KERAGAMAN GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2 DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2013 Della Yuniar Windi NIM G34090107
ABSTRAK DELLA YUNIAR WINDI. Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI. Kompleks enzim Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) berperan dalam metabolisme Branched Chain Amino Acids (BCAA) yang ada dalam mitokondria. Subunit pertama (E1-α) dari kompleks enzim BCKD disandikan oleh gen BCKDHA. Mutasi pada gen BCKDHA dapat menyebabkan defisiensi pada kompleks enzim BCKD dan akhirnya dapat menyebabkan Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Tujuan penelitian ini adalah mendeteksi keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura dengan metode Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCRSSCP). Berdasarkan pola migrasi utas tunggal, ditemukan empat tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D. Pada sapi madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat, yaitu A, B, C dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%. Kata kunci: BCKDHA, ekson 2, ekson 3, gen, sapi madura, SSCP, tipe gen
ABSTRACT DELLA YUNIAR WINDI. Variability of Exon 2 and 3 Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) gene in Madura Cattle. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and DYAH PERWITASARI. Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) enzyme complex have a role in metabolism of Branched Chain Amino Acid (BCAA). BCKDHA gene encoding the first subunit of these enzyme complex within mithochondrion. Mutation in BCKDHA gene caused deficiency of BCKD complex that caused Maple Syrup Urine Disease (MSUD). The aim of this research is to detect variability of BCKDHA gene in madura cattle using Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) method. According to migration pattern of single strand in PAGE 9%, there was four types found in exon 2 and 3 BCKDHA gene in madura cattle, that is A, B, C and D. There was two types of gene found in cattle that its origin from Bangkalan, which is A and C, whereas type that found in Sampang was four, which is A, B, C and D. The highest frequency in two locations is type A, in Bangkalan (83%) and in Sampang (50%). Keywords: BCKDHA, exon 2, exon 3, gene, madura cattle, SSCP, gene type.
KERAGAMAN GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2 DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura Nama : Della Yuniar Windi NIM : G34090107
Disetujui oleh
Dr Achmad Farajallah Pembimbing I
Dr Dyah Perwitasari Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari sampai bulan Juli 2013 ialah Keragaman, dengan judul Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Achmad Farajallah dan Ibu Dr Dyah Perwitasari selaku dosen pembimbing, serta Prof Dr Ir Alex Hartana selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam penyusunan skripsi ini. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Kak Wildan, Kak Yanti, Kak Vendi, Kak Lora, Kak Bulan dan segenap penghuni Lab. Molekuler, teman-teman tercinta Nadia, Ines, Lina, Shelly, Ruth, Gloria, Agus, Dhyah, Hendri, Yovita, Abduh, Olii, Zahra, Manda, Noyara dan sejawat BIO46 lainnya serta Penghuni Zoo Corner yang saya hormati. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013 Della Yuniar Windi
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE PENELITIAN
2
Waktu dan Tempat
2
Metode
2
Ekstraksi DNA
2
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
2
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Hasil
3
Pembahasan
5
SIMPULAN
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
8
RIWAYAT HIDUP
9
DAFTAR TABEL 1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura
4
DAFTAR GAMBAR 1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada gel poliakrilamida 6% 2 Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9% (A) Diagram elektroforesis (zymogram) (B)
3 4 4
DAFTAR LAMPIRAN 1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616)
8
PENDAHULUAN Latar Belakang Sapi merupakan hewan dengan keanekaragaman tinggi dan ditemukan hampir di semua negara termasuk Indonesia. Beberapa bangsa sapi lokal di Indonesia antara lain sapi bali, madura, aceh, pesisir dan peranakan ongole. Sapi madura merupakan hasil persilangan sapi zebu yang berpunuk (Bos indicus) dengan banteng (Bos javanicus). Sapi madura berkembang di pulau Madura serta pulau-pulau sekitarnya dan merupakan sapi tipe dwiguna (pedaging dan pekerja). Sapi madura memiliki kemampuan adaptasi yang baik dan toleran terhadap iklim panas/tropik, ternak sapi madura yang berada di pulau Madura dikelola dengan baik dan dalam jangka waktu yang panjang (Mohamad et al. 2009) Ada tiga kompleks enzim yang berkaitan dengan fungsi normal mitokondria pada mamalia dan berperan penting dalam metabolisme intermediet karbohidrat dan asam amino. Kompleks enzim tersebut adalah Pyruvat Dehydrogenase Complex (PDC), α-Ketoglutaratate Dehydrogenase Complex (αKGDC) dan Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase Complex (BCKDC) (Patel dan Harris 1995). Kompleks enzim BCKD pada sel eukariot sangat terpelihara. BCKD kompleks terdiri atas empat subunit polipeptida enzim, yaitu E1-α, E1-β, E2 dan E3. Subunit E1-α disandikan oleh gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) yang berada pada kromosom no. 19, panjang gen sekitar 55 kb dan terdiri atas 9 ekson (King 2013). Kompleks enzim BCKAD berperan dalam metabolisme tiga asam amino esensial, yaitu isoleusina, leusina dan valina. Tiga asam amino ini disebut juga Branched Chain Amino Acid (BCAA) atau asam amino bercabang. Pada keadaan normal, BCAA akan dihancurkan oleh kompleks enzim BCKD. Jika enzim ini mengalami defisiensi maka BCAA tidak bisa masuk kedalam rangkaian metabolisme mitokondria sehingga terjadi akumulasi yang tinggi dalam darah dan jaringan. Hal ini disebut dengan kondisi Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Ada tiga penyebab defisiensi kompleks enzim BCKD yaitu autoantigen, anti-mitochondrial antibodies (Strauss et al. 2009) dan mutasi genetik (Zhang et al. 1990). Penyebab yang umum dari defisiensi kompleks BCKD adalah mutasi pada gen BCKDHA. Mutasi gen BCKDHA ekson 2 pada anak sapi polled hereford merupakan mutasi titik yang terjadi karena substitusi 248C/T pada kodon 6 dan menyebabkan stop kodon prematur (Zhang et al. 1990). Dennis dan Healy (1999) juga menemukan mutasi gen BCKDHA pada sapi polled shorthorn tetapi mutasinya terjadi pada 1380C/T. Mutasi pada ekson selain di ekson 2 pada sapi belum pernah ditemukan, dan mutasi pada sapi selain polled hereford dan polled shorthorn juga belum pernah ditemukan. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). Metode ini merupakan salah satu analisis kejadian mutasi pada tingkat nukleotida dari fragmen DNA pendek menggunakan produk dari Polymerase Chain Reaction (PCR) secara cepat. Mutasi dideteksi berdasarkan perbedaan pola migrasi pita utas tunggal DNA pada gel poliakrilamida (Hayashi 1991).
2
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura dengan metode Single Strand Conformation Polymorphism.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Juli 2013 di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Metode Ekstraksi DNA Sampel darah sapi madura koleksi Dr. Dyah Perwitasari digunakan untuk ekstraksi DNA. Sampel yang digunakan berjumlah 16 sampel yang berasal dari Kabupaten Sampang (N=9) dan Kabupaten Bangkalan (N=7), Madura. Ekstraksi DNA menggunakan cara manual mengikuti Sambrook et al. (1989) dengan sedikit modifikasi. Urutan ekstraksi DNA yang dilakukan yaitu pelisisan sel, pemisahan DNA, dan pengendapan (pemurnian) DNA. Pelisisan sel menggunakan larutan bufer lisis 1x STE (NaCl 1M, Tris HCL 10-1 M, EDTA 10-2 M, pH 8.0), air destilata, 10% Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan Proteinase K. Pemisahan DNA menggunakan larutan NaCl 5M, fenol, dan Chloroform Isoamilakohol (CIAA) dengan perbandingan 24:1. Pengendapan (pemurnian) DNA menggunakan larutan NaCl 5M, alkohol absolut, dan alkohol 70%. Endapan DNA yang diperoleh kemudian disuspensikan dalam 100 µl bufer TE (Tris HCl 10-1 M, EDTA 10-2 M, pH 8.0) dan disimpan dalam freezer. Amplifikasi dan Visualisasi DNA Amplifikasi gen BCKDHA ruas ekson 2 dan 3 dilakukan secara in vitro menggunakan mesin PCR ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Bahan pereaksi PCR yang digunakan untuk volume reaksi 25 µl adalah sampel DNA 1 µl (sekitar 50 ng), GoTaq® Green Master Mix 2X (Promega) sebanyak 12,5 µl (pH 8.5, 400 mM dNTP, 3mM MgCl2), primer forward AF318 5’-agcacccccacaggtggcag dan primer reverse AF319 5’-cctgtcttgtggtccttagacc (Lampiran 1) dengan konsentrasi 0,1 µM masing-masing sebanyak 1 µl dan nuclease-free water (Promega) sebanyak 9,5 µl. Kondisi PCR yang digunakan predenaturasi 95 °C dua menit, denaturasi 95 °C 45 detik, suhu penempelan primer 60 °C satu menit, pemanjangan DNA pada suhu 72 °C satu menit, dan pemanjangan DNA akhir pada suhu 72 °C lima menit sebanyak 30 siklus. Visualisasi produk PCR dengan menggunakan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% dalam bufer 1x
3 TBE (Tris HCl 10 mM, asam borat 1M, EDTA 0,1 mM). Elektroforesis dijalankan pada gel vertikal pada kondisi tegangan 200 volt selama 40 menit. Proses dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009) dengan sedikit modifikasi. Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP Produk PCR dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol kemudian dicampurkan dengan formamide dye (95% formamida, 0.2N NaOH, 0.1M EDTA). Utas ganda DNA didenaturasi pada suhu 95 °C selama 10 menit kemudian seketika dipindahkan ke icebath, lalu sebanyak 2 µl di-loading ke PAGE 9%. PAGE 9% dibuat dengan rasio akrilamid:bisakrilamid = 59:1 untuk memperoleh pori-pori yang memanjang sehingga bisa membedakan bentuk molekul. Setelah itu elektroforesis dilakukan di lemari pendingin dengan suhu 4 °C pada tegangan 150 volt selama 6 jam. Kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen BCKDHA Ekson 2 dan 3 Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi menggunakan metode PCR. Pasangan primer yang digunakan adalah AF318 sebagai primer forward dan AF319 sebagai primer reverse. Dari 16 sampel sapi madura, yang berhasil diamplifikasi sebanyak 14 sampel dengan panjang fragmen gen BCKDHA adalah sekitar 531 pb berdasarkan desain primer (Gambar 1). Oleh karena itu persentase keberhasilan PCR yang dilakukan sebesar 85%.
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada gel poliakrilamida 6%. Keterangan: M = penanda DNA 100 pb; Nomor di bagian atas gambar adalah nomor sampel sapi madura. Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode PCR-SSCP Pendeteksian keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 dilakukan dengan metode SSCP. Pada penelitian ini didapat 4 tipe gen, yaitu A, B, C dan D (Gambar 2A). Perbedaan pola migrasi utas tunggal DNA dalam gel poliakrilamida 9% dapat dilihat lebih jelas pada diagram elektroforesis (zymogram) (Gambar 2B).
4
(-)
(+)
(A) (B) Gambar 2 (A) Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9%. (B) Diagram elektroforesis (zymogram). Keterangan: A, B, C dan D = tipe gen BCKDHA; 40, 30, 7 dan 14 = nomor sampel sapi madura yang mewakili tipe gen BCKDHA. Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang berasal dari dua lokasi (Kabupaten Bangkalan dan Kabupaten Sampang, Madura) dapat dilihat pada Tabel 1. Pada sapi yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat yaitu A, B, C dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%. Persentase frekuensi diketahui dengan cara membagi jumlah sampel yang memiliki tipe tertentu dengan jumlah sampel total yang terdapat pada masingmasing lokasi. Tabel 1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura Tipe gen BCKDHA A B C D Total
Lokasi (% frekuensi) Bangkalan 5 (83%) 0 (0%) 1 (16.7%) 0 (0%) 6
Sampang 4 (50%) 2 (25%) 1 (12.5%) 1 (12.5%) 8
5 Pembahasan Sebanyak 14 sampel DNA sapi madura berhasil diamplifikasi dari 16 sampel darah yang diekstraksi. Dua sampel yang tidak teramplifikasi dapat disebabkan DNA sudah rusak sehingga primer tidak menempel pada fragmen DNA target. Kisaran suhu yang membuat primer menempel dengan komplemennya pada fragmen DNA target saat PCR dilakukan disebut suhu penempelan primer. Pada penelitian ini suhu penempelan primer yang digunakan 60 °C, umumnya suhu yang digunakan agar primer dapat menempel pada fragmen DNA target berkisar antara 50-65 °C. Persentase keberhasilan amplifikasi sebesar 85%, oleh karena itu primer yang digunakan spesifik. Panjang fragmen hasil amplifikasi sekitar 531 pb sesuai dengan desain penempelan primer pada sekuen gen BCKDHA ekson 2 dan 3 (Genbank No. Acc. NW001493616). Menurut Yuwono (2006), keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, (1) deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), (2) oligonukleotida primer, (3) DNA cetakan, (4) komposisi larutan bufer, (5) jumlah siklus reaksi, (6) enzim taq polimerase yang digunakan, dan (7) faktor teknis dan non teknis lainnya, seperti kontaminasi. Keragaman genetik dapat diketahui dengan analisis SSCP, teknik ini telah banyak digunakan untuk mendeteksi mutasi yang menyebabkan penyakit. Keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang dideteksi dari penelitian ini ada empat tipe, yaitu A, B, C dan D. Teori yang mendasari metode SSCP adalah perubahan yang terjadi pada fragmen DNA walau hanya satu nukleotida saja, akan mempengaruhi konformasi dari DNA utas tunggalnya dan dapat dideteksi dengan melihat perbedaan pola migrasi pita pada gel poliakrilamid dengan elektroforesis yang dilakukan pada kondisi non denaturasi (Orita et al. 1989). Pita utas tunggal yang ditemukan pada penelitian ini berjumlah 3-4, sesuai dengan Barosso et al. (1998) yang menyatakan bahwa biasanya jumlah pita utas tunggal DNA dengan metode SSCP adalah empat untuk sampel DNA yang berasal dari individu heterozigot. Penyebaran gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang berasal dari dua lokasi di Madura, yaitu Kabupaten Sampang dan Kabupaten Bangkalan menunjukkan di Sampang terdapat empat tipe gen, yaitu A, B, C dan D. sedangkan di Bangkalan hanya ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C. Keragaman tipe gen yang lebih tinggi di Sampang mungkin disebabkan karena pola persebaran sapi madura berkaitan dengan proses tata niaga di pulau Madura yang umumnya bergerak dari wilayah Timur ke Barat (Harmadji 1993). Kabupaten Sampang berada di sebelah Timur dari Kabupaten Bangkalan yang menyebabkan keanekaragaman jenis sapi madura lebih tinggi. Hasil pendeteksian keragaman gen dengan metode SSCP sangat bergantung pada perubahan bentuk utas tunggal DNA. Bentuk dari utas tunggal DNA dalam gel dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah komposisi gel, ukuran fragmen DNA, komposisi bufer, ada tidaknya bufer aditif seperti gliserol, suhu pada saat elektroforesis, konsentrasi DNA, kandungan basa G+C dalam fragmen DNA (Nataraj et al. 1999). Gel yang digunakan untuk metode ini adalah PAGE 9% dengan perbandingan akrilamid:bisakrilamid = 59:1, bisakrilamid berfungsi sebagai cross-linking akrilamid dalam pembentukan
6 poliakrilamida. Utas tunggal DNA lebih dapat terpisah dalam gel dengan crosslinking yang rendah, oleh karena itu rasio akrilamid dan bisakrilamid yang besar efektif digunakan. Sensitivitas metode SSCP adalah 99% untuk fragmen DNA yang memiliki panjang 100-300 pb dan 89% untuk fragmen DNA yang memiliki panjang 300–450 pb (Hayashi 1991). Pada penelitian ini fragmen DNA target memiliki panjang 531 pb, maka sensitivitasnya hanya sekitar 79%. Suhu yang rendah dan konstan diperlukan untuk metode SSCP karena mobilitas utas tunggal DNA dan perubahan bentuknya yang disebabkan oleh mutasi dapat berubah secara drastis jika suhu elektroforesis tidak konstan. Elektroforesis pada penelitian ini dilakukan dalam lemari pendingin dengan suhu yang konstan yaitu 4 °C. Penambahan bufer aditif seperti gliserol dalam gel dapat meningkatkan pemisahan sekuens yang bermutasi, tetapi gliserol dapat mengurangi mobilitas utas tunggal DNA. Identifikasi keragaman genetik pada gen BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi madura dengan metode SSCP merupakan penelitian pendahuluan yang dapat menuntun pada penemuan penanda genetik sehingga dapat digunakan untuk seleksi ternak. Penelitian yang lebih signifikan dari SSCP telah dilakukan oleh Neibergs et al. (1993) untuk menganalisis kekerabatan dari Bovinae berdasarkan polimorfisme yang ditemukan pada 5 gen, yaitu ARVP (arginine vasopressin), COXP (cytochrome oxydase c subunit IV pseudogene), CYM (prochymosin), LDLR (low density lipoprotein receptor), dan OXT (oxytocin). Penelitian lainnya yang menggunakan metode SSCP dilakukan oleh Lagziel et al. (1996) untuk menganalisis haplotipe gen bGH (bovine Growth Hormone) pada populasi sapi holstein Israel dan asosiasinya dengan protein dalam susu.
SIMPULAN Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi dengan panjang fragmen DNA sebesar 531 pb sesuai desain primer. Ditemukan empat tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D. Pada sapi madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat yaitu A, B, C dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
DAFTAR PUSTAKA Barroso A, Dunner S, Canon J. 1998. Technical note: use PCR-single strand conformation polymorphism analysis for detection of Bovine-casein variants A1, A2, A3 and B. J. Anim. Sci. 76:1535-1538. Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385:174-175.
7 Dennis JA, Healy PJ. 1999. Definition of the mutation responsible for maple syrup urine disease in poll shorthorns and genotyping poll shorthorns and poll herefords for maple syrup urine disease alleles. Res. Vet. Sci. 67:1-6. Harmadji. 1993. Prospek Pengembangan Sapi Madura. Di dalam: Prosiding Pertemuan Ilmiah Hasil Penelitian dan Pengembangan Sapi Madura. (1992 Oktober 11-12). Sumenep (ID). Hayashi K. 1991. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA. PCR Method. Appl. 1:34-38. King MW. 2013. Introduction to Maple Syrup Urine Disease: MSUD. [Internet]. [(2013 Februari 1, [diunduh 2013 Agustus 18]). Tersedia pada: http://themedicalbiochemistrypage.org/msud.php. Mohamad K, Olsson M, van Tol HTA, Mikko S, Vlamings BH, Andersson G, Rodriguez-Martinez H, Purwantara B, Paling W, Colenbrander B et al. 2009. On the origin of Indonesian cattle. PLoS ONE. 4:e5490. Lagziel A, Lipkin E, Soller M. 1996. Association between SSCP haplotypes at the bovine growth hormone gene and milk protein percentage. Genetics. 142:945-951. Nataraj AJ, Glander IO, Kusukawa N, Highsmith WE. 1999. Single strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection. Electrophoresis. 20:1177-1185. Neibergs HL, Dietz AB, Womack JE. 1993. Single strand conformation detected in five bovine genes. Anim. Genet. 24:81-84. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphism. Genetics. 86:2766-2770. Patel MS, Harris RA. 1995. Mammalian α-keto acid dehydrogenase complexes: gene regulation and genetic defects [review]. FASEB J. 9:1164-1172. Sambrook J, Fritsch EF, Miniatis T. 1989. Molecular Clooning: A Laboratory Manual. Ed ke-8. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Strauss KA, Puffenberger EG, Morton DH. 2009. Maple Syrup Urine Disease. Gene Review, Bookshelf ID: NBK131, PMID: 20301495 (online review http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta (IN): Penerbit ANDI. Zhang B, Healy PJ. Zhao Y, Ciabb DW, Hams RA. 1990. Premature translation termination of the pre-Ela subunit of the branched chain a-ketoacid dehydrogenase as a cause of maple syrup urine desease in polled hereford calves. J. Biol. Chem. 265:2425-2427.
8
LAMPIRAN Lampiran 1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616).
1
cacccccaca ggtggcagca acagcagcac ttctcgtccc tggatgacaa AF318-primer forward
51 101 151 201 251 301 351 401 451
gccgcagttc ccaggggcct cagcggagtt catagacaag ctcgaattca
501
tggtccttag acc primer reverse
tccagcccaa tgtcatctct gggatcccca tctaccgggt catggaccgg cagggccaga tcatcaaccc cagcgaggat ccccacgtaa gaggccacct ccccccgacc ctgtgcctcc catgcccaag ccccttgccc atctcctctc tggccccagc tggcccacgt ctgtctgtgc ctctgtctgc agctgcccca ggagaaggtg ctcaaattct acaagagcat gaccctgctc aacaccatgg accgcatcct ctatgaatcc cagaggcagg tgcgtgggga caggctaggg agggggcctg ggattacctg aggtcctgcc caccctacct gtgtctgggc caaaagacag cgcccaaaga agagggagtg gaatggagat ccctgtcttg AF319-
9
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 26 Juni 1992 dari Bapak Endin Jaenudin dan Ibu Wina Daswinah (Alm). Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Penulis menyelasaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 1 Cileungsi pada tahun 2009, dan pada tahun yang sama melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor (IPB), Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur Ujian Talenta Mandiri (UTM). Selama mengikuti masa perkuliahan di IPB, penulis aktif di berbagai organisasi kepanitiaan, BIONIC (Biology on Action) divisi publikasi dekorasi dan dokumentasi (PDD), panitia masa perkenalan departemen (MPD) divisi konsumsi, panitia masa perkenalan fakultas (MPF) divisi komisi disiplin (Komdis). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama tahun 2013 dan Struktur Hewan tahun 2013. Penulis melakukan Studi Lapangan pada tahun 2011 di hutan pendidikan gunung walat (HPGW) Sukabumi dengan judul “Status Simbiosis Mikoriza Arbuskula dan Keragaman Cendawannya di Hutan Pendidikan Gunung Walat” di bawah bimbingan Dr Nampiah Soekarno, Msi. Selain itu, penulis melakukan kegiatan Praktik Lapangan pada tahun 2012 di PTPN VIII Gunung Mas, Cisarua Bogor dengan judul “Budidaya Tanaman Teh di PTPN VIII kebun Gunung Mas” di bawah bimbingan Dr Nisa Rachmania, Msi.
