KARAKTERISASI GENOM MlTOKONDRlA LABI-LABI, Dogania subplana (TRIONYCHIDAE, TESTUDINES, REPTILIA)
ACHMAD FARAJALLAH
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2002
ABSTRAK ACHMAD FARAJALLAH (985098). Karakterisasi genorn rnitokondria labi-labi, Dogania subplana, (Trionychidae, Testudines, Reptilia). Komisi pernbirnbing: Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osarnu Takenaka, D.Sc., Barnbang Suryobroto, D.Sc., dan Dr. M.F. Rahardjo. Runutan nukleotida lengkap genorn rnitokondria (rntDNA) labi-labi, Dogania subplana, telah dilakukan. Ukuran rntDNA labi-labi adalah 17289 bp. Organisasi, orientasi dan ukuran setiap gen dari 13 gen penyandi protein rntDNA, 22 gen penyandi tRNA dan dua gen penyandi rRNA serta daerah kontrol adalah serupa dengan yang telah diternukan pada vertebrata lainnya. Panjang daerah kontrol adalah 1820 bp, yang di dalarnnya bisa diternukan tiga motif runutan DNA berulang. Motif pertarna dan kedua berturut-turut adalah 15 bp dan 37 bp, yang keduanya berulang secara tandem sarnpai 728 bp. Motif ketiga adalah ruas TA berulang, yaitu (TA)n dan (ATAlT)n. Motif ketiga ini disebut rnikrosatelit rnitokondria. Analisis terhadap daerah kontrol rnenernukan adanya domain tengah yang stabil untuk sernua anggota Testudines, dan adanya tiga macarn Conserve Sequence Blocks yang hornolog dengan daerah kontrol rntDNA vertebrata. Berdasarkan domain tengah daerah kontrol, keragarnan nukleotida D. subplana di lndonesia cukup tinggi (0.21%). Selain itu, penyebaran labi-labi di lndonesia rnengikuti penyebaran vikarian. Populasi 0.subplana Surnatera Bagian Selatan mernpunyai afinitas yang tinggi ke populasi Jawa dibanding ke populasi Bengkulu. Trionychidae merupakan kelornpok yang rnonofiletik berdasarkan analisis parsirnoni dan neighbourjoining rnenggunakan gabungan data runutan nukleotida Cyt b, tRNA Phe, tRNA Pro dan domain tengah daerah kontrol rntDNA. Kata kunci: Labi-labi, Testudines, genorn rnitokondria, runutan DNA, keragarnan nukleotida, filogeni rnolekular
ABSTRACT ACHMAD FARAJALLAH (985098). Characterization of mitochondrial genome of the soft-shelled turtle, Dogania subplana, (Trionychidae; Testudines; Reptilia). Advisory committe: Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osamu Takenaka, D.Sc., Bambang Suryobroto, D.Sc., and Dr. M.F. Rahardjo. Complete nucleotide sequence of Malayan soft-shelled turtle, Dogania subplana, mitochondrial genome (mtDNA) was determined. The total length of the sequence was 17289 bp. The organization, orientation and individual gene size of 13 protein-coding genes, 22 tRNA genes, two rRNA genes (12 s and 16s rRNA), and the control region were identical to the typical vertebrate arrangement. The control region is 1820 bp long that contains three repeat sequences. The first and the second repeated motifs were 15 bp and 37 bp long, repectively, and spanned 728 bp. The third repeat sequence consisted of two motifs which are (TA)n and (ATATT)n; they are named as mitochondrial microsatellites. Analysis of this control region permitted the identification of the middle conserved domain of all Testudines, and three types of Conserve Sequence Blocks, which have high homology to vertebrate mtDNA. Nucleotide diversity of the middle conserved domain of D. subplana in Indonesia is relatively high (0.21%). Based on the nucleotide sequences, D. subplana is shown to be vicariantly distributed in Indonesia. D. subplana population of South Sumatra has high affinity to Java compared to Bengkulu. Trionychidae as a monophyletic group was supported by parsimony and neighbor joining analyses using combined sequence data of Cyt b, tRNA Phe, tRNA Pro, and the middle conserved domain of mtDNA. Keyword: Softshelled turtle, Testudines, mitochondrial genome, DNA sequence, nucleotide diversity, molecular phylogeny
SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul: "Karakterisasigenom mitokondria iabi-labi, Dogania subplana (Trionychidae, Testudines, Reptilia)" adalah benar karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bo or, Septe ber
hfl
02
KARAKTERISASI GENOM MlTOKONDRlA LABI-LAB1, Dogania subplana (TRIONYCHIDAE, TESTUDINES, REPTILIA)
oleh ACHMAD FARAJALLAH
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2002
-
s . d - ,; ,
.*-'em- Kamkterisasi Genorn M t o k o n d r i a b b b i 4 a b i ; - ~aUbp/ana ~~ia (Trionychibae; Testudines; Reptilia) :Achmad Farajallah
Nama~ .. ,NRP- - :985098 m, :P Studi: Bidogi '
n
&Ay?*;i
-
-
-4-,
.
;.'
Menyetujui, 1. Komisi Pembimbing
- ,Pmf. Dr. NdG;anasan Suairi -. '
,i '
-
--;
,
'L * -.
Tanggal Lulus : 28 hi2002
Prof. Osamu Takenak. D.Sc, Anggota
Nama
: Achmad Farajallah
Tempat, Tanggal Lahir
: Sampang - Madura, 27 April 1965
Pekerjaan
: Dosen di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan IPA, lnstitut Pertanian Bogor : Laboratorium Zoologi Jurusan Biologi FMlPA IPB Gedung Zoologi dan Biokimia Lantai II Kampus Gunung Gede Jalan Raya Pajajaran Bogor 16143 : Kawin
Alamat Kantor
Status Perkawinan Riwayat Pekejaan 1989 1990 - sekarang
: Calon Pegawai Negeri di Jurusan Biologi, FMlPA IPB : Dosen di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan IPA, IPB
Riwayat Pendidikan 1972 - 1984
-
: SD, SMP dan SMA di Sampang Madura
1984 1985
: Tingkat Persiapan Bersama IPB
1985 - 1989
: S1, Program Studi Biologi, FMlPA IPB
1991 - 1995
: S2, Program Studi Biologi Program Pascasarjana IPB : S3, Program Studi Biologi Program Pascasarjana IPB
KATA PENGANTAR Tulisan ini berisi hasil penelitian tentang keragaman genetik labi-labi, Dogania subplana, di Indonesia berdasarkan runutan nukleotida genom mitokondria, dan filogeni anggota ordo Testudines. Penelitian dilaksanakan untuk menyusun disertasi sebagai syarat memperoleh gelar Doktor dalam bidang studi Biologi di Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor. Untuk itu, penulis sampaikan terima kasih yang mendalam kepada komisi pembimbing, yaitu Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osamu Takenaka D.Sc., Bambang Suryobroto, D.Sc. dan Dr. M.F. Hahardjo atas segala kesabaran, ketelitian dan dukungannya selama penulis menempuh program doktor. Terima kasih khusus kepada Prof. Osamu Takenaka, D.Sc. yang telah memperkenalkan penulis ke pendekatan molekular terbaru untuk menganalisis biodiversitas hewan. Dalam kesempatan ini pula, penulis sampaikan terima kasih kepada Dr. Muladno dan Dr. Jatna Supriatna atas komentar dan koreksinya. Selain itu, penulis sampaikan terima kasih yang mendalam kepada Bapak
. Go Bang, A Cun, Benny Prakasa Putra, Kasmirudin M.Si., Nasarudin M.Si, Qodri Madang M.Si., Dra. Titisari Puntorini dan Haerul Azhar atas kerjasama yang saling menguntungkan dalam menangkap dan memperoleh sampel labi-labi dan kura-kura. Penulis menikmati interaksi yang hangat dan saling mendukung dari rekan sejawat, staf teknisi, staf administrasi dan para mahasiswa di Department of Molecular and Cellular Biology, Primate Research Institute Universitas Kyoto dan di Laboratorium Zoologi FMlPA IPB, yang kalau disebutkan satu persatu terlalu banyak, terima kasih. Untuk isteri, anak-anak dan ibu, terima kasih atas kesabaran dan dukungannya. Akhimya, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada lembaga yang memberi dukungan finansial atau fasilitas penelitian selama penulis menempuh program doktor, yaitu DlKTl melalui BPPS, PRI-Kyoto University, PPS IPB, FMlPA IPB dan JBA-MITI-BPPT Biodiversity Project.
DAFTAR IS1
RIWAYAT HlDUP KATA PENGANTAR DAFTAR IS1 DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN DAFTAR SINGKATAN BAB 1. PENDAHULUAN UMUM Klasifikasi Kura-kura Labi-labi Posisi Filogeni Kura-kura dalam Amniota Distribusi, Filogeni dan Sistematika Kura-kura Karakteristik Genom DNA Mitokondria Vertebrata Tujuan Penelitian BAB 2. BAHAN DAN METODE Penentuan Runutan Lengkap Nukleotida mtDNA D. subplana Keragaman Daerah Kontrol mtDNA Labi-labi, D. subplana, di Indonesia Filogeni Kura-kura di lndonesia Berdasarkan Runutan Cyt b, tRNA Pro, tRNA Thr dan Domain Tengah dari Daerah Kontrol BAB 3. RUNUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP GENOM MlTOKONDRlA LABI-LABI, DOGANIA SUBPLANA Pendahuluan Hasil Pembahasan Kesimpulan BAB 4. KERAGAMAN DNA DAERAH KONTROL LABI-LABI, DOGANIA SUBPLANA, Dl INDONESIA Pendahuluan Hasil
Pembahasan Kesimpulan BAB 5. FlLOGENl MOLEKULAR KURA-KURA, LABI-LAB1 DAN PENYU BERDASARKAN RUNUTAN DNA CYT B, tRNA THR, tRNA PRO DAN DOMAIN TENHA DAERAH KONTROL GENOM MlTOKONDRlA Pendahuluan Hasil Pembahasan Kesimpulan DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
DAFTAR TABEL Nomor
Teks
Halaman
1.1 Tabel 1.1. Klasifikasi kura-kura (Gaffney 1975; Hirayama 1984; Meylan 1987
12
Karakteristik mtDNA labi-labi, D. subplana
36
3.2 Komposisi nukleotida mtDNA D. subplana (%)
37
3.3 Jumlah penggunaan kodon (huruf cetak tegak) dan nilai indeks penggunaan kodon (huruf cetak miring) dalam mtDNA D. subplana
38
4.1 Sampel Labi-labi Dogania subplana dan haplotipe mtDNA
77
4.2 Jarak genetik antar haplotipe D. subplana berdasarkan domain tengah dari daerah kontrol mtDNA (di bawah diagonal) dan standart error (di atas diagonal) yang diduga menggunakan metode bootstrap dengan 1000 ulangan
74
3.1
4.3
Divergensi nukleotida dalam populasi (di diagonal), divergensi nukleotida antar populasi (di bawah diagonal) dan total divergensi nuleotida antar populasi (di atas diagonal) dari D. subplana
76
5.1 Sampel spesies kura-kura dan ukuran produk PCR (bp) menggunakan primer 512-576 (Cyt b - TAS), primer 577-578 (TAS CSBIII) dan primer 512 - 578
93
5.2 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan kombinasi data dari nukleotida pertama dan kedua gen Cyt b, gen tRNA dan domain tergah daerah kontrol mtDNA
94
5.3 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan ketiga nukleotida setiap kodcn gen Cyt b 5.4 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan nukleotida pertama dan kedua setiap kodon gen Cyt b
'
95
DAFTAR GAMBAR Nomor Teks 1.I Beberapa hipotesis hubungan filogeni testudines dan anggota amniota
Halaman 11
3.1 Peta pemotongan Mbol dan posisi penempelan primer (angka cetak tebal) dalam mtDNA D. subplana
39
3.2 Peta genetik mtDNA D. subplana
40
3.3 Runutan lengkap nukleotida dan karakteristik mtDNA D. subplana
41
3.4 Runutan nukleotida dan struktur sekunder gen-gen tRNA mtDNA D. subplana
56
3.5 Struktur batang dan gelung dari OnL (titik asal replikasi utas L) mtDNA D. subplana
59
3.6 Struktur batang dan gelung dari dua motif runutan DNA berulang di bagian ujung 5' daerah kontrol mtDNA D. subplana
60
3.7 Hubungan filogeni antar anggota amniota berdasarkan kombinasi runutan nukleotida dari gen-gen penyandi protein (kecuali gen-gen ND3, ND4L dan ND6), penyandi tRNA (kecuali gelung DHU dan
Vc)
61
3.8 Hubungan filogeni antar anggota amniota berdasarkan runutan asam amino yang ditranslasikan dari gen-gen penyandi protein (kecuali gen-gen ND3, ND4L dan ND6)
62
4.1 Peta pengambilan sampel labi-labi D. subplana
77
4.2 Posisi runutan nukleotida yang beragam antar haplotipe mtDNA D. subplana
78
4.3 Pohon filogeni Neighborjoining antar haplotipe D. subplana
79
4.4 Pohon filogeni yang dihasilkan metode Minimum Evolution (A) dan UPGMA (B) antar haplotipe D. subplana
80
5.1 Organisasi gen antara Cyt b dan daerah kontrol dalam mtDNA Testudines
97
5.2 Perbandingan runutan nukleotida gen Cyt b beberapa spesies kura-kura menggunakan ClustalW yang dibantu dengan hasil translasi ke asam aminonya
98
5.3 Perbandingan runutan nukleotida gen-gen tRNA Thr dan tRNA Pro beberapa spesies kura-kura berdasarkan struktur sekundernya
100
5.4 Perbandingan runutan nukleotida domain tengah daerah kontrol dari mtDNA beberapa spesies kura-kura menggunakan ClustalW
101
5.5 Hubungan filogeni antar spesies kura-kura berdasarkan kombinasi data dari gen-gen Cyt b, tRNA Thr, tRNA Pro, dan domain tengah dari daerah kontrol
105
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1
Daflar kura-kura yang ada di Indonesia
111
Lampiran 2
Peta penyebaran labi-labi, Dogania subplana, di lndonesia
113
Lampiran 3
Runutan dan perbandingan nukleotida domain tengah dari daerah kontrol pada masing-masing haplotipe mtDNA D. subplana yang diapit oleh primer 577 dan 578
114
Lampiran 4
Runutan nukleotida Cyt b, tRNA Thr, tRNA Pro, dan domain tengah dari daerah kontrol genom mitokondria beberapa spesies kura-kura
121
Lampiran 5
Daftar spesies yang digunakan dalam analisis filogeni amniota bersama-sama dengan D. subplana
133
DAFTAR SINGKATAN 12Sr RNA
12s ribosomal RNA
16Sr RNA
16s ribosomal RNA
ATPase 6
Adenosine triphosphatase sub unit 6
ATPase 8
Adenosine triphosphatase sub unit 8
COI
Cytochrome c oxidase sub unit 1
COll
Cytochrome c oxidase sub unit I1
COlll
Cytochrome c oxidase sub unit 111
Cyt b
Cytochrome b apoenzyme
NDI
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 1
ND2
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 2
ND3
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 3
ND4
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 4
ND4L
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 4L
ND5
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 5
ND6
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 6
dloop
Displacement loop
tRNA - (J
Transfer RNA three letter amino acid abbreviation (anticodon)
A
Adenine
G
Guanine
C
Cytosine
T
Timine
