TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
Isolasi Protein Antioksidan Dari Biji Melinjo (Gnetum gnemon L.)
Tri Agus Siswoyo, Madios Aldino, Wahdyah Ningsih, Purnama Okviandari Pusat Penelitian Biologi Molekul dan Jurusan Agronomi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember
ABSTRAK Purifikasi protein antioksidan dilakukan dengan menggunakan kombinasi kolom kromatograpi seperti CM cellulose dan DEAE-Cellulose. Aktivitas protein antioksidan dan free radical-scavenging ditentukan secara in vitro dengan menggunakan metode penghambatan autooksidasi linoleic acid, efek scavenging dengan menggunakan α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl free radical, reducing power, dan kemampuan mengikat ion Fe2+ dan Cu2+. Dua faksi protein hasil isolasi menunjukkan kemampuan antioksidan, dimana protein dengan berat molekul sekitar 30 kD mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan protein satunya yang mempunyai berat molekul sekitar 12 kD. Aktivitas antioksidan akan mengalami peningkatan seiring dengan meningkatnya kosentrasi protein yang ditambahkan. Protein isolat menunjukkan kemampuan yang sama dengan BHT pada pengujian menggunakan metode penghambatan autooksidasi linoleic acid. Lebih lanjut, dua protein fraksi juga menunjukan kemampuan dalam mengikat ion Fe2+ dan Cu2+. Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa protein storage biji melinjo mempunyai potensi sebagai sumber antioksidan alami. Kata kunci : Protein, antioksidan, Mlinjo, Radical-scavenging
PENDAHULUAN Antiradikal bebas atau antioksidan adalah senyawa yang dalam jumlah kecil dibanding substrat mampu menunda atau menjaga terjadinya oksidasi dari substrat yang mudah teroksidasi (Halliwell et al, 1987).Antioksidan sangat bermanfaat bagi kesehatan dan berperan penting untuk mempertahankan mutu produk pangan. Berbagai kerusakan seperti ketengikan, perubahan nilai gizi, perubahan warna dan aroma, serta kerusakan fisik lain pada produk pangan karena oksidasi dapat dihambat oleh antioksidan ini. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik dan
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1045
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
antioksidan alami. Antioksidan sintetik yang biasa digunakan secara luas adalah BHA (Butil Hidroksi Anisol) dan BHT (Butil Hidroksi Toluen). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, diketahui bahwa BHA dapat menyebabkan kanker dan penggunaan antioksidan ini perlu dipertimbangkan lagi karena memiliki efek toksik (Toda et al 1984), sehingga mendorong penemuan obat untuk penangkal radikal bebas dari sumber bahan alam, terutama tumbuhan. Tanaman melinjo (Gnetum gnemon), banyak dibudidayakan di Indonesia, Malaysia dan beberapa negara Asia Tenggara lainnya sebagai penghasil tepung dari biji mlinjo. Di Indonesia, tanaman ini merupakan salah satu komoditas favorit dimana bijinya dapat dimakan setelah dimasak dan dibuang kulitnya. Kandungan protein biji melinjo (Gnetum gnemon) relative tinggi sekitar 9 - 11% sehingga dapat
dipertimbangkan
sebagai
sumber
bahan
protein
fungsional
dan
nutraceutical food supplement. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkaji potensi alami biji melinjo sebagai sumber alami protein antioksidan.
BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : biji melinjo (Gnetum gnemon) diperoleh dari sekitar daerah Jember dan Banyuwangi, Jawa Timur. CM-celullose, DEAE-cellulose dan Sephadex G-25 dari Pharmacia, massa molekul protein standar dari Daiichi Chemica, dan bahan kimia lain yang digunakan merupakan analytical reagent grade. Ekstraksi protein dari biji mlinjo Isolasi protein antimikrobia dari biji mlinjo menggunakan buffer ekstraksi 50 mM MOPS-NaOH (pH 6.8), 0.5 M NaCl yang diikuti dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 min. Setelah didapat supernatan aktivitas antibakteri diujikan. Purifikasi protein biji mlinjo Purifikasi protein antimikrobial dilakukan dengan mengunakan presipitasi amonium sulfate (0-30%) dan kombinasi kolom kromatagraphi (CM-Celullose dan
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1046
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
DEAE-Celulose). Evaluasi aktivitas dilakukan dengan menggunakan metode LA (untuk aktifitasnya); Abs280 nm (protein) dan 15% SDS-PAGE. Penentuan berat molekul polipeptida Penentuan berat molekul peptida dilakukan dengan menggunakan gel sodium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE) dengan konsentrasi gel sebesar 15%. Estimasi berat molekul dilakukan dengan membandingkan pita protein isolat dengan protein maker (myosin, -galactosidase, albumin, aldolase, carbonic anhydrase dan myoglobin). Karakter Gg-AOP. Penentuan potensi aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Potensi aktivitas antioksidan diukur dengan menggunakan metode DPPH-radical scavenging berdasarkan jumlah donor hidrogen atau kemampuan radical scavenging dari radikal berupa DPPH yang stabil (Yamaguchi et al, 1998; Gadow et al, 1997). Emulsi model Linoleic Acid. Aktivitas antioksidan pada masingmasing ekstraksi phenolik jaringan melinjo menggunakan ferric thiocyanate methode (Mitsuda et al, 1966). Reducing power diukur berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Oyaizu (1988). Aktivitas chelating Cu2+ dan Fe2+ diukur berdasarkan metode yang dilakukan oleh
shimada (1992) dan
Dinis et al.
(1994)
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan purifikasi protein antimikrobia Hasil isolasi Gg-AMP dengan menggunakan metode presipitasi ammonium sulfat (0-30%) dan kombinasi kolom kromatograpi (CM-cellulose dan DEAE-Cellulose). Pada awal ekstraksi diperoleh jumlah protein sebesar 452,96 mg dan setelah dilakukan presipitasi saturasi ammonium sulfate 0-30% jumlah protein yang diperoleh yaitu 154 mg. Penurunan jumlah protein sebesar 66 % dari semula menunjukkan adanya beberapa protein tertentu yang tidak terpresipitasi. Hal ini dapat dimungkinkan karena adanya perbedaan sifat fungsional pada setiap protein yang terkandung pada biji melinjo.
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1047
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
16
0,16 Fraction I
14
Fraction II
0,14 280 nm
Absorbance at 280 nm
0,12
LA
10
0,1
8
0,08
6
0,06
4
0,04
2
0,02
0 0
50
100
150
200
250
Antioxidant activity (500 nm)
NaCl
12
1
NaCl (M)
0
0 300
Fraction number (2 ml/tube)
Gambar 1. Grafik pemurnian protein antimikrobial (Gg-AOP) yang berasal dari biji mlinjo pada DEAE-selulose dengan elusi gradien 0 sampai 1 M NaCl. Proses presipitasi sebagian protein ini terjadi karena konfigurasi protein yang berubah, menurut Salcedo-Chavez (2002) terjadinya presipitasi ini akibat dari peningkatan interaksi elektrostatis antar molekul protein sehingga interaksi protein dengan air mengalami penurunan. Isolasi dengan metode kombinasi kolom kromatograpi lebih efektif untuk memperoleh Gg-AOP, secara kualitatif hasil pemisahan dapat dilihat pada Gambar 1. Pada kolom kromatograpi jenis DEAE-celulose yang merupakan kolom bermuatan negative dapat diperoleh tingkat efisiensi yang cukup tinggi hal ini dapat terlihat dari hasil elektrogram 15% SDS-PAGE dimana pada protein kasar terlihat beberapa pita protein dengan berat molekul yang berbeda, akan tetapi setelah dilakukan isolasi terlihat satu pita protein (Gambar 2). Hal ini sesuai dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya yang menyebutkan bahwa protein antimikrob rata-rata mempunyai berat molekul yang relatif rendah atau sering disebut dengan Low Molecular Weight dengan kisaran antara 10-30 kD (Marshall, 2003). Hasil aktivitas spesifik isolat Gg-AOP yang diujikan pada B. cereus juga memperlihatkan peningkatan sebesar 1.14 kali lebih besar dibandingkan dengan protein kasar dengan nilai recovery sebesar 3.5 % (Tabel 1).
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1048
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
I
II
CP Mr
Gambar 2. Elektrograph hasil purifikasi protein antimikrobial biji mlinjo (GgAMP) pada 12% SDS-PAGE Cp.: Protein kasar, Mr. Marker protein, I. Fraksi I dan II. Fraksi II. Karakter aktivitas Protein antioksidan. Stabilitas free radikal pada DPPH dapat terlihat secara maksimal pada panjang gelombang A517 pada larutan ethanol. Penurun DPPH sebagai donor proton pada subsrat
yang radical dapat ditandai dengan penurunan
absobansinya (Shimada et al., 1992). Dasar prinsip tersebut digunakan sebagai dasar untuk dapat menggunakan DPPH sebagai senyawa untuk mengukur kemampuan aktivitas antioksidan. Pada penelitian ini kemampuan scavenging dari kedua fraksi yang diperoleh. Pada Gambar 3 menunjukkan hasil bahwa kemampuan aktivitas scavenging dari fraksi I
kemampuan yang tinggi
dibandingkan dengan fraksi II, prosentase aktivitas fraksi I dapat disamakan dengan kemampuan dari BHT.
DPPH radikal (%)
50 40 30 20 10 0 BHT
Fraction I
Fraction II
Gambar 3. Aktivitas DPPH radical scaveging protein Gg-AOP dari biji melinjo. Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1049
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
Aktivitas antioksidan dari dua fraksi diiuji dengan menggunakan model emulsi linoleic acid. Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode ini adalah kemampuan proteksi antioksidan yang diuji terhadap oksidasi oleh air yang jenuh dengan oksigen dan pemanasan (Hanny et al., 2003). Induksi oksidasi terjadi setelah hari ke 3 sampai 8 ini terlihat pada kontrol, tapi berbeda dengan fraksi I dan II serta pada BHT sebgai positif kontrol, ketiganya tidak menujukkan perubahan yang berarti dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4). Lamanya proses terjadinya oksidasi ini menunjukkan indikasi akan kemampuan dari kedua fraksi sebagai antioksidan yang potensial. Protein fraksi (I dan II) kemungkinan juga mengandung elektron donor yang dapat bereaksi dengan radikal bebas dan dapat meng konver produk menjadi stabil dan reaksi rantai radikal berhenti.
3,00
Absobansi (A500)
2,50
Crude Protein
BHT
Control Fraction II
Fraction I
2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Lama inkubasi (hari) Gambar 4. Aktivitas penghambatan Lipid peroxidation protein Gg-AOP dari biji melinjo (Gnetum gnemon). Aktivitas diukur berdasarkan jumlah linoleic acid yang teroksidasi selama 8 hari. Butylated hydroxytoluene (BHT) digunakan sebagai positive control.
Reducing power diukur pada panjang gelombang A700 dan kemampuan dari kedua praksi hasil isolasi dari biji melinjo dapat terlihat pada Tabel 1. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa protein hasil isolasi mempunyai kemampuan meredukasi produk begitu pula dari Tabel 1 menunjukkan kemampuan dalam mengkelat atau mengikat ion Cu2+ dan Fe2.
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1050
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
Table 1. Kemampuan chelating ion copper dan ferros dan reducing power dari protein Gg-AOP. Chelating (%) Cu Fe2+ 74.69 53.70 28.88 43.60
Reducing power (A700) 0.465 0.479
2+
Fraction I Fraction II
KESIMPULAN Dua faksi protein hasil isolasi menunjukkan kemampuan antioksidan, dimana protein dengan
berat molekul sekitar 30 kD
mempunyai aktivitas
antioksidan tertinggi dibandingkan dengan protein satunya yang mempunyai berat molekul sekitar 12 kD. Aktivitas antioksidan akan mengalami peningkatan seiring dengan meningkatnya kosentrasi protein yang ditambahkan. Protein isolat menunjukkan
kemampuan
yang
sama
dengan
BHT
pada
pengujian
menggunakan metode penghambatan autooksidasi linoleic acid. Lebih lanjut, dua protein fraksi juga menunjukan kemampuan dalam mengikat ion Fe2+. Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa protein storage biji melinjo mempunyai potensi sebagai sumber antioksidan alami.
DAFTAR PUSTAKA Dinis, T. C. P., Madeira, V. M. C. and Almeida, L. M. (1994) Action of phenolic derivatives (acetaminophen, salicylate, and 5-aminosalicylate) as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers. Arch. Biochem. Biophys. 315: 161-169. Halliwell B, Gutteridge J.M.C, and Aruoma O.I. (1987) The deoxyribose method: a simple ‘test tube’ assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals. Anal Biochem. 165:215–9. Marshall, S. H. (2003) Antimicrobial Peptides: A Natural Alternative To Chemical Antibiotics And a Potential For Applied Biotechnology. Electronic Journal of Biotechnology. 6: 271-284. Mitsuda, H., Yasumoto, K. and Iwami, K. (1966) Antioxidative action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Eiyoto Shokuryo 19: 210-214.
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1051
TP-75
ISBN : 978-979-16456-0-7
Oyaizu, M. (1988) Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 35: 771-775. Salcedo-chaävez, B., Osuna-castro J. A., Guevara-Lara, F. Domiänguezdomiänguez, J. and Paredes-Loäpez O. (2002) Optimization of the Isoelectric Precipitation Method To Obtain Protein Isolates from Amaranth (Amaranthus cruentus) Seeds. J. Agric. Food Chem. 50: 6515-6520. Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K. and Nakamura, T. (1992) Antioxidative properties of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. J. Agric. Food Chem. 40: 945-948.
Seminar Nasional PATPI, Bandung 17–18 Juli 2007 Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
1052
