Tudományos Diákköri Dolgozat
BENICSEK MIHÁLY
Kalpasztatin peptidkonjugátumok szintézise és sejtbejutása
Témavezetők: Dr. Hudecz Ferenc Dr. Bánóczi Zoltán
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007
KALPASZTATIN PEPTIDKONJUGÁTUMOK SZINTÉZISE ÉS SEJTBEJUTÁSA..................................................1 RÖVIDÍTÉS JEGYZÉK.............................................................................................................................3 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.......................................................................................................................4 1. BEVEZETÉS.......................................................................................................................................5 1.1. KALPAIN..................................................................................................................................................5 1.2. KALPASZTATIN............................................................................................................................................6 1.3. SEJTPENETRÁLÓ PEPTIDEK; PENETRATIN...............................................................................................................8 2. CÉLKITŰZÉS....................................................................................................................................10 3. KÍSÉRLETI RÉSZ..............................................................................................................................11 3.1. PEPTIDEK SZINTÉZISE..................................................................................................................................11 3.1.1.Penetratin.................................................................................................................................11 3.1.2. A fluoreszcensen jelölt penetratin............................................................................................12 3.1.3. Metionin hiányos penetratin....................................................................................................12 3.1.4. Kalpasztatin-A..........................................................................................................................12 3.1.5. A peptidek gyantáról való hasítása..........................................................................................13 3.1.6. A peptidek tisztítása.................................................................................................................13 3.2. KONJUGÁTUMOK SZINTÉZISE..........................................................................................................................13 3.2.1. A peptidkonjugátumok tisztítása.............................................................................................13 3.3 A PEPTIDEK ÉS A KONJUGÁTUMOK JELLEMZÉSE......................................................................................................14 3.3.1. Fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia..................................................14 3.3.2. Tömegspektrometria................................................................................................................14 3.3.3. Aminosavanalízis......................................................................................................................14 3.4. ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁS VIZSGÁLATOK...............................................................................................................14 4. EREDMÉNYEK................................................................................................................................15 4.1. PEPTIDKONJUGÁTUMOK SZINTÉZISE.................................................................................................................15 4.2. METIONIN HIÁNYOS PEPTID SZINTÉZISE.............................................................................................................18 4.3. SEJTBEJUTÁSI VIZSGÁLATOK...........................................................................................................................19 5. ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................................................21 IRODALOMJEGYZÉK...........................................................................................................................22
2
Rövidítés jegyzék AAA Boc BOP t Bu cf ClAc DBU DCM DIC DIEA DMF DMS EDT FACS Fmoc HOBt MBHA OBzl OPcpPbf TFA TIS TRIS-HCl Trt
amino acid analysis (aminosavanalizís) terc-butil-oxi-karbonilbenzotriazol-1-il-oxi-trisz-dimetil-amino-foszfónium hexafluoro-foszfát terc-butil5(6)-karboxifluoreszcein klóracetil1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én diklór-metán N,N’-diizopropil-karbodiimid N,N-diizopropil-etilamin N,N- dimetil-formamid dimetil-szulfid 1,2-etánditiol Fluorescence Activated Cell Sorting (áramlásos citometria) 9-fluorenil-metoxi-karbonil1-hidroxi-benzotriazol 4-metil-benzhidril-amin (gyanta) benzil-észter pentaklór-fenil-észter2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurán-5-szulfoniltrifluor-ecetsav triizopropil-szilán 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propándiol-hidrogénklorid tritil-
3
Köszönetnyilvánítás
Tisztelettel köszönöm Prof. Dr. Hudecz Ferenc egyetemi tanárnak, az ELTEMTA Peptidkémiai Kutatócsoport vezetőjének, hogy lehetőséget biztosított számomra bekapcsolódni a csoport kutatómunkájába és mint témavezetőm segítette a munkámat. Kiemelten szeretnék köszönetet mondani másik témavezetőmnek Dr. Bánóczi Zoltánnak, hogy nap mint nap készen állt lankadatlan szakmai lelkesedéssel támogatást nyújtani a felmerülő problémák megoldásában. Köszönetet mondok Dr. Mező Gábor tudományos tanácsadónak, amiért megismerhettem a peptidkémia elméleti alapjait. Köszönöm Bai Katalinnak és Dr. Schlosser Gittának a tömegspektometriás mérések elvégzését. Köszönöm Medzihradszkyné Dr. Schweiger Hedvig és Dr. Bősze Szilvia tudományos főmunkatársak munkáját és segítségét, amelyet az aminosavanalízis terén nyújtottak. Köszönöm Dr. Bősze Szilvia tudományos főmunkatársnak, Dr. Szabó Rita tudományos munkatársnak és Orbán Erika PhD hallgatónak a biológiai vizsgálatok elvégzésében nyújtott segítségét. Köszönöm
az
OTKA
K
68285,
GVOP-3.2.1-2004-04-0352/3.0,
GVOP-3.2.1-2004-04-0005/3.0, NK-60-723 anyagi támogatását.
4
1. Bevezetés Az orvostudomány nagymértékű fejlődése az eddig gyógyíthatatlan betegségek esetén is egyre közelebb kerül azok gyógyításához és mind részletesebben feltárja azok kialakulásának okait. A betegségek gyógyítására használt legelső gyógyszerek a természetből vett növényi eredetű szerek voltak. Paracelsus óta pedig a kémia nyújt óriási segítséget az új hatóanyagok kifejlesztésében. A biológiában és a biokémiában bekövetkezett szemléletváltozás (pl. centrális dogma – retrovírusok felfedezése, a molekuláris szintű folyamatok vizsgálatának igénye) és a bevezetett számos új módszer (PCR,
kétdimenziós
gélelektroforézis,
géntechnológiai
módszerek,
enzimek
térszerkezetének megismerésének lehetősége: NMR, röntgenkrisztallográfia) lehetővé teszi az élő sejtek alapvető működéseinek mind részletesebb megismerését. Ennek következtében fény derült a sejtek működésében fellépő számos hibára, melyek gyakran okoznak betegségeket. A biomolekuláriskémia újabb eredményei a hatóanyag kutatás terén is újszerű, mind specifikusabban ható gyógyszerek kifejlesztését tette lehetővé. A korszerű gyógyszerekkel szembeni mind erősebb követelmény, hogy a betegség helyén hassanak, specifikusan csak a beteg sejtekbe jussanak be, és csak ott halmozódjanak fel. Számos hatóanyag esetén a legnagyobb problémát a sejtbe való bejuttatása jelenti. Az utóbbi időben felfedezett sejtpenetráló peptidek(1) új lehetőséget jelentettek különböző molekulák sejtbejuttatásában (kis molekulák, peptidek, fehérjék, oligonukleotidok). Sok betegség az enzimek hibás működésére vagy szabályozásuk hibáira vezethető vissza. Ezért fontos szerepet kap olyan molekulák kutatása, szintézise, amelyek képesek az enzimek hibás működését ellensúlyozni (pl. inhibíció).
1.1. Kalpain A kalpain enzimek a Ca2+ függő cisztein proteázok családjába tartoznak, amelynek eddig több mint 15 tagját fedezték már fel. Minden emlős sejtben megtaláljuk az m (2)és µ (1)-kalpaint, melyeket klasszikus kalpainoknak is neveznek. In vitro eredmények alapján a μ-kalpain mikromoláris, míg az m-kalpain milimoláris koncentrációjú kalciumot igényel az aktiválódáshoz. Az intracelluláris kalcium koncentrációnövekedés aktiválja az enzimeket, amelyek a megfelelő szubsztrát fehérjéket elhasítják. Az izolált enzim aktiválódásához lényegesen nagyobb kalciumion koncentrációra van szükség, mint ami a sejtek belsejében kialakulhat. Az intracelluláris kalpainok aktiválódásában 5
ezért olyan folyamatok játszhatnak szerepet, amelyek fokozzák az enzim Ca2+-ra való érzékenységét. Például foszfolipid(2) vagy aktivátor fehérjék kötödése az enzimhez(3), az enzim autolízise(4) vagy foszforilációja(5). Az enzim katalitikus helye a papain-szerű proteázokéhoz hasonló szerkezetű(6). Az összes kalpain szerkezeti és funkcionális eleme a proteolitikus hatásért felelős II-es domén. A II-es domén tovább osztható II.a és II.b aldoménekre, amelyek között található a szubsztrát kötő zseb. A Ca2+ ion olyan térszerkezeti változást idéz elő, amely során a két alegység közel kerül egymáshoz és az enzim aktív lesz. A kalpain enzimek fontos biológiai funkciókat látnak el: csökkentik a sejtek közötti adhéziót, növelik a sejtek motalitását(7), a megnövekedett kalpain aktivitás felgyorsítja a sejtciklust és letapadás független sejtosztódást eredményez(8). Míg a kalpain-4 knock out embriók tíz napos korukig elpusztultak(9), mivel mind az m- mind a µ-kalpain működése, a szabályozóegység (kalpain-4) hiánya miatt zavart szenvedett. Ezzel szemben, ha csak a µ-kalpain hiányzott az egérembriók ugyan életben maradtak, de a vérlemezkék aggregációs képessége, valamint a véralvadék retrakciós képessége lecsökkent(10). Az enzim szabályozása még nem teljesen tisztázott. A kalpainnak egyetlen természetes és specifikus inhibitora van: a kalpasztatin fehérje. Szintetikus inhibitorok alkalmazása esetén figyelembe kell venni, hogy ezek az inhibitorok más enzimeket is gátolnak, nem kellően specifikusak(11). A kalpain túlzott mértékű vagy lecsökkent aktivitása több súlyos betegség kialakulásában játszhat szerepet. A kalpain-1 és -2 túlműködése akut idegrendszeri elváltozásokban (stroke és traumás agysérülések), az idegsejtek pusztulását idézik elő a sérült területen(12,13,14). Továbbá az Alzheimer-kór kialakulásában is feltételezik a két enzim szerepét. A Huntington-kór kialakulása során túlzott mértékű µ-kalpain aktivitás észlelhető(15,16). A kalpain-3 génjének funkció nélküli (loss-of-function) mutánsaival sikerült fényt deríteni a végtag öveket érintő 2A típusú izom disztrófia okára. A kalpain-10 génnek a kettes típusú diabétesz kialakulásában, míg a kalpain-9-nek a gyomorrák szupresszálásában van szerepe. A kalpainoknak fontos szerepére utal az a tény is, hogy több mint 100 szubsztrátjuk ismert. Mint azt említettem igen fontos szerep jut a kalpain funkció vizsgálatában az egyetlen, specifikus kalpain inhibitornak, a kalpasztatinnak.
1.2. Kalpasztatin Az m-kalpain tisztítása során figyeltek fel az aktivitást mutató extraktum inhibitor tartalmára (kalpasztatin), amely a kalpaint gátolja(17). A kalpain enzimeknek ez az egyetlen természetes és specifikus inhibitora. Az enzim 4 inhibitor domént tartalmaz, 6
amely három konzervatív régióval rendelkezik. Ezek közül az A- és C-régiók aktiváló(18), míg a B-régió (12 aminosavból áll) gátló hatást fejtenek ki a kalpainra. A maximális gátlás elérése érdekében mind a 3 régiónak egyidejűleg kell kötődnie a kalpainhoz. A kalpasztatin A és C régiójának vizsgálata során izolált enzimen végzett kísérletekben megállapították, hogy az A- és C-régió külön-külön is aktiváló hatást fejt ki az enzimre, de ez a hatás sokkal nagyobb, ha a két peptid egyszerre van jelen, azonos koncentrációban(18) (1. ábra). Az A- és C-régiók Ca2+-ion koncentráció-függő módon,
µ-kalpain aktivitás (%)
specifikusan kötődnek a kalpainhoz.
kalpasztatin A és C
kalpasztatin A vagy C
Peptid (µ M)
1. ábra: Kalpain enzim aktiválása kalpasztatin peptidekkel(5)
A kalpain enzim funkcióvizsgálataiban a kalpasztatin, mint specifikus inhibitor igen hasznosnak bizonyult. Ezen vizsgálatokban vagy mikroinjektálást(19) vagy transzfekciót használtak a kalpasztatin sejtbejuttatására. A transzfektálás során vagy a kalpasztatin génjét, vagy csak az inhibitor doménnek megfelelő DNS szakaszt jutatták be a sejtekbe(20,21). A B régiónak megfelelő peptid is hatékony és specifikus inhibitor lehetne, de nem képes a sejtmembránon átjutni. A sejtpenetráló peptidek felfedezése után, mint új lehetőséget kipróbálták ezeket a peptideket a B régió sejtbejuttatására is. Croce
és
mtsai
az
inhibitor
(EKLGERDDTIPPEYRELLEKKTGV) szekvencián
alapuló
sejtpenetráló
hatásért
felelős
kapcsoltak
amid
peptid
minimális kötéssel
egy
peptidet szignál-
(AAVALLPAVLLALLAP)
C-
terminálisához(22). A konjugátummal sikerült kimutatni, hogy a kalpain szerepet játszik a vérlemezkék degranulációjában és aggregációjában. Egy másik vizsgálatban Wu és mtsai a B-régiónak megfelelő peptid (DPMSSTYIEELGKREVTIPPKYRELLA) Nterminálisára amid kötéssel 11 tagú oligoarginit építettek be. Az így előállított konjugátum a patkány agykéregből nyert sejtekben gátolta a kalpaint(23). Ugyanezt a peptidet Gil-Parrado és mtsai penetratinhoz kapcsolták(24), mégpedig a két peptid között diszulfid kötést kialakítva. Mivel egyik természetes szekvenciában sem áll rendelkezésre Cys, ezért mind a kalpasztatin mind a penetratin szekvenciáját az N7
terminálison egy ciszteinnel meghosszabbították. A konjugátum bejutott LCLC-103H sejtekbe, és ott gátló hatást fejtett ki a kalpainra. Sengoku és mtsai vagy a teljes kalpasztatin fehérjét vagy csak az inhibitor doménjét (115-248) fuzionáltatták Tatpeptiddel (Tat47–57, YGRKKRRQRRR)(25). A fúziós fehérje sejtmentes közegben gátolta az m-kalpain működését, bejutott ugyan patkány agykéregből származó sejtekbe, de azokban nem fejtett ki gátló hatást az intracelluláris kalpainra. A vizsgálatokban megállapították, hogy a sejtek endocitózissal veszik fel a fehérjét, amely összefügghet a gátlóhatás elvesztésével. Az izolált kalpain enzimen kalpasztatinnal végzett kísérletek megmutatták, hogy a kalpasztatin-A és –C peptidek azonos koncentrációban, együttesen fejtik ki a legnagyobb aktiváló hatást. Ezekből az eredményekből kiindulva kívánták a kalpasztatin peptidek intracelluláris kalpainokra kifejtett hatását vizsgálni. Mivel a kalpasztatin peptidek nem képesek a sejtekbe bejutni, ezért Bánóczi és mtsai azokat egy sejtpenetráló peptidhez, a penetratinhoz kapcsolva jutatták be a sejtekbe. A konjugáció során a két peptid között különböző kémiai kötést alakítottak ki (amid, diszulfid, tioéter). A különböző kötéseket tartalmazó konjugátumok bejutottak a sejtekbe, megőrizték az enzimaktiváló képességet, és alkalmasak voltak sejtbejutás után is a kalpain enzim aktiválására(26). Az itt bemutatott példákból látható, hogy a sejtpenetráló peptidek alkalmasak peptidek hatékony sejtbevitelére, úgy hogy azok a funkciójukat is megőrzik. A következő fejezetben röviden bemutatom ezeket a peptideket.
1.3. Sejtpenetráló peptidek; penetratin A különböző méretű molekulák sejtekbe való bejutásának több módja ismert. A kis molekulák diffúzióval, míg a nagy molekulák csatornákon keresztül, endo- vagy pinocitózissal juthatnak a sejtekbe. Számos természetes eredetű és szintetikus peptidet állítottak elő az utóbbi évtizedekben, melyek képesek bejutni a sejtekbe, ezek a peptidek a sejtpenetráló peptidek. A bejutáshoz nem rendelkeznek sejtfelszíni receptorral, kis molekulatömegűek. Ezek a peptidek nem csak önmagukban képesek bejutni a sejtekbe, hanem a hozzájuk kovalensen kapcsolt molekulákat is beviszik a citoszolba. Széles azon molekulák választéka, amelyeket képesek a sejtbe bejuttatni (pl. oligonukleotidok, PNS, fehérjék, gyógyszermolekulák). Az elsőként felfedezett sejtpenetráló peptid a HIV-1 Tat fehérjéből származó 86 aminosavból álló fragmens volt(27,28). Néhány évvel később fedezték fel a Drosophila Antennapedia fehérjéjének 60 aminosav hosszúságú 8
homeodoménjét, melynek megfelelő peptid képes önmagában bejutni idegsejtekbe(29). Ezek a tapasztalatok és újabb sejtpenetráló peptidek felfedezése (pl. hidrofób peptidek) újabb kutatásokat indítottak el de novo peptidek fejlesztésére, még hatékonyabb sejtbejutási képességek
érdekében(30,31,32). A sejtpenetráló
peptidek
nem csak
hatóanyagokat képesek sejtbe juttatni, hanem más peptideket és oligonukleotidokat, amellyel lehetőség nyílik az egyes vegyületekhez kötött biológiai funkciók vizsgálata (pl. apoptózis, antigén feldolgozás és prezentálás, sejt mozgás). A sejtpenetráló peptideknek számos csoportja létezik. Ilyenek: a) argininben gazdag peptidek, b) amfipatikus peptidek, c) szignál-szekvencián alapuló peptidek. Joliet és munkatársai mutatták ki, hogy a Drosophila Antennapedia fehérje 60 aminosavból álló homeododoménje bejut az idegsejtekbe, a sejtmagban kötődik a DNS-hez és szabályozza az idegsejt morfogenezisét(29). Helyspecifikus mutációval sikerült megállapítani, hogy a homeodomén 3. hélixe tartalmazza a sejtbejutásért felelős régiót(33). Derrosi és munkatársai szintetikus peptidekkel bizonyították, hogy a 3. hélixben található 16 tagú peptid (43RQIKIWFQNRRMKWKK58, penetratin) képes bejutni az idegsejtekbe(34). A C- és N- terminálison meghosszabbított penetratin változat hatékonyan és gyorsan jutott be primer B- és T-sejtekbe, amelyek igen nehezen transzfektálhatóak(35). A sejtbejutás szerkezeti magyarázatához feltételezték, hogy az αhélix szerkezet megléte szükséges. Ugyanakkor a szerkezet-hatás vizsgálatok kimutatták, hogy az α-hélix szerkezet elvesztése nem jár a sejtbejutási képesség megszűnésével. Azonban a C-terminálison a WKK tripeptiddel rövidített változat már nem jut be a sejtbe(36). Szintetikus peptidekkel végezett vizsgálatok kimutatták, hogy a HaCaT humán fibroblaszt és A549 humán tüdőrák sejtvonal esetén a sejtbejutáshoz feltétlen szükséges szakasz a C-terminális heptamer darabja (52RRMKWKK58). A vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a bázisos aminosavak egyenkénti cseréje alaninnal a sejtpenetráció nagyfokú csökkenéséhez vezetett, míg hidrofób aminosavak cseréje nem befolyásolja lényegesen a sejtbejutást(37). Az irodalomban nagyszámú példa található a penetratinhoz kapcsolt molekulák sejtbe juttatásáról, ahol a penetratinhoz peptideket, foszfopeptideket, oligonukleotidokat, peptidnukleinsavakat kapcsoltak(1). A 16 aminosavból álló penetratinnal, amely az argininben gazdag peptidek közé tartozik végezett kísérletek kimutatták, hogy ezen peptidek receptortól, energiától és hőmérséklettől független módon képesek a bejutni a sejtbe, endocitózis független úton(38). Azonban a pontos mechanizmus még nem teljesen tisztázott. Az első kísérletek után kiderült, hogy a sejtek fixálása befolyásolja és módosítja a sejtbejutást, valamint a sejten belüli lokalizációt(39,40). 9
2. Célkitűzés A kalpasztain peptidek (A és C régió) aktiváló hatása akkor a legnagyobb, ha a két peptid azonos koncentrációban egyidejűleg van jelen a sejtben. A peptidekkel végzett kísérletek végső célja olyan vegyületek előállítása, amelyek segítségével a két aktiváló peptid nemcsak bejuttatható a sejtbe, hanem alkalmas intracelluláris kalpain aktiválására is. E vizsgálatokhoz penetratinnal, mint sejtpenetráló peptiddel alkotott konjugátumok készültek, melyek aktiválják, mind az izolált mind pedig a sejtben található kalpaint. Izolált enzim esetén a peptidek azonos koncentrációja biztosítható, azonban a sejtekkel végzett kísérletek esetén, az inkubáláshoz használt azonos koncentrációk nem biztosítják egyértelműen a két peptid konjugátumának sejten belüli azonos koncentrációját. Ezért
munkám
során
a
kalpasztatin
peptidek
penetratinnal
alkotott
konjugátumainak sejtbejutási képességét kívántam vizsgálni, mind önmagukban mind a peptidkonjugátumok keverékéből. A vizsgálatokhoz a penetratinC, kalpasztatin-A és -C peptidek, majd ezekből peptidkonjugátumok szintézisét terveztem, tioéter kötés kialakításával. A konjugátumok sejtbejutási képességét áramlási citometriás mérésekkel terveztük vizsgálni. Az áramlási citometriás
(FACS)
vizsgálatokhoz
fluoreszcensen
jelölt
peptidkonjugátumok
szintézisét terveztem. Fluorofórnak 5,6-karboxifluoreszceint választottam. A sejtbejutási vizsgálatokat COS-7 májsejteken végezzük.
10
3. Kísérleti rész 3.1. Peptidek szintézise A peptid-amidokat szilárd fázisú peptidszintézissel (SPPS), Fmoc/tBu stratégiát alkalmazva építettem föl. A szintézisekhez Rink-amid MBHA gyantát alkalmaztam, (kapacitása 0,73 mmol/g). Az Fmoc védőcsoport hasítása 2% piperidint és 2% DBU-t tartalmazó DMF-oldattal történt. Az aminosavak kapcsolása aktív észteres módszerrel történt, amelynél az aminosavakat, valamint a HOBt és a DIC kapcsolószereket 3 ekvivalensnyi feleslegben alkalmaztam. Az egyes aminosavak kapcsolását 1 órán keresztül végeztem, majd a kapcsolási reakció eredményességét Kaiser-teszttel (ninhidrin) ellenőriztem. Pozitív eredmény esetén (maradt szabad amino csoport a gyantán) megismételtem a kapcsolást. Az alkalmazott protokollt az 1. táblázatban foglaltam össze. 1. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia lépései. Lépés Mosás Hasítás Mosás Kapcsolás
Mosás Ellenőrzés
Oldószerek / reagensek DMF 2% piperidin, 2% DBU / DMF DMF 3 ekv. AAA, 3 ekv. DIC,HOBT/ DMF DMF DCM ninhidrin, izatin
Idő / perc
Ismétlés
0,5
3x
2+2+5+10
1x
1
8x
60
1x
1 1
2x 3x
3
1x
3.1.1.Penetratin A penetratinC (RQIKIWFQNRRMKWKKC) szintézisét 0,5 g Rink-amid MBHA gyantán végeztem. A szintézishez a következő aminosavszármazékokat használtam:
FmocArg(Pbf)-OH
Fmoc-Gln(Trt)-OH
Fmoc-Met-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Phe-OH
Fmoc-Cys(Trt)-OH
Fmoc-Lys(Boc)-OH
Fmoc-Trp-OH
2.táblázat: A penetratinC szintéziséhez felhasznált aminosavszármazékok.
11
3.1.2. A fluoreszcensen jelölt penetratin Az utolsó aminosav N-terminális Fmoc védőcsoportjának eltávolítása után a gyantán felépített penetratinC peptidhez kapcsoltam az 5,6-karboxifluoreszceint. Az összes gyanta+peptid mennyiségből 1,3 g-ot vettem ki, amely annak 1/3-a volt. A kapcsoláshoz 3 ekvivalens feleslegben használtam az 5,6-karboxifluoreszceint, a BOP és HOBt kapcsolószereket. A kapcsoláshoz 6 ekvivalens DIEA-t, mint bázist is alkalmaztam. A kapcsolás reakció ideje 2 óra volt (3. táblázat). Oldószerek / reaIdő / perc Ismétlés gensek Mosás DMF 0,5 3x 2% piperidin, 2% Hasítás 2+2+5+10 1x DBU / DMF Mosás DMF 1 8x 3 ekv. 5,6 karboxifluoreszcein, 3 Kapcsolás 60 1x ekv. BOP,HOBt, 6 ekv. DIEA DMF, 1 2x Mosás DCM 1 3x Ellenőrzés ninhidrin, izatin 3 1x 3. táblázat: A fluoreszcens jelölés lépései Lépés
3.1.3. Metionin hiányos penetratin A Flu-PenC* (FluPenC – Met) peptidet 0,1 g Rink-amid MBHA gyantán szintetizáltam. A felhasznált aminosavszármazékok a 2. táblázatban láthatóak. 3.1.4. Kalpasztatin-A A kalpasztatin-A (SGKSGMDAALDDLIDTLGG) peptid szintéziséhez 0,3 g Rinkamid MBHA gyantát használtam. Az utolsó Fmoc védőcsoport eltávolítása után a peptid N-terminálisára klór-acetil csoportot építettem be, melyhez 5 ekvivalensnyi feleslegben ClAc-OPcp
aktív-észtert
használtam.
A
peptid
szintéziséhez
a
következő
aminosavszármazékokat használtam fel:
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Ile-OH Fmoc-Met-OH Fmoc-Trp-OH 4.táblázat: A kapasztatin-A peptid szintéziséhez felhasznált aminosavszármazékok
12
3.1.5. A peptidek gyantáról való hasítása A peptidek gyantáról történő hasításához használt elegy: 10 ml TFA, 750 mg fenol, 0,5 ml tioanizol, 0,25 ml EDT, 0,5 ml deszt. víz, illetve a klóracetilezett peptid esetén 10 ml TFA, 250 µl deszt. víz, 250 µl tioanizol 100 µl TIS összetételű volt. A hasítás reakció ideje 3 óra volt. A hasítás után a peptideket dietiléterrel kicsapaptam, 3x mostam dietiléterrel, majd pedig 10 %-os ecetsavban oldottam fel és liofilizáltam. 3.1.6. A peptidek tisztítása A nyers peptideket fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadék kromatográfiával (RPHPLC) tisztítottam, Phenomenex Jupiter C18 (250x10 mm I.D., 10 µm szilika, 300 Å pórusméret)
(Torrance,
CA,
USA)
fél-preparativ
oszlopon.
Az
elválasztás
szobahőmérsékleten 4 ml/perc áramlási sebességgel történt. A csúcsokat λ=220 nm hullámhosszon detektáltam. A PenentratinC és a Fluorszcein-PenetratinC esetében a következő gradienst használtam: 0 perc 25% B; 5 perc 25% B; 50 perc 75% B; míg a kalpasztatin-A peptid esetén: 0 perc 30% B; 5 perc 30% B; 50 perc 65% B. Az A eluens 0,1% TFA/H2O és a B eluens pedig 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril-víz (80:20, V/V) elegy volt. A termékeket a megfelelő frakciók liofilizálásával izoláltam.
3.2. Konjugátumok szintézise A
penetratinC-t
konjugáltam
kalpasztatin-A
és
-C
peptidek
klór-acetilezett
származékaival. A reakció Tris pufferben zajlott, melynek pH-ja 8,11 volt. A peptidek koncentrációja a pufferoldatban 1,5 mg/ml volt. A kalpasztatin-A és -C peptideket 2 ml pufferoldatban oldottam fel, majd ezután 1 órán keresztül, 1 mg/ 15 perc sebességgel adagoltam a penetratinC-t a reakcióelegyhez, elkerülendő annak dimerizációját. A penetratinC-t 1,2 ekvivalens feleslegben használtam fel, a kalpasztatin peptidekhez képest. A reakció idő 3 óra volt. A reakció befejezése után 10 % ecetsav hozzáadásával megsavanyítottam az oldatot. 3.2.1. A peptidkonjugátumok tisztítása A konjugátumokat RP-HPLC-val tisztítottam, amelyhez Phenomenex Jupiter C18 (250x10 mm I.D., 10 µm szilika, 300 Å pórusméret) (Torrance, CA, USA) félpreparativ oszlopot használtam. A folyási sebesség 4 ml/min volt, a használt gradiens 0,7 B% / perc ( 30-65 B%), a detektálás pedig 220 nm-n történt. 13
3.3 A peptidek és a konjugátumok jellemzése 3.3.1. Fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia A peptidek homogenitásának jellemzése analitikai RP-HPLC-val, Knauer (Herbert Knauer GmbH, Berlin, Németország) rendszerrel történt. Az alkalmazott oszlop Phenomenex SYNERGI MAX-RP (250x4,6 mm I.D., 4 µm szilika, 80 Å pórusméret) (Torrance, CA, USA) volt. Lineáris gradiens elúciót (0 perc 0% B; 5 perc 0% B; 50 perc 90% B) használtam, ahol az A eluens 0,1% TFA/H2O és a B eluens pedig 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril-víz (80:20, V/V) elegy volt. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt. A csúcsok detektálása λ=220 nm-en történt. A mintákat B eluensben oldottam fel. 3.3.2. Tömegspektrometria Pozitív ion elektrospray ionizációs tömegspektrometriás (ESI-MS) analízist Bruker Esquire 3000 plus (Bruker Daltonik, Bréma, Németország) és PerkinElmer API 2000 triple quadrupole (Sciex, Toronto, Kanada) készüléken végeztük. A mintákat acetonitrilvíz (50:50, V/V) elegyében oldottuk, mely 0,1% ecetsavat tartalmazott. 3.3.3. Aminosavanalízis Az aminosav analíziseket Beckman (Fullerton, CA, USA) Model 6300 automata aminosav analizátoron készítettük. A mintákat 6M HCl oldattal hidrolizáltuk el 110oCon. A hidrolízist 24 órán át, leforrasztott, evakuált csőben végeztük.
3.4. Áramlási citometriás vizsgálatok 5(6)-karboxifluoreszceinnel jelölt peptideket és konjugátumot DMEM médiumban oldottuk fel (c = 10 és 50 µM). A COS-7 sejteket 24 lyukú sejttenyésztő lemezen (sejtszám=105) 24 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk, majd a vegyületek oldataival (c= 10 és 50 µM) 3 órán keresztül kezeltük. A kontroll sejteket csak szérummentes médiummal kezeltük. Az inkubálás után a sejteket PBS-sel mostuk, és 5 percig tripszinnel kezeltük. A tripszin hatását 10 % FCS-t (foetal calf serum) tartalmazó fenolvörös mentes DMEM méduimmal állítottuk le. Újabb mosás után a sejteket PBS oldatban reszuszpendáltuk. A COS-7 sejtek fluoreszcencia intenzitásának növekedését áramlási citométerrel vizsgáltuk (BD LSR II, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Az adatokat FACSDiva szoftver segítségével értékeltük ki. 14
4. Eredmények Az eddig több mint 15 tagot számláló kalpain enzim család fontos szerepet tölt be a sejtek osztódásában, motalitásának változtatásában és a sejtciklus sebességének szabályozásában. A kalpain enzimek hibás működése sok betegség kialakulásában játszik fontos szerepet. Az enzimek szabályozása nem teljesen ismert. A kalpain enzim egyetlen természetes és specifikus inhibitora a kalpasztatin. A kalpasztatin fehérje regulátor doménjében található A és C régió kalpain aktiváló hatással rendelkezik. Izolált µ-kalpain enzimen végzett kísérletek azt mutatták, hogy az A és C régió aktiváló hatása akkor volt a legnagyobb, ha mindkét peptidet egy időben, azonos koncentrációban volt jelen. Ezen eredményekből kiindulva a kalpasztatin peptidek intracelluláris kalpainra gyakorolt aktiváló hatásának vizsgálatára, különböző kötést tartalmazó sejtpenetráló konjugátumaikat állították elő az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban. A konjugátumok megőrizték enzimaktiváló képességüket, mind izolált enzimen mind sejtlizátumban. A TDK munkám során arra kerestem a választ, hogy az élő sejtek milyen arányban veszik fel a penetratinnal konjugált kalpasztatin peptideket. Ebből pedig meghatározható az a sejten kívüli konjugátum koncentráció, amelyet alkalmazva a kalpasztatin konjugátumok azonos mértékben jutnak be a sejtekbe. A következő három fejezetben a peptidek és konjugátumaik szintézisének és a sejtbejutási képességük vizsgálatának az eredményeit mutatom be.
4.1. Peptidkonjugátumok szintézise Az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoportban folyó kutatás során azt vizsgálják, hogy alkalmasak-e az izolált enzimre aktiváló hatást kifejtő kalpasztatin-A és -C peptidek intracelluláris kalpain enzim aktiválására. Mivel a peptidek nem képesek önmaguk bejutni a sejtekbe, ezért penetratinnal (sejtpenetráló peptid) alkotott konjugátumait készítették el, melyek bejutottak a sejtekbe és megőrizték a peptidek enzimaktiváló hatását.
Ezen
vizsgálatokban
amid,
tioéter
és
diszulfid
kötést
tartalmazó
konjugátumokat vizsgáltak. Az amid kötés kialakításánál egy természetes kötést hozunk létre. Az ekkor kialakuló peptid, a nagy tagszáma miatt még szilárd fázisú szintézissel is nehezen állítható elő. A peptidlánc hossza miatt a termék lehet heterogén és a kívánt peptid izolálása is nehézségekbe ütközhet. A két peptid között az amid kötés 15
oldatfázisban is kialakítható, de ekkor a peptid oldalláncaiban található amid és karboxil csoportokat is védeni kell. Ezen esetben ha a peptid nagyszámú ilyen funkciós csoportot tartalmaz, akkor oldhatósági és elválasztási problémák léphetnek fel. Az amid kötés kémiai
ligációs
technikával
is
kialakítható,
amely
nem
védett
peptidek
összekapcsolásával is megvalósítható. Ez a kötés a sejten belül csak a fehérjebontó enzimek és sejtalkotók (lizoszóma) által degradálódhat. A diszulfid kötés a sejtekben uralkodó redukáló közeg hatására felnyílhat, és a két peptid komponens szétválhat(41). Ez a kötés nem védett peptidek között oldatfázisban kialakítható. A diszulfid kötés kialakításakor és tárolásakor, illetve alkalmazásakor fenn áll annak a veszélye, hogy a heterodimer konjugátumok átalakulnak a stabilabb homodimer formává(42). A tioéter kötés kialakítása során egy nem természetes kötést hozunk létre, amely befolyásolhatja a konjugátum enzimaktiváló hatását. A tioéter kötés a sejten belüli körülmények között stabil. Előnye ennek a kapcsolódási módnak, hogy tisztított, jellemzett védetlen peptidek között oldatfázisban, gyorsan és szelektíven kialakítható. Mindezek alapján, valamint annak ismeretében, hogy az eltérő kötéstípusokat tartalmazó konjugátumok enzimaktiváló képessége között nincs lényeges eltérés, a sejtbejutási vizsgálatokhoz a tioéter kötést tartalmazó konjugátumok előállítását választottam. A tioéter kötés kialakításához a penetratin C-terminálisát egy további Cys-nel hosszabbítottam meg, míg a kalpasztatin-A és -C peptidek N-terminálisára klór-acetil csoportot építettem be. A peptideket Trisz pufferben (pH=8,11) konjugáltam úgy, hogy a cisztein tartalmú penetratint kis részletekeben adagoltam, hogy elkerüljem a penetratin oxidációját. A peptidek és konjugátumaik homogenitását és minőségét aminosavanalízissel, analitikai RP-HPLC-vel és ESI-MS tömegspektrométerrel végeztem (5. táblázat).
Anyag
Rt
Tömeg [ M+H]+
(perc) Mért Várt PenetratinC 25,9 2348,9 2349 Flu-PenetratinC 22,75 2708,1 2708 PenC-KalpC 21,2 4324,5 4324,1 Flu-PenC-KalpC 18,82 4683,1 4683,3 4223,5 4224 PenC-KalpA 31,33 FluPenC* 27,51 2576,5 2577 5. táblázat: A peptidek és konjugátumok analitikai jellemzői
16
A következő ábrán a PenC-KalpA analitikai RP-HPLC kromatogrammja látható. 0,44 0,39 0,34 0,29 0,24
bszoranci A
0,19 0,14 0,09 0,04 -0,01 0
10
20
Idő / perc
30
40
50
2. ábra: PenC-KalpA konjugátum analitikai RP-HPLC-vel készített kromatogramja
A sejtbejutási vizsgálatokat áramlási citométerrel (FACS) végeztük, amelyhez fluoreszcensen jelölt konjugátumokat szintetizáltam. Két eltérő tulajdonságú (egymás mellet detektálható) fluorofór alkalmazásával, egyidejűleg mérhető a két konjugátum (más-más fluorofórral jelölve) sejtbejutása. Azonban, mind szerkezeti (kis molekula tömeg), mind készülék paraméterek (gerjesztési és emissziós hullámhossz) miatt nem találtam két megfelelő fluorofórt. Ezért egyetlen fluoreszcens jelzőmolekulának az irodalomban gyakran hivatkozott és a kutatócsoportban is alkalmazott 5(6)karboxifluoreszceint választottam. A sejtbejutás vizsgálatához mindkét kalpasztatin peptidkonjugátumból
készítettem
fluoreszceinnel
jelölt
származékot.
Ezen
konjugátumok előállítása a jelöletlenek szintézisével azonos módon történt, azzal a különbséggel, hogy az N-terminálisán karboxifluoreszceint tartalmazó penetratint alkalmaztam a konjugálási reakcióban (3.ábra). Az 5(6)-karboxifluoreszceinnel jelölt penetratinC esetében a szekvenciában található metionin kismértékű oxidációját tapasztaltuk. Az oxidált metionin redukálását az irodalomban megadott módon NH4I/DMS eleggyel végeztem el(43). A jelöletlen penetratin esetében ezt a jelenséget nem tapasztaltam, mely arra utalhat, hogy a fluoreszcein molekula jelenléte elősegítheti a Met oxidációját.
17
x-PenetratinC-KalpasztatinA konjugátum: ClAc-SGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2
( c=1,5 mg/ml, 0,1 M Trisz puffer, pH=8,11)
+
X-RQIKIWFQNRRMKWKKC
(1 mg/ 15 perc) X-RQIKIWFQNRRMKWKKC
S-CH2CO-SGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2
x-PenetratinC-KalpasztatinC konjugátum: -
ClAc-SKPIGPDDAIDALSSDFTS NH2
( c=1,5 mg/ml, 0,1 M Trisz puffer, pH=8,11)
+ x-RQIKIWFQNRRMKWKKC (1 mg/ 15 perc) x-RQIKIWFQNRRMKWKKC
-
S –CH2CO-SKPIGPDDAIDALSSDFTS NH2
X: H, Fluoreszcein 3.ábra: Konjugálási reakció
4.2. Metionin hiányos peptid szintézise A peptidekben található Met azáltal, hogy viszonylag könnyen oxidálódhat, megnehezíti ezen peptidekkel való munkát. A metionint tartalmazó peptidek a feldolgozás és a tárolás során is oxidálódhatnak. A munka során én is tapasztaltam különböző mértékű oxidációt a fluoreszceinnel jelölt penetratin esetén. Mivel az irodalomban nem található adat arra, hogy a metionin szükséges-e a penetratin sejtbejutásához, vizsgálni kívántuk a metionin hiányos penetratin sejtbejutó képességét is. A vizsgálatokhoz előállítottam a fluoreszceinnel jelölt metionin hiányos penetratint (5. táblázat, 4.ábra).
1,38 1,18 0,98 0,78
ci n ra szo b A
0,58 0,38 0,18 -0,02 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Idő / perc
4. ábra: FluPenC* analitikai RP-HPLC-vel készül kromatogramja
18
4.3. Sejtbejutási vizsgálatok COS-7 sejteket három órán keresztül inkubáltuk a peptidek és peptidkonjugátumok oldataival. A sejtekhez 10 és 50 µM-s koncentrációban adtuk a fluoreszcensen jelölt és jelöletlen penetratin-származékokat (Fluoreszcein-PenetartinC = FluPenC, metionin hiányos Fluoreszcein-PenetratinC= FluPenC*, Fluoreszcein-PenetratinC-Kalpasztatin-C konjugátum = FluPenC-CalpC, PenetratinC-Calpasztatin-A konjugátum = PenCCalpA). 25000
23337
23097
20000
15683 14666
Fluoreszcencia
15000
10000
8259
9269
10 uM 50 uM
5000
3696 1568
0 FluPenC
FluPenC*
FluPenC-CalpC
FluPencCalpC+PenCalpA
5. ábra: A sejtbejutási vizsgálatok során mért intracelluláris fluoreszcencia értékek
A penetratin származékok már alacsony koncentrációban (c = 10 µM) is jelentős, szignifikánsan nem különböző mértékű fluoreszcencia intenzitást eredményeztek: FluPenC Fátlag = 8259, FluPenC* Fátlag = 9269. Növelve a koncentrációt (c = 50 µM) a sejtek fluoreszcencia intenzitása jelentősen nőt, de nem lineárisan: FluPenC Fátlag = 23097, FluPenC* Fátlag = 23337. A két származék sejtfelvétele ezen koncentrációnál is azonos mértékű volt. A kalpasztatin-C peptid konjugátumát vizsgálva mindkét koncentrációnál a penetratinhoz képest kisebb fluoreszcencia intenzitást detektáltunk 10 µM-nál Fátlag = 1568 és 50 µM-nál Fátlag = 14666. Ha a fluoreszcensen jelölt kalpasztatinC konjugátum mellett a jelöletlen kalpasztatin-A konjugátum is jelen volt, akkor a szórásokat figyelembe véve azonos sejtfelvételt detektáltunk: FluPenC-CalpC+PenCCalpA 10 µM-nál 3696 és 50 µM-nál 15683. A FluPenC jelentős sejtfelvételt mutatott, melyhez képest a kalpasztatin-C konjugátum sejtbejutása kisebb volt. A különbség 10 µM-os koncentráció esetén 19
jelentősebb volt, mely csökkent magasabb koncentrációnál. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a penetratin sejtbejutását befolyásolja a hozzá kapcsolt peptid. A kalpasztatin-C peptidben jelentős számú Asp található melyek negatív töltésű karboxilcsoportjai leárnyékolhatják a penetratin pozitív töltésű aminosav oldalláncait. Ez pedig a sejtbejutás hatékonyságának romlását eredményezi, jó egyezésben azon irodalmi megfigyelésekkel, hogy a penetratinban található pozitív töltésű aminosavak játszanak fontos szerepet a sejtbejutásban. A konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozást azonos koncentrációjú elegyükből úgy vizsgáltuk, hogy az egyik konjugátumot jelölt, míg a másikat jelöletlen formában adtuk a sejtekhez azonos koncentrációban. Ha a fluoreszcensen jelölt kalpasztatin-C peptidkonjugátum mellett jelen volt a jelöletlen kalpasztatin-A peptidkonjugátum is, azonos koncentrációban, akkor az azonos fluoreszcencia intenzitásokból megállapítható, hogy az nem befolyásolta a jelölt konjugátum sejtbejutását. A vizsgálatokhoz szükséges másik konjugátum FluoreszceinPenetratinC-Kalpasztatin-A
konjugátum
előállítása
folyamatban
van,
melynek
vizsgálata fontos adatokat szolgáltathat majd arra, hogy milyen módon befolyásolja a penetratin sejtbejutását a hozzá kapcsolt sejtbejuttatandó peptid milyensége. A FluPenc és a FluPenC* esetében látható, hogy a penetratin szekvenciájából a metionin kihagyása nem befolyásolja szignifikánsan a penetratin sejtbejutási képességét, amely a szintézis és a tárolás során fellépő esetleges oxidálódás elkerülését teszi lehetővé. Így olyan új penetratin származékot állítottam elő, amely ugyanolyan hatékonyan internalizál, mint maga a penetratin.
20
5. Összefoglalás A kalpasztatin-A és –C peptidek penetratinnal történő konjugálás után is bejutnak a sejtekbe és megőrzik aktiváló hatásukat. A sejtbejutási képesség vizsgálatához tioéter kötést tartalmazó konjugátumokat szintetizáltam. Mindkét konjugátumból készítettem fluoreszceinnel jelölt változatot is. A tioéter kötés kialakításához a penetratin Cterminálisára egy további Cys-t építettem be, illetve olyan származékot is szintetizáltam ahol az N-terminálisra 5(6)-karboxifluoreszceint kapcsoltam; míg a kalpasztatin-A és – C peptidek N-terminálisán klór-acetil csoportot alakítottam ki. Az elkészített konjugátumok sejtbejutási képességét COS-7 sejteken vizsgáltuk, áramlási citométerrel. A kalpasztatin-C peptidet tartalmazó konjugátum internalizációs képessége jelentősen kisebb volt, a penetratinhoz képest, mely arra utal, hogy a konjugált peptid minősége befolyásolja a penetratin sejtbejutását. A további eredmények azt mutatták, hogy a kalpasztatin-A konjugátum nem befolyásolja a fluoreszcensen jelölt kalpasztatin-C sejtbejutását. A Met-t nem tartalmazó penetratinC esetén kapott eredmények azt mutatták, hogy annak sejtbejutási képessége megegyezik a penetratinnál tapasztalt értékkel. Ezáltal olyan új penetratin származékot állítottam elő, amely ugyanolyan hatékonyan internalizál, mint maga a penetratin.
21
Irodalomjegyzék
1. Hudecz, F., Bánóczi, Z. and Csík, G. (2005) Medium-sized peptides as built in carriers for biologically active compounds. Med. Res. Rev. 25, 679-736. 2. Arthur, J. S. C. and Crawford, C. (1996) Investigation o f the interaction of M-kalpain with phospholipids, kalpain-phospholipid, kalpain-foszfolipid interaction.
Biochem. Biophys. Acta 1293,
201-206. 3. Michetti, E., Viotti, P. L., Melloni, E. and Pontremoli, S. (1991) Mechanism of action of the calapin activator protein in rat skeletal muscle. Eur. J. Biochem. 202, 1177-1180. 4. Cong, J., Goll, D. E., Peterson, A. M. and Kapprell, H. P. (1989) The roll of autolysis in activity of the Ca2+ J. Biol .Chem., 264, 10096-10103. 5. Kuo, W., N.,Genesan, U., Davis, D. L. and Walbey, D. L. (1994) Regulation of the phosphorylation of calpain II. and its inhibitor. Mol. Cell. Biochem. 136, 157-161. 6.Sorimachi, H., Ishiura, S. and Suzuki, K. (1997) Structure and physiological function of calpains. Biochem. J. 328, 721-732. 7. N. O. Carragher, et al., J. Cell Biol. 1999, 7, 619-630. 8. N. O. Carragher , M. A. Westhoff , D. Riley , D. A. Potter , P. Dutt , J. S. Elce , P. A. Greer , M. C. Frame, v-Src-induced modulation of the calpain-calpastatin proteolytic system regulates transformation. Mol Cell Biol. 2002 Jan ;22 (1):257-69, 11739739 9. N. Dourdin, et al.,J. Biol. Chem. 2001, 276, 48382-48388. 10. Azam, M., Andrabi, S. S., Sahr, K. E., Kamath, L., Kuliopulos, A. and Chishti, A. H. (2001) Disruption of the mouse µ-calpain gene reveals an essential role in platelet function. Mol. Cell. Biol. 21, 2213-2220. 11. Wells, G. J. and Bihovsky, R. (1998) Calpain inhibitors as potential treatment for stroke and other neurodegenerative diseases: recent trends and developments. Exp. Opin. Ther. Patent 8, 1707-1727. 12. Wang, K. K., (2000) Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends Neurosci. 23, 20-26. 13. Pike, B. R., Flint, J., Dutta, S., Johnson, E., Wang, K. K. W. and Hayes, R. L. (2001) Accumulation of non-erythroid {alpha}II-spectrin breakdown products in cerebrospinal fluid after traumatic brain injury in rats. J. Neurochem. 78, 1297-1306. 14. Neuman, R. W., Meng, F. H., Mills, A. M, Xu, Y. A., Zhang, C., Welsh, F. A. and Siman, R. (2001) Calpain activity in the rat brain after transient forebrain ischemia. Exp. Neurol. 170, 27-35. 15. Gafni, J. and Ellerby, L. M (2002) Calpain activation in Huntington's diseas. J. Neurosci. 25, 5365-5375. 16. Mishizen-Eberz, A. J., Norris, E. H., Giasson, B. I., Hodara, R., Ischiropoulos, H., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Lynch, D. R., (2005) Cleavage of alpha-synuclein by calpain: potential role in degradation of fibrillized and nitrated species of alpha-synuclein. Biochemistry 44, 7818-7829. 17. Murachi, T. (1989) Intracellular regulatory system involving calpain and calapastatin. Biochem. Int. 18, 263-294. 18. P. Tompa et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 9022-9026
22
19. Temm-Grove, C. J., Wert, D., Thompson, V. F., Allen, R. E. and Goll, D. E. (1999) Microinjection of calpastatin inhibits fusion in myoblasts. Exp. Cell Res. 247, 293–303. 20. Glading, A., Lauffenburger, D. A. and Wells, A. (2002) Cutting to the chase: calpain proteases in cell motility. Trends Cell Biol. 12, 46–54. 21. Lu, T., Xu, Y., Mericle, M. T. and Mellgren, R. L. (2002) Participation of the conventional calpains in apoptosis. Biochim. Biophys. Acta 1590, 16–26. 22. Croce, K., Flaumenhaft, R., Riversi, M., Furie, B., Furie, B. C., Herman, I. M. and Potter, D. (1999) A. Inhibition of calpain blocks platelet secretion, aggregation, and spreading. J. Biol. Chem. 274, 36321– 36327. 23. Wu, H. Y., Tomizawa, K., Matsushita, M., Lu, Y. F., Li, S. T., and Matsui, H. (2003) Poly-argininefused calpastatin peptide, a living cell membrane-permeable and specific inhibitor for calpain. Neurosci. Res. 47, 131-135. 24. Gil-Parrado, S., Assfalg-Machleidt, I., Fiorino, F., Deluca, D., Pfeiler, D., Schaschke, N., Moroder, L. and Machleidt, W. (2003) Calpastatin exon 1B-derived peptide, a selective inhibitor of calpain: enhancing cell permeability by conjugation with penetratin. Biol. Chem. 384, 395-402. 25. Sengoku, T., Bondada, V., Hassane, D., Dubal, S. and Geddes, J., W. (2004) Tat-calpastatin fusion proteins transduce primary rat cortical neurons but do not inhibit cellular calpain activity. Exp. Neurol. 188, 161-170. 26. Banóczi Z, Tantos A, Farkas A, Tompa P, Friedrich P, Hudecz F. Synthesis of cell-penetrating conjugates of calpain activator peptides. Bioconjug Chem. 2007 Jan-Feb;18(1):130-7. 27. Frankel, A. D. and Pablo, C. O. (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193. 28. Green, M. and Loewenstein, P. M. (1988) Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1186. 29. Joliot, A., Pernelle, C, Deagostini-Bazin, H. and Prochiantz, A. (1991) Antennapedia homeobox peptide regulats neural morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868. 30. Lindgren, M., Hällbrink, M., Prochiantz, A. and Langel, U. (2000) Cell-penetrating peptides. Trends Pharmacol Sci 21, 99-103. 31. Schwainrtz, J.J. and Zhang, S. (2000) Peptide-mediated cellular delivery, carriers for intracellular protein delivery. Curr. Opin. Mol. Ther. 2., 162-167. 32. Lindsay, M. A. (2002) Peptide-mediated cell delivery: Application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594. 33. Le Roux, I., Duharcourt, S., Volovich, M., Prochiantz, A. and Ronchi, E. (1995) Promoter-specific regulation of gene expression by an exogenously added homeodomain that pro-motes neurit growth. FEBS Lett. 368, 311-314. 34. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450. 35. Fenton, M., Bone, N. and Sinclair, A. J. (1998) The efficient and rapid import of a peptide into primary B and T lymphocytes and lymphoblastoid cell line. J. Imminol. Methods 212, 41-48. 36. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing,G. And Prochiantz, A. (1996) A cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193.
23
37. Fischer, P. M., Zhelev, N. Z., Wang, S., Melville, J. E., Fahreus, R. and Lane, D. P. (2000) Stuctureactivity relationship of truncated and substitued analogues of the intracellular delivery vector penetratin. J. Pept. Res. 55, 163-172. 38. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193. 39. Lunberg, M. and Johansson, M. (2002) Positively charged DNA binding proteins cause apparent cell membrane translocation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 367-71. 40. Richard, J. P., Melikov, K., Vives, E., Ramos, C., Verbeure, B., Gait, M. J., Chernomordik, L. V. and Lebleu, B. (2003) Cellpenetrating peptides. A reevaulation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278, 585-90. 41. Hällbrink, M., Florén, A., Elmquist, A., Pooga, M., Bartfai, T. and Langel, Ü (2001) Cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides. Biochim. Biophys. Acta 1515, 101-109. 42. Andreu, D., Albericio, F., Sole, N. A., Munson, M. C., Ferrer, M. and Barany, G. (1994) Formation of disulfide bonds in synthetic peptides and proteins. Methods Mol Biol. 35, 91-169. 43. E. Nicolás, et al. in „Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, 3rd International Symposium”, R. Epton (Ed.), Myflower Worldwide Ltd., Birmingham, 1994, pp. 619.
24
