SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA MURNI DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN TUMBUHAN AKAR KAIK-KAIK Uncaria cordata (Lour.) Merr Noveri Rahmawati, Rahayu Utami, Azwendah Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau Email :
[email protected]
ABSTRAK Uncaria cordata (Lour.)Merr merupakan salah satu tumbuhan dari genus Uncaria yang tumbuh di Indonesia. Ekstrak etil asetat dari tumbuhan ini mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat kuat sehingga perlu dilakukan isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa murninya. Ekstrak etil asetat diiisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan uji aktivitas sitotoksik menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) . Diperoleh senyawa murni Uc7 berupa amorf, bewarna putih sebanyak 65 mg dengan titik leleh 232-2340C serta memberikan warna merah muda pada uji pereaksi warna dengan Liebermann-Burchard. Berdasarkan hasil karakterisasi dengan spektroskopi UV dan IR serta perbandingan data dari literatur, senyawa Uc7 yang diperoleh kemungkinan berasal dari golongan terpenoid. Senyawa Uc7 memiliki nilai LC50 sebesar 2,75µg/mL dan nilai ini menunjukkan bahwa senyawa ini mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat kuat. Kata kunci: Isolasi, Sitotoksik, Terpenoid, Uncaria cordata ABSTRACT
Uncaria cordata (Lour.) Merr is one of the genus Uncaria plant that native to Indonesia. The ethyl acetate extract of this plant has a very strong cytotoxic activity so it is necessary to isolate and evaluate the cytotoxic activity of pure substance. Ethyl acetate extract was isolated by using column chromatography and cytotoxic activity was done by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Uc7 pure compound was obtained in the form of amorphous, white coloured as much as 65 mg with a melting point of 232-2340C and give pink in color reagent test with the Liebermann-Burchard. Based on the results of characterization by UV and IR spectroscopy as well as a comparison of data from the literature, the Uc7 compound was suggested the group of terpenoids. Compounds Uc7 have LC50 this value indicated that compound has a very strong cytotoxic activity. Keywords: Isolation, Cytotoxic, Terpenoid, Uncaria cordata
PENDAHULUAN Kekayaan flora yang dimiliki oleh Indonesia berpotensi untuk dikembangkan dalam pencarian obat baru. Diduga dari sekitar 30.000 jenis flora yang ada di dalam hutan tropis Indonesia sekitar 9.600 spesies telah diketahui berkhasiat obat, dari jumlah tersebut tercatat 283 spesies merupakan ISSN : 2087-5045
tumbuhan obat penting bagi industri obat tradisional (Kusuma dan Zaky, 2005). Salah satu tumbuhan obat yang digunakan masyarakat di beberapa negara tropis ialah tumbuhan genus Uncaria. Beberapa penelitian terdahulu yang dilakukan terhadap genus Uncaria diantaranya Uncaria gambir dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat 122
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
kuat terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan LC50 26,30 µg/mL dari fraksi etil asetat (Suminiati, 2013). Penelitian lainnya yang dilakukan oleh (Bacher, 2005) dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium bromid) terhadap Uncaria tomentosa menyatakan bahwa kandungan kimia dari Uncaria tomentosa yaitu pteoropodin dan uncarin F mampu menghambat poliferasi sel leukemia limfoblastik akut. Penelitian terhadap Uncaria perrottetii juga telah dilakukan (Vital dan Rivera, 2009) dengan menggunakan metode TUNEL dan menunjukkan hasil bahwa ekstrak Uncaria perrottetii mampu mengurangi jumlah parasit dan terjadinya perubahan apoptosis pada kit deteksi kematian sel. Salah satu tumbuhan genus Uncaria yang ditemukan di Indonesia khususnya di hutan Larangan Adat Kabupaten Kampar Propinsi Riau adalah Uncaria cordata (Lour.) Merr. Telah dilakukan uji aktivitas sitotoksik dari ekstrak n-heksana, etil asetat, metanol dan diperoleh nilai LC 50 sebesar 7,46 µg/mL, 6,66 µg/mL dan 7,83 µg/mL. Berdasarkan nilai LC50 di atas maka perlu dilakukan isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa murni hasil isolasi dari ekstrak etil asetat daun Uncaria cordata (Lour.) Merr dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kolom kromatografi, chamber, lampu ultraviolet, spektrofotometer UV, spektrofotometer IR, alat pengukur titik leleh Fisher Johns, corong, tisu, spatel, timbangan analitik, aluminium foil, rak dan tabung reaksi, pipet mikro, plat tetes, pipet tetes, beker glass, gelas ukur, kapas,wadah akuarium, aerator, lampu dan vial uji. Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak etil asetat daun tumbuhan Uncaria cordata (Lour.) Merr., kloroform 2 ISSN : 2087-5045
N, kloroform amoniak 0,05 N, reagen Mayer, FeCl 3 1%, logam Mg, HCl pekat, asam asetat anhidrat, H2SO4 pekat, nheksana, etil asetat, metanol, silika gel, plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT), air laut, larva Artemia salina Leach dan dimetilsulfoksida (DMSO). Prosedur Kerja Isolasi Senyawa Murni Sebanyak 4 g ekstrak etil asetat dipreabsorbsi terlebih dahulu dengan menggunakan silika gel 60 sehingga menjadi serbuk. Dilakukan packing kolom dengan cara membuat bubur silika dengan pelarut organik yaitu n-heksana lalu dimasukkan ke dalam kolom dan kemudian dielusi sampai kerapatan silika dalam kolom maksimum. Ekstrak yang sudah dipreabsorbsi kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dielusi menggunakan metoda SGP (step gradient polarity) menggunakan pelarut n-heksan (non polar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Eluen akan ditingkatkan kepolarannya apabila pita yang turun dengan eluen sebelumnya telah terelusi semua dan ditampung dalam vial yang sudah diberi nomor. Hasil pemisahan kromatografi kolom dilakukan uji KLT. Vial-vial yang akan diuji ini diambil secara acak setiap 5 vial. Vial yang mempunyai harga Rf yang sama dapat digabungkan menjadi satu fraksi. Fraksi yang mempunyai pemisahan yang cukup baik kemudian dimurnikan sehingga diperoleh senyawa murni. Senyawa murni yang diperoleh dilakukan uji sitotoksik, pengukuran titik leleh, uji Liebermann-Burchard serta karakterisasi menggunakan spektroskopi Ultraviolet (UV) dan spektroskopi Inframerah (IR). Uji Sitotoksik Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Wadah disiapkan terlebih dahulu untuk penetasan larva udang, kemudian diberi sekat dan sebagian ditutup dengan menggunakan alumunium foil.Wadah yang sudah siap, diisi dengan air laut yang sudah disaring. Kista udang dimasukkan pada bagian wadah yang ditutup dengan
123
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
alumunium foil dan diletakkan di bawah pencahayaan lampu, biarkan hingga 48 jam. Vial uji yang dikalibrasi sebanyak 5mL. Sampel uji ditimbang sebanyak 20 mg, kemudian dilarutkan dengan 2 mL pelarut yang melarutkannya, sehingga diperoleh larutan induk 10000 µg/mL. Dari larutan induk dipipet sebanyak 0,5 mL dan ditambah pelarut hingga 5 mL ke dalam vial yang sebelumnya telah dikalibrasi sehingga diperoleh larutan dengan kosentrasi 1000 µg/mL. larutan dengan kosentrasi 1000µg/mL dipipet sebanyak 0,5 mL ke dalam 4 vial berbeda, dimana larutan uji di 3 vial diuapkan dan 1 vial lainnya ditambah dengan pelarut hingga 5 mL sehingga diperoleh larutan uji dengan kosentrasi 100 µg/mL. Perlakuan yang sama dilakukan hingga didapatkan larutan uji dengan kosentrasi 10 µg/mL. Masing-masing vial berisi sampel uji yang telah diuapkan ditambahkan ke dalamnya dimetil sulfoksida sebanyak 50 µg/mL, lalu larva udang sebanyak 10 ekor dan ditambah air laut hingga 5 mL. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati.
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dari ekstrak etil asetat diawali dengan melakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Hasil kromatografi kolom ditampung dalam vial dan dibiarkan menguap. Sebanyak 467 vial diperoleh dari kromatografi kolom dan kemudian dilakukan pemeriksaan KLT dengan jarak 5 vial, pola nodanya diamati dibawah lampu UV dan ditandai menggunakan pensil tepat pada nodanya. Fraksi yang memiliki noda dan nilai Rf yang sama kemudian digabung sehingga didapat 11 fraksi gabungan yang hasilnya kemudian diperiksa kembali menggunakan KLT (Gambar 1). Semua fraksi diberi label Uc1-Uc11. Fraksi Uc1 (vial 67-77), fraksi Uc2 (vial 127-202), fraksi Uc3 (vial 222-242), fraksi Uc4 (252-272), fraksi Uc5 (vial 322-327), fraksi Uc6 (vial 337-342), fraksi Uc7 ( vial 347-352), fraksi Uc8 ( vial 387-392), fraksi Uc9 (vial 397-402), fraksi
Uc10 (vial 412-417), fraksi Uc11(vial 457462).
Gambar 1. Profil KLT Hasil Penggabungan Fraksi Kolom dari Ekstrak Etil Asetat Uncaria cordata (Lour.) Merr Dengan Penampak Noda Anisaldehid Fraksi Uc5, Uc6, dan Uc7 dipilih untuk dilakukan pencucian, karena ketiga fraksi ini berbentuk amorf bewarna putih kekuningan. Tujuan dari dilakukannya pencucian adalah untuk menghilangkan pengotornya, sehingga dengan dilakukannya pencucian diharapkan didapat amorf bewarna putih.Pencucian dilakukan berdasarkan perbedaan kelarutan antara zat yang akan dimurnikan dengan pengotor dalam suatu pelarut tunggal atau kombinasi dari beberapa pelarut yang cocok. Pencucian ini dilakukan dengan cara melarutkan amorf dengan sedikit pelarut yang melarutkannya yaitu etil asetat dan kemudian menambahkan lebih banyak pelarut yang tidak melarutkannya yaitu nheksan. Apabila amorf sudah mengendap kembali kemudian pipet pelarut yang tersisa.Proses pencucian ini dapat dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan senyawa murni. Dari ketiga fraksi yang dilakukan pencucian, fraksi Uc7 menunjukkan hasil yang lebih baik dari kedua fraksi lainnya, ditunjukkan dengan diperolehnya amorf bewarna putih sebanyak 65 mg (Gambar 2).
Gambar 2. Senyawa Murni Uc 7 ISSN : 2087-5045
124
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
Senyawa Uc7 diuji kembali untuk memastikan bahwa senyawa ini murni dengan pengujian titik leleh dan diperoleh nilai titik leleh 232-234 leleh yang sempit ini dapat dikatakan bahwa senyawa dalam keadaan murni (Fiesser dan Williamson 1992). Pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan pada beberapa eluen yang berbeda menggunakan pereaksi warna anisaldehid. Tujuan pemberian pereaksi warna adalah untuk membantu memperjelas penampakan bercak noda pada plat KLT dikarenakan pada lampu UV 254 dan 366 nm tidak memberikan tampak noda yang jelas. Pereaksi warna anisaldehid biasanya digunakan untuk senyawa- senyawa terpenoid. Pereaksi warna anisaldehid akan membentuk kompleks sehingga menimbulkan warna yang spesifik dan jelas untuk senyawa-senyawa kimia. Adapun bercak warna yang ditunjukkan meliputi hijau, biru, coklat hingga merah (Matuszewska dan Jhon,2004). Pada pemeriksaan KLT didapatkan satu noda, maka senyawa tersebut bisa dikatakan sudah murni (Gambar 3).
menunjukkan bahwa senyawa Uc7 memiliki gugus kromofor, diduga serapan ini diberikan oleh gugus C=O yang juga terlihat pada spektrum IR.
Gambar 4. Spektrum UV Senyawa Uc7 Pada spektrum IR pita serapan terdapat didaerah bilangan gelombang 1690 dan 1681 cm-1 yang berasal dari gugus C=O, untuk pita yang muncul pada bilangan gelombang 2964,72 cm-1, 2927,10 cm-1, 2904,92 cm-1, dan 2871,17 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-H hal ini memberikan petunjuk kemungkinan adanya gugus metil dan metilena, dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada bilangan gelombang 1459,21 cm-1 yang disebabkan oleh gugus -CH2 hali ini mengindikasikan adanya gugus gem dimetil yang merupakan ciri khas senyawa terpenoid (Supratman, 2010) (Gambar 5).
Gambar 3. Profil KLT Senyawa Murni Uc7 dengan Berbagai Perbandingan dan Penambahan Reagen Penampak Noda Anisaldehid Senyawa murni Uc7 dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UVdan IR.Hasil pengukuran spektrofotometer UV senyawa Uc7 yang diukur dengan pelarut metanol pada rentang panjang gelombang 200-400 nm menunjukkan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang 280 nm dan 276 nm (Gambar 4) maks ISSN : 2087-5045
Gambar 5. Spektrum IR senyawa Uc7 Senyawa Uc7 dilakukan pengujian aktivitas sitotoksik menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan kosentrasi 100, 10, 1 µg/mL dan dari masing-masing konsentrasi diperoleh persen kematian sebesar 90%, 80 % dan 125
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
30%. Nilai probit yang didapat yaitu 6,2816, 5,8416, dan 4,4756. Dari perhitungan yang dilakukan didapatkan nilai LC 50 sebesar 2,57 µg/mL. Senyawa ini dapat dikategorikan memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat kuat, karena suatu senyawa dikatakan bersifat sitotoksik jika nilai LC 50 kecil dari 30 µg/mL (Meyer et al, 1982). Aktivitas sitotoksik yang sangat kuat pada senyawa Uc7 ini diduga karena adanya senyawa golongan terpenoid di dalamnya. Hal ini didukung oleh beberapa penelitian dimana golongan senyawa terpenoid dari Uncaria rhynchphylla mampu menghambat phospolipase 50 berkisar antara 9,5 – 44,6 µM (Andre et al, 2013).
KESIMPULAN Senyawa yang diperoleh merupakan senyawa Uc7 golongan terpenoid dan mempunyai aktivitas sitotoksik kategori sangat kuat yaitu 2,57 pµg/mL.
DAFTAR PUSTAKA Andre, N., Wang, X., He, Y., Pan, G., kojo, A., Liu, Y., 2013, A Review of the Occurrence of Non-Alkaloid Constituent in Uncaria Species and Their Structure-Activity Relationship, American Journal of Biomedical and life Sciences, Vol 1, No. 4, Hal. 79-98. Bacher, N., Tiefenthaler, M., Sturm, S., Stuppner, H., Ausserlechner, M. J., Kofler, R., dan Konwalinka, G., 2005, Oxindole alkaloids from Uncaria tomentosa Induce Apoptosis in Proliferating, G0/G1Arrested and bcl-2-Expressing Acute Lymphoblastic Leukemia Cells, British Journal of Hematology, Vol 123, Hal. 615622. Fiesser, L.F., Williamson, K.L., 1992 Organic Experiments 7th Ed.,
ISSN : 2087-5045
D.C.Heath and Company,Toronto, Canada. Kusuma, F.Rdan Zaky, B.M., 2005, Tumbuhan Liar Berkhasiat Obat, Agromedia Pustaka, Jakarta. Matuszweska.A and Jhon.A., 2004, Some Possibilities of Thin Layer Chromatographic Analysis of The Molecular Phase of Balticamber and Other Natural Resins, Acta Chromatographica. Meyer, B.N.,Feerigni, N,R., Putnam, J.E., Jacobson, L,B., Nicholas, D,E., dan McLaughlin, J, L., 1982, Brine Shrimp: A convenient. General Bioasssay For Active Plant Constituens, Plant Medical, Vol 45, Hal. 31-34. Suminiati, 2013, Skrining Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksik dari Ekstrak dan Fraksi Daun Gambir (Uncaria gambir) ( Hunter) Roxb, Skripsi, Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau, Pekanbaru. Supratman, U., 2010, Elusidasi Struktur Senyawa Organik, Univeritas Padjajaran, Bandung. Vital, P. G., dan Rivera, W. L., 2009, Antimicrobial Activity and Cytotoxicity of Chromlaena odorata (L.f) King and Robinson and Uncaria perrottetii (A. Rich) Merr. Extracts, Journal of Medicinal Plant Reasearch, Vol 3, No 7, Hal. 511-518.
126
