JURNAL AGROTEKNOS Nopember 2013 Vol. 3 No. 3. Hal 179-183 ISSN: 2087-7706
KARAKTERISASI BIOKIMIAWI RIZOBAKTERI ASAL GULMA BERDAUN LEBAR YANG BERPOTENSI SEBAGAI DELETERIOUS RHIZOBACTERIA Biochemical Characterization of Rhizobacteria from broadleaf weeds Potential as Deleterious Rhizobacteria ASNIAH, TRESJIA C. RAKIAN, SRI WANGADI, GUSNAWATY HS*) Jurusan Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo
ABSTRACT The research aimed to know biochemical characters of rhizobacteria from broadleaf weed that are potential as deleterious rhizobacteria. The research was conducted at Agronomy Laboratory of Agriculture Faculty Halu Oleo University Kendari from January until March 2013. The results showed that 9 of 10 rhizobacteria isolates tested from broadleaf weeds rhizosphere had the ability to solubilize phosphate with different diameters. For nitrogen fixation ability, all isolates tested were potential but only isolates of ML-01 and KL-06 had high capability. All isolates had different ability to produce IAA, with isolates of KL-06 produced higher concentration of IAA (33,07 ppm) compared to other isolates. Isolates that had the ability to produce HCN were isolates BL-07, with filter paper change from yellow to dark brown, and BL-08 and BL-03 light brown color changes indicated to that the production of HCN was increased. Result of research showed that some isolates tested had biochemical character as deleterious rhizobacteria by the ability to solubilize phosphate, fix nitrogen, produce IAA and HCN. Keywords: biochemical characterization, rhizobacteria, broadleaf weeds, deleterious.
1PENDAHULUAN
Gulma adalah tumbuhan yang keberadaannya dapat menimbulkan gangguan dan kerusakan bagi tanaman budidaya. Kehadiran gulma pada areal tanaman sangat berpengaruh terhadap hasil panen. Hal ini terjadi karena gulma memiliki kemampuan dalam hal berkompetisi yang tinggi untuk memperoleh air, unsur hara, cahaya matahari, CO2, dan pemanfaatan ruang tumbuh (Rao, 2000). Penggunaan herbisida sintetis yang berlebihan dapat mengakibatkan pencemaran lingkungan karena sifatnya yang sulit terurai dalam tanah sehingga meninggalkan residu yang berbahaya bagi organisme lain terutama manusia sebagai konsumen terakhir. Salah satu alternatif usaha pengendalian gulma pertanian yang ramah lingkungan adalah Alamat Korespondensi: Email:
[email protected] *)
menggunakan rizobakteri yang memiliki potensi sebagai deleterious rhizobacteria yaitu rizobakteri yang bersifat memacu pertumbuhan tanaman sekaligus sebagai bioherbisida dalam pengendalian gulma. Peranan rizobakteri selain sebagai pemacu pertumbuhan tanaman adalah memiliki potensi sebagai bioherbisida terhadap gulma sesuai dengan hasil penelitian Carvalho et al. (2007) menunjukkan bahwa senyawa anti metabolit yang dihasilkan oleh Bacillus cereus mampu menghambat 52% pertumbuhan biji gulma Brachiaria decumbens dan 48% biji lainnya menjadi abnormal. Penelitian ini sangat penting dilakukan karena diharapkan menjadi solusi untuk memecahkan masalah gulma sekaligus mengembangkan teknik baru dalam pengendalian gulma secara biologi yang murah dan ramah terhadap lingkungan serta peningkatan pertumbuhan tanaman dengan pemanfaatan rizobakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui
Vol. 3 No.3, 2013
Karakterisasi Biokimiawi Rizobakteri Asal Gulma
karakter biokimiawi rizobakteri asal gulma berdaun lebar yang berpotensi sebagai deleterious rhizobacteria
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah koleksi isolat rizobakteri, plastik wrap, alumunium foil, alkohol 70 %, tissue, aquadesh, media TSA, media glisin, agar, TCP, glukosa, yeast extract, sukrosa, asam amino triptofan, NaCl, KCl, MgSO4, MnSO4, FeSO4, (NH4)2SO4, KOH, H2SO4, FeCL3, K2HPO4, KH2PO4, CaSO4 dan Na2MOO4. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas kimia, timbangan analitik, wiseclave, spatula, cawan petri, pelubang gabus, pH meter, botol schoot, pipet mikro, hot plate, erlenmeyer, shaker, tabung reaksi, vortex, oven, laminar air flow cabinet, jarum ose, spektrofotometer. Sejumlah 10 isolat potensial yang diisolasi dari rizosfer gulma berdaun lebar yang diuji adalah berasal dari empat Kabupaten di Sulawesi Tenggara yaitu Buton, Muna, Kolaka dan Konawe Selatan. Kesepuluh isolat tersebut telah dilakukan uji potensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan biherbisida pada penelitian sebelumnya, kemudian penelitian ini dilakukan karakterisasi Biokimiawinya.
Kemampuan
Melarutkan
Fosfat.
Untuk menguji kemampuan rizobakteri melarutkan fosfat digunakan media uji Pikovskaya’s agar dengan penambahan tricalcium posphate (TCP) sebagai sumber fosfat. Komposisi per liter media yang digunakan terdiri atas: glukosa (10g), NaC1 (0,2g), KC1 (0,2g), MgSO4 (0,1g), MnSO4 (2,5mg), FeSO4 (2,5mg), yeast extract (0,25g), (NH4)2SO4 (0,25g), dan agar-agar (15g). Media disterilisasi dengan pemanasan menggunakan autoklaf. Setelah sterilisasi pH media diatur menjadi 7,2 dengan KOH 5 N. Media uji dituangkan kedalam cawan petri, dibuat lubang dengan pelubang gabus dan diisi dengan 0,2 mL suspensi masing-masing 10 isolat rizobakteri yang diuji. Media uji yang telah berisikan bakteri di inkubasi selama 3 hari dalam inkubasi dengan suhu 280C. Perlakuan ini dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Kemampuan melarutkan fosfat dari isolat yang diuji dievaluasi secara kualitatif berdasarkan terbentuknya halo di
180
sekitar lubang yang berisi suspensi bakteri (Thakuria et al., 2004). Kemampuan Memfiksasi Nitrogen. Kemampuan rizobakteri sebagai pemfiksasi nitrogen secara bebas dari udara dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan media Burk sebagai berikut: (1) MgSO4 2 g, K2HPO4 8 g, KH2PO4 2 g, dan CaSO4 1,3 gram dicampur menjadi satu dan digunakan sebagai stok media Burk Salt; (2) FeCl3 0,145 g dan Na2MoO4 0,0235 g di larutkan dalam 100 mL aquades dan dijadikan sebagai stok larutan FeMo. Sebanyak 1,3 gram media Burk Salt dicampur dengan 1 mL stok larutan Fe-Mo lalu ditambahkan 10 g sukrosa, semua bahan tersebut dilarutkan dalam 1000 mL aquades steril dan selanjutnya disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC tekanan 1 atm selama 15 menit. Sebanyak 20 µl media Burk salt dimasukan dengan tahap reaksi steril. Sebanyak 1 ose isolat rizobakteri yang diuji dimasukan kedalam larutan tersebut lalu diinkubasi pada shaker inkubator selama 48 jam menggunakan 150 rpm. Isolat positif sebagai pemfiksasi nitrogen jika bakteri tersebut mampu tumbuh dalam larutan Burk Salt yang ditandai dengan kekeruhan media dalam tabung reaksi. Isolat yang tumbuh diberi tanda + (positif), sedangkan yang tidak tumbuh diberi kode – (negatif). Produksi Asam Indol Asetat (IAA) . Kemampuan masing-masing isolat rizobakteri untuk memproduksi IAA dianalisis dengan metode Glickman dan Dessaux (1995). Isolat bakteri rizosfer ditumbuhkan selama 24 jam dalam medium TSB untuk memacu sintesis auksin, kedalam masing-masing media ditambahkan asam amino triptofan 0,5 g∕l. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit, kemudian supernatan dipisahkan dari endapan bakteri, disaring dengan membran nitroselulosa berporositas 0,2 g dan dianalisis kandungan IAA-nya. Kandungan IAA dalam filtrat kultur bakteri dideteksi dengan menggunakan pereaksi FeCI3 12g∕l. dalam 7,9 M H2SO4. Pereaksi FeCI3 (1 ml) dan filtrat dan kultur bakteri (1 mL) dimasukan dalam tabung eppendorf (Volume 2 mL), dan campuran di inkubasi didalam ruang gelap pada suhu 26oC selama 30 menit. Setelah periode inkubasi, nilai absorbansi dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Kurva standar bedasarkan
181 ASNIAH ET AL.
J. AGROTEKNOS
nilai absorbansi larutan, IAA murni dengan kosentrasi 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 75; 100; 150 dan 200 ug/mL digunakan untuk menghitung kandungan IAA dalam filtrat kultur bakteri. Kemampuan Menghasilkan senyawa HCN. Produksi senyawa HCN dari setiap isolat rizobakteri dilakukan berdasarkan metode yang dikembangkan Bakker dan Schipper (Munif, 2001). Isolat bakteri rizosfer yang diuji ditumbuhkan pada media glisin dalam cawan petri. Pada bagian tengah tutup cawan petri ditempelkan potongan kertas saring yang telah direndam dalam larutan untuk mendeteksi HCN (asam pikrat 2 g, natrium karbonat 8 g, dalam 200 mL air). Kultur bakteri diinkubasikan selama 4 hari pada suhu 24oC dan perubahan warna kertas saring digunakan sebagai indikator terbentuknya
senyawa HCN. Warna kertas saring yang tetap kuning mengindikasikan isolat yang diuji tidak memproduksi HCN sedangkan warna coklat muda, coklat dan merah bata mengindikasikan produksi HCN yang semakin meningkat. Semua data hasil pengamatan karakterisasi biokimiawi dari setiap isolat rizobakteri yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengamatan menunjukkan semua isolat yang diuji dapat melakukan fiksasi N tetapi tidak semua mampu memproduksi senyawa metabolit HCN. Hasil pengamatan karakter biokimia dari isolat rizobakteri dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kemampuan isolat rizobakteri dalam melarutkan fosfat, memfiksasi nitrogen, memproduksi IAA dan HCN.
Kode Isolat BL-03 BL-05 BL-07 BL-08 ML-01 ML-04 KL-06 KL-11 KL-15 SL-01
Pelarut fosfat (cm) 1,33 1,10 1,37 1,60 1,30 1,20 1,67 0,00 1,10 1,57
Fiksasi N ++ + ++ ++ +++ + +++ + + ++
Kandungan IAA (ppm) 20,08 17,75 24,39 29,43 17,30 20,33 33,07 26,27 18,24 29,47
Produksi HCN + ++ + -
Keterangan: untuk fiksasi N (+) cukup keruh, (++) keruh, (+++) sangat keruh, untuk produksi HCN (-) kuning, (+) coklat muda, (++) coklat tua
Hasil penelitian menunjukkan ada 9 dari 10 isolat yang diuji dengan rata-rata luas zona bening yang berbeda menunjukkan isolat tersebut mampu melarutkan fosfat menggunakan media pikovskaya’s agar dengan penambahan TCP sebagai sumber fosfat. Kemampuan rizobakteri pelarut fosfat dalam melarutkan P dilakukan dengan mengukur diameter zona bening (halo). Semakin tinggi diameter halo yang dihasilkan, kemampuan rizobakteri pelarut fosfat dalam melarutkan P juga tinggi. Isolat KL-06 dan BL-08 memiliki luas zona bening tertinggi masing-masing 1,67 dan 1,60 cm. Hal ini menunjukkan isolat tersebut memiliki kemampuan melarutkan fosfat paling baik diantara isolat lain. Mikroba pelarut fosfat mempunyai peranan sangat besar dalam membantu penyediaan unsur hara bagi tanaman karena mampu
mengubah bentuk-bentuk fosfat yang tidak tersedia bagi tanaman menjadi bentuk yang tersedia. Tanaman membutuhkan fosfat untuk perkembangan dan pertumbuhannya, namun senyawa fosfat yang ada dalam lingkungan tanaman tidak selalu tersedia, sehingga keberadaan bakteri pelarut fosfat di rizosfer tanaman dapat membantu penyediaan senyawa fosfat bagi tanaman, seperti bakteri Pseudomonas sp., dan Bacillus sp. dapat mengeluarkan asam-asam organik, seperti asam formiat, asetat dan laktat yang bersifat melarutkan bentuk-bentuk fosfat yang sukar larut menjadi bentuk yang tersedia bagi tanaman. Fosfat tersedia dalam bentuk organik dan anorganik. Fosfor organik mengandung senyawa-senyawa yang berasal dari tanaman dan mikroorganisme dan tersusun dari asam nukleat, fosfolipid dan fitin
Vol. 3 No.3, 2013
Karakterisasi Biokimiawi Rizobakteri Asal Gulma
(Rao, 1994). lebih lanjut menurut Rao (1994) mikroorganisme tanah yang dapat melarutkan fosfat memegang peranan dalam memperbaiki tanaman yang mengalami defisiensi fosfor. Kemampuan isolat rizobakteri melarutkan fosfat merupakan salah satu karakter fisiologi rizobakteri yang berhubungan dengan perannya sebagai pemacu pertumbuhan tanaman (Sutariati, 2006). Selain melarutkan fosfat, karakteristik biokimia yang dimiliki oleh rizobakteri adalah kemampuan memfiksasi nitrogen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat KL-06 dan ML-01 memiliki kemampuan yang lebih baik dibandingkan dengan isolat yang lain dalam mengikat nitrogen dengan dihasilkan kekeruhan yang sangat keruh pada media yang digunakan. Interaksi rizobakteri terhadap sistem perakaran tanaman berpengaruh terhadap keberhasilan pertumbuhan tanaman diatasnya. Bakteri penambat N non simbiotik termasuk kelompok rizobakteri yang berperan dalam penyediaan unsur N bagi tanaman (Khairul, 2001). Keberadaan populasi bakteri penambat N non simbiotik serta distribusinya yang cukup luas memberikan arti penting bagi tersedianya unsur N bagi tanaman. Menurut Rao (1994), bakteri penambat N non simbiotik mampu menyumbang sekitar 10 sampai 15 kg N/ha/tahun, tergantung dari tersedianya sumber karbon. Karakteristik penting yang dimiliki oleh rizobakteri selain mampu melarutkan fosfat dan memfiksasi nitrogen adalah kemampuannya dalam memproduksi asam indol asetat (IAA). Berdasarkan nilai absorbansi isolat uji yang diperoleh menunjukkan isolat-isolat rizobakteri mampu memproduksi IAA dengan produksi tertinggi dihasilkan oleh isolat KL-06 yaitu dengan konsentrasi 33,07 ppm dibandingkan dengan isolat lainnya dengan kemampuan yang berbeda dalam menghasilkan IAA yaitu kisaran 17,30 sampai dengan 29,47 ppm Perbedaan produksi IAA dari berbagai rizobakteri bergantung pada isolat yang diuji dan kemampuan masing-masing isolat dalam mengolonisasi perakaran tanaman (Thakuria et al., 2004). Kemampuan suatu isolat rizobakteri sebagai penghasil IAA mampu memfiksasi nitrogen serta sebagai pelarut fosfat dari bentuk tersedia menjadi tersedia bagi
182
tanaman menunjukkan isolat-isolat tersebut memiliki potensi sebagai agensia pemacu pertumbuhan tanaman. Selain sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, isolat rizobakteri yang diuji bisa bersifat menghambat pertumbuhan gulma dengan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkannya seperti HCN. Rizobakteri yang sifatnya menghambat atau merugikan disebut dengan Deleterious rhizobakteria (DRB). Hal ini dapat dilihat pada penelitian pengujian HCN yang dilakukan terhadap setiap isolat yang berasal dari rizosfer gulma berdaun lebar pada tabel 4, terdapat 3 isolat yang diuji mampu memproduksi HCN yaitu dengan terjadinya perubahan warna kertas saring. Hal ini sejalan dengan penelitian Kremer dan Souissi (2001), mengemukakan bahwa DRB menunjukkan reaksi positif dalam menghasilkan HCN yang jumlahnya bervariasi yang dapat terdeteksi berdasarkan intensitas warna yang diuji. Hasil penelitian menunjukkan isolat BL-07 dengan produksi HCN yang lebih tinggi dibandingkan dengan isolat BL-08 dan BL-03, sedangkan 7 isolat lainnya tidak mampu memproduksi HCN. 3 isolat yang mampu menghasilkan senyawa HCN ini juga mampu melarutkan fosfat, memfiksasi nitrogen dan memproduksi IAA sehingga isolat ini diindikasikan sebagai deleterious rhizobacteria karena berpengaruh negatif bagi gulma tetapi berpengaruh baik untuk tanaman. Senyawa HCN yang dihasilkan oleh rizobakteri khusus menghambat pertumbuhan gulma tapi tidak pada tanaman. Beberapa DRB yang diisolasi dari berbagai akar gulma dapat mengurangi perkecambahan benih, vigor dan pertumbuhan tanaman (Kremer dan Souissi, 2001). Cara DRB menginfeksi gulma adalah dengan memproduksi phytotoksin yang dapat diserap oleh biji-biji gulma. DRB tidak memberantas gulma, akan tetapi hanya menekan pertumbuhan awal dari gulma dan menekan perkecambahan biji.
SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa isolatisolat rizobakteri berpotensi memiliki karakter biokimiawi sebagai deleterious rhizobacteria melalui kemampuannya dalam melarutkan fosfat, fiksasi nitrogen, produksi
183 ASNIAH ET AL.
Isolat rizobakteri yang memiliki potensi sebagai deleterious rhizobacteria yaitu isolat BL-03, BL-07 dan BL-08 melalui kemampuannya menghasilkan HCN, sebagai pelarut fosfat, pemfiksasi nitrogen dan memproduksi IAA IAA dan HCN.
DAFTAR PUSTAKA Carvalho, D. D. C., D. F. Oliveira, R. S. B. Correa, V. P. Campos, R. M. Guimaraes and J. L. Coimbra, 2007. Rhizobacteria able to produce phytotoxic metabolites. Brazilian Journal Of Microbiology 38:759-765. Glickman, E., and Dessaux, Y., 1995. A critical examination of specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. App Environ Microbiol 61:793-796. Khairul, U. 2001. Pemanfaatan Bioteknologi Untuk Peningkatan Produksi Pertanian, (online), (http://www.worddagroforestry.org/s
ea/publocation/files/book/BK0028pdf. Diakses pada tanggal 13 Maret 2013).
J. AGROTEKNOS Kremer, R. J. and T. Souissi, 2001. Cyanide production by Rhizobacteria potential for supression of weed sedling growth. Current Microbiology 43:182-186. Munif A., 2001. Studies on the importance of endophytic bacteria for the biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita on tomato [Dissertation]. Bonn, Germany: Institute for plant Diseases, University of Bonn. Rao, N.S. Subba, 1994. Mikroorganisme tanah dan pertumbuhan tanaman. Terjemahan Soil organisms and growth. Terjemahan oleh Herawati Susilo. UI-PRESS. Jakarta.. Rao, V.S., 2000. Principles of weed science. Second edition. Science Publisher Inc. Plymouth. UK. Sutariati GAK, Widodo, Sudarsono, Ilyas S., 2006. Pengaruh perlakuan Plant Growth Promoting Rhizobacteria terhadap pertumbuhan bibit tanaman cabai. Buletin Agronomi 34(1):46-54. Thakuria, D, Talukdar NC, Goswami C, Hazarika S, Boro RC, Khan MR., 2004. Characterization and screening of bacteria from rhizosphere of rice grown in acidic soils of Assam. CurrSci 86:978-985
