Jiří Schindler. Mikrobiologie. Pro studenty zdravotnických oborů. 2., doplněné a přepracované vydání

ISBN 978-80-247-4771-2 Grada Publishing, a.s., U Průhonu 22, 170 00 Praha 7 tel.: +420 234 264 401, fax: +420 234 264 400 e-mail: [email protected], www.grada.cz

9 788024 747712

Jiří Schindler 2., doplněné a přepracované vydání

Mikrobiologie

Pro studenty zdravotnických oborů

Druhé, doplněné a přepracované vydání učebnice pro studenty bakalářského studia ošetřovatelství, vyšších odborných zdravotnických škol, přírodovědných oborů, pro žáky zdravotnických škol a gymnázií, asistenty hygienické služby, nutriční terapeuty. Obsah učebnice stručného rozsahu je speciálně přizpůsoben potřebám studujících, pro které je klinická mikrobiologie součástí zdravotnického vzdělání a pro které vědomosti o vybraných druzích bakterií, virů, hub a parazitických prvoků napomohou v orientaci v mikrobiologii denní zdravotnické praxe. Text je doplněn tabulkami, grafy a fotografiemi.

Jiří Schindler

Mikrobiologie Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání

Jiří Schindler

Mikrobiologie Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání

GRADA Publishing

Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno. Prof. MUDr. Jiří Schindler, DrSc. MIKROBIOLOGIE Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE: © Grada Publishing, a.s., 2014 Zdroje obrázků uvedeny v kapitole Poděkování Ostatní obrázky z archivu autora Technická kvalita některých obrázků je snížena vzhledem k množství a různé kvalitě zdrojů. Cover Photo © fotobanka allphoto, 2014 Vydala Grada Publishing, a.s. U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 5548. publikaci Odpovědná redaktorka Mgr. Ivana Podmolíková Sazba a zlom Karel Mikula Počet stran 224 + 24 stran barevné přílohy 2. vydání, Praha 2014 Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s. Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky. ISBN 978-80-247-4771-2 TIRÁŽ ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE: ISBN 978-80-247-9275-0 ve formátu PDF ISBN 978-80-247-9276-7 ve formátu EPUB

Obsah Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

1 Lékařská mikrobiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13

2 Bakteriální buňka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1 Morfologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Cytologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Růst a množení bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Růst v tekuté půdě . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Růst na pevné půdě . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Biofilm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1 Vznik a složení biofilmu . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2 Biofilm a medicína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Rezistence buněk biofilmu k antibiotikům . . . . . . 2.5 Genetika bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6 Nástroje patogenity a patogeneze bakteriálních infekcí . . . 2.6.1 Adherence, kolonizace . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.2 Tvorba toxinů, toxiny . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.3 Patogenní ostrovy v genomu . . . . . . . . . . . . . . 2.6.4 Perzistoři . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Usmrcení bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.1 Fyzikální vlivy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.2 Chemické vlivy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.8 Klasifikace bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15 15 17 23 23 25 27 27 29 31 31 34 35 37 39 41 42 44 44 45

3 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Charakteristika antibiotik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Vyšetření citlivosti bakterií k antibiotikům . . . . . . . . . 3.3 Mechanizmus účinku antibiotik . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Rezistence bakterií k antibiotikům . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 Přirozená rezistence bakterií . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Rozložení rezistence v populaci bakterií . . . . . . . 3.4.3 Přenos rezistence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.4 Rezistence změnou cílové struktury mutací . . . . . 3.4.5 Enzymatická inaktivace antibiotik . . . . . . . . . . 3.5 Multirezistence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47 47 50 52 54 54 54 55 56 57 58 5

3.6 Problémové druhy bakterií z hlediska rezistence . . . . . . 3.6.1 Dynamika rezistence . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.2 Surveillance a monitorování rezistence . . . . . . . . 3.7 Budoucnost antimikrobní terapie . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.1 Nové látky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.2 Nové cílové struktury . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8 Omezování rezistence, racionální antibiotická politika . . .

59 59 61 62 63 63 63

4 Speciální bakteriologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1 Pyogenní koky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.1 Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.2 Staphylococcus epidermidis . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.3 Streptokoky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.4 Streptococcus pyogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.5 Streptococcus agalactiae . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.6 Streptococcus pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.7 Ostatní streptokoky a „viridující streptokoky” . . . 4.1.8 Enterokoky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.9 Neisserie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Enterobacteriaceae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.1 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2 Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.3 Enterobacter cloacae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.4 Serratia marcescens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.5 Proteus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.6 Yersinia enterocolitica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.7 Salmonely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.8 Shigelly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.9 Vibria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Hemofily a bordetely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 Haemophilus influenzae . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis . . . . 4.4 Legionella pneumophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Gramnegativní nefermentující aerobní tyčky . . . . . . . . 4.5.1 Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.2 Burkholderia cepacia a Stenotrophomonas maltophilia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Mikroaerofilní pohyblivé prohnuté tyčky . . . . . . . . . . 4.6.1 Campylobacter jejuni . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65 66 66 69 69 70 71 71 73 74 74 75 77 78 79 79 79 80 80 81 82 83 83 84 84 85 85

6

86 86 86

4.6.2 Helicobacter pylori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 4.7 Spirochety . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.7.1 Treponema pallidum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.7.2 Borrelia burgdorferi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 4.7.3 Leptospira interrogans . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 4.8 Rickettsia prowazekii a Coxiella burneti . . . . . . . . . . . 92 4.9 Chlamydie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 4.9.1 Chlamydia trachomatis . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 4.9.2 Chlamydia psittaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.9.3 Chlamydia pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.10 Anaerobní bakterie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 4.10.1 Anaerobní koky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.10.2 Gramnegativní anaerobní tyčky . . . . . . . . . . . . 95 4.10.3 Grampozitivní anaerobní tyčky . . . . . . . . . . . . 96 4.10.4 Actinomyces israeli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 4.10.5 Klostridia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 4.10.6 Clostridium tetani . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 4.10.7 Clostridium botulinum . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 4.10.8 Clostridium perfringens . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 4.10.9 Clostridium difficile . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 4.11 Grampozitivní tyčky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 4.11.1 Corynebacterium diphtheriae . . . . . . . . . . . . . 101 4.11.2 Corynebacterium jeikeium . . . . . . . . . . . . . . 102 4.11.3 Listeria monocytogenes . . . . . . . . . . . . . . . . 103 4.11.4 Nocardia asteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 4.11.5 Bacillus anthracis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 4.12 Mykobakterie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 4.12.1 Mycobacterium tuberculosis . . . . . . . . . . . . . 107 4.12.2 Mycobacterium avium complex . . . . . . . . . . . . 110 4.12.3 Mycobacterium kansasii . . . . . . . . . . . . . . . . 110 4.13 Bakterie bez buněčné stěny, mykoplazmata . . . . . . . . . 110 4.13.1 Mycoplasma pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . 112

5 Normální flóra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 5.1 Význam mikrobní flóry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 5.2 Kolonizace povrchu těla a sliznic . . . . . . . . . . . . . . . 114 6 Biologie virů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 6.1 Klasifikace virů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 6.2 Struktura virů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 7

6.2.1 Symetrie virionu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 Replikace virů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 Adsorpce viru . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2 Penetrace viru . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3 Odstranění obalu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.4 Aktivace genomu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.5 Syntéza viru a uvolnění . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.6 Efektivita virové replikace . . . . . . . . . . . . . . 6.3.7 Cytopatogenní efekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.8 Výsledek infekce buňky . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4 Patogeneze a rozvoj virové infekce . . . . . . . . . . . . . . 6.4.1 Brána vstupu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.2 Primární pomnožení . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.3 Šíření k cílové tkáni či orgánu . . . . . . . . . . . . 6.4.4 Sekundární pomnožení . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.5 Vyloučení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5 Pomnožování virů v laboratoři . . . . . . . . . . . . . . . .

118 120 121 121 122 122 124 124 125 126 127 127 127 128 128 128 128

7 Speciální virologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1 Adenoviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 Herpesviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.1 Herpesvirus hominis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.2 Varicella zoster virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.3 Virus Epsteina-Barrové . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.4 Cytomegalovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.5 HHV 6 – HHV 7 (Roseolovirus) . . . . . . . . . . . 7.3 Poxviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3.1 Virus varioly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3.2 Virus vakcinie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3.3 Virus Molluscum contagiosum . . . . . . . . . . . . 7.4 Papovaviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4.1 Papilomaviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4.2 Polyomaviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5 Pikornaviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5.1 Enteroviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5.2 Poliovirus hominis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5.3 Coxsackie viry (C-viry) . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5.4 Echoviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5.5 Rinoviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

130 130 131 131 132 133 134 135 135 135 136 137 137 137 138 139 139 140 141 142 142

8

7.5.6 Virus hepatitidy A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.6 Ortomyxoviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.6.1 Myxovirus influenzae . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.7 Paramyxoviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.7.1 Viry parainfluenzy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.7.2  Respirační syncytiální virus . . . . . . . . . . . . . 7.7.3 Virus spalniček . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.7.4 Virus příušnic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.8 Rubivirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.9 Virus vztekliny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.10 Arboviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.10.1 Virus klíšťové encefalitidy . . . . . . . . . . . . . . 7.10.2 Virus žluté zimnice . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.10.3 Virus západodonilské encefalitidy . . . . . . . . . . 7.11 Arena viry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.12 Viroví původci zánětu jater . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.12.1 Virus hepatitidy B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.12.2 Virus hepatitidy C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.12.3 Virus hepatitidy D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.12.4 Virus hepatitidy E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.13 Rotaviry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.14 Caliciviry, astroviry, koronaviry . . . . . . . . . . . . . . . 7.15 HIV, lidský virus ztráty imunity . . . . . . . . . . . . . . . 7.16 Infekční jednotky podobné virům . . . . . . . . . . . . . . 7.17 Imunizace proti virovým onemocněním, virové vakcíny 7.17.1 Vlastnosti vakcíny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.17.2 Inaktivované vakcíny . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.17.3 Živé vakcíny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.17.4 Rekombinantní vakcíny . . . . . . . . . . . . . . . . 7.17.5 Vakcíny v praxi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.18 Chemoterapie virových infekcí . . . . . . . . . . . . . . . .

143 143 143 148 149 149 149 149 150 150 151 152 153 153 153 154 154 155 155 155 156 157 158 160 161 161 161 162 162 163 163

8 Houby (Fungi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1 Rod Candida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2 Cryptococcus neoformans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3 Rod Aspergillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4 Pneumocystis jiroveci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5 Původci systémových endemických mykóz . . . . . . . . . 8.6 Původci dermatomykóz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

166 166 168 168 169 169 170 9

9 Prvoci (Protozoa) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.1 Trichomonas vaginalis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2 Cryptosporidium parvum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3 Entamoeba histolytica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4 Giardia lamblia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.5 Jiná parazitická protozoa menšího významu . . . . . . . .

171 171 172 173 174 175

10 Klinická mikrobiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.1 Infekce horních cest dýchacích . . . . . . . . . . . . . . . . 10.1.1 Pneumonie v komunitě . . . . . . . . . . . . . . . . 10.1.2 Nozokomiální pneumonie . . . . . . . . . . . . . . 10.1.3 Bronchitida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2 Sepse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2.1 Zdroj nozokomiální sepse . . . . . . . . . . . . . . 10.2.2 Mikrobiologické vyšetření . . . . . . . . . . . . . . 10.3 Endokarditida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4 Močové infekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4.1 Uretritida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4.2 Cystitida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4.3 Pyelonefritida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4.4 Prostatitida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4.5 Mikrobiologické vyšetření moči . . . . . . . . . . . 10.5 Sexuálně přenosné infekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.6 Průjmová onemocnění . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.7 Infekce ran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.8 Nemocniční infekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

176 177 177 178 178 179 180 181 182 183 184 184 185 185 185 186 188 190 191

11 Principy diagnostiky infekčních chorob . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1 Odběr materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Mikroskopické vyšetření vzorku . . . . . . . . . . . . . . . 11.3 Kultivace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.4 Identifikace bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.5 Testování citlivosti k antimikrobním látkám . . . . . . . . 11.6 Sdělení výsledku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.7 Virologické vyšetření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

193 196 196 196 198 202 202 203

12 Nové a obnovené infekční nemoci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Poděkování . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 Doporučená literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

208

Rejstřík . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 10

Úvod

Úvod Lékařská mikrobiologie je mikrobiologie člověka pojednávající o původcích onemocnění i o nepatogenních mikrobech v těle a v jeho bezprostředním okolí. Tato stručná učebnice lékařské mikrobiologie je zaměřena na studenty zdravotnických oborů, především na studentky a studenty bakalářského oboru všeobecná sestra. Výběr, rozsah a hloubka látky vycházely ze zkušenosti s výukou na tomto stupni a z realisticky pochopených potřeb v praxi. Hlavní snahou je, aby studenti poznali obecné souvislosti existence mikrobů a jejich vztahu k člověku. Cílem není memorování látky, ale její pochopení. Znalosti lékařské mikrobiologie jsou pro zvolený obor studia nástrojem a prostředkem orientace, jejich samostatné používání je však určeno lékařům. Všichni studenti přicházející do prvního studijního kontaktu s lékařskou mikrobiologií si stěžují na obtížnost systematiky a množství jmen mikrobů, jež mají znát. Jejich stesky lze samozřejmě chápat. Z množství mikrobů byly proto v kapitolách speciální mikrobiologie, virologie, mykologie a parazitologie vybrány druhy, s nimiž se v povolání častěji setkají, nebo které znamenají ohrožení života pacienta. To je však vše, čím lze studium lékařské mikrobiologie ulehčit. Některé druhy mikrobů jsou probírány kvůli hrozbě bioterorizmu, jiné pro možnost epidemického šíření. Jména některých druhů mikrobů jsou uváděna pro seznámení a jako připomínka při případném výskytu v praxi. Kaž­dopádně je hlavním cílem studia vědět „Jak?“ a „Proč?“. Problém výuky virologie u studentů zdravotnických oborů spočívá kromě jiného v tom, že viry pouhým okem nebo jednoduchým mikroskopem „nejsou vidět“. Druhy probíraných virů jsou vybrány podle závažnosti onemocnění, podle praktické potřeby studentů, zejména všeobecných sester, a podle epidemiologické naléhavosti. Objem informací o virech může pro studenty zdravotnických oborů působit někde nepřiměřeně, je však potřebné poukázat na rozmanitost a komplikovanost ustrojení virů, a zdůraznit tak biomedicínský význam virových infekcí. Je na učiteli, aby své požadavky přizpůsobil svému pedagogickému záměru. Vydavatelé se snažili umožnit prezentaci co nejvíce obrazového materiálu z archivu autora, případně elektronoptických snímků autorů 11

Mikrobiologie z významných světových pracovišť. Z technických a ekonomických důvodů však všechny kapitoly nemohly být názorně doplněny dostatečným počtem obrázků, a proto i počet barevných verzí obrázků byl omezen. Je opět na pedagogovi, který je hlavním mediátorem výuky, aby v přednáškách a praktických cvičeních potřebné doplnil.

12

Lékařská mikrobiologie

1

Lékařská mikrobiologie

Mikroorganizmy, které žijí v lidském těle, nejsou výhradně škodlivé. Člověk je s některými (převážně bakteriemi) ve vzájemném pozitivním vztahu. Člověk – hostitel – zajišťuje prostředí, z něhož bakterie těží živiny, a jejich metabolity jsou mu prospěšné. Příkladem je Escherichia coli v tlustém střevě, která obstarává menachinon – vitamin K, jenž je zpracováván v játrech při syntéze protrombinu, který má význam pro srážlivost krve. Určité druhy bakterií, virů, hub i prvoků jsou přítomny na sliznicích a na kůži, aniž by vyvolávaly onemocnění. Jsou to organizmy nepatogenní. Vztah člověka jako hostitele a mikrobů je vztahem dynamickým, při němž se mění kvalita i kvantita mikrobů a současně s nimi i reakce organizmu hostitele. Lékařská mikrobiologie se zabývá jak mikroby, které jsou vysloveně patogenní, tak i takovými, které vyvolávají onemocnění jen za určitých podmínek, nejčastěji při snížení imunity hostitele. Zabývá se i mikroby v bezprostředním okolí člověka, které se na člověka přenášejí, a mikroby, které se na člověka přenášejí ze zvířat. Prvotními a nejdůležitějšími objekty jsou však mikroby patogenní. Čtyři skupiny mikrobů se vztahem k člověku jsou od sebe více či méně biologicky vzdáleny. Jejich spektrum jde od nebuněčných virů, přes jednobuněčné bakterie schopné již samostatné existence, houby – složitější organizmy s bohatou morfologií s organelami – až po parazitické jednobuněčné prvoky již podobné buňkám vyšších živočichů. Kromě popisu vlastností těchto mikroorganizmů se lékařská mikrobiologie zabývá způsobem zneškodňování původců onemocnění fyzikálními i chemickými vlivy, zejména antimikrobními látkami – antibiotiky a antivirovými látkami. Lékařská mikrobiologie se také zabývá teorií očkovacích látek a jejich přípravy. Klinická mikrobiologie se zabývá infekčními onemocněními a podmínkami výskytu nemocničních infekcí u pacientů oslabených základním onemocněním a zároveň vystavených infekci z prostředí. Do tohoto oboru patří i epidemiologie používaná jako nástroj zkoumání šíření infekčních onemocnění v nemocnicích i v komunitě mimo ně. V neposlední řadě k lékařské mikrobiologii patří i zájem o nová a znovu se vyskytující infekční onemocnění. Nejjednodušší organizmy schopné reprodukce jsou viry. Jsou živé v tom smyslu, že se replikují, nejsou však schopny samostatné existence 13

1

1

Mikrobiologie (života), protože jsou závislé na hostitelské buňce. Jsou nejmenšími infekčními agens s jedním druhem nukleové kyseliny. K replikaci používají v různé míře aparát hostitelské buňky, kterou pak většinou ničí. Jsou tedy parazity na molekulární úrovni, protože využívají makromolekuly, zejména enzymy, pro svou reprodukci. Míra tohoto využívání, tedy míra relativní autonomie, je různá. Jejich původ je předmětem teorií. Podle regresivní teorie viry vznikly únikem z hostitelské buňky. Podle teorie progresivní je základem plazmid nebo transpozon, jehož DNA byla obalena bílkovinou a získala schopnost vniknutí do buňky. RNA viry mají původ v mRNA buňky. Byly by tedy vývojově mladší než bakterie. Koevoluční teorie praví, že se viry jako biologické struktury vyvíjely nezávisle a jsou na počátku vývojové řady organizmů schopných množení. O žádné z těchto teorií nejsou důkazy a vývoj virů je zřejmě provždy tajemstvím. Bakterie jsou nejstarší organizmy na Zemi. Existuje jich něco mezi 300 000 a jedním milionem druhů, z nichž bylo nalezeno a popsáno na tři tisíce. Bakterie jsou jednobuněčné organizmy, které si mohou obstarat energii a výživu z anorganických zdrojů. Evolucí se však tato vysoká nezávislost na prostředí změnila, některé bakterie se přizpůsobovaly prostředí, ztrácely schopnost stavby těla z anorganických zdrojů, potřebovaly doplnit výživu aminokyselinami, cukry i bílkovinami, a adaptovaly se dokonce na určitého hostitele, ačkoliv mohou růst i na relativně bohaté umělé půdě. Například Streptococcus pyogenes se vyskytuje jen u člověka. Některé bakterie ztratily schopnost růstu mimo buňku a jsou obligatorními intracelulárními parazity. Jejich strategií je množit se s co nejmenším vynaložením energie, což je vedlo k parazitizmu. Paradoxně však působí skutečnost, že činnost patogenu vede k smrti hostitele, čímž však je ohrožen sám patogen, protože logicky ztrácí možnost další existence. Houby jsou mikroorganizmy s rozvětvenými vlákny – myceliem, která mají průchodné přepážky, jsou mnohojaderná a cytoplazma či nukleové kyseliny jimi procházejí. Nepravé houby jsou kvasinkovité organizmy, buď jednobuněčné, nebo tvoří mnohobuněčná vláknitá pseudomycelia. Protozoa jsou jednobuněčné eukaryotické (mají jádro) organizmy s organelami. Některé mají bičíky, jiné se pohybují pomocí pseudopodií jako améby.

14

Bakteriální buňka

2

Bakteriální buňka

V průběhu evoluce trvající miliony let se bakterie rozrůznily jak ve způsobu života, tak svým tvarem a velikostí. Jejich velikost je od 0,2 µ až po 0,75 mm, některé druhy rostou při 0 °C a jiné při 113 °C, při pH 0,06 a pH 12, při tlaku více než 1000 atm, nebo v 32% nasyceném roztoku NaCl. Vlastnosti bakterií v okolí člověka jsou dány charakterem jeho životního prostředí a vlastnostmi hostitele.

2.1 Morfologie Morfologie bakterií se studuje mikroskopickými metodami. V diagnostice se běžně používá pozorování obarvených usmrcených bakterií, v praxi kombinované Gramovo barvení. To kromě znázornění tvaru bakterií vypovídá o jejich charakteru – bakterie grampozitivní se od bakterií gramnegativních liší strukturou a jinými vlastnostmi, včetně mechanizmu infekce. Velikost nejmenšího objektu, který lze spatřit (při dané vlnové délce světla) světelným mikroskopem, je dána jeho rozlišovací schopností. Je to nejmenší vzdálenost dvou bodů (objektů), které lze jako dva body rozlišit. Užitečné zvětšení mikroskopu je takové zvětšení, jež umožní pozorovat objekt nejmenší rozlišitelné velikosti. Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu (např. 100×) a okuláru, kterým se zvětšený obraz pozoruje (např. 10×) (obr. 2.1). Konfokální mikroskop umožňuje ostře pozorovat objekt v rovině zaostření a překrýt obraz v rovinách nad a pod rovinou zaostření. Procházením rovin lze získat trojrozměrný obraz objektu. Obraz se zpracovává elektronicky pomocí vestavěného počítače. Jako zdroj světla se používá laserový paprsek, rozlišovací schopnost tohoto typu mikroskopu je proto větší než obyčejného světelného mikroskopu. Elektronový mikroskop pracuje s elektrony, které mají menší vlnovou délku, má větší rozlišovací schopnost a umožňuje vyšší zvětšení. Paprsek elektronů buď objektem (např. ultratenkým řezem bakterie) prochází, nebo se od objektu (celé bakterie) odráží. Transmisivní elektronová mikroskopie pracuje s paprskem elektronů podobně jako světelný mikroskop se světelným paprskem. Procházející elektrony se zachycují, obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat 15

2

2

Mikrobiologie

Obr. 2.1  Mikroskop starého typu dnes nepoužívaný (vlevo) a současný jednoduchý laboratorní mikroskop (vpravo). Hlavní části: A) objektiv (vpravo binokulární), B) sada objektivů na otočném měniči, C) kondenzor světla, D) zdroj světla (vlevo světlo z lampy odráží vzhůru zrcátko), E) zaostřovací šroub, F) stolek pro pozorovaný objekt detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropouštějí elektrony (jedná se např. o uranyl acetát nebo molybdenan amonný). Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu) tence potažený paprskem iontů kovu, např. platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem v místech, kam se kovové ionty nedostanou, vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz. Tvar a velikost bakterií Velikost bakterií významných pro medicínu se pohybuje v řádu tisícin milimetru (μ). Stafylokoky a streptokoky jsou kulovité bakterie o průměru přibližně 1 μ. Kulovité bakterie jsou koky, tyčky různé délky buď pravidelného, nebo nepravidelného tvaru. Tyčky mohou mít tvar kyjovitý s rozšířením na jednom pólu (korynebakteria), rohlíčkovitý (vibrio), obloučkovitě nebo esovitě zprohýbaný (kampylobakter), spirálový či spíše vývrtkový (treponema), některé s nepravidelným 16

Bakteriální buňka

Obr. 2.2  Základní morfologické tvary bakterií stoupáním závitu (borrelie) (obr. 2.2). Některé tyčky se za podmínek prostředí prodlužují do vláken (např. Escherichia coli v moči, legionely). Bakterie mohou být vyduté sporou uvnitř cytoplazmy, uprostřed (centrálně), nebo na konci těla (subterminálně, terminálně). Aerobní sporulující bakterie jsou bacily, anaerobní klostridia (vypadají jako vřeteno – closter).

2.2 Cytologie Navenek je bakterie ohraničena cytoplazmatickou membránou, tuhou a pevnou buněčnou stěnou, u grampozitivních bakterií silnější, u gramnegativních tenčí, které ještě mají na sobě složitou vnější membránu. S okolním prostředím se bakterie stýkají strukturami důležitými pro přilnutí buňky hostitele, pro pohyb, pro přenos genetické informace na jiné bakterie i jako čidla stavu vnějšího prostředí. Bakteriální chromozom je tvořen jedinou molekulou dvouvláknové DNA, která je do sebe uzavřena. Vzhledem k délce buňky je velmi dlouhá, u E. coli měří 1 mm (obr. P1). Dvoušroubovice DNA 17

2

2

Mikrobiologie *

je dalším stočením zavinuta do nepravidelné struktury a pak svinuta do klubka. Aby klubko drželo pohromadě, je zpevňováno třemi bílkovinami. (Tento útvar se nazývá nukleoid, protože neobsahuje jen DNA, ale v malém množství i RNA a podobně jako jádro eukaryot i bílkovinu [přípona -oid naznačuje, že jde o podobnost jádru]) Chromozom nese geny a jejich soubor se označuje jako genom. Nejmenší bakteriální chromozom se skládá z 600 kilobází (kB), největší má 10 000 kB. Chromozom E. coli má asi 4500 kB a obsahuje na 4405 genů. Chromozom E. coli je dlouhý asi 1400 µ a při šetrném lyzování buňky je dobře patrna rozvinutá struktura. DNA určuje přímo trans­ kripci – přepis či okopírování určitého úseku DNA na mRNA. Na ribozomech probíhá podle kódu na mRNA translace, což je řetězení aminokyselin do peptidového (bílkovinného) řetězce. Aminokyseliny přivádí na ribozom, kde je již navázána mRNA, přenosová či transferová molekula ribonukleové kyseliny – tRNA. Každá tRNA je pro danou aminokyselinu specifická a přináší jenom ji. Výběr se řídí podle kódu, který na aktuálním úseku mRNA přečte. Tak geny řídí syntézu bílkoviny, kterou určují. Cytoplazma nemá endoplazmatické retikulum. Obsahuje ribozomy, jež jsou nástrojem proteosyntézy (obr. 2.3). Skládají se ze dvou podjednotek, jsou asi 10–20 nm velké, v buňce jich je několik tisíc. Při sestavování molekul bílkovin jsou jakoby navlečeny na mRNA, jež obsahuje informaci, kterou aminokyselinu má právě tRNA napojit na polypeptidový řetěz. Některé druhy bakterií mají v cytoplazmě inkluze, z nichž jsou nejvýznamnější volutinová granula charakterizující Corynebacterium diphtheriae. Slouží jako zásoba energie.

Obr. 2.3 Ribozom prokaryotických buněk složený ze dvou částí značených podle hmotnosti 50  S a 30 S (CDC ATB) 18

Bakteriální buňka

Obr. 2.4  Ohraničení bakteriální buňky proti prostředí (CDC ATB) Cytoplazmu ohraničuje dvouvrstvá fosfolipidová cytoplazmatická membrána. Má jemnou strukturu, její povrch se elekronopticky ozřejmí speciální technikou odlomení. Obsahuje enzymy permeázy, které selektivně transportují látky, tj. živiny dovnitř, katabolity ven z buňky. Jsou na ní též enzymy, které syntetizují buněčnou stěnu. Cytoplazmatická membrána naléhá na tuhou buněčnou stěnu, která určuje tvar bakteriální buňky a chrání ji mechanicky zvnějšku. Zevnitř odolává osmotickému tlaku (obr. 2.4). Když se buňka zbaví stěny, praskne. Pokud na buňku grampozitivní bakterie působí enzymem lysozymem, musí se vyrovnat vnější osmotický tlak sacharózou a z buňky se stane kulovitý protoplast. Buněčná stěna je pevná, silná kolem 20 nm, propouští molekuly menší než 1 nm. Je složena z řetězových makromolekul peptidoglykanu (murein nebo glykopeptid) síťovitě pospojovaných oligopeptidy. Tato struktura způsobuje její pevnost, tuhost a určitou omezenou elasticitu. Je silnější u grampozitivů, které obsahují ještě významnou kyselinu teichoovou. Buněčnou stěnu syntetizují enzymy transpeptidázy, které mohou také na sebe vázat penicilin (PBP – penicillin binding proteins) a tím být inaktivovány. Gramnegativní buňky mají ještě vnější membránu. Je hlavní permeabilní bariérou. Její strukturu lze z náhledu vidět elektronovým mikroskopem. Propouští pasivně vodu a selektivně některé látky s malou molekulou. V membráně jsou bílkoviny – poriny, jež propouštějí látky s malou molekulou. Dvě molekuly porinů k sobě přiléhají, mezi nimi 19

2

2

Mikrobiologie je pór, otvor, kterým molekuly procházejí do periplazmového prostoru a poté cytoplazmatickou membránou do nitra buňky (obr. 2.5). Vnější membrána chrání peptidoglykan před účinkem lysozymu a je na ní vázán lipopolysacharid s výrazným biologickým účinkem. Mezi ní a buněčnou stěnou je periplazmový prostor, v němž jsou enzymy, které mají rozličnou funkci: transport, štěpení a pohyb. Jsou tu i β-laktamázy, enzymy inaktivující penicilin a jemu příbuzné β-laktamy. Grampozitivní bakterie tento prostor nemají a enzymy vylučují do prostředí, kde štěpí makromolekulární látky, např. bílkoviny. Štěpy o menší molekule se pak snadněji dostanou do buňky. Na povrchu některých bakterií je dobře patrné pouzdro až 1 µ silné, které do určité míry chrání buňku před nepříznivými vlivy prostředí a zabraňuje fagocytóze – pohlcení leukocyty. Je většinou polysacharidové povahy (Streptococcus pneumoniae), někdy polypeptidové (Bacillus anthracis) či velmi tenké z kyseliny hyaluronové (Streptococcus pyogenes). Pouzdro, např. u pneumokoků, má specifickou antigenicitu, takže protilátky proti pneumokoku jednoho antigenního typu nechrání před infekcí jinými typy. Očkovací látka proti pneumokokovým infekcím proto musí obsahovat směs antigenních typů nejčastěji vyvolávajících infekce. Pneumokokové kmeny se typizují pomocí antisér proti jednotlivým typům. Specifické antisérum způsobí zbobtnání pouzdra, jež se pozoruje v mikroskopu. Polymerní hmota na povrchu bakterie je glykokalyx, produkovaná za určitých podmínek. Může to být pouzdro nebo neorganizovaná hlenová vrstva. Je nástrojem tvorby biofilmu, protože zajišťuje přilnutí na pevný povrch – na sliznici,

Obr. 2.5 Stavební součásti buněčné stěny a vnější membrány (CDC ATB) 20

Bakteriální buňka

Obr. 2.6  Dlouhé bičíky E. coli neporušené preparací zubní sklovinu, implantát. Oba pojmy, pouzdro a glykokalyx, se proto významově oddělují. Bičíky jsou silné kolem 20 nm, tedy asi padesátkrát tenčí než šířka bakterie. Jsou křehké a snadno se odlamují (obr. 2.6). Běžným barvením nejsou vidět. V optickém mikroskopu je lze spatřit až po speciálním barvení, např. po impregnaci stříbrem. Bičík může být na pólu buňky jen jeden, nebo jich je více uspořádaných jako koňský ohon. Bičíky mohou pokrývat celé tělo bakterie (u salmonel, Escherichia coli nebo některých bacilů). Elektronová mikroskopie umožnila poznat strukturu bičíku a mechaniku pohonu buňky. Bičík je složen z bílkovinných stavebních jednotek šroubovitě na sebe naskládaných. Vlákno bičíku se nehýbe jako bič, ale pohybuje se šroubovitou rotací po celé délce, je poháněno složitou bílkovinnou turbínou, již do pohybu uvádí proud protonů. Vnější vláknitá část bičíku je vsazena do duté ohnuté spojky, která může převádět rotační pohyb ve své ose. Spojka sedí na vnější membráně buňky a spojuje vlákno bičíku s motorem, který bičíkem pohybuje (obr. P2). Motor je složen ze šesti částí. Je pevně usazen v periplazmovém prostoru. Funguje podobně jako elektromotor, ale rotor roztáčí proud protonů nebo iontů sodíku procházejících do buňky. Točivý moment se přenáší na hřídel a přes ohebnou spojku na vlastní bičík. 21

2

2

Mikrobiologie

Obr. 2.7  Elektronoptický snímek E. coli s dlouhými bičíky a krátkými fimbriemi, získaný speciální řádkovací technikou Bičíky E. coli rotují ve svazku rychlostí asi 18 000 otáček za minutu a posunují bakterií o 30 µ za vteřinu. Urazí tak desetinásobek své délky stejně jako automobil jedoucí rychlostí 100 km/hod. Bičíky se točí doleva a chvílemi se směr rotace obrátí. Pohyb chemotaxí směřuje ke zdroji živin nebo od toxických látek. Bakterie, které nemají bičíky, se mohou pohybovat jinými způsoby, např. klouzáním a trhavými pohyby těla. Povrch buněk některých bakterií je pokryt kartáčkovitými výběžky – fimbriemi, jež vypadají jako chloupky, a proto se označují termínem pili (obr. 2.7). Jsou také složeny z bílkovin ve šroubovicovém uspořádání. Mají několikerou funkci: adherují na povrch sliznice, zakládají biofilm i na pevné neživé podložce. Fimbrií je několik typů. Fimbrie typu 1 na povrchu enterobakterií se vážou na glykoproteinové receptory buněk sliznice. Fimbrie typu 4 adherují i na bakterie, jsou relativně dlouhé, mohou smrštit a přitáhnout si buňku, na kterou se navázaly. Jsou to fimbrie sex-specifické, přítomné jen na samčích buňkách enterobakterií, a jsou nástrojem konjugace a přenosu DNA na jinou buňku. Spory jsou klidové formy, které tvoří některé vegetativní bakterie při nepříznivých podmínkách, jako je vysušení, hladovění, vysoká teplota. Sporami si buňka zachovává život i při těchto podmínkách, ačkoliv má všechny životní funkce zastavené (obr. 2.8, 2.9). Spory jsou rezistentní k vysoké teplotě (100 °C), organickým rozpouštědlům a dezinfekčním látkám, iradiaci, kyselinám. Ačkoliv mají zastavený metabolizmus, reagují na restituci podmínek, které umožňují život původní vegetativní buňce, a klíčí – germinují. Mají složitou strukturu, uvnitř 22

Bakteriální buňka

Obr. 2.9 Spory uvnitř buňky. Obr. 2.8  Umístění spor uvnitř ty- Elektronoptický snímek řezu buňčinkovitých buněk Bacillus cereus kami Bacillus anthracis je dřeň obklopená vnitřní membránou, kůrou, obalem a vnějším exosporiem. Spory tvoří aerobní grampozitivní bakterie rodu Bacillus (Bacillus anthracis) a anaerobní rodu Clostridium (Clostridium tetani). Tělo buňky se většinou sporami vydouvá. Ničí se autoklavací – vystavení teplotě 120 °C po dobu 20 minut.

2.3

Růst a množení bakterií

Růst jedné individuální bakteriální buňky, to znamená zvětšování jejího objemu, syntézu makromolekul a vedlejších metabolitů až do momentu, kdy je růst dokončen, nelze sledovat (a pro praxi nemá velký význam). Před ukončením růstu se bakterie rozdělí, obě buňky, teoreticky rovnocenné, pokračují v růstu a cyklus se opakuje.

2.3.1

Růst v tekuté půdě

Velikost populace bakterií živých i mrtvých lze sledovat: ■■ přímo počítáním buněk v určitém (malém) objemu mikroskopem, ■■ měřením zákalu, který např. v jednotkovém objemu kultivační půdy způsobí nejméně statisíce buněk, ■■ vážením sušiny buněk odebraných z kultivační půdy. 23

2

2

Mikrobiologie (U obou posledních metod je ovšem nutné zákal, respektive hmotnost bakterií kalibrovat na počet buněk.) Odběry a měření se mohou dít opakovaně ve zvolených časových intervalech a podle toho lze poznat průběh růstu populace bakterií, která se za laboratorních podmínek pěstování označuje jako kultura bakterií. Předpokládejme, že se jedna bakterie dostane do tekutého živného prostředí. To lze provést experimentálně v laboratoři za optimálních podmínek. Tato jedna bakterie se za určitý čas rozdělí na dvě. Ony dvě buňky se rozdělí a v médiu jsou již čtyři, ze čtyř je pak osm atd. Evidentně lze předvídat, kolik by na konec teoreticky mohlo být v dané půdě bakterií, neboť konečný počet buněk B by byl 1 × 2n. Tedy: B = B0 × 2n, kdy B0 je počet bakterií na počátku a n počet generací. Generací se rozumí zdvojení počtu buněk. Buňky se rozdělují v určitém čase, což je tzv. generační doba. Čím je generační doba kratší, tím roste populace rychleji. Platí, že za optimálních podmínek je generační doba E. coli 20 minut, generační doba Mycobacterium tuberculosis je při kultivaci v laboratoři 36 hodin. Rychlost množení c je dána počtem generací za jednotku časovou t, např. za hodinu: c = n/t Zaznamenáváme-li počet buněk po naočkování do tekuté půdy v čase, získáme typickou růstovou křivku, z níž jsou zřejmé fáze množení. Po naočkování se buňky adaptují na nové podmínky a metabolizmus se z klidové fáze přepíná na aktivní. Tato fáze, kdy buněk nepřibývá, je lag fáze. Pomalu a nesynchronně se buňky začínají dělit, křivka se ohýbá a přechází do fáze vyrovnaného růstu s konstantní maximální rychlostí množení, kdy se všechny buňky dělí stejným tempem a bílkoviny i nukleové kyseliny se syntetizují stejnou rychlostí. Počet buněk roste exponenciálně, proto se tento interval označuje jako exponenciální fáze (obr. 2.10). Lineární průběh je zřejmý po vynesení logaritmu počtu buněk v čase (odtud někdy používané označení logaritmická fáze). Rychlost množení se pozvolna snižuje a po fázi zpomalení se populace dostává do stacionární fáze, kdy buněk nepřibývá, ani 24

Bakteriální buňka

Obr. 2.10  Základní fáze růstové křivky bakterií neubývá. Po další době začne živých buněk ubývat a populace je ve fázi hynutí. Proč kultura přechází do stacionární fáze, když prokazatelně nejsou vyčerpány živiny, není zcela vysvětleno (jistě mohou být vyčerpány limitní živiny a nahromaďují se toxické metabolity). V optimální tekuté půdě (živném bujonu) se za 18 hodin namnoží modelová bakterie E. coli při teplotě 35 °C do koncentrace 109 buněk/ml. Při pohledu je původně čirá kultivační půda ve zkumavce mléčně zakalená, je slabě průsvitná a neprůhledná. Takto rostou nepříliš náročné střevní bakterie, pseudomonády, stafylokoky.

2.3.2 Růst na pevné půdě Bakterie se pěstují na živných půdách v kulatých skleněných nebo plastových miskách. Rostou v kupkách, kterým se výstižně říká kolonie, neboť osídlují určité území. Zpočátku se bakterie pěstovaly v přirozených tekutých půdách i v těch umělých, jako je masový bujon, ovšem nebylo možno od sebe oddělit bakterie různých druhů. To umožnily až agarové půdy. 25

2

2

Mikrobiologie Jednotlivé druhy bakterií rostou v oddělených koloniích, a lze je tak získat v čisté kultuře. Kolonie bakterií mají rozmanitou velikost, tvar, konzistenci, zbarvení, mají lesklý nebo hrubý povrch, různě se ohraničují od podložky, na níž rostou. Kolonie některých bakterií jsou typicky zbarveny pigmentem, u jiných barvivo difunduje také do půdy a zabarvuje ji, některé fluoreskují nebo svítí (obr. P3, P4). Bakterie z domény lékařské mikrobiologie vyrůstají převážnou většinou za 18 až 48 hodin v koloniích. Mladé kolonie jsou konvexní útvary, hladkého či drsného povrchu, většinou pravidelného tvaru. Kolonie aktinomycet, klostridií a bacilů tvoří bizarní rozvětvené útvary složené ze sektorů nepravidelné struktury s laločnatými okraji (obr. 2.11). Tak dorůstají i kolonie, které za 24 hodin byly zcela pravidelné. Kolonie modelové bakterie Escherichia coli jsou po 24 hodinách za optimálních laboratorních podmínek pravidelné, okraj je tvořen různě dlouhými buňkami, často v tenkých provazcích (obr. P5). Po několikadenní kultivaci, také vlivem lokálního vyčerpání živin, mají i kolonie Escherichia coli a ostatních gramnegativních tyček rozsochatou strukturu, jako je pravidlem u bacilů. Pravidelný okrouhlý tvar kolonie je více méně artefaktem krátké kultivace v nadbytku živin, který se bakteriím nabízí v laboratoři (obr. 2.12, P6). Obr. 2.11 Stromovitá struktura vyvinuté kolonie Bacillus pumilus po 7 dnech

Obr. 2.12  Kolonie Streptococcus mitis, která má na okraji dceřiné kolonie, z nichž se pak šíří do okolí opět pomocí dceřiných kolonií. Tento způsob není běžný 26

Bakteriální buňka Růst kolonie Množením buněk se populace prostorově zhušťuje a buňky na okraji se vytlačují do volné plochy. Pohyblivé bakterie putují po agarové půdě z periferie a plazivým růstem se šíří koncentricky ve vlnách. Například bakterie rodu Proteus přerůstají všechny bakterie izolované ze vzorku od pacienta, a proto je nutno jeho šíření po agaru zabránit. Dociluje se toho jednoduše použitím kultivační půdy s vyšším obsahem agaru. Taková půda je tužší a ostatní bakterie lze pak dobře izolovat.

2.4 Biofilm Biofilm je společenství mikrobiálních buněk nevratně přichycených k podložce nebo k okolním buňkám, usazeným v polymerní mimobuněčné hmotě, kterou samy produkují, jež mají změněný fenotyp (růstové vlastnosti). Biofilmem není povlak bakterií nebo plochá kolonie, pokud nemají tyto bakterie změněný fenotyp.

2.4.1

Vznik a složení biofilmu

Volně plovoucí planktonické buňky se přichycují na pevný povrch pomocí adhezinů. Po přichycení změní své chování a fenotyp. Produkují velké množství lepivého polysacharidu podobného škrobu (obr. P7). Vytváří se z něj hlenová matrice, která drží buňky pohromadě a funguje jako voštinové lešení (obr. 2.13), v němž se buňky množí, tvoří se mikrokolonie a spleť kanálků (obr. 2.14, 2.15). Z biofilmu se ale na určitý impulz také buňky odlučují, přecházejí do planktonického stavu, odplouvají a kolonizují další části povrchu.

Obr. 2.13 Systém kanálků v biofilmu 27

2

2

Mikrobiologie

Obr. 2.14  Mikroskopický řez biofilmem. Kanálkem v hmotě biofilmu proudí tekutina s rozpuštěnými živinami

Obr. 2.15 Voštinová struktura polymerní matrice bio­filmu nesoucí uvnitř stafylokoky. Tenká vlákna polysacharidu glykokalyxu lepí buňky k sobě navzájem a ke stěnám voštinového lešení Biofilm lze zobrazovat konfokálním laserovým mikroskopem v optických řezech a z nich složit prostorovou strukturu. Lze pořídit i animovaný záznam dějů v biofilmu. Podle dostupnosti živin kolísá tloušťka biofilmu od několika µ do stovky µ. Biofilm není homogenní, skládá se ze shluků buněk a četných dutin propojených kanálky. Bakterie v něm rostou v mikrokoloniích. 28

Bakteriální buňka Polymerní matrice vytváří voštinovou strukturu, v níž jsou buňky přichyceny. Zhruba šestistěnné komůrky voštiny mají stěnu tlustou 150 nm.

2.4.2 Biofilm a medicína Tvorba biofilmu a zejména změna vlastností buněk má pro patogenezi některých infekčních onemocnění rozhodující význam. Nejdéle známý biofilm v lidském těle je povlak na zubní sklovině – zubní plak. Je fyziologický, vzniká přirozeně. Lze ho sice odstranit, ale vždy se tvoří znovu. Biofilmem kolonizují sliznice nepatogenní i patogenní bakterie. Biofilm hraje významnou roli v infekcích, kdy se patogenní bakterie usadí na sliznici nebo uvnitř tkáně. Typickým případem je bakteriální endokarditida, srdeční zánět. Na chlopních se vytváří biofilm a za účasti fibrinu vzniknou vegetace. Endokarditida je způsobena převážně koky – streptokoky různého druhu, nebo stafylokoky. Toto onemocnění se velmi těžko léčí. Respirační choroba cystická fibróza je genetické onemocnění, při němž jsou pozměněny poměry v dolních cestách dýchacích. K primárním respiračním infekcím se přidávají chronické nebo opakující se infekce. Mají za následek ucpávání průdušek a trvalé poškození jejich epitelu. Na poškozeném terénu se později biofilmem usadí Pseudomonas aeruginosa a jemu podobné druhy. Biofilm se vyskytuje i při chronickém zánětu prostaty. Bakterie pronikají do prostaty proti proudu moči, z akutní prostatitidy se vyvine chronická, kterou biofilm zprvu jen komplikuje, později je i její příčinou. Častá jsou infekční onemocnění v dutině ústní. Při periodontitidě vzniká v kapsách pod dásní polymikrobní biofilm, do něhož neproniká kyslík. Nahromaděná bakteriální hmota, odumřelé buňky tkáně a hnisavé buňky situaci zhoršují, neboť redukující prostředí napomáhá pomnožení anaerobních bakterií. Biofilm se vytváří také na špatně vyživované kůži a podkoží při bércových vředech a účastní se tak bludného kruhu – chabého krevního zásobení, nekrózy a působení bakterií. Biofilm se vytváří i na povrchu popálených ploch. Systematické chirurgické ošetřování eliminuje nebezpečí z tvorby biofilmu a ohrožení života jen kvůli infekci popálenin je minimalizováno. Cizí tělesa – cévky, náhrady Bakterie mají tendenci vytvořit biofilm na pomůckách zavedených do tělních dutin a tkání (obr. 2.16, 2.17). Při asistovaném dýchání se 29

2

2

Mikrobiologie

Obr. 2.16  Adherující stafylokoky vytvářejí na povrchu katétru bohatou slizovou hmotu

Obr. 2.17  Stafylokoky adherují navzájem na povrch katétru biofilm tvoří na stěně trubic. Při nedostatečném dohledu a ošetřování mohou bakterie proniknout i do průdušek a do plic. Na kontaktních čočkách se při nesprávném používání usazuje většinou Pseudomonas aeruginosa. V močových katétrech se rychle usazují bakterie z dolní části močové trubice. Usazují se také v delší dobu zavedených žilních a arteriálních katétrech. Mají endogenní i exogenní původ a závisí také na kvalitě katétru. Koky se mohou usadit také na protézách srdeční chlopně a mohou poškodit stehy, kterými je přichycena. Je-li biofilm objemný, mohou se jeho části utrhnout. Biofilm bakterií i kvasinkovitých mikrobů na nekontrolovaném nitroděložním tělísku byl příčinou 30

Bakteriální buňka mnoha zánětů v dutině pánve a sepsí. Bakterie tvoří biofilm i v místech, kde je cizí těleso od zevního prostředí zcela izolováno, třeba na kovových náhradách kloubů. Biofilm tvoří nejčastěji stafylokoky, pseudomonády, Escherichia coli, někdy streptokoky a aktinomycety. Dosud není známa metoda, kterou by se tvořený nebo vytvořený biofilm odstranil.

2.4.3 Rezistence buněk biofilmu k antibiotikům Buňky v biofilmu jsou vysoce rezistentní k antimikrobním látkám a dezinficienciím. Jsou až tisíckrát více rezistentní než buňky planktonické. V lékařské praxi to znamená, že k léčbě nestačí ani vysoké dávky antibiotik. Odolnost je vyjádřena fenotypově, nejde o rezistenci podmíněnou geneticky. Laboratorní vyšetření citlivosti k antibiotikům, prováděné v kultivační půdě, poskytuje nesprávné výsledky. Bakterie v biofilmu jsou totiž rezistentní, avšak na rozdíl od planktonických bakterií vyšetřovaných v optimálních podmínkách se v laboratoři jeví jako citlivé. Odolné buňky, které antibiotikum tolerují a zůstávají v těle, se označují obecným termínem varianty nebo perzistoři. V biofilmu se mezi buňkami přenášejí geny až tisíckrát úspěšněji než mezi buňkami žijícími planktonicky. To podporuje přenos genů rezistence v populaci. Hlenovou hmotou jsou buňky v biofilmu také fyzicky chráněny před protilátkami.

2.5

Genetika bakterií

Takzvaná genetická informace je uložena v bakteriálním chromozomu. Dělení buňky je vázáno na replikaci DNA, jež zajišťuje předání veškeré informace do potomstva. Replikace je semikonzervativní, neboť každý z obou provazců se kopíruje do svého protějšku a vzniknou dvě stejné nové molekuly, z nichž každá obsahuje polovinu té původní. Soubor genů uložených na chromozomu bakterie se označuje jako genom. Gen si lze představit jako lineární soubor nukleotidů určitým způsobem organizovaný, určuje, kóduje funkční bílkovinu nebo různé molekuly RNA. Geny se mohou koordinovaně exprimovat, tj. být aktivní ve skupině, jež se označuje jako operon, a tvořit tak jednu funkční jednotku. 31

2

2

Mikrobiologie Regulace aktivity genů je v mnohých případech velmi složitá – umožňuje buňce přežívání za kritických podmínek. Soubor zděděných vlastností charakterizujících buňku je genotyp. Genotyp se může měnit mutací, která je buď spontánní, bez vnějšího zásahu, nebo indukovaná z vnějšku. Mutace lze indukovat chemicky nebo ultrafialovým či ionizačním zářením. Spontánně vznikají např. chybnou replikací DNA. V každé populaci bakterií jsou v určité (nízké) frekvenci přítomny mutanty každé vlastnosti bakterie, které lze z populace selektovat. Například v populaci bakterií citlivé ke streptomycinu se ve frekvenci 10–8 spontánně vyskytují mutanty rezistentní ke streptomycinu. Geny nejsou jen na bakteriálním chromozomu, ale i na tzv. plazmidech. Plazmid je genetický element, množící se nezávisle na chromozomu. Je to také kruhová molekula DNA menší než chromozom. Plazmidy se vyskytují v buňce v mnoha kopiích. Některé mají schopnost se přenášet z jedné buňky do druhé. Na plazmidech jsou umístěny geny rezistence k antibiotikům, geny určující produkci toxinů, geny určující syntézu adhezinů a takzvané kolonizační faktory, jež trvaleji umožňují osídlení sliznic hostitele a jiné různé geny. Celková dávka genů bakterie a jejich kvalita může být za určitých okolností nedostatečná. Aby se mikrob s novými podmínkami vypořádal, musí je změnit. Bakterie může přežít např. přítomnost antibiotika, jen pokud získá geny rezistence. Přenos genů Geny se přenášejí i za nevynucených podmínek, zdánlivě bez zřetelného účelu. Bakteriální virus – bakteriofág – si při množení v buňce do své DNA zabuduje část její DNA (s geny) a při infekci ji pak přenese na nového hostitele, na němž se pomnoží. Tento proces se nazývá transdukce. Cizí geny může buňka získat také transformací, přenosem holé DNA z jedné buňky na recipientní. Transformaci se staví překážky: recipientní buňka vždy nemusí DNA přijmout, tj. není kompetentní. V prostředí přenosu může být DNA štěpena všudypřítomnými nukleázami. Přesto ale k transformaci dochází nejen v laboratoři, ale i za přirozených podmínek.

32

Bakteriální buňka Sexuální polarita Někdy před padesáti lety zjistil Joshua Lederberg, později odměněný Nobelovou cenou, že se geny bakterií mohou přenášet kontaktem a že tento přenos je jednosměrný. Buňky, které vlastnosti přenášejí (samčí F+), nejsou schopny je přijímat, a buňky, které přijímají (samičí F–), je nejsou schopny předávat. Geny se přenášejí do recipientní buňky po fyzickém kontaktu konjugací. Dárcovské samčí buňky – donoři – mají plazmid F+, který je přítomný v cytoplazmě. Je nezávislý na chromozomu a je za konjugaci a přenos zodpovědný. Sám může nést rozličné geny určující syntézu enzymů, rezistenci k různým látkám, k antibiotikům, anebo geny s jinými funkcemi. Celý přenos probíhá v několika fázích řízených plazmidem (obr. 2.18). Kontakt mezi buňkami obstarávají fimbrie, které jsou jen u buněk samčích. Označují se jako sex-specifické fimbrie (fimbrie IV. typu). Geny pro jejich tvorbu jsou neseny F plazmidem. Svým koncem se dotkne

Obr. 2.18  Přenos plazmidu konjugací. Menší kruh znázorňuje plazmidovou DNA dárcovské (samčí) buňky, jež se napojí pomocí sex-specifické fimbrie na recipientní buňku. Plazmidová DNA se přenese, s ní některé geny a původně recipientní buňka se stává dárcovskou 33

2

2

Mikrobiologie jednoho místa na povrchu recipientní buňky a pak se retrahuje, přitáhne si samičí buňku a obě buňky k sobě přilehnou. Fimbrie jako jehla proděraví všechny obaly recipienta, bílkoviny sekretorického systému aktivně napumpují DNA plazmidu, včetně genů, které případně nese. Je to jeden z hypotetických modelů. V recipientní buňce se dosyntetizuje chybějící řetězec DNA a totéž se stane v buňce donorové. Plazmid F také produkuje toxické bílkoviny zabíjející všechny samičí buňky v okolí. Ty by totiž rychlejším množením v dalších generacích exkonjuganty vytlačily. Plazmid může znamenat pro buňku metabolickou zátěž, a proto mohou být tyto buňky v určité nevýhodě. Někdy se plazmid integruje do chromozomu. Celý chromozom se prakticky nepřenáší, dlouhé vlákno DNA se při přechodu, který trvá několik minut, láme. Protože integrovaný F-faktor určující syntézu nezbytné F-fimbrie je na konci, jakoby postrkává DNA, už na něj nedojde. Recipientní buňka proto zůstává samičí, je F–. U grampozitivních bakterií probíhá přenos přes hranice rodů, tedy na buňky málo příbuzné. Hraje tu opět roli plazmid, který determinuje syntézu peptidu, se sex-specifickou funkcí – tzv. feromon, který působí na potenciálního donora, nesoucího plazmid. Ten determinuje tvorbu shlukovacích faktorů, které se navážou na povrch recipienta, zafixují ho a umožní fyzický kontakt nutný pro přenos. Enterokoky mají několik druhů specifických feromonů. U stafylokoků a streptokoků může konjugace probíhat bez jejich pomoci. Polarita bakterií je vzhledem k přenosu genů uskutečňovaným fyzickým kontaktem, konjugací, důležitý fenomén. Neslouží ovšem k rozmnožování, ale ke zlepšení genetické výbavy zejména v kritických situacích.

2.6

Nástroje patogenity a patogeneze bakteriálních infekcí

Patogenita je obecná schopnost bakterie způsobit infekční onemocnění. Patogenitu určuje virulence, jež je mírou patogenity pro daný živočišný druh. Patogenní bakterie nemusí být aktuálně virulentní. Virulence či její míra se stanovuje obtížně, protože ji lze měřit jen in vivo na zvířatech nebo na buněčných kulturách. Virulence je komplexní vlastnost, spočívá v invazivitě, tedy ve schopnosti proniknout do tkáně a tam se pomnožit, ve schopnosti kolonizace, to znamená osídlit sliznice hostitele, a v adherenci na buňku. Toxigenní bakterie 34

Bakteriální buňka produkují bílkovinné toxiny. Produkují také bílkoviny, jež samy toxicky nepůsobí, ale jejich kooperace hostitelskou buňku poškodí. Mezi klasickými toxiny a těmito toxiny není logický rozdíl. Toto všechno jsou složky determinující patogenitu a její míru – virulenci. Všechny faktory, včetně adhezinů, toxinů, bílkovin zasahujících metabolizmus buňky či aktivujících různé geny, se souhrnně označují jako faktory virulence. Faktorů virulence je mnoho, např. schopnost mobilizovat a vázat železo z prostředí, využít je v metabolizmu tvorby toxinů aj. Vztah bakterií a člověka závisí na tom, zda mezi hostitelem a bakterií je vytvořena rovnováha, nebo zda jeden či druhý převáží. Primární patogeny způsobují infekční onemocnění, jakmile se dostanou do styku s osobou jinak zdravou. Podmíněné patogeny nebo oportunní patogeny vyvolávají infekční metabolizmus osob oslabených nějakou základní nemocí, dlouhým pobytem v nemocnici, podvýživou, vysokým věkem. Patogenní bakterie přicházejí z okolního prostředí, z půdy, z vody nebo od hmyzu, zvířat či lidí, přenášejí se vzduchem, kontaminovanými předměty nebo kontaktem. Do těla se dostávají dýchacím traktem, trávicím traktem, spojivkami, kůží – bodnutím hmyzem, kousnutím zvířete, při porušení celistvosti kůže poraněními i zcela neviditelnými.

2.6.1 Adherence, kolonizace Patogenní mikrob se musí v organizmu hostitele uchytit. Bakterie přilnou k buňkám sliznice. Adheziny (tab. 2.1) na povrchu bakterie reagují s receptory na povrchu buněk sliznice a bakterie se na ně navážou. Na sliznici soupeří patogenní bakterie s přítomnou kolonizující normální flórou o receptory. Jako adheziny fungují různé fimbrie, zejména fimbrie typu I a typu IV. Lze zmínit také p-fimbrie, jež se vážou na buňky močového epitelu a jsou specifické pro kmeny gramnegativních bakterií, zejména E. coli, vyvolávající močové infekce, zvláště pyelonefritidu. Jsou 1 µ dlouhé a 6,5 nm tlusté, mají závitnicovou strukturu z bílkoviny. Po adhezi fungují jako spirálová pružina a rozvinou se do sedminásobné délky (obr. 2.19). Podle specificity fimbriového adhezinu vyvolávají určité kmeny E. coli buď střevní, nebo močovou infekci. Bílkovina schopná vazby na receptor eukaryotické buňky je lokalizována na špičce fimbrie. U streptokoků funguje jako adhezin kyselina teichoová a lipoteichoová ve stěně grampozitivních bakterií. Nespecificky adheruje také pouzdro nebo glykokalyx. 35

2

2

Mikrobiologie

Obr. 2.19  Adhezivní p-pilus působící jako spirálová pružina, která se rozvine do sedminásobné délky Adheziny se však nevážou na jakoukoliv buňku, jsou specifické pro určitou tkáň a/nebo živočišný druh. Specificita pro tkáň je patrná u kmenů Escherichia coli; některé adherují jen k prasečím buňkám, jiné k buňkám telecím a nikoliv lidským, jiné výhradně k buňkám lidským. Určitý typ Salmonella enterica adheruje k buňkám hovězím, nikoliv k lidským, a proto infikuje jen hovězí dobytek. Streptococcus pyogenes skupiny A, původce angíny, adheruje pouze k buňkám lidským. Lze to považovat za relativní výhodu, protože člověk se pyogenním streptokokem nemůže nakazit od zvířat. Ani Neisseria gonorrhoeae neinfikuje jiný živočišný druh kromě člověka. Jako adhezin zde funguje fimbrie typu IV. U escherichií je např. schopna poznat jednoduchou cukrovou Tab. 2.1  Nejvýznamnější adheziny Mikrob

Adhezin

Epitel

Streptococcus pyogenes

teichoová kyselina

buňky faryngu

Streptococcus salivarius teichoová kyselina

buňky ústní sliznice

Escherichia coli

fimbrie typu I, typu IV, p-fimbrie

buňky střevního, močového epitelu

Neisseria gonorrhoeae

fimbrie typu IV

buňky močového epitelu, čípku

Bordetella pertussis

fimbrie

buňky respiračního epitelu

Mycoplasma sp.

bílkovina

buňky respiračního epitelu

36

Bakteriální buňka molekulu – d-manózu. Podobně je tomu u neisserií, u Bordetella pertussis (původce dávivého kašle), vibrií nebo pseudomonád. Adheziny nemusí být organizovány, grampozitivní buňky fimbrie většinou nemají a bílkovinný adhezin pokrývá celý povrch bakteriální buňky, jako je tomu u stafylokoků, pneumokoků, streptokoků. Kolonizovány jsou tkáně spojené s vnějším prostředím, sliznice dýchacího, trávicího a močového traktu, pochvy, spojivky. Invaziny Ukotví-li se patogenní bakterie na sliznici, může ničit buňky v okolí svými cytotoxiny a jiné toxiny posílat krevním oběhem do organizmu hostitele. Invazi, průniku bakterií do organizmu, napomáhají invaziny, molekuly produkované do okolí. Enzymaticky narušují látky ve tkáních a ničí fyzickou bariéru průniku nebo porušují buňky sliznice a leukocyty, bílé krvinky, které zabraňují invazi. Pyogenní streptokoky, anae­­ robní klostridia a s menší účinností i stafylokoky produkují enzym hyaluronidázu, který rozpouští mezibuněčný tmel. Tomuto enzymu se říká faktor průniku. Podobně i jiné anaerobní mikroby štěpí pomocí kolagenázy kolagen v podkoží a ve svalech. Streptokináza nebo stafylokináza rozpouštějí fibrin a brání fixaci bakterií ve tkáních. Buňky poškozují také bakteriální enzymy, jako je lecitináza nebo fosfolipáza klostridií, které hydrolyzují součásti buněčné membrány eukaryotických buněk. Jako invaziny působí i hemolyziny nebo lekocidiny streptokoků a stafylokoků.

2.6.2 Tvorba toxinů, toxiny K poškození nebo usmrcení hostitele nemusí bakterie proniknout do krevního oběhu a do orgánů, neboť produkují toxické bílkoviny, které účinkují na dálku (tab. 2.2). Bakteriální toxiny jsou bílkoviny účinkující jako enzymy a mají specifickou aktivitu. Jejich substráty jsou určité buňky, tkáně nebo tělesné tekutiny. Podle toho se také označují – neurotoxiny poškozují funkci a stavbu nervových vláken centrálního nervstva, hemolyziny rozpouštějí červené krvinky, enterotoxiny poškozují střevní sliznice. Úzce specifické neurotoxiny jsou tetanotoxin (produkuje Clostridium tetani) a botulotoxin (produkuje Clostridium botulinum), tzv. klobásový jed. Je to jeden z nejjedovatějších bakteriálních toxinů, způsobuje paralýzu svalů. Využívá se v kosmetice, kde se aplikuje do okolí mimických obličejových svalů k odstranění vrásek. 37

2

2

Mikrobiologie Tab. 2.2  Některé toxigenní bakterie a jejich toxiny Mikrob

Toxin

Účinek

Streptococcus pyogenes

erytrogenní toxin

spálový exantém

Staphylococcus aureus

enterotoxin

střevní sliznice

toxin syndromu toxického šoku

cévy, zánět, šok

Corynebacterium diphtheriae

difterický toxin

nekróza

Clostridium tetani

tetanotoxin

spastická paralýza

Clostridium botulinum

botulotoxin

chabá paralýza

Vibrio cholerae

cholerový enterotoxin

sekrece vody a iontů

Escherichia coli

LT toxin

sekrece vody a iontů

Bacillus anthracis

antraxový toxin

hemolýza, edém

Nekrotoxiny způsobují nekrózu tkáně, např. difterický toxin produkovaný Corynebacterium diphtheriae. Způsob účinku některých toxinů způsobujících smrt hostitele, tzv. letálních toxinů, však není detailně znám, přestože cílové orgány a tkáně známy jsou. Buňky poškozují cytotoxiny. Ty z nich, které poškozují např. buňky střevní sliznice, způsobují onemocnění se závažným průběhem. S rozvojem metod molekulové biologie a experimentální genetiky se přichází na mechanizmy účinku cytotoxinů a bílkovin s diskrétním, ale významným účinkem. Molekuly většiny toxinů mají podobnou strukturu. Skládají se ze dvou podjednotek obecně označovaných A a B. Podjednotka A má enzymatickou aktivitu toxinu, který netoxická podjednotka B váže na receptory cílové buňky. Obě podjednotky se od sebe oddělí po proniknutí membránou. Geny determinující toxin jsou umístěny na chromozomu, často i na plazmidu. Z toho vyplývá, že bakterie produkuje toxin, pokud má plazmid, který příslušný gen nese. Protože toxiny jsou bílkoviny, jsou antigenní a vyvolávají tvorbu protilátek – antitoxinů. Toxin může být též detoxikován. Děje se to sice pozvolna i spontánně, zejména vlivem vyšší teploty nebo na světle UV zářením. Chemicky se působí na toxin například formolem, pepsinem. Po delší době (několika týdnech) se toxoformní skupiny molekuly 38

Bakteriální buňka změní, toxicita zmizí, zachová se však imunogenita. Tak pozměněný toxin – toxoid – se používá k očkování, např. proti záškrtu a tetanu. Onemocnění, v nichž rozhodující roli hraje toxin, jsou záškrt, tetanus, botulizmus, stafylokové otravy z potravin, spála, těžká forma úplavice, syndrom toxického šoku, antrax, dávivý kašel či posttraumatické nekrózy svalů a tkání. Bílkoviny, které bakterie vylučují na povrch nebo do prostředí, mají hlavní úlohu v interakci bakterie a hostitelské buňky. Toxiny jako bílkoviny s velkou molekulou nemohou projít oběma membránami ven z buňky spontánně. Aktivní transport z buňky zprostředkují sekreční systémy. Obecným systémem je sekreční systém II, který transportuje bílkovinu přes cytoplazmatickou membránu do prostoru periplazmy, kde odštěpí její část, která funguje jako signál k rozpoznání, a pak v druhém kroku převede produkt vnější membránou na povrch bakterie bílkovinnými kanálky. Pseudomonas aeruginosa používá tohoto systému pro toxin A, pro lipázu, elastázu, proteázu, fosfolipázu. Podobně podmíněný patogen je Burkholderia cepacia, Legionella pneumophila či Vibrio cholerae. Méně složitý je sekreční systém I, který přenáší bílkoviny oběma membránami najednou. Escherichia coli tak vylučuje svůj hemolyzin. Sekreční typ III gramnegativních bakterií injikuje toxin do eukaryotické buňky a tím buňku poškozuje nebo usmrcuje. Má typickou komplexní strukturu, z kruhových destiček vyčnívá bílkovinná trubička, kterou bakterie mikroinjekcí vpraví toxin do eukaryotické buňky. Tento komplexní systém, injektozom (obr. P8), se morfologicky a funkčně podobá bakteriálnímu bičíku. Kromě přenosu toxinů Salmonella enterica, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica, enteropatogenní Escherichia coli nebo Pseudomonas aeruginosa se sekreční systém typu III účastní stavby bičíku. Helicobacter pylori a Bordetella pertussis využívají sekreční systém typu IV, který kromě bílkovin také u jiných bakterií dopravuje DNA při přenosu chromozomu nebo plazmidu konjugací.

2.6.3 Patogenní ostrovy v genomu Je zřejmé, že patogenní bakterie mají obsáhlý látkový arzenál, jímž mohou hostitele poškodit. Mají také nástroje pro export toxických a agresivních produktů ze svého těla. Vedle patogenních toxigenních druhů existují druhy příbuzné, které se v životních projevech zásadně neliší, avšak jsou nepatogenní. Některé kmeny patogenních druhů nemusí 39

2

2

Mikrobiologie být vybaveny toxiny, a tudíž mohou být nepatogenní. Toxigenní kmen však může být na sliznici přítomen, aniž by svému hostiteli jakkoliv uškodil. Difterický toxin, používaný jednou americkou společností pro výrobu očkovací látky, byl izolován ze spojivky zdravého děvčátka. Časem začalo být nápadné, že geny určující faktory virulence jsou na chromozomu nebo na plazmidu umístěny blízko sebe. Před méně než 20 lety tak vznikl koncept ostrovů patogenity založený na skutečnosti, že v jedné oblasti genomu patogenních bakterií jsou shluknuty geny spojené s virulencí patogenů. Termín sám není v českém jazyce nijak zvlášť povedený, na první pohled nic nevysvětluje. Čím vším jsou patogenní ostrovy charakteristické? Obsahují geny kódující jeden nebo více faktorů virulence, jako jsou adheziny E. coli nebo Vibrio cholerae, toxiny Staphylococcus aureus, invaziny salmonel, shigell, listerií, kmenů Escherichia coli vyvolávajících průjmy nebo geny sekrečního systému II u enterohemoragických Escherichia coli, sekrečního typu III u průjmových escherichií, yersinií, salmonel a shigell a sekrečního typu IV Helicobacter pylori. O uspořádání genů u patogenů do ostrovů patogenity není dnes pochyb. Asi před padesáti lety bylo v této otázce jasno: několik bakteriálních druhů je patogenních pro své vysoce aktivní bílkovinné toxiny, jako je difterický toxin, botulotoxin, tetanotoxin. Mechanizmus patogenity ostatních bakterií byl neznámý. Proto se hledaly nějaké skryté nebo málo účinné toxiny podobné těmto klasickým. Ty však většinou nebyly nalezeny. Postupně byly objevovány látky, které hrají pomocnou roli při vzniku infekce, samy o sobě vlastně neškodí, ale v souhře umožňují bakterii infekci rozvinout – od kolonizace přes invazi do buňky, narušení metabolizmu až po její smrt. Geny pro všechny tyto látky jsou v těsném styku uloženy ve specifickém patogenním ostrově. U jednotlivých druhů se liší velikostí a funkcemi, které determinují. Ostrovy mají různou velikost od 20 000 bází do 200 000 bází, podle toho, kolik genů nesou. Jsou ohraničeny sekvencemi nukleotidů, které jejich přenos umožňují. Patogenní ostrov je oblast v genomu cizorodá, liší se sekvencí bází a jiným poměrem bází guaninu a cytozinu. Jestliže je to oblast, která do genomu jakoby nepatří, musí mít schopnost přenosu a integrace do jiného genomu. Nepatogenní druhy nebo příbuzní je nemají. Z toho plyne, že se patogenní ostrov dostal do původně nepatogenního druhu odjinud. Patogenní ostrov se přenáší plazmidem (také bakteriofágem nebo transpozonem), integruje se do chromozomu, ale někdy na něm již zůstává. Přenos se děje horizontálně, do genomu jiného 40

Bakteriální buňka kmene téhož nebo příbuzného druhu. V něm se integrují. Pokud jsou nějaké geny na plazmidu, jsou v buňce méně stabilní. I na chromozomu může ostrov patogenity jako element cizorodé DNA měnit svou pozici, či dokonce zmizet. Nepatogenní bakterie stejného druhu nebo druhu blízce příbuzného patogenní ostrov v genomu nemají. Také ale mohou mít oblasti DNA s odlišnou skladbou bez spojitostí s patogenitou. Označují se analogicky podle patogenních ostrovů jako ostrovy genomové a obsahují geny zajišťující metabolické funkce či přežívání v prostředí, nebo například mecA, gen pro rezistenci k oxacilinu. Termín genomový ostrov se stal obecně nadřazeným pojmem všem cizorodým oblastem DNA s vyjádřenou funkcí. Přenos oblasti DNA kódující funkce virulence je faktorem evoluce. Patogenní druhy vznikly z nepatogenních předků, nebo z druhů patogenních pro jiné živočichy, nikoliv pro člověka. Dobrým příkladem je patogenita shigell. Shigelly jsou metabolicky velmi příbuzné Escherichia coli, jejich genom je z 90 % totožný, a mohou proto být považovány za jeden druh. Shigell je pět druhů, jsou velmi podobné escherichiím, v některých případech fenotypem nerozeznatelné, takže by mohly být považovány za identický druh. Shigelly se liší tím, že nemají bičíky, jsou tudíž nepohyblivé a nemají enzym lyzindekarboxylázu. Má se za to, že shigelly vznikly z Escherichia coli horizontálním přenosem a akvizicí velkého plazmidu nesoucího geny virulence a patogenních ostrovů. Některé nepatogenní druhy nesou patogenní ostrovy a jejich geny patogenitu neuplatňují.

2.6.4 Perzistoři V infikovaném hostitelském organizmu někdy existují bakterie ve stavu, kdy se nemnoží a odolávají léčbě. Kultivují se vesměs velmi obtížně. Přetrvávají-li po prodělané nemoci, třeba úspěšně vyléčené, působí jako časovaná bomba. Tyto bakterie přetrvávající v organizmu jsou již zmínění perzistoři. Snaha o jejich odstranění je většinou marná, protože odolávají i dlouhodobé antibiotické léčbě. Mohou to být bakterie různých druhů – Mycobacterium tuberculosis nebo Pseudomonas aeruginosa z těch typických, ale i pyogenní koky. Nedávno byl nalezen obecně regulační gen, který potlačuje různé metabolické procesy, má úlohu v řízení transportu živin mebránami, syntézy bičíku a chemotaxe. Jeho mutace má za následek zvýšenou metabolickou aktivitu a změnu 41

2

2

Mikrobiologie citlivosti. Perzistenci způsobuje zesílená činnost tohoto genu. Jeho homology jsou přítomny i v genomu jiných druhů bakterií.

2.7

Usmrcení bakterií

Základním projevem života je schopnost rozmnožování. Smrt je nevratná ztráta této schopnosti. U bakterií se projeví po naočkování do tekuté půdy nebo na půdu pevnou. V tekuté půdě se nevytvoří zákal, na pevné půdě nevyrostou kolonie. Smrt mohou mikrobu přivodit různé fyzikální a chemické vlivy. Při působení letálního faktoru (fyzikálního nebo chemického) klesá počet živých buněk exponenciálně. V logaritmickém vyjádření počtu živých buněk v čase působení letálního faktoru je průběh lineární. Je nezávislý na velikosti populace, tedy na množství buněk, na něž se působí, ale absolutní počet přeživších buněk na počáteční koncentraci závisí. Působení letálních faktorů probíhá s různou rychlostí. Vyjadřuje se zlomkem usmrcené populace za jednotku časovou. Průběh je exponenciální a znázorňuje se letální křivkou (obr. 2.20). Různé faktory působí na různé cíle, tj. struktury v buňce. Tento cíl může být jeden, ale

Obr. 2.20  Letální křivka vyjadřující časový průběh usmrcení bakterií chemickými nebo fyzikálními vlivy 42

Bakteriální buňka

Obr. 2.21  Při větším množství kritických cílů vystihuje průběh vícezásahová křivka může jich být i více. Při větším množství cílů je vícezásahová křivka na počátku mírně lomená. Vyjadřuje to inaktivaci všech cílů – např. enzymů, které jsou v buňce v mnoha kopiích. Když jsou citlivé struktury inaktivovány, usmrcení probíhá (v logaritmickém vynesení) lineárně (obr. 2.21). Podle koncentrace letální látky nebo intenzity fyzikálního vlivu (energie) má křivka různý sklon – směrnici. Ta závisí také na povaze látky nebo fyzikálního vlivu. Proces praktické inaktivace mikrobů má podle účelu typická označení. Sterilizace je proces, jímž se usmrtí všechny mikroby. Dezinfekcí se odstraňují mikroby na povrchu neživých předmětů. Efekt chemické dezinfekce závisí na druhu a množství přítomných mikrobů, na koncentraci a stabilitě dezinficiencia, na teplotě, době působení, na složení a pH prostředí, zejména na přítomnosti organických látek (bílkoviny, hnis). V principu podobně je definována antisepse, antiseptika však nemají škodlivý vliv na tkáně, a proto se používají v medicínské, zejména chirurgické praxi. Asepse je lékařský postup, kdy jsou mikroby, zejména patogenní, odstraněny, nebo je jim zamezen přístup např. do operačního pole. Z hlediska mikrobiologického se neliší od dezinfekce či antisepse. Antimikrobně působí také konzervační látky používané v potravinářství, antibiotika, biocidní látky v toaletních mýdlech 43

2

2

Mikrobiologie a čisticích prostředcích pro domácnost, kde jsou zbytečné a navíc k nim vzniká rezistence, jež zasahuje i antibiotika. Antimikrobně působí chemické látky a záření na DNA, jejíž struktura je poškozena a buňka se nemnoží. Některé antimikrobní látky také poškozují stavební bílkoviny nebo enzymy denaturací.

2.7.1

Fyzikální vlivy

Teplo je nejčastěji a nejúčinněji používané agens pro sterilizaci předmětů, jež však musí teplu odolávat. Potřebné účinné podmínky se udržují snáze než při působení chemickém. Při teplotě 100 °C hynou po 2–3 minutách všechny vegetativní formy bakterií kromě spor. Na ty bezpečně působí teplota 120 °C po dobu 20 minut. Takových podmínek se docílí v autoklávu za zvýšeného tlaku 101,5 kPa vodní parou. Suché teplo se aplikuje tam, kde by vodní pára porušila sterilizovaný předmět. Protože jde o méně účinný proces, aplikuje se např. na laboratorní sklo či nástroje při teplotě 170 °C po dobu 1 hodiny. Za obou těchto podmínek denaturují bílkoviny a nukleové kyseliny. Ke sterilizaci se také používá ultrafialové a ionizační záření. Ultrafialové záření způsobuje vznik zkřížených vazeb mezi sousedními pyrimidinovými bázemi v polynukleotidovém řetězci DNA. Energie ionizačního záření, jež je vyšší než energie UV záření, způsobuje zlomy v jednom nebo obou řetězcích DNA.

2.7.2

Chemické vlivy

Antimikrobní účinek mají biocidní látky různé chemické povahy. Etanol a izopropylakohol mají rychlý antimikrobní účinek na vegetativní formy bakterií, na viry i houby. Optimálně působí při naředění na 70–90 %. Fenoly jsou dávno známým biocidním prostředkem, ve spreji ho při operacích používal již lord Lister v 19. století. Peroxidy (peroxid vodíku, kyselina peroctová) mají biocidní účinek, včetně sporocidního. Účinkují mohutnou destruující oxidací. Podobně i látky, které uvolňují chlor – kyselina chlorná. Jod a látky uvolňující jod jsou též biocidní, účinkují i na spory. Například povidon jodid je jodofor, který postupně uvolňuje jod. Glutaraldehyd se používá ve 2% koncentraci pro dezinfekci a sterilizaci nástrojů. Tento aldehyd nahradil dříve hojně používaný formaldehyd. Chlorhexidin se jako biocid používá do mýdel a čisticích prášků. Podobně i triklosan a hexachlorofen. Biocidní 44

Bakteriální buňka účinek mají také těžké kovy, zejména rtuť a stříbro. Detergenty – kvarterní amoniové báze – působí na bakterie, včetně mykobakterií, i na obalené viry. Používají se jako dezinfekční a sterilizační prostředky, zejména ke sterilizaci kůže v předoperační přípravě.

2.8

Klasifikace bakterií

Klasifikace či třídění je součástí taxonomie, vědního oboru s vlastní metodou vytváření klasifikačního systému a jeho vyhodnocováním. Taxonomie je věda o klasifikaci, nomenklatuře a jejich aplikaci. Je založena na konsenzu odborníků. Podobné objekty (v našem případě bakterie) se řadí k sobě, méně podobné s více rozdílnými vlastnostmi do skupin odlehlejších. Skupiny podobných objektů (bakterií) i objekty samotné jsou pak pojmenovávány. Teprve nomenklatura činí klasifikační systém srozumitelným. Když se v předminulém století začaly množit objevy původců infekčních chorob, dostávaly bakterie různá jména, která měla vystihovat jejich vlastnosti, choroboplodnost, onemocnění nebo objevitele. Brzy bylo jasné, že je nutno zavést určitá, všemi přijatá pravidla a bakterie třídit podle dohodnutých vlastností. Klasifikovat bakterie podle jednoho nebo dvou znaků, např. podle tvaru nebo zbarvení kolonií, nelze, protože koků se žlutými koloniemi je mnoho. Mnoho je tyček s koloniemi červenými anebo tyček s koloniemi nezbarvenými. Proto musí být pro každý druh bakterii nalezena jednoznačná definice. Třídy bakterií jsou stanoveny hierarchicky, každá nižší zužuje definici. Pro praxi je nejširší třídou čeleď (familia) (Enterobacteriaceae), nižší je rod (genus) (Klebsiella). Základní taxonomickou třídou je bakteriální druh. Je označen jménem složeným obráceně než naše – první jméno je rodové, jakoby příjmení, označuje příslušnost (např. Staphylococcus), druhé je jméno druhové (aureus). Jméno se píše vždy kurzivou; rodové jméno začíná vždy velkým písmenem, druhové vždy malým písmenem a je jednoznačné (tab. 4.1). Znaky, které se používají pro rozlišení rodů a druhů, mají mít co nejširší rozsah. Popisují morfologii buněk a kolonií, fyziologii, chemické složení buněk, nároky na výživu, přirozenou rezistenci k antibiotikům, rezistenci k chemickým a fyzikálním faktorům, antigenní skladbu. Je to klasifikace podle fenotypu, souboru vlastností, kterými se bakterie projevuje. Bakterie se mohou třídit i podle jiných kritérií – podle 45

2

2

Mikrobiologie chemického složení buněčné stěny, mastných kyselin, velikosti a náboje bílkovin, podle podobnosti ribonukleové kyseliny v ribozomech, podle obecné příbuznosti DNA, podle celkového obsahu bází v DNA. Praktickým cílem klasifikace je popsat a definovat druh. V praxi je potřeba určit, jaký druh bakterie je u pacienta původcem průjmu, jaký druh u jiného vyvolal smrtelnou plicní infekci, případně že druh bakterie izolovaný z rány u jiného pacienta je nepatogenní. Druh je kategorie geneticky kompaktní skupiny izolátů s vysokým stupněm podobnosti velkého počtu nezávislých znaků. Druh může být také definován analýzou DNA-genomu, jedinečně pak sekvencí nukleotidů v bakteriálním chromozomu. Taxonomie se také zabývá obsahem pojmu izolát, kmen, klon, biovar, sérovar. Jsou to pojmy potřebné, jejich definice ovšem není a také nemůže být jednoznačná. Nejjednodušší je vymezit izolát – je to čistá kultura bakterií izolovaná z určitého zdroje. Nevypovídá nic o historii a vztahu k jiným kulturám. Kmen je izolát nebo skupina izolátů téhož druhu obvykle určitého původu s totožným fenotypem. Klon je izolát nezávisle izolovaný z různých zdrojů, s jedinečným fenotypem a genotypem. Předpokládá se, že to je potomstvo jedné původní buňky. Biovar je varieta se stálým odlišným metabolizmem uvnitř druhu, sérovar s odlišným antigenním složením.

46

Antibiotika

3 Antibiotika 3.1

Charakteristika antibiotik

Antibiotika jsou nejčastěji produkty půdních mikroorganizmů, které selektivním účinkem napomáhají či umožňují přežívání druhů v jejich prostředí. Éra moderní etiologické chemoterapie začíná ve 30. letech 20. století sulfonamidy. Antimikrobní léčbu masově zavedla druhá světová válka s využitím Flemingova objevu a jeho zavedením do výroby. Zavedení penicilinu a dalších antibiotik do praxe ve 40. a 50. letech 20. století znamenalo obrat v terapii. Výzkum a vývoj je charakterizován izolací antibiotik z kultur mikroorganizmů nejrůznějších druhů, biosyntézou až čistě chemickou syntézou. Prakticky není rozdíl mezi antibiotiky a synteticky připravenými chemoterapeutiky. Přesněji se hovoří o antimikrobních látkách, jež však převážně zahrnují antibiotika. Proto se užívá termín antibiotikum, i když nejde jen o látky mikrobního původu. Na trhu je asi 150 druhů antibiotik vyráběných ve farmaceutickém průmyslu (tab. 3.1). Antibiotikum nesmí poškozovat eukaryotické buňky a účinek na ně musí být zanedbatelný, nebo nejlépe žádný. Žádné antibiotikum není pro makroorganizmus zcela neškodné, neboť není tělu vlastní. Dalším požadavkem je, aby účinkovalo v nízkých koncentracích (řádově v mg/l) a aby těchto hladin dosahovalo v přiměřeně krátké době. Existuje řada dalších přísných farmakologických požadavků. Byla nalezena antibiotika různé chemické povahy a později také syntetizovány různé antimikrobní látky podle základní chemické povahy. Každá skupina antibiotik nese podle své povahy skupinové jméno. Nejznámější antibiotikum je penicilin ze skupiny příbuzných β-laktamů, kam patří i cefalosporiny zdokonalované v několika dalších generacích. Molekula prostého benzylpenicilinu, který se podával jen injekčně a několikrát denně, byla postupně záměrně měněna, takže se může podávat per os, a/nebo s dlouhodobým účinkem. Chemickou úpravou molekuly se u antibiotik dosahuje změny vlastností. Některé pozměněné peniciliny a cefalosporiny se mohou podávat per os a účinkují i na gramnegativní bakterie, včetně pseudomonád. Podobně se z původních perorálních cefalosporinů vyvinuly stabilní cefalosporiny 47

3

3

Mikrobiologie druhé generace a parenterální cefalosporiny druhé, třetí a čtvrté generace stabilní k β-laktamázám s delší dobou působení v těle. Aminoglykosidů se široce používaným gentamicinem je nejméně pět. Z makrolidů je asi neznámější erytromycin a podobný linkosamid účinkující na anaerobní bakterie – klindamycin. Donedávna byly glykopeptidy poslední záchranou u některých infekcí, z nichž je nejdůležitější vankomycin. Existují další antibiotika a antimikrobní látky, jako nejstarší sulfonamidy a ciprofloxacin ze skupiny dvanácti fluorochinolonů. Tab. 3.1  Přehled vybraných antibiotik aminoglykosidy

kanamycin

amikacin

neomycin

netilmicin

streptomycin tobramycin

karbapenemy

imipenem/cilastatin meropenem

cefalosporiny (1. generace)

cefazolin cefalotin cefalexin

cefalosporiny (2. generace)

cefaklor cefamandol cefoxitin cefuroxim

cefalosporiny (3. generace)

cefotaxim cefpodoxim ceftazidim ceftizoxim ceftriaxon

cefalosporiny (4. generace)

cefepim

cefalosporiny (5. generace)

ceftarolin

48

Antibiotika glykopeptidy

teikoplanin vankomycin telavancin

lipopeptidy

daptomycin

linkosamidy

linkomycin klindamycin

makrolidy

azitromycin klaritromycin erytromycin roxitromycin spektinomycin

monobaktamy

aztreonam

peniciliny

amoxicilin ampicilin azlocilin karbenicilin kloxacilin penicilin G piperacilin tikarcilin

oxazolidony

linezolid tedizolid

polypeptidy

bacitracin kolistin polymyxin B

makrocykly

fidaxomycin

49

3

3

Mikrobiologie fluorochinolony

ciprofloxacin levofloxacin norfloxacin ofloxacin gemifloxacin

sulfonamidy a trimetoprim

sulfametoxazol sulfisoxazol trimetoprim trimetoprim-sulfametoxazol (kotrimoxazol)

tetracykliny

doxycyklin minocyklin oxytetracyklin tetracyklin tigecyklin

ostatní

chloramfenikol fosfomycin fusidová kyselina metronidazol mupirocin nitrofurantoin quinupristin/dalfopristin rifampicin

3.2

Vyšetření citlivosti bakterií k antibiotikům

Základem difuzní metody je fenomén inhibiční zóny: kápne-li se antibiotikum na agar, na němž je hustě naočkován citlivý mikrob, vytvoří se po inkubaci kolem této kapky kruhová zóna zábrany růstu, inhibiční zóna. V praxi se místo kapání na plotnu pokládá na naočkovaný agar papírový disk napuštěný zvoleným množstvím antibiotika. Antibiotikum tak lze dávkovat a zajistit rovnoměrnou difuzi. 50