanol Extract of the Ginger (Zingiber officinale Roscoe) with Zn as Antiatheroma in Hypercholesterolemic Rabbits
Abstrak Aterosklerosis adalah penyempitan pembuluh darah arteri karena akumulasi sel busa pada tunika intima. Aterosklerosis dapat terjadi karena hiperkolesterolemia, kerusakan endotel, dan LDL teroksidasi. Ekstrak etanol rimpang jahe (EERJ) dan Zn masing-masing mempunyai efek menurunkan kadar kolesterol, antioksidan, dan antiinflamasi yang bermanfaat untuk mencegah aterosklerosis. Untuk membuktikan efektivitasnya sebagai antiateroma, kombinasi EERJ dengan Zn diberikan pada kelinci hiperkolesterolemia. Dua puluh empat kelinci New Zealand white jantan hiperkolesterolemia dibagi menjadi 6 kelompok. Selama 6 minggu, kelompok 1 hanya diberi diet standar, kelompok 2,3,4,5, dan 6 selain diberi diet standar juga diberi perlakuan Zn 6,67 mg/ kg, EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan atorvastatin 1,9 mg/ kg BB per hari. Parameter ateroma yang diukur adalah kadar kolesterol total (KT), LDL, plak ateroma, MDA, dan aktivitas SOD. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian Zn tidak efektif menurunkan kadar kolesterol total, LDL, dan plak ateroma karena efeknya tidak berbeda dengan diet standar (p>0,05). Pemberian EERJ dan kombinasi EERJ dengan Zn efektif menurunkan kadar kolesterol total, LDL, dan plak ateroma karena efeknya sama dengan atorvastatin (p>0,05). Berdasarkan besarnya kemampuan menurunkan LDL dan plak ateroma, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn cenderung lebih baik dibandingkan atorvastatin dan dapat menurunkan kadar LDL sampai normal. Kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn menurunkan MDA lebih baik dibandingkan perlakuan lain (p<0,05) dan meningkatkan SOD sama dengan EERJ 200 mg/kg (p>0,05) serta lebih baik dari perlakuan lainnya (P<0,05). Dapat disimpulkan bahwa kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn memberikan hasil terbaik untuk mencegah ateroma pada kelinci hiperkolesterolemia. Kata-kata kunci:
ateroma, hiperkolesterolemia, LDL teroksidasi, ekstrak etanol rimpang jahe (EERJ), dan atorvastatin
58
Abstract Atherosclerosis is a disease affecting arterial blood vessels due to the accumulation of macrophage white blood cells and low density lipoprotein (LDL), and is triggered by hypercholesterolemia and oxidized LDL (oxLDL). To prevent plaque atheroma, hypercholesterolemic rabbits were treated by the combination ethanol extract of ginger (EEG) and zinc, which hypothesized to work as reduce of cholesterol and antioxidant. In the present study, 24 male New Zealand white hypercholesterolemic rabbits were divided into 6 groups. For six weeks, group 1 was fed with a standard diet. In succession group 2, 3, 4, 5, and 6 were treated by zinc at dose 6.67 mg/ kg, EEG 200 mg/kg, combination EEG 50 mg/kg and Zinc, combination EEG 100 mg/kg and zinc, and atorvastatin at dose 1.9 mg/ kg BW per day, as suplements to the standard diet. Zinc treatment dit not effectively reduce total cholesterol, LDL, and plaque atheroma because the effect dit not show different as compared to standard diet (p>0.05). EEG 200 mg alone and combination EEG and zinc treatment effectively reduce total cholesterol, LDL, and plaque atheroma because the effect similar to atorvastatin (positive control) (p>0.05). Based on reduced LDL and plaque atheroma, combination EEG 50 mg/kg and zinc treatment resulted higher than atorvastatin (p>0.05). Comparative study with EEG 200 mg/kg and positive control treatment have shown that combination EEG 50 mg and Zinc has the best antioxidant effect (p<0.05) and resulted higher than combination EEG 100 mg and zinc base on MDA levels (p>0.05). This research concluded that combination EEG 50 mg/kg and zinc treatment showed the highest atheroma prevention effect compared the other treatments. Key word: Atheroma, hypercholesterolemic, antioxidant, oxidized LDL, ethanol extract of the ginger (EEG), and plaque atheroma
Pendahuluan
Hiperkolesterolemia adalah suatu kondisi terjadinya kenaikkan kadar kolesterol total plasma darah lebih dari 250 mg/dL dan merupakan faktor risiko utama terjadinya aterosklerosis yang dapat berkembang menjadi
penyakit
jantung koroner (PJK). Terapi pada pasien hiperkolesterolemia bertujuan untuk mengurangi dan menjaga agar kadar kolesterol total dan low-density lipoprotein (LDL) kolesterol berada pada kadar optimal. Kadar kolesterol total optimal adalah < 150 mg/dL (3,88 mmol/L) dan LDL < 100 mg/dL (2,58 mmol/L) (Kimble et al. 2007). Berasarkan penelitian yang ada, 12,4% penduduk di kota besar Indonesia mengalami hiperkolesterolemia sehingga berpotensi mengalami aterosklerosis. World Health Organization (WHO) memprediksi bahwa jumlah
59
penderita PJK di negara berkembang, seperti Indonesia, akan mengalami peningkatan sebesar 137% pada tahun 2020, sedangkan di negara-negara maju hanya 48% (Anonim 2012). LDL kolesterol merupakan parameter yang lebih baik untuk memprediksi kemungkinan terjadinya PJK jika dibandingkan kolesterol total (Kimble et al. 2007). PJK merupakan penyebab kematian utama di dunia, oleh karena itu, pedoman nasional atau internasional untuk mencegah aterosklerosis menekankan pentingnya menurunkan LDL hingga mencapai kadar optimal. Selain LDL yang tinggi merupakan faktor risiko utama PJK, LDL teroksidasi dapat menyebabkan stres oksidatif, disfungsi endotel, inflamasi, koagulasi, hipofibrinolisis, dan aktivasi platelet yang semuanya dapat menyebababkan aterosklerosis (Shen 2006). Aterosklerosis adalah suatu penyakit pada arteri sedang atau besar yang ditandai dengan disfungsi endotel, inflamasi vaskuler, akumulasi lemak, dan kalsium pada tunika intima dinding pembuluh darah (Price dan Wilson 2006). Aterosklerosis menyebabkan lumen pembuluh darah menyempit, elastisitas berkurang, respons vaskuler yang berlebihan, obstruksi luminal akut atau kronik, aliran darah tidak normal, dan suplai oksigen ke jaringan berkurang (Madhumati et al. 2006). Berdasarkan uraian di atas, untuk mencegah aterosklerosis dapat dilakukan dengan memberikan obat yang bekerja menurunkan kadar kolesterol dan mencegah oksidasi LDL. Berbagai penelitian menyimpulkan bahwa EERJ mempunyai aktivitas antihiperkolesterolemia, antioksidan, dan faktor risiko aterosklerosis yang lain. EERJ dosis 200 mg/kg BB per hari terbukti dapat menurunkan kadar lemak dan antiaterosklerosis pada kelinci diet tinggi kolesterol. Pada penelitian yang lain, dosis 200 mg/kg BB yang diberikan selama 20 hari secara signifikan dapat menurunkan glukosa, kolesterol total, LDL, dan menaikkan HDL pada tikus diabetik karena induksi streptozotosin (Bhandari et al. 2005). EERJ dosis 250 ug/hari pada mencit defisien apolipoprotein E dapat mengurangi luas lesi aterosklerosis
sebesar 44%, menurunkan trigliserida
sebesar 27%, dan kolesterol sebesar 29% dibandingkan kontrol normal. Selain itu, dapat juga menurunkan LDL teroksidasi (LDL-associate lipid peroxides) dan menghambat agregrasi LDL sebanyak 62% dan 33% (Fuhrman et al. 2000).
60
EERJ dosis 100-400 mg/kg BB yang diberikan pada tikus yang diberi diet tinggi lemak selama 6 minggu dapat menurunkan kadar glukosa, kolesterol total, LDL, trigliserida, dan asam lemak bebas secara signifikan (Nammi et al.2009). Efek antioksidan EERJ ditunjukkan oleh sifat radioprotektif pada tingkat seluler dengan melindungi antioksidan enzimatik dan mengurangi lipid peroksidasi pada tikus stres oksidatif karena radiasi (Nabil et al. 2009). EERJ mengandung senyawa polifenol yang bersifat sebagai scavenger radikal bebas, mempercepat konversi kolesterol menjadi asam empedu,
dan secara lokal
menghambat absorpsi lemak (Powell 2000). Senyawa utama yang terdapat dalam EERJ dan berkhasiat sebagai scavenger radikal bebas adalah gingerol dan shogaol dengan konsentrasi 40 mg/g atau 4% (Barnes et al. 2007) Zink (Zn) sebagai antioksidan dan antihiperkolesterolemia telah terbukti dari penelitian menggunakan tikus knock-out (LDL-R-/-) yang diberi diet tinggi lemak. Pada tikus knock-out (LDL-R-/-) defisien Zn menyebabkan kenaikkan kadar kolesterol, trigliserida, glutation reduktase (GSSH), dan marker inflamasi seperti nuclear factor-kB (NF-kB) dan vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) (Reiterer et al. 2005). Defisien Zn juga dapat meningkatkan kerusakan sel endotel yang dipicu stres oksidatif (Alsuhendra 2004) sehingga mengganggu kelenturan pembuluh darah. Zn karbonat yang ditambahkan pada diet (1 g/Kg) selama 8 minggu dapat menurunkan aterogenesis pada kelinci diet tinggi kolesterol (Ren et al. 2006). Zn dapat mencegah kerusakan seluler dan melindungi gugus sulfihidril (-SH) karena radikal bebas (Zelikoff dan Thomas 1998). Efek EERJ menurunkan kolesterol dengan meningkatkan aktivitas kolesterol-7α-hidroksilase hepatik, suatu rate limiting enzyme pada biosintesis asam empedu, menghambat HMG-CoA reduktase pada síntesis kolesterol, dan menghambat absorpsi lemak (Powell 2000; Fuhrman et al. 2000; Sanghal et al. 2012). Peningkatan aktivitas kolesterol-7α-hidroksilase hepatik akan menstimuli konversi kolesterol menjadi asam empedu (Fuhrman
et al. 2000). Namun,
peningkatan kolesterol-7α-hidroksilase hepatik akan meningkatkan radikal bebas dalam tubuh (Murray et al. 2003) sehingga peran EERJ dalam mencegah aterosklerosis karena hiperkolesterolemia efektivitasnya dapat berkurang jika
61
tubuh kekurangan antioksidan. EERJ yang bersifat antiaterosklerosis pada kelinci adalah dosis 200-500 mg/kg BB yang jika dikonversi ke manusia (70 kg) sekitar 2840-7100 mg (Paget and Barnes 1964), nilai ini tidak aplikatif dan tidak ekonomis digunakan pada manusia. Ini salah satu alasan kenapa penambahan Zn yang juga berfungsi sebagai antihiperkolesterolemia dan antioksidan serta antiinflamasi perlu diteliti. Kombinasi antara EERJ dan Zn akan bersifat sinergis sebagai antiaterosklerosis karena sama-sama bersifat antioksidan, penurun kolesterol, dan antiinflamasi. Alasan lain penambahan Zn karena pada kondisi hiperkolesterolemia dapat terjadi defisien Zn, selain itu Zn dapat meredistribusi LDL kolesterol dari jaringan, seperti jantung (Eby and Halcomb 2005). Atas dasar berbagai alasan di atas, penelitian ini bertujuan membuktikan efektivitas kombinasi ekstrak etanol rimpang jahe gajah (Zingiber officinale Roscoe) dengan Zn dan melakukan optimasi EERJ dengan penambahan Zn sebagai antiateroma pada kelinci hiperkolesterolemia.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Mei 2011-Juni 2012. Penelitian dilaksanakan di Balitnak Ciawi Bogor, Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi dan Sain Uhamka, Laboratorium PAU IPB, dan Laboratorium Anatomi dan Fisiologi serta Bagian Patologi FKH IPB.
Bahan dan Alat Penelitian Hewan yang digunakan adalah kelinci New Zealand white jantan (Orytolagus cuniculu) usia 3-4 bulan dengan bobot badan 2-3,5 kg yang diperoleh dari Balitnak Ciawi Bogor. Kelinci ditempatkan pada kandang terpisah terbuat dari galvanis. Kandang dilengkapi dengan tempat pakan, minum, dan tempat penampung feses.
Kandang diletakkan
pada ruang tertutup dengan
ventilasi dan penerangan yang cukup. Lampu dinyalakan pada siang hari dan dimatikan pada malam hari agar tidak mengubah siklus hidup hewan coba.
62
Pakan yang digunakan ada dua macam yaitu, pakan standar dan pakan aterogenik (pakan standar yang mengandung kolesterol 0,5% dan minyak kelapa 5%). Bahan-bahan lain meliputi atorvastatin, Zn sulfat, rimpang jahe gajah, EERJ, kit untuk menetapkan kadar kolesterol total dan LDL, dan pewarna lemak (hematosilin eosin atau HE dan Oil Red O). Peralatan yang diperlukan antara lain, kandang hewan coba, timbangan hewan, neraca analitik, sentrifus, spektrofotometer, peralatan bedah, water bath, oven, rotari evaporator, peralatan pembuatan sediaan histopatologi, mikroskop Olympus, kamera,
kamera mikroskop digital, dan mikropipet serta program
MacBiophotonic (Uraian bahan dan alat penelitian secara lebih lengkap ditulis pada Bab 3).
Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan dengan rancangan acak lengkap (RAL) menggunakan enam perlakuan yang diulang empat kali. Percobaan terdiri atas tiga tahap, yaitu tahap adaptasi, tahap induksi hiperkolesterolemia, dan tahap perlakuan. Tahap adaptasi dilakukan selama dua minggu, yaitu kelinci diberi pakan standar dan air minum ad libitum. Pada minggu ke dua adaptasi, jumlah pakan rata-rata per kg BB
dihitung
sebagai
acuan
pemberian
pakan
pada
tahap
induksi
hiperkolesterolemia dan perlakuan. Pada tahap induksi hiperkolesterolemia, hewan coba diberi pakan aterogenik sebanyak 43,2 g/kg BB (2900 kkal/kg) selama minimal enam minggu
atau
sampai terjadi hiperkolesterolemia (kadar kolesterol total lebih dari 250 mg/dL), setelah itu hewan coba dibagi menjadi enam kelompok dan masing-masing kelompok 4 ekor. Selanjutnya, selama enam minggu semua hewan coba diberi pakan standar sebanyak 48,2 g/kg BB (2600 kkal/kg) dan perlakuan sebagai berikut: Kelompok 1 hanya diberi pakan standar, kelompok 2 diberi Zn dosis 6,67 mg/kg, kelompok 3 diberi EERJ 200 mg/kg, kelompok 4 diberi kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/ kg, kelompok 5 diberi kombinasi EERJ 100 mg/kg BB dengan Zn 6,67 mg/kg BB, dan kelompok 6 diberi atorvastatin dosis 1,9 mg/kg BB per hari.
63
Tabel 4.1 Skema Penelitian Antiateroma pada Kelinci Hiperkolesterolemia Hewan Coba
Perlakuan 6 Minggu Hiperkolesterolemia Diet standar (DS)
Pemeriksaan Akhir Minggu ke 6 - Kadar kolesterol total (KT), LDL, dan luas serta tebal plak tunika intima - Kadar MDA dan aktivitas SOD Hiperkolesterolemia DS + Zn 6,67 - Kadar KT, LDL, dan luas serta mg/kg BB tebal plak tunika intima - Kadar MDA dan aktivitas SOD Hiperkolesterolemia DS + EERJ 200 - Kadar KT, LDL, dan luas serta mg/kg BB tebal plak tunika intima - Kadar MDA dan aktivitas SOD Hiperkolesterolemia DS + EERJ 50 - Kadar KT, LDL, dan luas serta dengan Zn 6,67 tebal plak tunika intima mg/kg BB - Kadar MDA dan aktivitas SOD Hiperkolesterolemia DS + EERJ 100 - Kadar KT, LDL, dan luas serta dengan Zn 6,67 tebal plak tunika intima mg/kg BB - Kadar MDA dan aktivitas SOD Hiperkolesterolemia DS + atorvastatin - Kadar KT, LDL, dan luas serta 1,9 mg/kg BB tebal plak tunika intima - Kadar MDA dan aktivitas SOD Keteranga: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Pengukuran Parameter Penelitian Kadar kolesterol total, LDL, luas ateroma, tebal plak ateroma, kadar MDA, dan aktivitas SOD ditetapkan pada akhir minggu ke-6 perlakuan. Penetapan kadar kolesterol total dan LDL dengan metode CHODPAP menggunakan Kit dari Boehringer. Luas ateroma ditetapkan melalui pewarnaan dengan Oil Red O dan warna merah yang terjadi dianalisis dengan program digital image bio-imaging MacBiophotonic (NIH. 2009). Plak
ateroma ditentukan dengan membuat
preparat histologi dengan pewarnaan hematosilin-eosin dan plak yang terbentuk dilihat dengan mikroskop
Olympus dengan pembesaran 200 kali (cara
pengukuran parameter penelitian secara lebih terperinci terdapat pada Bab 3).
Analisis Data Data yang berupa kadar kolesterol total, LDL, dan luas plak dalam tunika intima dianalisis dengan menggunakan analisis varian (ANOVA) dan kalau ada
64
pengaruh perlakuan dilanjutkan dengan uji perbandingan berganda dengan Tukey. Analisis data dilakukan dengan software Minitab 15.
Hasil dan Pembahasan Kadar Kolesterol Total dan LDL Terdapat beberapa faktor yang dapat menaikkan kadar kolesterol dalam plasma darah, yaitu jenis makanan, faktor genetik, asupan kalori, dan adanya penyakit tertentu. Untuk hewan coba kelinci, dikatakan hiperkolesterolemia jika kadar kolesterol plasma ≥ 250 mg/dL dan LDL ≥ 200 mg/dL. Kadar tersebut dapat dicapai dengan pemberian diet aterogenik (tinggi kolesterol), yaitu suatu pakan yang mengandung 0,2% kolesterol selama satu bulan (Marliyati 2005). Menurut Laborge et al. (2005) pakan aterogenik adalah pakan standar yang mengandung 0,25-1% kolesterol dan 5% minyak kelapa sawit. Pemberian pakan aterogenik yang mengandung 0,25% kolesterol dan 5% minyak kelapa sawit dapat menyebabkan kenaikkan kadar kolesterol plasma mulai pada minggu keempat. Hiperkolesterolemia telah konstan pada minggu ke 5, 6, dan 7. Pemberian pakan aterogenik yang mengandung 0,25% kolesterol dan 1% kolesterol selama empat minggu dapat menyebabkan hiperkolesterolemia dengan kadar kolesterol total 322,3 mg/dL dan 1582,5 mg/dL. Pemberian diet aterogenik yang mengandung kolesterol 1% selama sepuluh minggu dapat meningkatkan kadar kolesterol hingga 2000 mg/dL (Adriyanto 2009). Pada penelitian ini, diet aterogenik yang diberikan adalah pakan standar yang mengandung 0,5% kolesterol dan 5% minyak kelapa yang diberikan minimal enam minggu atau sampai hewan coba mengalami hiperkolesterolemia. Dengan diet seperti di atas, kadar kolesterol total plasma meningkat hingga 1074,72 mg/dL dan LDL meningkat sampai 814,40 mg/dL (Lampiran 24 dan 25). Hewan coba hiperkolesterolemia yang diberikan diet standar dan tidak mendapat perlakuan, setelah enam minggu kadar
kolesterol total dan LDL
mengalami penurunan masing-masing sebesar 67,13% dan LDL 72,55%. Penurunan sebesar itu baik
untuk kolesterol total maupun LDL belum
menyebabkan kadarnya kembali menjadi normal (Tabel 4.2). Kolesterol total rerata turun dari 615,0 mg/dL menjadi 182,87 mg/dL dan LDL dari 405,0 m/dL
65
menjadi 110,3 mg/dL (Lampiran 24 dan 25). Penurunan tersebut lebih rendah (p<0,05) jika dibandingkan pada hewan coba hiperkolesterolemia
yang
mendapatkan perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin (Tabel 4.2).
Tabel 4.2 Rerata Penurunan Kadar Kolesterol Total (KT) dan LDL (%) pada Kelinci Hiperkolesterolemia Setelah 6 Minggu Perlakuan Perlakuan
Penurunan Penurunan KT (%) LDL (%) a Diet standar (DS) 67,13 ± 14,64 72,55 ± 7,96a DS + Zn 6,67 mg/kg BB 81,16 ± 8,24ba 80,66 ± 1,68ba DS + EERJ 200 mg/kg BB 90,07 ± 4,02cb 90,79 ± 1,31cb DS + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 87,73 ± 6,52c 93,89 ± 3,07c c DS + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 89,86 ± 3,31 89,20 ± 4,25c DS + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB 91,43 ± 3,19c 86,21 ± 8,56c Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Berkurangnya kadar kolesterol pada hewan coba hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar kemungkinan disebabkan oleh asupan kolesterol yang normal dalam dietnya.
Asupan kolesterol yang normal dari diet
menyebabkan sintesis reseptor LDL dan hydroxymethlglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reduktase kembali normal setelah mengalami tekanan akibat diet aterogenik (Burgess et al.2006). Berkurangnya kadar kolesterol pada hewan coba hiperkolesterolemia menunjukkan bahwa kelinci sebagai hewan coba tidak mengalami cacat genetik pada reseptor LDL atau pada HMG-CoA reduktase, sehingga keduanya masih berfungsi sebagai regulator kadar kolesterol. Penurunan kadar LDL plasma pada hewan coba hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar pararel dengan penurunan kadar kolesterol total. Hal ini disebabkan karena LDL merupakan bagian utama dari kolesterol total. Berdasarkan Tabel 4.2, kemampuan Zn dalam menurunkan kolesterol total dan LDL secara kuantitatif lebih besar dibandingkan dengan diet standar tetapi perbedaannya tidak signifikan. Ini kemungkinan disebabkan oleh pemberian Zn yang waktunya belum cukup lama atau dosisnya masih terlalu kecil. Berdasarkan penelitian sebelumnya, suplementasi Zn dengan dosis 45 mg pada orang dewasa
66
dapat menurunkan kejadian aterosklerosis setelah pemberian selama enam bulan (Bao et al. 2010). Pada penelitian dengan hewan coba kelinci, Zn dapat menghambat aterogenesis setelah diberikan selama 8 minggu dengan dosis 48,2 mg/kg BB (Ren et al. 2006). Dalam penelitian ini dosis Zn adalah 6,67 mg/kg BB dan diberikan selama 6 minggu. Dosis Zn sengaja diberikan dalam jumlah yang relatif kecil karena hanya digunakan sebagai tambahan pada EERJ dan tidak dimaksudkan untuk terapi tunggal. Selain itu, pemberian Zn dosis 50-300 mg/kg BB secara signifikan dapat menurunkan HDL (Eby and Halcomb 2005).
Tabel 4.3 Rerata Luas Plak Ateroma Tunika Intima (%) pada Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan 6 Minggu Perlakuan
Luas Plak Ateroma (%) Diet standar (DS) 56,03±2,66a DS + Zn 6,67 mg/kg BB 44,15±5,22 b DS + EERJ 200 mg/kg BB 43,00±6,29 b DS + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 39,73±4,32 b DS + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 42,50±1,34 b DS + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB 43,93±5,24b Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe) Pada penelitian ini, pemberian EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari mampu menurunkan kadar kolesterol total dan LDL yang tidak berbeda bermakna dengan atorvastatin. Pemberian kombinasi EERJ 50 mg/kg BB dengan Zn 6,67
mg/kg BB per hari memberikan hasil terbaik, yaitu
menurunkan LDL sebesar 93,89% (Tabel 4.2) dan mampu menurunkan kadar LDL sampai di bawah normal, yaitu 35,1 mg/dL sedangkan rentang kadar LDL normal adalah 45-59,2 mg/dL (Lampiran 25). Kesimpulan ini didukung oleh Kimble et al. 2007 yang menyatakan bahwa kadar LDL adalah prediktor yang lebih baik dibandingkan kadar kolesterol total maupun lemak total untuk memperkirakan terjadinya PJK.
67
Plak Ateroma Berdasarkan
Tabel
4.3,
luas
plak
ateroma
pada
hewan
coba
hiperkolesterolemia yang tidak mendapatkan perlakuan adalah paling besar dibandingkan dengan kelompok lain, yaitu seluas 56,03% (p<0,05). Ini terjadi karena penurunan kolesterol total dan LDL tidak secepat kelompok hewan coba hiperkolesterolemia yang mendapatkan berbagai perlakuan. Kadar kolesterol total dan LDL yang tinggi pada sirkulasi sistemik atau plasma menyebabkan lebih banyak LDL masuk pada tunika intima dan membentuk plak ateroma.
Gambar 4.1 Histologi Aorta Normal dengan Permukaan Kasar Berdasarkan data histologi, plak ateroma terbentuk pada 50% hewan coba hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar dengan ketebalan plak 39-52%, tetapi tidak terbentuk pada kelompok yang mendapatkan perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin (Gambar 4.1). Selain itu, plak ateroma juga terjadi pada 25% hewan coba yang mendapatkan perlakuan Zn dengan ketebalan plak sebesar 11% (Gambar 4.2 dan 4.3). Plak terbentuk pada hewan coba hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar dan yang mendapatkan perlakuan dengan Zn, ini sesuai dengan penurunan kadar kolesterol total dan LDL yang relatif kecil pada kelompok tersebut. Pada kelinci New Zealand white, jika terjadi kenaikkan kadar kolesterol dalam plasma dengan cepat
68
akan diikuti terbentuknya lesi yang ditandai dengan adanya sel busa yang berasal dari sel makrofag. Lesi yang terbentuk pada kelinci sama dengan garis lemak (fatty streaks) pada manusia. Inilah alasan banyak peneliti menggunakan hewan coba atau hewan model kelinci untuk melihat efektivitas obat dalam menghambat aterosklerosis (Yanni 2004). Pada penelitian ini, fatty streaks atau plak ateroma yang kemungkinan terbentuk saat kelinci mengalami hiperkolesterolemia hilang setelah kelinci diberi perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dan Zn atau atorvastatin. Ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan kondisi di atas. Pertama, tempat terbentuknya plak ateroma sangat bervariasi sehingga pemilihan bagian untuk pembuatan preparat histologi untuk melihat adanya plak dapat mempengaruhi hasil. Alasan tersebut menjadikan terbentuknya plak sebagai parameter sekunder untuk melihat hasil penelitian. Menurut VanderLaan et al. (2004), cara sederhana dan realistis adalah menentukan aterosklerosis adalah berdasarkan kadar kolesterol total atau LDL dari seluruh aorta yang dalam penelitian ini digantikan dengan luas plak dalam tunika intima aorta. Alasan kedua, lesi atau fatty streaks pada kelinci tidak dapat berkembang seperti plak pada manusia.
plak
Gambar 4.2 Plak Ateroma pada Kelinci Hiperkolesterolemia yang Mendapatkan Perlakuan Zn
69
plak
Gambar 4.3 Plak Ateroma pada Kelinci Hiperkolesterolemia yang Mendapatkan Perlakuan Diet Standar Fatty streaks yang terbentuk gagal membentuk plak karena pemberian atorvastatin, EERJ, dan kombinasi EERJ dengan Zn dapat menurunkan kadar kolesterol total, LDL, dan akumulasi lemak dalam tunika intima serta bersifat antioksidan. Berkurangnya LDL dalam plasma menyebabkan berkurangnya LDL teroksidasi dalam tunika intima sehingga LDL dapat kembali ke plasma darah (cairan ekstraseluler). Berkurangnya LDL teroksidasi akan menyebabkan berkurangnya stres oksidatif, perbaikan endotel, berkurangnya inflamasi, berkurangnya koagulasi, berkurangnya aktivitas platelet, dan tidak terjadi hipofibrinogen yang semuanya akan mengurangi terbentuknya aterosklerosis (Shen 2006). Selain itu pemberian Zn menyebabkan redistribusi LDL dan EERJ menyebabkan peningkatan reseptor LDL sehingga klirennya meningkat.
Kadar MDA dan Aktivitas SOD Malonaldialdehid (MDA) dipilih sebagai parameter stres oksidatif karena terbentuk dengan jumlah yang proporsional dengan terjadinya reaksi radikal bebas dengan komponen sel (Halliwell and Gutteridge1991). Berdasarkan Tabel 4.4, pemberian Zn, EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin mempunyai sifat sebagai antioksidan karena dapat menurunkan kadar MDA atau
70
kadar MDA lebih kecil dibandingkan pada hewan coba hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar. Tabel 4.4.
Kadar MDA (nmol/ml) dan Aktivitas SOD (Unit/mg Protein) Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan
Perlakuan
Kadar MDA Aktivitas SOD (nmol/ml) (Unit/mg Protein) Diet standar (DS) 0,29 ± 0,02a 3,18 ± 0,14a DS + Zn 6,67 mg/kg BB 0,24 ± 0,00b 3,62 ± 0,41a c DS + EERJ 200 mg/kg BB 0,21 ± 0,02 4,24 ± 0,31b DS + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB 0,16 ± 0,01d 4,65 ± 0,25cb ed DS + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB 0,19 ± 0,01 3,87 ± 0,30db DS + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB 0,21 ± 0,01fe 4,03 ± 0,33d Keterangan: Superskrip huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan bermakna (P<0,05). EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Efek antioksidan EERJ karena mengandung senyawa 6-gingerol dan shogaol yang berfungsi sebagai scavenger radikal bebas (Mishra et al. 2012). Zn bersifat antioksidan karena kemampuannya melindungi gugus sulfidril (-SH) pada asam amino dari serangan radikal bebas dan menghambat produksi oksigen reaktif atau superoksid karena transisi logam-logam seperti Fe++ dan Cu+. Zn berkompetisi dengan logam-logam seperti Fe++ dan Cu+ dalam berikatan dengan membran sel atau protein, mencegah timbulnya reaksi reduksi-oksidasi yang menghasilkan radikal bebas (Persamaan reaksi 4.1). Kompetisi tersebut di atas menyebabkan logam Fe++ dan Cu+ tetap terikat pada feritin dan metalotionin (Bettger 1993). Alasan lain, logam Zn juga merupakan komponen dari SOD yang terdapat di sitosol, yaitu ZnSOD. SOD berfungsi mengurangi reaktivitas radikal superoksid (O 2 *-) dengan mempercepat reaksinya menjadi H 2 O 2 . Mn+n (logam) + H 2 O 2
Mn (n+1) + OH* + OH- .....................4.1
Efektivitas antioksidan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn adalah terbaik jika dibandingkan dengan perlakuan lain, termasuk dengan atorvastatin. Aktivitas antioksidan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn lebih baik dibandingkan dengan perlakuan Zn, EERJ 200 mg/kg, dan atorvastatin (P<0,05) dan cenderung
71
lebih baik dibandingkan dengan perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn dalam menurunkan kadar MDA. Hasil tersebut di atas juga dikuatkan dengan adanya aktivitas SOD pada kelompok perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn yang secara kuantitatif lebih besar dibandingkan dengan perlakuan lain maupun atorvastatin (Tabel 4.4). Efek antioksidan perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn lebih kecil dibandingkan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn kemungkinan karena efek antioksidan yang berlebihan dari kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn sehingga justru bersifat prooksidan (Welson 2006). Kadar MDA yang tinggi berpotensi menyebabkan cedera endotel dan akan memacu terjadinya aterosklerosis (Matfin and Port 2008). Kadar MDA yang tinggi juga merupakan indikasi tingginya LDL teroksidasi karena keduanya sama-sama merupakan hasil degradasi dari asam lemak akibat bereaksi dengan radikal bebas. LDL teroksidasi bersifat pro-inflamasi, menghambat endothelial nitric oxide synthetase (eNOS), memacu vasokonstriksi, meningkatkan regulasi vascular endothelial growth factor (VEGF), dan sitotoksik. LDL teroksidasi tidak dikenali oleh reseptor LDL di hati, tetapi dikenali oleh reseptor scavenger makrofag. Ada perbedaan antara reseptor LDL di hepar dengan reseptor scavenger makrofag, yaitu reseptor scavenger makrofag tidak bersifat down regulated yang artinya dalam memfagosit LDL teroksidasi ke dalam makrofag dapat berjalan terus-menerus walaupun kadar LDL intrasel sudah sangat tinggi (Singh and Jialal 2006). Berdasarkan Tabel 4.2 dan 4.4, besarnya kadar kolesterol total, LDL, dan pembentukan plak ateroma pada tunika intima pada berbagai kelompok proporsional dengan kadar MDA dan aktivitas SOD. Ini menunjukkan bahwa kadar kolesterol total dan LDL yang tinggi dapat menyebabkan stres oksidatif dan memacu timbulnya ateroma (Madhumathi et al. 2006, McCommis et al 2011).
Simpulan dan Saran Simpulan Berdasarkan parameter yang ditentukan, perlakuan Zn dosis 6,67 mg/kg BB per hari pada kelinci hiperkolesterolemia tidak efektif sebagai antiateroma
72
karena efeknya hasilnya sama dengan diet standar. Pemberian EERJ 200 mg/kg, kombinasi EERJ dengan Zn pada kelinci hiperkolesterolemia menurunkan kadar kolesterol total,
LDL, dan
luas plak ateroma serta mingkatkan SOD sama
dengan atorvastatin dosis 1,9 mg/kg. Perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari cenderung memberikan hasil terbaik dalam menurunkan LDL dan luas plak ateroma serta menurunkan kadar MDA terbaik dibandingkan perlakuan lain (p<0,05)
sehingga
paling
potensial
mencegah
ateroma
pada
kelinci
hiperkolesterolemia.
Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mencari dosis kombinasi antara EERJ dengan Zn yang optimum dalam mencegah ateroma serta mengetahui kemungkinan timbulnya interaksi, baik interaksi farmasetik, kinetik, maupun farmakodinamik untuk menjelaskan fenomena efek yang ditimbulkan.
73
Daftar Pustaka Adriyanto D. 2009. Induksi Kolesterol pada Kelinci untuk Model Penelitian Hiperlipidemia dan Aterosklerosis (Tesis). Sekolah Pascasarjana IPB: 5-6 Alsuhendra. 2004. Daya Antiaterosklerosis Zn-Turunan Klorofil dan Daun Singkong (Manihot esculenta Crantz) pada Kelinci Percobaan (Disertasi). Pascasarjana IPB. Hal: 30-32 Anonim. 2012. Kadar kolesterol orang Indonesia setara dengan orang Amerika. Detik health. Diakses (18-07-2012). Bao B, Prasad AS, Beck FWJ, Fitzgerald JT, Snell D, Bao GW, Singh T, Cardozo LJ. 2010. Zn decrease C-reactive protein, lipid peroxidation, and inflammatory cytokines in elderly subjects: potential implication of Zn as an atheroprotective agent. AM J Clin Nutr 91 (6): 634-41 Barnes J, Anderson LA, Phillipson JD. 2007. Herbal Medicines. Pharmaceutical Press: 293-97 Bettger WJ. 1993. Zinc and selenium, site-specific versus general antioxidant. J Physiol Pharmacol; 71(9): 721-4 Bhandari U, Kanojia R, Pillai KK. 2005. Effect of ethanolic extract of Zingiber officinale on dyslipidaemia in diabetic rats. J of Ethnopharmacol Vol 97, Issue 2, p 227-30 Burgess JW, Sinclair PA, Chretien CM, Boucher J, Sparks. 2006. Oxidatively modified low-density lipoprotein and thrombosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochemistry of Atherosclerosis. Vol 1. New York: Springer. 3-15 Eby GA, Halcomb WW. 2005. High-dose zinc to terminate angina pectoris: A review and hipotesis for action by ICAM inhibition. Medical Hypotheses 66: 169-72 Fuhrman B, Rosenblat M, Hayek T, Coleman R, Aviram M. 2000. Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol, inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic, apolipoprotein E-deficient mice. J. Nutr. 130: 1124-31 Halliwell B, Gutteridge JMC. 1991. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press Oxford, second edition: 417-22 Kimble MAK, Young LY, Krajan WA, Guglielmo BJ, Alldredge BK, Corelli RL. 2007. Handbook of Applied Therapeutics, Eighth ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Leborgne L, Pakala R, Dilcher C, Hellinga D, Seabron R, Tio FO, Waksman R. 2005. Effect of antioxidants on atherosclerotic plaque formation in balloondenuded and irradiated hypercholesterolemic rabbits. J Cardiovasc Pharmacol Vol. 46 (4): 540-47 Madhumathi BG, Venkatarangan MV, Gopumadhavan S, Rofiq M, Mitra SK. 2006. Induction and evaluation of atheroscleroris in New Zealand white rabbits. Indian J of Experiment Biol Vol 44; 203-08 Marliyati SA. 2005. Pemanfaatan Sterol Tanaman Gandum (Triticum sp) Untuk Pencegahan aterosklerosis (Disertasi). Sekolah Pascasarjana IPB: 108-13 Matfin G, Port CM. 2008. Disorders of Blood Flow in the Systemic Circulation in Phatophysiology Concepts of Altered Health States. Lippincott Williams and Wilkins, 8th: 475-85
74
McCommis KS, McGee AM, Laughlin MH, Bowles DK, Baines CP. 2010. Hypercholesterolemia increase mitochondrial oxidative stress and enhances the MPT response in the porcine myocardium: beneficial effects of chronic exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 301: R1250-58 Mishra RK, Kumar A, Kumar AS. 2012. Pharmacological activity of Zingiber officinale. Int J of Pharm and Chem Sciences; Vol 1(3) Murray, Robert K, Granner, Daryl K, Mayes, Peter A, Rodwell, Victor W. 2003. Harper’s Illustrated Biochem; 26th Ed; McGraw-Hill, New York. 205-30 Nabil GM, Attia AMM, Elhag MA. 2009. Radio protective effect of dietary ginger (Zingiber Officinale Roscoe) against fast neutron-induce oxidative stress in rats. World Applied Sciences Journal 6 (4): 494-98 Nammi S, Sreemantula s, Rounfogalis BD. 2009. Protective effect of ethanolic extract of gingger on the development of metabolic syndrome in high-fat diet-fed rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. May; 104 (5): 366-73 NIH. 2009. MacBiophotonic ImageJ 1.38e/java 1.5.0_09. http//www.rsb.info.nih.gov/ij/feature.html. Diakses (22 Mei 2012) Paget GE, Barnes JM. 1964. Toxicity test. Di dalam: Laurence DR, Bacharah AL, editor. Evaluation of Drug Activities: Pharmacomethrics. London: Academic Press. Hlm 135-165 Powell SR. 2000. The antioxidant properties of zinc. J Nutr. 130: 1447s-54s Price SA, Wilson LM. 2006. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit. Penerbit Kedokteran, EGC, Edisi 6 Vol. 1: 576-87 Reiterer G, MacDonald R, Browning JD, Morrow J, Matveev SV, Daugherty A, Smart E, Toborek M, Hennig B. 2005. Zinc deficiency increase plasma lipids and atherosclerosis markers in ldl-receptor-deficient mice. J Nutr. 135: 2114-18 Ren M, Rajendran R, Ning P, Huat BTK, Nam OC, Watt F, Jenner A, Halliwell B. 2006. Zinc supplementation decreases the development of atherosclerosis in rabbits. Free Radical Biology & Medicine 41: 222-25 Sanghal A, Pant KK, Natu SM, Nischal A, Khattri S, Nath R. 2012. An Experimental study to evaluate the preventive effect of Zingiber officinale (ginger) on hypertension and hyperlipidemia and its comparison with Allium sativum (garlic) in rats. J of Med Plants research; Vol. 6(25), p. 4231-4238 Shen GX. 2006. Oxidatively modified low-density lipoprotein and thrombosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochem of Atherosclero. Vol 1. New York: Springer. Hlm 150-160 Singh U, Jialal I. 2006. Review oxidative stress and atherosclerosis. Pathophysiol 13: 129-42 Zelikoff JT, Thomas TP. 1998. Immunotoxicology of Enviromental and Occupational Metals. Taylor Francis 1798-1998. P: 239-42 VanderLaan PA, Reardon CA, Getz GS. 2004. Site specificity of atherosclerosis site-selective responses to atherosclerotic modulator. Arterioscler Tromb Vasc Biol, 24: 12-22 Welson LT. 2006. Triglycerides and Cholesterol Research. Nova Biomedical Books, New York: 69-96 Yanni AE. 2004. The Laboratory Rabbit: An animal model of atherosclerosis research. Lab Animals 38: 246-56
BAB 5 PEMBAHASAN UMUM
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik Kadar lemak feses dianalisis untuk melihat kemungkinan adanya hambatan absorpsi lemak oleh zat uji. Kadar lemak feses ditentukan dari feses yang dikumpulkan pada minggu ketiga penelitian dengan tujuan absorpsi dan ekskresi lemak melalui feses sudah stabil atau relatif tidak bervariasi antarindividu (Hernaman et al. 2008). ANOVA terhadap kadar lemak total dalam feses diketahui ada pengaruh perlakuan (p=0,0427). Hasil penelitian yang tercantum dalam Tabel 3.2 menunjukkan bahwa kadar lemak feses kelompok yang hanya mendapatkan diet standar lebih kecil dan berbeda bermakna dengan kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik. Ini terjadi kemungkinan karena kandungan lemak pada pakan aterogenik lebih besar dibandingkan kadar lemak pada pakan standar, yaitu 28,47% dan 13,42% (Lampiran 17). Tingginya kadar lemak dalam diet aterogenik menyebabkan tidak semuanya dapat diabsorpsi. Ini kemungkinan karena terbatasnya sekresi asam empedu di usus halus atau karena waktu pakan di saluran cernak yang relatif pendek akibat lemak yang dapat meningkatkan peristaltik. Secara kuantitatif kadar lemak feses pada kelompok hewan yang mendapatkan diet aterogenik dan perlakuan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok yang hanya mendapatkan diet aterogenik, kecuali yang mendapatkan perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg. Hasil ini menunnjukkan bahwa hanya perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg yang berpengaruh pada absorpsi lemak. Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya (Powell 2000) yang menyatakan bahwa EERJ secara lokal menghambat absorpsi lemak. Kadar lemak feses yang lebih rendah pada kelinci yang diberi diet aterogenik dan mendapatkan perlakuan dibandingkan dengan yang diberi diet aterogenik saja kemungkinan karena efek antioksida dari perlakuan. Antioksidan memacu peningkatan aktivitas enzim kolesterol-7α-hidroksilase hepatik yang berakibat pada meningkatnya sekresi asam empedu ke dalam usus halus. Peningkatan
76
sekresi asam empedu ke dalam usus halus akan meningkatkan emulsifikasi lemak dari diet sehingga absorpsi lemak meningkat. Tidak terhambatnya absorpsi lemak pada hewan coba diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan sebagai salah satu penyebab kadar kolesterol total dan LDL secara kuantitatif tetap lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok yang hanya mendapatkan diet normal. Pada kelinci diet aterogenik yang mendapatkan perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari, kadar LDL tidak meningkat bahkan turun dan berada di bawah nilai normalnya, hasil ini merupakan kombinasi efek dari perlakuan yang dapat menghambat absorpsi lemak, menurunkan kadar kolesterol, dan antioksidan. Mengingat LDL adalah tolok ukur hiperkolesterolemia yang lebih valid dibandingkan kadar kolesterol total dan efek antioksidannya maka kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari lebih efektif untuk mencegah ateroma dibandingkan dengan atorvastatin atau perlakuan yang lain (Tabel 3.3 dan Tabel 3.5). Berdasarkan nilai akumulasi lemak (plak) dalam tunika intima sebagai tolok ukur kuantitatif adanya ateroma, perlakuan Zn belum efektif karena hasilnya tidak berbeda dengan diet aterogenik saja (p>0,05). Hasil ini menunjukan bahwa Zn dosis 6,67 mg/kg BB per hari belum efektif jika dibandingkan dengan atorvastatin atau perlakuan lainnya (Tabel 3.2). Zn yang efektif untuk mencegah aterosklerosis pada kelinci adalah dosis 48,2 mg/kg BB. Dosis yang relatif kecil (6,67 mg/kg BB) sengaja diberikan hanya sebagai tambahan pada EERJ dan mencegah defisien Zn pada kondisi hiperkolesterolemia. Alasan ini berdasarkan suatu kenyataan bahwa luas lemak dalam tunika intima pada seluruh aorta merupakan parameter kuantitatif untuk menilai adanya ateroma atau kondisi praaterosklerosis (VanderLaan et al. 2004). Pemberian diet aterogenik menyebabkan peningkatan kadar kolesterol total dan LDL tertinggi dibandingkan dengan kelompok lain (p<0,05).
Pemberian
EERJ 200 mg/kg dan kombinasi EERJ dengan Zn dapat mencegah kenaikkan kadar kolesterol total dan LDL sehingga kenaikkan yang terjadi sama dengan kenaikkan pada kontrol normal, walaupun kalau dilihat secara kuantitatif selisih kenaikannya cukup banyak, ini terjadi karena nilai standar deviasi (SD) yang besar. Nilai SD yang besar ini sulit dihindari karena kadar kolesterol total dan
77
LDL sebelum perlakuan sudah bervariasi dengan rentang yang cukup lebar, 48,35-72,1 mg/dL dan 36,58-67,53 mg/dL (Lampiran 8 dan 9). Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa EERJ dan Zn dapat menurunkan kadar kolesterol (Bhandari et al. 2005; Nammi et al. 2009; Reiterer et al. 2005). Dilihat dari kemampuannya menghambat peroksidasi lipid (kadar MDA), perlakuan EERJ 200 mg/kg belum sebaik efek EERJ 50 mg atau 100 mg yang dikombinasikan dengan Zn. Dari hasil ini terlihat ada peran Zn yang sangat penting dalam meningkatkan EERJ menurunkan kadar MDA. Peran Zn antara lain meningkatkan stabilisasi membran dari senyawa sitotoksik seperti radikal bebas dan mencegah terbentuknya radikal bebas hidroksil (Hennig et al. 1999; Eby and Halcomb 2005). Pada kelinci diet aterogenik yang mendapatkan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari terjadi peningkatan kadar kolesterol total dan LDL terendah, yaitu 73,57 ± 21,2% dan kenaikkan LDL 41,4 ± 19,2% yang diikuti oleh atorvastatin, kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg, dan diikuti EERJ 200 mg/kg. Perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg + Zn 6,67 mg/kg menurunkan kadar kolesterol total dan LDL lebih kecil dibandingkan perlakuan kombinasi EERJ 50 m/kg dengan Zn 6,67 mg/kg. Ini terjadi kemungkinan karena perlakuan EERJ dengan dosis yang lebih besar sifat antioksidannya berlebihan sehingga menjadi bersifat prooksidan (Halliwel and Gutteridge 1991; Welson 2006). Kemungkinan sifat prooksidan ini akan menghambat konversi kolesterol menjadi asam empedu yang melibatkan cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) (Shibata et al. 2007). Hambatan enzim cholesterol 7α-hidroxylase (CYP7A1) membuat konversi kolesterol menjadi asam empedu berkurang dan menyebabkan ekskresi kolesterol juga berkurang. Efek antioksidan senyawa polifenol akan berbahaya atau memberikan efek yang sebaliknya jika diberikan dalam dosis yang berlebihan (Saini et al. 2006). Ini terlihat dari kadar MDA yang lebih tinggi pada kelompok yang mendapatkan perlakuan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg dibandingkan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg. Berdasarkan kadar MDA, perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg dapat menurunkan kadar MDA lebih tinggi dibandingkan dengan atorvastatin dan perlakuan yang lain (p<0,05). Kemampuan menurunkan MDA
78
akan mengurangi terjadinya oksidasi LDL. Nilai MDA yang tinggi berpotensi menimbulkan cedera atau inflamasi pada endotel yang dapat memicu timbulnya aterosklerosis (Matfin and Port 2008). LDL teroksidasi berisifat pro-inflamasi, menghambat
endothelial
nitric
oxide
syntethase
(eNOS),
merangsang
vasokontriksi dan adhesi, meningkatkan regulasi vascular endothelial growth factor (VEGF), sitotoksik, dan merangsang retensi makrofag. LDL teroksidasi tidak dikenali oleh reseptornya di hepar tetapi dikenali oleh reseptor scavenger makrofag (reseptor pembersih) yang tidak mengalami down regulation, yang berakibat makrofag terus-menerus menumpuk ester kolesterol dari LDL dan membentuk sel busa (Singh and Jialal 2006). Efek antiaterogenik dari antioksidan (penghambat terbentuknya MDA) lebih besar jika dibandingkan dengan obat penurun kolesterol (Halliwel and Gutteridge 1991). Pemberian diet standar ternyata juga dapat menaikkan kadar kolesterol total 61,73% dan LDL 59,3%, kenaikkan ini masih lebih kecil jika dibandingkan dengan kenaikkan pada kelompok kelinci yang mendapatkan diet aterogenik dan diet aterogenik dengan perlakuan (Tabel 3.3). Ada beberapa hal yang mempengaruhi kadar kolesterol dalam darah, yaitu asupan kalori, kandungan lemak jenuh, kandungan kolesterol, kandungan serat dalam diet, dan kelainan metabolisme. Pada penelitian ini diet yang diberikan adalah ad libitum dengan kandungan serat yang relatif rendah, yaitu 14% (Lampiran 12). Diet aterogenik meningkatkan kadar kolesterol total dan LDL karena asupan kolesterol yang berlebihan dalam jangka waktu yang relatif lama akan mengurangi pembentukan reseptor LDL sehingga bersihan kolesterol akan berkurang. Tujuh puluh persen LDL akan dibersihkan dari darah melalui reseptor yang ada di sel hepar dan sisanya melalui sel dan reseptor lain, seperti sel kelenjar adrenal, sel otot polos, sel endotel, sel limfoid, dan sel scavenger monosit dan makrofag (Matfin and Port 2008).
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci Hiperkolesterolemia Diet yang digunakan untuk membuat kelinci hiperkolesterolemia adalah diet standar yang mengandung 0,5% kolesterol dan 5% minyak kelapa sawit. Diet diberikan minimal selama 6 minggu karena berdasarkan penelitian sebelumnya,
79
diet tersebut dapat menyebabkan hiperkolesterolemia mulai pada minggu ke empat dan konstan pada minggu ke 5 (Adriyanto 2009). Pada kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar selama 6 minggu terjadi penurunan kadar kolesterol total, LDL, tetapi penurunannya lebih kecil dibandingkan kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang mendapatkan perlakuan EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, dan atorvastatin. Penurunan kadar kolesterol total dan LDL pada kelompok yang mendapatkan diet standar terjadi karena perubahan diet, dari diet aterogenik ke diet standar. Diet standar yang kandungan kolesterolnya rendah menyebabkan hewan coba meningkatkan sintesis reseptor LDL dan hydroxymethlglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reduktase kembali normal (Burgess 2006), akibatnya kliren LDL kembali normal. Pada kelinci diet aterogenik terjadi penurunan sintesis reseptor LDL dan hydroxymethlglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reduktase dengan tujuan untuk mengurangi jumlah kolesterol endogen. Akibatnya, kolesterol dari diet yang jumlahnya berlebihan akan tetap berada dalam plasma darah dan masuk ke dalam tunika intima yang selanjutnya dapat memacu timbulnya plak. Penurunan kadar kolesterol total dan LDL yang lebih kecil pada kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar menyebabkan akumulasi lemak dalam tunika intima yang lebih banyak. Luas plak aterosklerosis pada kelompok ini lebih besar dibandingkan kelompok yang mendapatkan perakuan EERJ maupun kombinasi EERJ dan Zn (p<0,05) (Tabel 4.3). Selain terjadi peningkatan akumulasi lemak dalam tunika intima, kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar juga terbentuk plak ateroma dengan ketebalan sampai 35-52% pada 50% hewan coba (Gambar 4.4). Hasil ini menunjukan bahwa perlakuan EERJ dan kombinasi EERJ dan Zn bersifat menurunkan kolesterol dan mencegah ateroma dengan meningkatkan sintesis reseptor LDL dan menurunkan MDA. Sifat antioksidan dari perlakuan EERJ dan kombinasi EERJ dan Zn ditunjukan dengan adanya peroksidasi lipid (kadar MDA) yang lebih rendah dan aktivitas SOD yang tinggi dibandingkan pada kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar
80
(Tabel 4.4). Kondisi ini menyebabkan tidak terbentuknya plak pada kelompok yang mendapatkan EERJ maupun kombinasi EERJ dengan Zn. Aktivitas antioksidan yang rendah pada kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar lebih memungkinkan terjadinya LDL teroksidasi. LDL yang teroksidasi akan menyebabkan gangguan pada endotel dan merangsang menosit bermigrasi ke tunika intima. Dalam tunika intima, monosit berkonversi menjadi makrofag dan memfagosit LDL teroksidasi secara terus menerus dan membentuk plak. Itulah kemungkinan kenapa pada kelompok kelinci hiperkolesterolemia yang hanya mendapatkan diet standar terjadi akumulasi lemak yang paling tinggi dan terbentuk plak (Tabel 4.3). Pemberian EERJ, kombinasi EERJ dengan Zn, serta atorvastatin memberikan efek yang sama dalam menurunkan kolesterol total, LDL, dan luas plak ateroma. Namun jika dilihat kadar LDL pada akhir penelitian, perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB memberikan hasil terbaik karena menurunkan kadar LDL hingga dibawah normal, yaitu 35,1 mg/dL padahal kadar normal berkisar 45-59,2 mg/dL (Lampiran 24). Hasil ini pararel dengan kemampuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari sebagai antioksidan atau dalam menghambat peroksidasi lipid. Kadar MDA pada kelinci hiperkolesterolemia yang mendapatkan perlakuan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari adalah terkecil jika dibandingkan dengan perlakuan lain (p<0,05) (Tabel 4.4)
Pengaruh Perlakuan pada Kelinci yang Diberi Diet Tinggi Kolesterol dan Hiperkolesterolemia Dari
penelitian pada Bab 3 dan Bab 4 disimpulkan bahwa perlakuan
kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg adalah paling efektif sebagai antiateroma baik pada kelinci yang diberi diet tinggi kolesterol maupun hiperkolesterolemia. Hasil tersebut mendukung bahwa pada dosis tersebutlah antara EERJ dengan Zn kemungkinan terjadi sinergisme. Efektivitas kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg dalam menghambat ateroma tampaknya sebanding. Pada perlakuan yang bersamaan dengan diet aterogenik menghasilkan luas plak 42,20 ± 5,1% dan kadar MDA 0,29 ± 0,03 nmol/mL berbanding 39,73 ±
81
4,3% dan kadar MDA 0,16 ± 0,01 nmol/mL pada perlakuan yang diberikan setelah kelinci hiperkolesterolemia. Berdasarkan luas plak ateroma dan kadar MDA efek kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg yang diberikan setelah kelinci hiperkolesterolemia sedikit lebih baik dibandingkan ketika diberikan bersamaan dengan diet aterogenik. Namun kalau dilihat kondisi permukaan pembuluh darah normal atau belum terbentuk plak pada hewan coba hiperkolesterolemia kebanyakan sudah tidak rata yang kemungkinan sudah mulai terjadi kerusakan lapisan endotel (Gambar 4.2). Kondisi ini kemungkinan terjadi karena ketika hewan coba mengalami hiperkolesterolemia terjadi defisien Zn yang mengakibatkan membran rentan terhadap zat sitotoksik seperti PUFA (Hennig et al. 1999).
BAB 6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 1. Pada kelinci yang diberi diet aterogenik, kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB dapat menghambat kenaikkan KT, LDL, dan plak ateroma tidak berbeda bermakna dengan atorvastatin, namun memiliki kecenderungan lebih baik dibandingkan atorvstatin. 2. Pada kelinci hiperkolesterolemia, pemberian kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari dapat menurunkan kolesterol total, LDL, dan plak ateroma tidak berbeda bermakna dengan atorvastatin, namun kecenderungannya menurunkan LDL dan plak ateroma lebih besar. 3. Efek antioksidan kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun hiperkolesterolemia lebih baik dibandingkan perlakuan lain. 4. Efek antiateroma kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg BB per hari lebih baik jika dibandingkan dengan atorvastatin baik pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun kelinci hiperkolesterolemia. 5. Kombinasi EERJ dengan Zn sebagai antiateroma bersifat sinergis pada dosisdosis tertentu karena kombinasi EERJ 50 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg lebih baik dibandingkan kombinasi EERJ 100 mg/kg dengan Zn 6,67 mg/kg baik pada kelinci yang diberi diet aterogenik maupun hiperkolesterolemia. Saran 1. Perlu dilakukan optimasi dosis kombinasi EERJ dan Zn sebagai antiateroma dan antioksidan baik pada kelinci yang diberi diet aterogenik atau hiperkolesterolemia. 2. Perlu dibuat formula sediaan oral yang terdiri atas kombinasi EERJ dan Zn serta melakukan uji bioavailabilitasnya pada hewan coba dan manusia. 3. Perlu penelitian tentang kemungkinan terjadinya interaksi farmasetik, farmakokinetik, dan farmakodinamik antara EERJ dengan Zn yang diberikan bersamaan.
DAFTAR PUSTAKA Adriyanto D. 2009. Induksi Kolesterol pada Kelinci untuk Model Penelitian Hiperlipidemia dan Aterosklerosis (Tesis). Sekolah Pascasarjana IPB: 5-6 Agarwal DK, Misra R, Gujrati VR, Panday S, Shanker K. 1996. Duodenal ulcer and oxyradical system a preliminary study. Asia Fasific J of Pharm 11: 3336 Agoreyo FO, Agoreyo BO, Onuorah MN. 2008. Effect of aqueous extracts of Hibiscus sabdariffa and Zingiber officinale on blood cholesterol and glucose levels of rats. African J of Biotec Vol. 7 (21): 3949-51 Ajith TA. 2010. Ameliorating reactive oxygen species-induced in vitro lipid peroxidation in brain, liver, mitochondria and DNA damage By Zingiber officinale Roscoe. Indian J of Clin Biochem Vol. 25 (1): 67 Alsuhendra. 2004. Daya Antiaterosklerosis Zn-turunan Klorofil dan Daun Singkong (Manihot esculenta Crantz) pada Kelinci Percobaan (Disertasi). Sekolah Pascasarjana IPB. Hal : 30-32 Anonim 2006. Acuan Herbal. Edisi Pertama, Volume Kedua, BPOM RI, hal 9-23 Anonim. 2009. Effects of apple juice on risk factors of lipid profile, inflammation and coagulation, endothelial markers and atherosclerotic lesions in high cholesterolemic rabbits. Lipids in Health and Disease (8): 39 Anonim. 2012. Kadar kolesterol orang Indonesia setara dengan orang Amerika. Detik Health. Ketersediaan (18-07-2012). Bao B, Prasad AS, Beck FWJ, Fitzgerald JT, Snell D, Bao GW, Singh T, Cardozo LJ. 2010. Zn decrease c-reactive protein, lipid peroxidation, and inflammatory cytokines in elderly subjects: a Potential Implication of Zn as an Atheroprotective Agent. AM J Clin Nutr 91 (6): 634-41 Barnes J, Anderson LA, Phillipson JD. 2007. Herbal Medicines. Pharmaceutical Press: 293-97 Bavelaar FJ, Beynen AC. 2004. the relation between diet, plasma cholesterol and atherosclerosis in pigeon, quails and chickens. International Journal of Poultry Science 3 (11): 671-84 Bettger WJ. 1993. Zinc and selenium, site-specific versus general antioxidant. J Physiol Pharmacol; 71(9): 721-4 Bhandari U, Kanojia R, Pillai KK. 2005. Effect of ethanolic extract of Zingiber officinale on dyslipidemia in diabetic rats. J of Ethnopharmacol Volume 97, Issue 2, p 227-30 Burgess JW, Sinclair PA, Chretien CM, Boucher J, Sparks. 2006. Oxidatively modified low-density lipoprotein and thrombosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochemistry of Atherosclerosis. Vol 1. New York: Springer. Hlm 315 Czernichow S, Vergnaud A. 2009. Effects of long-term antioxidant supplementation and association of serum antioxidant concentrations with risk of metabolic syndrome in adults. Am J of Clin Nutr Vol. 90 (2): 329 Deby C, Goutier R. 1990. New perspectives on the biochemistry of superoxide anion and the efficiency of SOD. Biochem Phar; 39 (3): 399-405 Depkes RI. 2008. Farmakope Herbal Indonesia. Depkes RI, Edisi I: 21-25 Depkes RI. 2009. Profil Kesehatan Indonesia 2008. Depkes RI Jakarta
84
Diaz M, Frei B, Vita JA,Keaney JFJR. 1997. Antioxidant and atherosclerotic heart disease. N Engl JMed 337: 408-416 Eby GA, Halcomb WW. 2005. High-dose zinc to terminate angina pectoris: A review and hipotesis for action by ICAM inhibition. Medical Hypotheses 66: 169-72 Elshater AA, Salman MMA, Moussa MMA. 2009. Effect of ginger extract consumption on level of blood glucose, lipid profile and kidney functions in alloxan induce-diabetic rats. Egypt. Acad.J. biolog. Sci 2 (1): 153-62 European Medicines Agency (EMA). 2011. Assessment report on Zingiber officinale Roscoe, rhizome. Committee on Herbal Medicinals Products: 1213 Frank CL. 2001. Basic Toxicology, Fundamental, Target Organ, and Risk Assesment, second edition. Hemisphere Publishing Comp, Washinton Fuhrman B, Rosenblat M, Hayek T, Coleman R, Aviram M. 2000. Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol, inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic, apolipoprotein E-deficient mice. J. Nutr. 130: 1124-31 Halliwell B, Gutteridge JMC. 1991. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press Oxford, second edition: 417-22 Heeba GH, Abd-Elghany MI. 2010. Effect of combined administration of ginger (Zingiber officinale Roscoe) and atorvastatin on the liver of rats. Phytomedicine Dec 1; 17 (14): 1076-81 Hennig B, Meerarani P, Ramada SSP, Taborek M, Malecki A, Slian R. 1999. Zn nutrition and apoptosis of vascular endothelial cells implication in atherosclerosis. Nutrition Vol 15, No. 10 Ghaffari MA, Ghiasvand. 2010. Kinetic study of LDL oxidation by copper. Indian Journal of Clinical Biochemistry 25 (1): 29-36 Halliwell B, Gutteridge JMC. 1991. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press Oxford, second edition: 417-22 Hernaman I, Kamil KA, Mayasari N, Salin MA, 2008. Dampak nata de coco dalam ransum mencit (Mus musculus) terhadap metabolisme lemak dan penyerapan mineral. http://pustaka. unpad. ac. id/achives/26459 (30 Mei 2011) Kemper KJ. 1999. Ginger. Longwood Herbal Task Force, Revised Nov 3: 3 Kimble MAK, Young LY, Krajan WA, Guglielmo BJ, Alldredge BK, Corelli RL. 2007. Handbook of Applied Therapeutics, Eighth ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Kolodgie FD, Katocs AS, Largis EE. 1996. Hypercholesterolemia in the rabbit induced by feeding graded amounts of low-level cholesterol. Arterioscler, Thromb, and Vasc Biol; 16: 1454-64 Leborgne L, Pakala R, Dilcher C, Hellinga D, Seabron R, Tio FO, Waksman R. 2005. Effect of antioxidants on atherosclerotic plaque formation in balloondenuded and irradiated hypercholesterolemic rabbits. J Cardiovasc Pharmacol Vol. 46 (4): 540-47 Leonard DB. 2006. Medicine at your feet: Healing Plats of Hawaiian Kingdom Zingiber officinale: 6
85
MacDonald-Wicks, Garg M. 2006. Oxidized LDL and antioksidant in atherosclerosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochem of Atheroscler. Vol 1. New York: Springer. Hlm 519-28 Madhumathi BG, Venkatarangan MV, Gopumadhavan S, Rofiq M, Mitra SK. 2006. Induction and evaluation of atheroscleroris in New Zealand white rabbits. Indian J of Experiment Biol Vol 44; 203-08 Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. Penerbit Buku Kedokteran, EGC. 513-23 Marliyati SA. 2005. Pemanfaatan Sterol Tanaman Gandum (Triticum sp) untuk Pencegahan Aterosklerosis (Disertasi). Sekolah Pascasarjana IPB: 108-13 Masaru S, Ichinose T. 1990. Experimental study on lipid peroxide formation and tumor promoting effect of nitrogen dioxide and ozone. In: Davies AJK Ed. Oxidative Damage and Repair. Pergamon Press: 511-16 Matfin G, Port CM. 2008. Disorders of Blood Flow in the Systemic Circulation in Phatophysiology Concepts of Altered Health States. Lippincott Williams and Wilkins, 8th: 475-85 McCommis KS, McGee AM, Laughlin MH, Bowles DK, Baines CP. 2010. Hypercholesterolemia increase mitochondrial oxidative stress and enhances the mpt response in the porcine myocardium: beneficial effects of chronic exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 301: R1250-58 Misra PH. 1995. Adenocrom Assay. In: Greenwald RA ed. CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press Florida: 237-241 Mishra RK, Kumar A, Kumar AS. 2012. Pharmacological activity of Zingiber officinale. Intl J of Pharm and Chem Sciences; Vol 1(3) Murray, Robert K, Granner, Daryl K, Mayes, Peter A, Rodwell, Victor W. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry; 26th edition; McGraw-Hill, New York. 205-30 Nabil GM, Attia AMM, Elhag MA. 2009. Radio protective effect of dietary ginger (Zingiber officinale Roscoe) against fast neutron-induce oxidative stress in rats. World Applied Sciences J 6 (4): 494-98 Nammi S, Sreemantula s, Rounfogalis BD. 2009. Protective effect of ethanolic extract of Zingiber officinale rhizome on the development of metabolic syndrome in high-fat diet-fed rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. May; 104 (5): 366-73 Nelson DL, Cox, Michael M, Lehninger 2004: Principles of Biochemistry; 4th edition; McGraw-Hill, New York, pp 787-32 NIH. 2009. MacBiophotonic ImageJ 1.38e/java 1.5.0_09. http//www.rsb.info.nih.gov/ij/feature.html. (22 Mei 2012) Paget GE, Barnes JM. 1964. Toxicity test. Di dalam: Laurence DR, Bacharah AL, editor. Evaluation of Drug Activities: Pharmacomethrics. London: Academic Press. Hlm 135-165 Papas AM, editor. 1998. Antioxidant Status, Diet, Nutrition, and Health. CRC Press Boca Raton: 21-22 Park JE, Chiang CE, Munawar M. 2012. Lipid-lowering treatment in hypercholesterolemia patient: the CEPHEUS Pan-Asia Survey. Eur J Prev Cardiol 2012; 19: 781-794
86
Piliang WG, Djojosoebagio S, Suprayogi A. 1996. Soybean hull and its effect on atherosclerosis in non-human primates (Macaca fascicularis). Biomed and Enviroment Sciences 9: 137-143 Powell SR. 2000. The antioxidant properties of zinc. J Nutr. 130 : 1447s-54s Price SA, Wilson LM. 2006. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit. Penerbit Kedokteran, EGC, Edisi 6 Vol. 1 : 576-87 Ramalingam K, Subrahmanyam G. 2012. Serum Zn status, oxidative stress and cronic low grade inflammation in high fat diet fed rabbits. Int J of Analyt, Pharma and Biomed Sciences, Vol 1: issue 2: 13-18 Reiterer G, MacDonald R, Browning JD, Morrow J, Matveev SV, Daugherty A, Smart E, Toborek M, Hennig B. 2005. Zinc deficiency increase plasma lipids and atherosclerosis markers in ldl-receptor-deficient mice. J Nutr. 135: 2114-18 Ren M, Rajendran R, Ning P, Huat BTK, Nam OC, Watt F, Jenner A, Halliwell B. 2006. Zinc supplementation decreases the development of atherosclerosis in rabbits. Free Rad Biol & Med 41: 222-25 Saifudin A, Rahayu V, Teruna HY. 2011. Standardisasi Bahan Obat Alam. Graha Ilmu. Hal 88 Saini HK, Dhani P, Xu YJ, Cheema SK, Arneja AS, Dhalla NS. 2006. Modification of biochemical and cellular processes in the development of atherosclerosis by red wine. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochem of Atheroscler. Vol 1. New York: Springer. Hlm 475 Sanghal A, Pant KK, Natu SM, Nischal A, Khattri S, Nath R. 2012. An Experimental study to evaluate the preventive effect of Zingiber officinale (ginger) on hypertension and hyperlipidemia and its comparison with Allium sativum (garlic) in rats. J of Med Plants Research; Vol. 6(25), p. 4231-4238 Septiana AT, Zakaria FR, Sulistiyani. 2002. Ekstrak jahe (Zingiber officinale Roscoe) penghambat oksidasi LDL. Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan Vol XIII (1): 70-76 Shen GX. 2006. Oxidatively modified low-density lipoprotein and thrombosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochem of Atheroscler. Vol 1. New York: Springer. Hlm 150-160 Shibata S, HakayawaK, Egashira Y, Sanada H. 2007. Hypocholesterolemic mechanism of chlorella: chlorella and its indigestible fraction enhance hepatic cholesterol catabolism trough up-regulation of cholesterol 7αhydroxylase in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(4), 916-925 Singh A, Duggal S, Singh J, Katekhaye S. 2010. Experimental advances in pharmacology of gingerol and analogues. Pharmacie Globale (IJCP), 2 (04) Singh U, Jialal I. 2006. Rev Oxidative Stress and Atherosclerosis. Pathophys 13: 129-42 Smith JD. 1998. Mouse models of atherosclerosis. Lab Animal Science Vol. 48 (6): 573-78 Srinivas M, Annapurna A, Reddy YN. 2008. Anti-atherosclerosis effect of atorvastatin and clopidogrel alone and in combination in rat. Indian J of Experiment Biol Vol 46: 698-703
87
Stapleton PA, Goodwill AG, James ME, Brock RW, Frisbee JC. 2010. Hypercholesterolemia and microvascular dysfunction: interventional strategies. J of Inflammation, 7:54 Stocker R, Keaney JF. 2003. Role of Oxidative Modifications in Atherosclerosis. Physiol Rev. 84: 1381-78 Tejasari 2007. Evaluation of ginger (Zingiber Officinale Roscoe) bioactive compounds in increasing the ratio of T-Cell surface molecules of CD3+CD4 : CD3+CD8 in-vitro. Mal J Nutr 13 (2): 161-70 Trevor AJ, Katzung BG, Master SB. 2008. Pharmacology Examination and Board Review. Boston, McGraw Hill Lange: 292-299 VanderLaan PA, Reardon CA, Getz GS. 2004. Site specificity of atherosclerosis site-selective responses to atherosclerotic modulator. Arterioscler Tromb Vasc Biol, 24: 12-22 Vijver LPLV, Kardinal AFM, Voorde WDV, Kruijssen DACM.1998. LDL oxidation and extent of coronary atherosclerosis. Atherioscler Thromb Vasc Biol. 18:193-99 Wells BG, Dipiro JT, Schwinghammer TL, Hamilton WW. 2006. Pharmacotherapy Hand Book. Sixth Edition, McGraw-Hill, New York Welson LT. 2006. Triglycerides and Cholesterol Research. Nova Biomedical Books, New York: 69-96 WHO. 1999. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. Volume 1. WHO Geneva: 277-85 Wicks LM, Garg M. 2006. Oxidized LDL and antioxidants in atherosclerosis. Di dalam: Cheema SK, editor. Biochem of Atheroscler. Vol 1. New York: Springer. Hlm 519-530 Wills ED 1987. Evaluation of lipid peroxidation in lipid and biological membranes. In: Snell K, Mullock B eds. Biochemical Toxicology. IRL Press Oxford: 127-37 Yanni AE. 2004. The Laboratory Rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Animals 38: 246-56 Yiming Li, Tran VH, Duke CC, Routagalis BD. 2012. Preventive and protective of Zingiber officinale (ginger) in diabetes mellitus, diabetic complications, and associated lipid and other metaboloic: Brief Review. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine, Hindawi Publishing Corporations Young IS, McEneny J. 2001. Lipoprotein oxidation and atherosclerosis. Biochem Society Transactions Vol. 29 (2): 358-62 Zelikoff JT, Thomas TP. 1998. Immunotoxicology of Enviromental and Occupational Metals. Taylor and Francis 1798-1998. P: 239-42 Zick S, Djuric Z, et al. 2008. Pharmacokinetics of 6-gingerol, 8-gingerol, 10gingerol and shogaol and conjugate metabolites in healthy human subjects. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17 (8): 1930-35
Lampiran 1 Skema Alur Pembuatan Ekstrak Etanol Jahe (EERJ) Rimpang jahe gajah segar Determinasi, dibersihkan, dicuci, dipotong tipis & diangin-anginkan
Rimpang jahe gajah kering Diserbukkan lalu diayak dengan pengayak no. 40 mesh
Serbuk simplisia rimpang jahe gajah
Dimaserasi dengan etanol 70% Maserat rimpang jahe gajah Diuapkan dengan rotary vacuum evaporator Ekstrak kental rimpang jahe gajah
Dikeringkan dalam oven suhu 45°C dan diidentifikasi
Ekstrak kering rimpang jahe gajah Kelinci diet aterogenik dan hiperkolesterolemia
3 varian dosis, 2 varian dosis + Zn Kontrol normal, positif dan negatif
Kadar kolesterol total, LDL, plak ateroma, aktivitas SOD dan kadar MDA
90
Lampiran 2 Cara Penetapan Kadar Air EERJ (PAU IPB) Sebanyak 1 gram sampel ditimbang dalam cawan. Cawan yang berisi sampel dimasukkan ke dalam oven suhu 1500C selama 8 jam, lalu timbang. Kadar air dihitung dengan rumus:
Kadar air =
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑠𝑒𝑔𝑎𝑟−𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔)𝑥 100 % 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑠𝑒𝑔𝑎𝑟
Bobot botol timbang kosong (A)
= 8,0312 g
Bobot botol timbang + ekstrak awal (B)
= 9,0532 g
Bobot botol timbang + ekstrak akhir/ konstan (C) Susut pengeringan
=
=
B−C
B−A
x 100%
9,0532 − 8,9542
9,0532 − 8,0312
= 9,69%
x 100%
= 8,9542 g
91
Lampiran 3 Penetapan Kadar Lemak Total dalam Feses Sebanyak 2 gram sampel disebar di atas kapas yang beralas kertas saring dan digulung membentuk thimble, lalu dimasukkan dalam labu soxhlet. Kemudian diekstraksi selama 6 jam dengan pelarut lemak (heksan) sebanyak 150 mL. Lemak yang terekstrak kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 100OC selama 1 jam. Kadar lemak dihitung dengan rumus: Kadar lemak =
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑙𝑒𝑚𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑟𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑥 100% 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
92
Lampiran 4 Penetapan Kadar Kolesterol Total dan LDL (CHOD-PAP) 1. Kolesterol total Serum diambil sebanyak 10 µL, lalu dicampur reagen enzim (“kit”) sebanyak 1000 µL, kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25oC atau lima menit pada suhu 37oC kemudian dibaca dengan fotometer klinikal yang sudah dikalibrasi dan terdapat internal standar. 2. LDL kolesterol Serum diambil 100 µL masukkan ke dalam tabung kemudian dicampur dengan 1000 µL pereaksi pengendap yang terdiri dari campuran larutan heparin dan natrium sitrat. Campuran dihomogenkan setelah itu diinkubasi selama 10 menit dengan temperatur 20-25oC atau selama lima menit dengan temperatur 37oC. Pereaksi ini akan mengendapkan HDL, kemudian campuran disentrifuse. Setelah disentrifuse diambil supernatan sebanyak 100 µL lalu dimasukkan ke dalam tabung kemudian dicampur dengan 1000 µL reagen enzim (“kit”). Setelah tercampur tentukan kadar kolesterol dalam supernatan dengan fotometer klinik yang sudah dikalibrasi dan terdapat internal standar. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut: Kolesterol ester + H 2 O Kolesterol + O 2
kolesterol esterase kolesterol oksidase
Kolesterol + RCOOH 4-kolesten-3-one + 4H 2 O 2
2H 2 O 2 + fenol + 4-aminoanthipyrine peroksidase Quinine (merah) + 4H 2 O
93
Lampiran 5 Persiapan Sampel untuk Pengukuran MDA dan Aktivitas SOD
Sel darah kelinci (sentrifus dingin)
Supernatan/plasma (MDA)
Sel darah merah (SOD)
+ TCA 20%, vorteks selama 1 menit lalu sentrifuse 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm
Dicuci dengan NaCl 0,9% (3x) lalu sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm
Supernatan + TBA 0,67%
Vortex selama 1 menit Panaskan pada suhu 100°C, 10 menit
Endapan sel darah merah + aquadest
Supernatan dibuang
Vorteks selama 1 menit lalu sentrifuse selama 10 menit kecepatan 3000 rpm Hemolisat + campuran kloroform-etanol 96% (3:5)
Dinginkan dengan air mengalir
Vortex selama 1 menit lalu sentrifuse 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm Fitrat berwarna kuning jernih
Ukur absorbans pada λ 532 nm
+ aquadest + buffer karbonat
+ epinefrin 0,0097 M Ukur absorbans pada λ 480
94
Lampiran 6 Pengukuran Kadar MDA. Malonaldehid bila direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) pada suhu 1000C akan membentuk senyawa berwarna merah muda yang serapannya dapat dibaca pada panjang gelombang 530-532 nm. Digunakan tetraetoksipropan (TEP) sebagai standar dari pengukuran MDA. 1. Pembuatan kurva standar Pembuatan kurva kalibrasi untuk penetapan kadar MDA dengan tetraetilpropan (TEP) BM TEP
= 220,3
TEP yang Tersedia
= 97% dengan B j = 0,92
Massa (g) TEP 1000 mL = (volume x Bj) x konsentrasi = (1000 x 0,92) x 97% = 844,2 g Konsentrasi (mol/ml) =
844,2
220,3
x
1
1000 𝑚𝑙
=
gram Mr
x
1
1000 mL
= 0,00405 mol/mL = 4,05 mmol/mL (larutan induk)
a. Membuat Larutan Kerja 50 nmol/mL Larutan induk 12,35 uL diencerkan ad 1000 mL atau pengenceran 80.000 kali (Larutan kerja) b. Membuat larutan Standar (0,25; 0,5; 1; 2; dan 4 nmol/mL) Dipipet 10, 20, 40, 80, dan 160 uL larutan kerja, diencerkan dengan akuades sampai 2 mL lalu ambil 1 mL dan ditambahkan 0,5 ml TCA 20% dan 1 mL TBA 0,67% . c. Larutan dipanaskan di water bath sampai mendidih selama 15 menit lalu didiamkan sampai dingin dan divortek, absorben supernatan diukur pada λ 532 nm
95
Hubungan Konsentrasi TEP dan Absorbans No.
Absorbans
1
Konsentrasi (nmol/mL) 0,25
2
0,5
0,090
3
1
0,192
4
2
0,373
5
4
0,771
0,060
Y= a + bX a= 0,00075 b= 0,239 R= 0,9995 Y= 0,00075 +0,239 X
Gambar 5 Kurva Kalibrasi Hubungan antara Konsentrasi TEP dan Absorbans pada λ 532 nm Keterangan: Yang dimaksud konsentrasi dalam gambar adalah volume (uL) yang dipipet
96
b. Pengukuran Kadar MDA Dalam 1 ml plasma ditambahkan 0,5 larutan TCA 20%, kocok selama satu menit dan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Ambil supernatan masukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL larutan TBA 0,67 %, kocok hingga homogen. Masukan ke dalam penangas air mendidih selama 15 menit. Setelah didinginkan dengan air mengalir larutan disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit dan supernatan diukur absorbansnya pada λ 520-532 nm.
Contoh Perhitungan Kadar MDA Kadar MDA (X) dihitung dengan cara memasukkan data serapan sampel (Y) dari kurva kalibrasi MDA standar dalam persamaan garis regresi. Misalkan : Y = 0,0460 a = 0,00075 b = 0,239 Y
= a + bX
0,0460
= 0,00075 + 0,239 X
X = 0,1893 nmol/mL
97
Lampiran 7 Pengukuran Aktivitas SOD Lima ratus μL hemolisat sel darah merah diekstraksi dengan 800 μL campuran kloroform-etanol 96% (3:5), kocok sampai homogen selama 1 menit. Sentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan dapat disimpan dalam pendingin pada suhu – 200C jika aktivitas SOD tidak langsung ditetapkan. Ke dalam kuvet untuk blangko masukkan 2800 μL buffer karbonat 0,0518 M pH 10,2 ditambahkan 150 μL aquadest dan 50 μL
epinefrin 0,0097 M, kocok sampai
homogen (volume 3000 μL). Absorbans diukur pada panjang gelombang 480 nm pada suhu 300C, setelah menit 1,2,3 dan 4 atau kecepatan penurunan absorban permenit konstan hitung delta Absorban per menit (delta tanpa sampel). Delta absorbans per menit dibuat sekitar 0,025, kalau tidak diperoleh nilai tersebut atur volume epinefrin 0,0097 M sehingga diperoleh nilai tersebut. Pada tabung sampel masukkan 2800 μL buffer karbonat 0,0518 M pH 10,2 dan tambahkan sampel dengan volume tertentu serta epinefrin 0,0097 M (sama dengan tanpa sampel) sedemikian rupa sehingga diperoleh delta Absorbans per menit kurang dari 0,025 (delta Absorbans dengan sampel).
Misalkan :
∆abs
menit
tanpa sampel
= 0,0264
∆abs
dengan sampel = 0,0060 menit
Faktor pengenceran % hambatan =
= = =
= 240
∆abs ∆abs tanpa sampel − dengan sampel menit menit ∆abs tanpa sampel menit
a%
50%
x 100% = a%
x faktor pengenceran = ….U/mL darah
0,0264 − 0,0060 0,0264
77,272% 50%
x 100% = 77,272%
x 240
= 370,90 unit/ml (1 mL sel darah merah = 99,5 mg protein) Maka % hambatan SOD adalah 370,90 unit/99,5 mg = 3,7276 unit/mg protein
98
Lampiran 8 Penentuan Luas Plak Ateroma di Aorta Aorta yang sudah dibersihkan dibelah membujur (dibuka) lalu dicuci dengan larutan isopropanol 60%. Selanjutnya aorta tersebut dimasukkan dalam larutan oil red o 0,3% dalam isopropanol selama 10 menit. Cuci aorta yang sudah direndam dalam pewarna di atas dengan larutan isopropanol 10% sebanyak 3 kali dan dilanjutkan dicuci dengan aquades. Aorta yang sudah terwarnai dibentangkan pada papan karet dengan bantuan jarum pentul lalu difoto. dihitung
Dari hasil foto tersebut
luas lemak di tunika intima (berwarna merah) dengan program
MacBiophotonic ImageJ untuk menentukan persentase luas plak aterosklerosis.
99
Lampiran 9 Perhitungan Rendemen dan Kadar Abu EERJ 1. Rendemen Bobot ekstrak kental rimpang jahe gajah
= 336,85 g
Bobot serbuk kering rimpang jahe gajah
= 2100 g
% rendemen
=
336,85
x 100%
2100
= 16,0405% 2. Kadar Abu Bobot botol timbang kosong (A)
= 22,5454 g
Bobot botol timbang + ekstrak awal (B)
= 23,2108 g
Bobot botol timbang + ekstrak akhir/ konstan (C)
= 22,5835 g
Kadar abu
=
=
C− A
B− A
x 100%
22,5835 − 22,5454 23,2108 − 22,5454
= 3,9465%
x 100%
100
Lampiran 10 Perhitungan Volume Cekok Zat Uji dan Pembanding 1. Volume Cekok Suspensi EERJ a. Dosis 200 mg/kgBB Konsentrasi yang dibuat
= 200 mg/mL
Misalkan bobot badan kelinci
= 3,656 kg
Dosis
= 3,656 kg x 200 mg/kg BB = 731,2 mg
Volume cekok yang diberikan = b. Dosis jahe 100 mg/kgBB Misalkan : Bobot badan kelinci Dosis
731,2 mg
200 mg/mL
= 3,66 mL
= 2,780 kg = 2,780 kg x 100 mg/kg BB = 278 mg
Volume cekok yang diberikan =
278 mg
200 mg/mL
= 1,39 mL c. Dosis jahe 50 mg/kgBB Misalkan : Bobot badan kelinci Dosis
= 3,070 kg = 3,070 kg x 50 mg/kg BB = 153,5 mg
Volume cekok yang diberikan =
153,5 mg
200 mg/mL
= 0,77 mL 2. Volume Cekok Suspensi Zinc
Dosis zink sulfat 49,38 mg/3 kg BB ~ 50 mg/3 kg BB Misalkan : Bobot badan kelinci
= 3,280 kg
Konsentrasi yang dibuat
= 50 mg/mL
Dosis
= 3,280 kg x 16,46 mg/kgBB = 53,99 mg
Volume cekok yang diberikan
=
53,99 mg
50 mg/mL
= 1,08 mL
101
3. Volume Cekok Suspensi Atorvastatin Dosis atorvastatin 2,8 mg/1,5 kgBB atau 1,9 mg/kgBB Misalkan : Bobot badan kelinci
= 2,988 kg
Konsentrasi yang dibuat
= 20 mg/ml (sediaan atorvastatin)
Bobot 1 tablet atorvastatin
= 523,3 mg (zat aktif 40 mg)
Dosis
= 2,988 kg x 1,9 mg/kgBB = 5,59 mg =
5,59 mg 40 mg
x 523,3 mg
=73,13 mg Volume cekok yang diberikan
=
73,13 mg
20 mg/mL
= 3,66 mL
102
Lampiran 11 Perhitungan Jumlah Kuning Telur dan Minyak Kelapa untuk Membuat Pakan Aterogenik
Misalkan : Pakan aterogenik yang dibuat
= 115 kg
Konsentrasi kolesterol dalam pakan
= 0,5%
Kolesterol yang dibutuhkan
=
0,5% 100
x 115 kg
= 0,575 kg Kandungan kolesterol dalam kuning telur = 5% Kuning telur yang dibutuhkan : 5
100
x kuning telur yang dibutuhkan = 0,575 kg
Kuning telur yang dibutuhkan
=
100 5
x 0,575 kg
= 11,5 kg Minyak Kelapa yang dibutuhkan 5%
=
5
100
x 115 kg
= 5,75 kg
103
Lampiran 12 Tabel Komposisi Pakan Standar, Pakan Aterogenik , dan Nilai Kalori No. 1 2 3 4 5 6
Komposisi Protein Kasar Serat Kasar Abu Air Lemak Kalori
(Balitnak 2011)
Pakan Standar 17% 14% 8% 11,8% 13,4% 2600 kkal/kg
Pakan Aterogenik 17% 14% 8% 11,5% 28,5% 2900 kkal/kg
104
Lampiran 13 Gambar Hewan Coba
Kelinci Percobaan
Contoh Sampel Uji
Saat Pemberian Zat Uji
Kandang Hewan Coba
105
Lampiran 14 Gambar Bahan Penelitian: Rimpang Jahe, EERJ, dan Pakan
Tanaman Jahe Gajah
Rimpang Jahe Gajah
Ekstrak Etanol Rimpang Jahe Kering
Pakan Aterogenik
Pakan Standar
106
Lampiran 15 Gambar Beberapa Alat untuk Penelitian
Oven
Centrifuse Dingin
Rotary evaporator vacum
Alat Pembuat Pakan Pellet
107
Lampiran 16 Tabel Konversi Dosis pada Berbagai Jenis Hewan (Paget dan Barnes) Dicari Mencit Tikus Marmut Kelinci Kucing Kera Anjing Manusia diketahui 20 g 200g 400 g 1,5 kg 1,5 kg 4 kg 12 kg 70 kg Mencit 1,0 7,0 12,23 27,80 29,7 64,10 124,20 387,90 20 g Tikus 0,14 1,0 1,74 3,9 4,20 9,20 17,80 56,0 200g Marmut 0,08 0,57 1,0 2,25 2,40 5,20 10,20 31,50 400 g Kelinci 0,04 0,25 0,44 1,0 1,08 2,40 4,50 14,20 1,5 kg Kucing 0,03 0,23 0,41 0,92 1,0 2,20 4,10 13,0 1,5 kg Kera 0,016 0,11 0,19 0,42 0,43 0,1 1,9 6,1 4 kg Anjing 0,008 0,06 0,l0 0,22 1,24 0,52 1,0 3,10 12 kg Manusia 0,0026 0,018 0,031 0,07 0,076 0,16 0,32 1,0 70 kg
108
Lampiran 17 Tabel Kadar Lemak Feses (%) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik pada Minggu ke-3 Perlakuan Perlakuan Kadar Air Diet standar (DS)
Kadar (%) Kadar zat Kadar non air lemak
32,86 67,14 2,53 27,73 72,27 3,22 24,63 75,37 3,24 28,40 71,60 3,11 Diet 19,09 80,91 6,32 aterogenik 20,04 79,96 4,26 (DA) 9,19 80,81 5,59 19,51 80,49 4,55 DA + Zn 6,67 23,77 76,23 3,64 mg/kg BB 15,41 84,59 3,12 17,71 82,29 5,89 22,71 77,29 4,48 DA + EERJ 40,83 59,17 4,33 200 mg/kg BB 19,12 80,88 2,17 18,91 81,09 4,48 17,47 82,53 2,20 DA + EERJ 21,40 78,6 4,86 50 + Zn 6,67 38,96 61,04 4,76 mg/kg BB 30,25 69,57 3,84 40,93 59,07 4,29 DA + EERJ 17,88 82,12 3,05 100 + Zn 6,67 16,69 83,31 2,06 mg/kg BB 29,64 70,36 6,42 13,54 86,46 3,35 DA + 19,56 80,44 2,92 Atorvastatin 11,69 88,31 3,36 1,9 mg/kg BB 16,44 83,56 4,76 10,85 89,15 6,82 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Kadar lemak Tanpa air 3,77 4,46 4,30 4,33 7,81 5,33 6,16 5,65 4,78 3,69 7,16 5,80 7,32 2,68 7,05 2,67 6,18 9,65 5, 52 7,26 3,71 2,47 9,12 3,87 3,63 3,80 5,70 7,65
Rata-Rata ± SD
4,23 ± 0,31
6,24 ± 1,10
5,36 ± 1,48
4,93 ± 2,61
7,15 ± 1,81
4,79 ± 2,95
5,20 ± 1,99
109
Lampiran 18 Tabel Kenaikkan Kadar Kolesterol Total (%) pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
Kadar KT (mg/dL) Awal Akhir
Diet standar (DS)
69,5 48,5 52,7 62,6 44,9 67,9 67,1 79,6 36,7 55,1 54,5 47,1 82,7 92,2 54,2 67,5 66,1 65,1 66,8 90,4 50,3 66,7 80,6 87,5 88,4 73,6 58,6 58,4
Diet aterogenik (DA)
DA + Zn 6,67 mg/kg BB
DA + EERJ 200 mg/kg BB
DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB
112,58 74,65 93,62 96,0 250,56 428,57 614,85 764,87 189,41 181,50 191,28 198,52 137,26 144,16 136,00 139,89 117,46 122,71 124,01 128,85 125,94 130,37 134,86 131,21 158,40 142,50 130,52 136,16
Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Kenaikan (%) Rerata ± SD 61,99 53,92 77,65 53,35 458,04 531,19 816,73 860,82 416,10 229,40 251,62 321,49 65,97 48,76 150,92 107,34 77,70 88,49 85,56 42,53 150,38 95,54 67,32 49,95 79,19 93,61 122,73 133,15
61,73 ± 11,3
666,70 ± 201,74
304,65 ± 84,02
93,25 ± 45.6
73,57 ± 21,2
90,80 ± 43,94
107,17 ± 25,0
110
Lampiran 19 Tabel Kenaikkan Kadar LDL (%) pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan Diet standar (DS)
Diet aterogenik (DA) DA + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 200 mg/kg BB DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB
Kadar LDL (mg/dL) Awal Akhir 54,87 40,22 43,67 50,21 33,68 52,07 46,53 58,46 28,60 40,70 41,49 35,54 64,04 68,75 42,99 51,81 70,17 56,99 60,96 81,92 37,00 51,25 68,58 68,27 68,35 58,11 48,00 46,58
88,93 60,81 74,87 76,63 149,08 298,82 381,06 567,15 143,61 139,10 146,32 152,72 107,90 110,63 106,51 108,58 91,39 91,23 94,53 98,59 101,59 103,85 105,76 104,12 120,11 114,50 117,53 109,85
Kenaikan (%) Rerata ± SD 62,07 51,19 71,44 52,62 342,64 473,88 718,95 1024,10 402,13 241,77 252,66 329,71 68,49 68,92 147,76 109,57 30,24 60,08 55,07 20,35 174,57 102,64 54,21 52,51 75,73 97,04 144,85 135,83
Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
59,3 ± 9,4
639,9 ± 299,9
306,6 ± 74,8
98,7 ± 38,0
41,4 ± 19,2
96,0 ± 57,3
113,4 ± 32,6
111
Lampiran 20 Bio-imaging Rerata Luas Plak Ateroma dalam Tunika Intima (%) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
Perwakilan Gambar image
Luas Plak (%)
Diet standar (DS)
37,98 ±
Diet aterogenik (DA)
56,03 ±
DA + Zn 6,67 mg/kg BB
52,48 ±
DA + EERJ 200 mg/kg BB
48,98 ±
DA + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB DA + Atorvastatin 1,9 mg/kg BB
42,20 ±
Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
0,90ad
2,66b
3,49b
3,75c
5,10dc 46,98 ± 0,88ec
43,55 ± 2,42d
112
Lampiran 21 Tabel Kadar MDA (nmol/mL) pada Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
Absorban Kadar MDA Rata-rata ± (nmol/mL) SD Diet standar (DS) 0,046 0,1893 0,2113 ± 0,0214 0,052 0,2144 0,058 0,2395 0,049 0,2019 Diet aterogenik 0,215 0,8964 0,9309 ± 0,0267 (DA) 0,226 0,9425 0,222 0,9257 0,230 0,9592 DA + Zn 6,67 0,149 0,6203 0,6359 ± 0,0247 mg/kg BB 0,155 0,6454 0,147 0,6119 0,160 0,6663 DA + EERJ 200 0,093 0,3860 0,4079 ± 0,0171 mg/kg BB 0,098 0,4069 0,099 0,4111 0, 093 0,4278 DA + EERJ 50 + 0,078 0,3232 0,2928 ± 0,0314 Zn 6,67 mg/kg 0,062 0,2563 BB 0,075 0,3146 0,067 0,2772 DA + EERJ 100 + 0,098 0,4069 0,3755 ± 0,0261 Zn 6,67 mg/kg 0,083 0,3441 BB 0,089 0,3692 0,092 0,3818 DA + 0,108 0,4487 0,4592 ± 0,0200 Atorvastatin 0,111 0,4613 1,9 mg/kg BB 0,117 0,4864 0,106 0,4404 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
113
Lampiran 22 Tabel Aktivitas SOD (unit/mg Protein) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
Diet standar (DS)
Δ Abs /menit
Aktivitas SOD (unit/mL)
Total Protein % (mg/ ml)
Aktivitas SOD (unit/mg Protein)
0,0060 370,90 99,5 3,7276 0,0120 261,89 105,5 2,4824 0,0072 352,70 96,2 3,6663 0,0072 349,06 87,0 4,0122 Diet 0,0192 130,90 86,0 1,5221 aterogenik 0,0180 152,74 94,0 1,6490 (DA) 0,0168 174,53 91,0 1,9179 0,0168 174,53 111,5 1,5653 DA + Zn 0,0132 240,00 87,0 2,7586 6,67 mg/kg 0,0144 218,16 83,5 2,4929 BB 0,0108 283,63 89,5 3,1691 0,0120 261,79 95,5 2,7413 DA + EERJ 0,0120 261,79 86,5 3,0265 200 mg/kg 0,0108 283,63 95,0 2,9856 BB 0,0156 196,37 92,5 2,1229 0,0096 305,47 78,0 3,9163 DA + EERJ 0,0072 394,06 114,0 3,4567 50 + Zn 0,0096 305,47 88,2 3,4634 6,67 mg/kg 0,0084 327,31 87,0 3,7622 BB 0,0144 218,16 99,5 2,1926 DA + EERJ 0,0144 281,16 76,0 3,6995 100 + Zn 0,0096 305,47 99,0 3,0855 6,67 mg/kg 0,0108 383,63 89,3 4,2960 BB 0,0120 261,79 77,0 3,3999 DA + 0,0096 305,47 81,0 3,7712 Atorvastatin 0,1080 283,63 77,5 3,6597 1,9 mg/kg 0,0132 240,00 87,0 2,7586 BB 0,0120 261,79 91,5 2,8611 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Rerata ± SD Aktivitas SOD (unit/mg protein) 3,4721 ± 0,6768
1,6636 ± 0,1775
2,7905 ± 0,2801
3,0128 ± 0,7324
3,2187 ± 0,6988
3,6202 ± 0,5156
3,2627 ± 0,5265
114
Lampiran 23 Tabel Kenaikkan BB (%) Kelinci yang Diberi Diet Aterogenik dan Perlakuan Perlakuan
BB (g) BB (g) Kenaikkan (Awal) (Akhir) (%) Diet standar 2307 2684 16,34 (DS) 2493 2708 8,62 3056 3196 4,52 2236 2456 9,88 Diet 2798 3013 7,67 aterogenik 3143 3308 5,25 (DA) 2468 2662 7,86 2699 2974 10,12 DA + Zn 6,67 2487 2767 11,25 mg/kg BB 3014 3275 8,65 2666 3065 11,97 2748 2915 6,08 DA + EERJ 2789 3110 11,51 200 mg/kg BB 2878 3075 6,85 2545 2887 13,43 2737 2965 8,33 DA + EERJ 2978 3208 7,72 50 + Zn 6,67 2675 2948 10,20 mg/kg BB 2683 2988 11,36 2545 2793 9,74 DA + EERJ 2820 3204 13,62 100 + Zn 6,67 2425 2660 9,69 mg/kg BB 2754 2892 5,01 2789 3162 13,37 DA + 2885 3024 4,82 Atorvastatin 2576 2874 11,56 1,9 mg/kg BB 2859 3055 6,86 2841 3122 9,89 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Rata-rata ± SD 9,84 ± 4,90
7,73 ± 1,99
9,49 ± 2,68
10,48 ± 2,43
9,76 ± 1,51
10,42 ± 4,03
8,28 ± 3,02
115
Lampiran 24 Tabel Penurunan Kolesterol Total (%) pada Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan Kadar KT (mg/dL) Penurunan (%) Perlakuan Awal Hiperko- Setelah Rerata ± SD mg/kg BB lesterol Perlaku an Diet standar 89,4 1015,38 368,52 63,70 67,13 ± 14,64 (DS) 57,6 428,57 221,30 48,36 74,4 764,83 97,22 74,21 56,4 250,54 44,44 82,26 DS + Zn 79,1 1074,72 86,11 91,98 81,16 ± 8,24 6,67 mg/kg 58,1 687,91 115,74 83,17 BB 54,5 428,57 107,41 74,93 35,7 251,97 64,00 74,55 DS + EERJ 92,1 876,92 59,26 93,24 90,07 ± 4,02 200 mg/kg 82,8 837,36 132,4 84,18 BB 52,2 578,02 48,15 91,66 68,5 672,52 59,26 91,18 DS + EERJ 67,1 619,78 68,52 88,94 87,73 ± 6,52 50 + Zn 90,2 929,67 77,78 91,63 6,67 mg/kg 66,2 639,56 50,00 92,18 BB 68,8 802,19 175,00 78,18 DS + EERJ 88,5 940,65 83,33 91,14 89,86 ± 3,31 100 + Zn 80,4 525,27 53,70 89,77 6,67 mg/kg 68,8 764,83 112,04 85,35 BB 52,2 745,83 50,93 93,17 DS + 80,6 861,53 49,07 94,30 91,43 ± 3,19 Atorvastatin 45,9 437,36 57,41 86,87 1,9 mg/kg 71,9 874,72 69,44 92,06 BB 68,7 764,83 57,41 92,49 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
116
Lampiran 25 Penurunan Kadar LDL (%) pada Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan Perlakuan
Kadar LDL (mg/dL) Penurunan (%) Awal HiperkoSetelah Rerata ± SD lesterol Perlaku an Diet standar 67,7 515,19 129,56 74,85 72,55 ± 7,96 (DS) 44,6 298,82 116,44 61,03 59,5 657,16 164,57 74,95 44,2 149,08 30,78 79,35 DS + Zn 64,8 841,55 166,6 80,20 80,66 ± 1,68 6,67 mg/kg 45,8 546,45 94,28 82,75 BB 42,4 318,33 60,58 80,96 27,0 108,80 23,16 78,71 DS + EERJ 75,4 700,34 57,56 91,78 90,79 ± 1,31 200 mg/kg 67,2 604,19 67,04 88,90 BB 41,1 328,27 27,66 91,57 53,1 523,25 47,56 90,91 DS + EERJ 50,9 463,78 19,98 95,69 93,89 ± 3,07 50 + Zn 72,9 787,23 30,95 96,06 6,67 mg/kg 51,5 541,02 57,32 89,41 BB 54,4 572,92 32,07 94,40 DS + EERJ 72,1 565,04 54,55 90,34 89,20 ± 4,25 100 + Zn 64,8 388,69 37,55 90,33 6,67 mg/kg 42,1 392,15 66,19 83,12 BB 39,5 446,32 31,17 93,01 DS + 65,6 814,40 74,86 90,80 86,21 ± 8,56 Atorvastatin 34,5 357,35 35,35 88,98 1,9 mg/kg 56,2 552,15 46,49 91,58 BB 52,4 552,15 146,44 73,48 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
117
Lampiran 26 Bio-imaging Rerata Luas Plak dalam Tunika Intima (%) Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan Perlakuan
Perwakilan Gambar Image
Diet standar (DS) DS + Zn 6,67 mg/kg BB DS + EERJ 200 mg/kg BB DS + EERJ 50 + Zn 6,67 mg/kg BB DS + EERJ 100 + Zn 6,67 mg/kg BB DS + Atorvastat in 1,9 mg/kg BB Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Luas Plak (%) 56,03 ± 2,66a 44,15 ± 5,22 b 43,00 ± 6,29 b 39,73 ± 4,32 b 42,50 ± 1,34 b 43,93 ± 5,24b
118
Lampiran 27 Tabel Kadar MDA (nmol/mL) Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan Perlakuan
Absorban Kadar MDA Rata-rata ± (nmol/mL) SD Diet standar (DS) 0,067 0,2772 0,2866 ± 0,0201 0,069 0,2856 0,065 0,2688 0,076 0,3149 DS + Zn 6,67 0,058 0,2374 0,2403 ± 0,0026 mg/kg BB 0,058 0,2404 0,059 0,2437 0,058 0,2395 DS + EERJ 200 0,045 0,1851 0,2089 ± 0,0176 mg/kg BB 0,055 0,2270 0,052 0,2144 0,050 0,2090 DS + EERJ 50 + 0,041 0,1663 0,1642 ± 0,0070 Zn 6,67 mg/kg 0,040 0,1621 BB 0,042 0,1726 0,038 0,1559 DS + EERJ 100 + 0,045 0,1851 0,1851 ± 0,0090 Zn 6,67 mg/kg 0,042 0,1726 BB 0,046 0,1893 0,047 0,1935 DS + Atorvastatin 0,055 0,2257 0,2085 ± 0,0133 1,9 mg/kg BB 0,047 0,1935 0,050 0,2061 0,051 0,2086 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
119
Lampiran 28 Tabel Aktivitas SOD (unit/mg Protein) pada Kelinci Hiperkolesterolemia karena Perlakuan
Perlakuan
Δ Abs /menit
Aktivitas SOD (unit/mL)
Total Protein % (mg/ mL) Diet standar 0,0098 301,82 90 (DS) 0,0102 294,55 97 0,0105 289,09 93 0,0110 280,00 87 DS + Zn 6,67 0,0075 343,64 105 mg/kg BB 0,0090 316,36 93 0,0045 398,18 95 0,0090 316,36 88 DS + EERJ 0,0075 343,64 86 200 mg/kg 0,0045 398,18 91 BB 0,0065 361,82 91 0,0075 424,45 92 DS + EERJ 0,0028 429,09 95 50 + Zn 6,67 0,0032 421,82 85 mg/kg BB 0,0030 425,45 97 0,0025 434,53 92 DS + EERJ 0,0068 356,36 87 100 + Zn 6,67 0,0045 398,18 103 mg/kg BB 0,0080 334,55 97 0,0064 363,64 89 DS + 0,0060 370,91 95 Atorvastatin 0,0075 343,64 94 1,9 mg/kg BB 0,0040 407,27 92 0,0058 374,54 91 Keterangan: EERJ (Ekstrak etanol rimpang jahe)
Aktivitas SOD (unit/mg Protein) 3,3535 3,0366 3,1084 3,2183 3,2728 3,4017 4,1914 3,5950 3,9958 4,3756 3,9760 4,6136 4,5167 4,9626 4,3860 4,7232 4,0961 3,8658 3,4490 4,0858 3,9043 3,6557 4,4268 4,1158
Aktivitas SOD (unit/mg Protein) rata-rata ± SD 3,1792 ± 0,1382
3,6152 ± 0,4063
4,2403 ± 0,3095
4,6471 ± 0,2520
3,8742 ± 0,3027
4,0257 ± 0,3269
