Keywords: isolasi klorofilase, fraksinasi aseton, daun mahoni

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

ISOLASI DAN PENENTUAN AKTIFITAS SPESIFIK KLOROFILASE DARI DAUN MAHONI (Swietenia mahagoni) (Isolation and Determination Specific Activity of Chlorophyllase from Mahogany Leaf (Swietenia mahagoni)) Nurlita Khasanah., Dra. Wuryanti, M.Si., Dra. Nies Suci M, M.S. Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275, Telepon (024) 7474754 [email protected]

ABSTRAK Telah dilakukan isolasi dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dari daun mahoni (Swietenia mahagoni). Tahapan penelitian meliputi isolasi plastida, isolasi enzim klorofilase, penentuan aktifitas spesifik klorofilase pada pH= 7,4 dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dengan berbagai variasi pH dan waktu inkubasi. Hasil penelitian diperoleh bahwa aktifitas spesifik tertinggi klorofilase dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) terdapat pada kejenuhan aseton 80-95%, yaitu sebesar 13,605 unit/mg protein Adapun pengaruh pH dan waktu inkubasi terhadap aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase terdapat pada pH 8,6 dan waktu inkubasi 5 menit, sedangkan aktifitas spesifik klorofilase terendah pada pH 7,0 dan waktu inkubasi 45 menit. Adanya variasi pH dan waktu inkubasi menunjukkan bahwa pH tidak terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik klorofilase sedangkan semakin lama waktu inkubasi, aktifitas spesifik klorofilase semakin menurun. Keywords: isolasi klorofilase, fraksinasi aseton, daun mahoni ABSTRACK Enzyme chlorophyllase was isolated and determination specific activity of chlorophyllase from mahoni leaf (Swietenia mahagoni) Several stage of this work including plastid isolation, determination of specific activity chlorophyllase at pH= 7,4 and determination of specific activity of chlorophyllase with pH and incubation time variation. Result showed the highest specific activity in leaf mahogany (Swietenia mahogany) present in acetone with saturation of 80-95%, with value is 13.605 units/mg protein. The influence of pH and incubation time of the higher specific activity of chlorophyllase at pH 8.6 and incubation time of 5 minutes, whereas the smaller specific activity of chlorophyllase at pH 7.0 and incubation time of 45 minutes. The presence of variation pH and incubation time on specific activity of chlorophyllase, showed that variation pH not influence specific activity of chlorophyllase and the longer of incubation time, specific activity of chlorophyllase was decreased. Keywords: isolation chlorophyllase, acetone fractionation, leaf mahogany

386

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

deodocyl sulfate (merck), petroleum eter p.a., NaCl, dll.

I.

PENDAHULUAN Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai katalisator reaksi-reaksi kimia dalam sistem biologis. Enzim memiliki daya katalitik yang tinggi. Kemampuan enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi tergambar melalui aktifitasnya. Harga aktifitas enzim dipengaruhi beberapa faktor antara lain: pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan inhibitor (Lehninger, 1982). Enzim memegang peranan dalam berbagai aspek dalam kehidupan, misalnya enzim klorofilase. Enzim klorofilase memiliki peranan penting dalam metabolisme daun. Secara in vitro enzim ini mengkatalisis pemutusan gugus fitol dari klorofil dan juga feofitin (Goodwin, 1976) dan dapat dimanfaatkan di berbagai bidang, salah satunya yaitu di bidang industri minyak. Khamessan, dkk., (1995) melaporkan bahwa klorofilase dapat berfungsi sebagai agen bleaching pada minyak sayur dengan menghilangkan senyawa klorofil. Berdasarkan manfaat tersebut, perlu dilakukan penelitian mengenai aktifitas spesifik klorofilase yang terdapat pada daun mahoni. Tanaman mahoni merupakan tanaman yang memiliki nilai potensial dalam bahan pembuatan obat-obatan. Namun daun mahoni masih jarang di manfaatkan secara luas. Diharapkan dengan isolasi klorofilase pemanfaatan daun pada mahoni dapat lebih luas dan dapat mengetahui informasi mengenai aktifitas klorofilase yang terdapat di daun mahoni tersebut.

2.2 METODE KERJA 2.2.1 Isolasi klorofil dengan Metode Kromatografi Kolom Isolasi klorofil dari daun mahoni menggunakan metode kromatografi kolom (Limantara, dkk., 2009). Daun mahoni yang telah kering kemudian di blender dan di maserasi dengan metanol:aseton (7:3, v/v). Lalu klorofil yang diperoleh digunakan sebagai substrat untuk penentuan aktifitas spesifik klorofilase. 2.2.2 Isolasi Plastida Daun mahoni yang telah dibersihkan dan dikeringkan diiris kecil-kecil lalu diblender kemudian ditimbang sebanyak 75 gram lalu dimaserasi dengan 500 mL larutan aseton. Homogenat disaring menggunakan corong Buchner. Filtrat hasil maserasi digabungkan untuk selanjutnya dipekatkan dengan rotary evaporator lalu dikeringkan dan disimpan dalam freezer. 2.2.3 Isolasi Enzim Klorofilase Ekstrak aseton dari daun mahoni yang berupa padatan hasil dari pengeringan kemudian ditimbang sebanyak 2,01 gram. Selanjutnya isolasi klorofilase dengan menggunakan 40 mL larutan pengekstrak yang terdiri dari trishidroksimetil-aminometan 42 mM, glisin 320 mM, glukosa 670 mM, polivinylpirolidon 2% (w/v), sodium deodocyl sulfate 0,5% (w/v) dengan kondisi pH larutan campuran tersebut sebesar 7,4. Kemudian dilakukan pengadukkan lambat menggunakan pengaduk magnet selama 8 o jam pada suhu 4 C, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm, selama 20 menit. Selanjutnya filtratnya difraksinasi dengan pelarut aseton. 2.2.4 Fraksinasi Enzim Klorofilase dengan pelarut aseton Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim (enzim kasar) dengan prinsip pengendapan. Untuk fraksi 0-20%, larutan aseton dingin dengan kejenuhan 0-20% ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan ekstrak kasar enzim, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Filtrat hasil fraksi 1 dilanjutkan untuk fraksinasi selanjutnya yaitu

II. 2.1 2.1.1

METODE KERJA Alat dan Bahan Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu alat-alat gelas laboratorium, Spectronic UV mini 1240, sentrifus Heraecus model Biofuge 13, inkubator, detektor UV (Spectroline ENF24/F), dll. 2.1.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu: daun mahoni (Swietenia mahagoni), aseton p.a., glisin (merck), polivinylpirolidon (merck), sodium 387

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

fraksi 2, 20-40%, fraksi 3, 40-60%, fraksi 4, 60-80%, fraksi 5, 80-95%.

larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol. 2.2.8 Penentuan Aktifitas Spesifik Klorofilase yang dipengaruhi Variasi Waktu Inkubasi Larutan campuran terdiri dari larutan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat dengan pH 7,4 dengan total volume 0,7 mL serta dibuat larutan pengontrol. Masing-masing larutan o d2nkubasi pada suhu 35 C dengan waktu inkubasi yang divariasikan yaitu 5 menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit, 30 menit, 35 menit, 40 menit dan 45 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol.

2.3.5 Penentuan Unit Aktifitas Enzim Klorofilase Satu unit aktifitas enzim klorofilase pada penelitian ini didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat menghidrolisis 1 mg klorofil per menit pada kondisi optimum. Untuk menentukan aktifitas enzim dilakukan dengan cara, larutan campuran terdiri dari larutan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat pada pH 7,4 dengan total volume 0,7 mL serta dibuat larutan pengontrol. Kemudian masing-masing larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol. 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat dengan III. HASIL DAN PEMBAHASAN pH yang divariasikan pada pH 6,2; 6,3; 6,4; 3.1 Isolasi Klorofil dengan Metode 6,5; 6,6; 7,0; 7,4; 7,8; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; dan Kromatografi Kolom 8,6 dan total volume 0,7 mL, serta dibuat Ekstraksi pigmen klorofil ini dilakukan larutan pengontrol. Kemudian masing-masing untuk mendapatkan klorofil dari daun mahoni 2.2.6 Penentuan Kadar Protein dengan (Swietenia mahagoni), yang akan digunakan Metode Lowry sebagai substrat pada penentuan aktifitas Kadar protein hasil fraksinasi aseton spesifik klorofilase. Hasil kromatografi kolom ditentukan dengan metode Lowry silika gel didapatkan 23 botol fraksi, dengan menggunakan larutan Bovine Serum Albumin 11 fraksi yang masing-masing akan di uji (BSA) sebagai protein standar. dengan KLT. Hasil KLT produk isolasi Aktifitas Spesifik klorofil dengan kromatografi kolom dengan 2.2.7. Penentuan Klorofilase yang dipengaruhi Variasi eluen heksan:eter:aseton (6:3:2) masingpH masing fraksi memberikan noda sebanyak 6 Untuk menentukan aktifitas enzim buah. Profil KLT tersebut mengindikasikan ada berbagai macam produk yang dihasilkan yang dipengaruhi pH dilakukan dengan cara, serta menunjukkan bahwa, eluen yang larutan campuran terdiri dari larutan aseton

388

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

digunakan masih belum cukup untuk larutan enzim berwarna kuning dan endapan mendapatkan isolat klorofil murni. yang berwarna coklat kehijauan dengan nilai tertinggi dari aktifitas klorofilase terdapat pada Hasil analisis klorofil dengan KLT, fraksi 5, 80-95%. menunjukkan bahwa klorofil a dan klorofil b berhasil di isolasi dari daun mahoni yang Selain menggunakan aseton, fraksinasi terdapat di fraksi A, ditandai dengan juga dapat menggunakan pelarut organik terbentuknya noda berwarna hijau muda untuk lainnya dan garam amonium sulfat. Penelitian klorofil a dan noda berwarna hijau tua untuk sebelumnya (Karboune, dkk., 2005; Arkus, dkk., 2006; Kumar, dkk., 2011) mengisolasi klorofil b, dengan Rf dari klorofil a sebesar dan fraksinasi klorofilase menggunakan 0,43 serta setelah di analisis dengan lampu pelarut aseton. Karena pelarut aseton yang detektor UV, λ=365 nm terbentuk noda dengan bersifat lebih nonpolar dan klorofil akan larut warna merah bata menyala. Klorofil pada dalam aseton dan protein dapat terendapkan fraksi A tidak dimurnikan kembali dan tanpa mengendapkan klorofil. digunakan sebagai substrat pada penentuan aktifitas spesifik klorofilase. 3.4 Penentuan Kadar Protein dengan 3.2 Isolasi Enzim Klorofilase metode Lowry Sebelum mengisolasi enzim klorofilase Kadar protein pada tiap-tiap fraksi diukur dengan menggunakan metode Lowry. Melalui pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) metode ini, protein dalam daun mahoni terlebih dahulu dilakukan isolasi jaringan sel (Swietenia mahagoni) akan bereaksi dengan (plastida) prosedur selanjutnya isolasi enzim pereaksi Lowry, menghasilkan senyawa klorofilase. Hasil yang diperoleh yaitu kompleks berwarna biru. Hasil absorbansi endapan berwarna hijau kecoklatan. Dalam hal yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva ini, SDS merupakan suatu molekul yang standar BSA. memiliki rantai lipofilik yang dapat berikatan dengan protein pada permukaan hidrofiliknya. Kadar protein dari daun mahoni yang Sehingga ikatan protein yang terikat dengan diperoleh pada fraksi tertinggi nilainya yaitu kuat melalui gaya hidrofobik dapat terputuskan 65,172 mg/mL. Penelitian sebelumnya dengan melalui proses pelarutan membran. (Scopes, penggunaan 2,01 gram serbuk yang diekstrak 1982; Johnston, 1987). Sedangkan untuk dan 40 mL larutan pengekstrak yang dikuti mengurangi pengaruh dari senyawa-senyawa dengan pengendapan aseton mendapatkan 0,387 mg protein pada daun suji, Sibarani, fenol yang dapat menginaktivasi enzim pada dkk., (1995). saat mengukur aktifitas enzim digunakan polivinylpirolidone (PVP). Berdasarkan 3.5 Penentuan Aktifitas Spesifik Enzim penelitian (Lopez, dkk., 1992) diinformasikan klorofilase bahwa polivinylpirolidone (PVP) yang Enzim Klorofilase ditemukan pertama digunakan pada saat isolasi enzim klorofilase kali oleh Wilstater dan Stoll pada tahun 1910. dapat meningkatkan aktifitas enzim klorofilase Nilai aktifitas enzim klorofilase ditentukan dari Citrus limon. dari banyaknya substrat klorofil yang 3.3 Fraksinasi enzim klorofilase dengan berkurang, karena hasil reaksi enzimatis

389

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

pelarut aseton Filtrat hasil penyaringan yang berisi campuran protein enzim dan protein non enzim ini disebut ekstrak kasar enzim, sehingga masih membutuhkan pemurnian lebih lanjut, menggunakan fraksinasi dengan pelarut aseton. Hasil yang diperoleh yaitu klorofil yang diukur dengan metode spektrofotometri pada λ= 662 nm (Terpstra, dkk., 1981., Khamessan, dkk., 1994). Hasil yang diperoleh tidak adanya penampakkan warna hijau pada larutan tersebut. Hasil yang seharusnya adalah terbentuknya larutan berwarna hijau yang

3.7 Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktifitas Spesifik Klorofilase Waktu inkubasi merupakan waktu kontak antara enzim dan substrat untuk menghasilkan produk. Hasil menunjukkan bahwa enzim klorofilase hasil isolasi dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) memiliki pola grafik yang tidak semestinya dari kerja suatu enzim. Seperti yang terlihat pada gambar 3.3 semakin lama waktu inkubasi aktifitas enzim klorofilase semakin menurun.

aktivitas spesifik (U/mg protein)

aktivitas spesifik(U/mgprotein)

(Swietenia mahagoni) yang dipengaruhi variasi pH, dilakukan terhadap enzim fraksi terbaik hasil fraksinasi dengan aseton. Hasil yang diperoleh, pada pH= 6,4 aktifitas enzim spesifik klorofilase di daun mahoni mengalami penurunan dengan unit aktifitas sebesar 4,487 unit/mL, pada pH= 7,4 hingga pH= 8,6 aktifitas enzim klorofilase dapat mengalami peningkatan. Gambar grafik dari pengaruh pH terhadap aktifitas enzim klorofilase pada daun mahoni dapat dilihat pada gambar 3.2 berikut ini:

0

7

8

20 40 t inkubasi (menit)

60

Gambar 3.3 Grafik pengaruh waktu inkubasi terhadap aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) Penurunan aktifitas dapat disebabkan karena enzim klorofilase yang diperoleh masih belum murni dan adanya pengaruh inhibitor pada saat pembentukkan reaksi kompleks enzim substrat. Selain itu juga dapat disebabkan karena waktu kontak dengan aseton dan fitol yang dapat menurunkan laju reaksi. Karena aseton dan fitol dapat bertindak sebagai inhibitor reaksi, sehingga akan terjadi penyimpangan terhadap aktifitas yang diperoleh dan memungkinkan terjadinya reaksi balik penguraian kompleks enzim substrat menjadi enzim bebas dan substrat kembali sehingga produk yang dihasilkan semakin sedikit (Garcia, dkk., 1980).

6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 6

14.000 12.000 10.000 8.000 6.000 4.000 2.000 0.000

9

variasi pH

Gambar 3.2 Grafik pengaruh pH terhadap aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) Dari gambar gambar 3.2 menunjukkan tidak adanya puncak optimum yang diperoleh dari hasil kerja enzim tersebut dan pH tidak terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik enzim klorofilase dikarenakan kondisi kemurnian enzim dan substrat yang masih belum murni. Selain itu, aktifitas enzim yang mulai menurun dapat disebabkan kontak enzim dengan sisa aseton hasil fraksinasi. Karena aseton dapat berfungsi sebagai inhibitor. (Garcia, 1980).

IV.

KESIMPULAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa : 1. Enzim klorofilase dapat diisolasi dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) yang difraksinasi menggunakan pelarut aseton.

390

ChemInfo Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013

Hasil fraksinasi dengan pelarut aseton menunjukkan aktifitas spesifik tertinggi pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) terdapat pada Fraksi ke 5, (80-95)%, nilainya yaitu 13,605 unit/mg protein. 2. Pengaruh pH dan waktu inkubasi terhadap aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase terdapat pada pH 8,6 dan waktu inkubasi 5 menit, sedangkan aktifitas spesifik klorofilase terendah pada pH 7,0 dan waktu inkubasi 45 menit, dengan pola grafik yang tidak sewajarnya (tidak diperoleh kondisi optimum dari kerja enzim klorofilase tersebut). Semakin lama waktu inkubasi, aktifitas spesifik klorofilase semakin menurun dan variasi pH tidak mempengaruhi aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni). V. DAFTAR PUSTAKA 1. Arkus, A.J., Kiani, dan Jez, M, Joseph., 2006, Development of High- Troughput purification method and a continous assay system for Chlorophyllase. USA, Donald Danforth Plant Sciences, Elsivier: Analytical Biochemistry, 353, 93-98 2. Garcia, A.L., Galindo, L., dan Navaro, S., 1980, Chlorophyllase in Citrus Leaves, Kinetics Aspects of Reaction, Biol.Plant, 22,(4), 255-262 3. Goodwin, T.W., 1976, Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, edisi kedua, Vol.,2 Acid Pess, New York 4. Johnston, A., 1987, Immunochemistry in Practice, edisi kedua. Blackwill Sci, Publ. Grit, Britain 5. Karboune, Salwa, Neufeld, Ronald dan Kermasha, S., 2005, Immobilization and biocatalysis of chlorophyllase in selected organic solvent systems, Elsevier, Journal of Biotechnology, 120, 273-283 6. Khamessan, A., Kermasha, S., dan Mollimard, L., 1995, Optimization of Chlorophllase-Catalyzed Hydrolytic Activity in a Micellar Ternary System, Biotechnol, Appl. Biochem, 22, 327-343 7. Kumar, N., Gupta, S., Gupta, S.M., 2011, Role of chlorophyllase in chlorophyll homeostasis and post-harvest breakdown 391