ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp. UNTUK BIOKONTROL PADA TAMBAK UDANG
DESY LESTARI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
ABSTRAK DESY LESTARI. Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak Udang. Di bawah bimbingan IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Penyakit bakteri yang umum ditemukan pada budidaya udang terutama disebabkan oleh Vibrio harveyi, selain itu syarat mutu dan keamanan pangan produk perikanan antara lain harus bebas dari cemaran mikrob seperti Escherichia coli. Tujuan penelitian ini untuk mengisolasi dan menyeleksi isolat bakteri Bacillus sp. dari tambak udang yang potensial digunakan sebagai agen biokontrol untuk menghambat V. harveyi dan E. coli di tambak udang. Bacillus sp. diisolasi dari sampel yang diambil dari tambak di provinsi Lampung. Sebanyak 175 isolat diperoleh dari 17 sampel berupa lumpur, air tambak dan saluran pencernaan udang. Dari 18 isolat yang yang memiliki aktifitas penghambatan, hanya delapan isolat yang memiliki indeks zona bening pada kedua bakteri indikator yaitu V. harveyi dan E. coli (perbandingan antara zona bening dan diameter koloni) yaitu sama dengan atau lebih dari 0.50. Tiga isolat yaitu LTS36, LTS40 dan LTW54 menunjukkan aktivitas antimikrob paling stabil saat diuji terhadap bakteri indikator dengan metode lapis ganda. Pada uji tantang, Isolat LTW54 yang diisolasi dari air tambak memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan V. harveyi dan E. coli sebesar 99.99 % sehingga dapat direkomendasikan sebagai kandidat bakteri biokontrol.
ABSTRACT DESY LESTARI. Isolation and Screening of Bacillus sp. for Biocontrol Agents in Shrimp Ponds. Under supervision of IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK. Bacterial diseases in shrimp aquacultures are mainly caused by Vibrio harveyi. Based on quality and food safety regulations, fishery product have to be free from microbial pathogents such as Escherichia coli. The aim of this research was to isolate and screen Bacillus sp. isolates that had potential used as biocontrol agents in aquacultures. Several isolates of Bacillus sp. were isolated from sediment, pond water and shrimp guts. Samples were collected from shrimp ponds in Lampung Province. As many as 175 isolates were obtained from 17 samples. From eighteen isolates that showed inhibiton activity, eight isolates showed high inhibition activities to either V. harveyi and E. coli. The values inhibition zone index were equal to or more than 0.50. Three isolates, i.e. LTS36, LTS40 and LTW54 isolates demonstrated the highest and stable antimicrobial activity against the indicator bacteria. Challenge tests showed that the LTW54 isolates had ability to inhibit growth of V. harveyi and E. coli growth up to 99.99%, therefore it could be recomended as biocontrol agents in shrimp ponds.
ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp. UNTUK BIOKONTROL PADA TAMBAK UDANG
DESY LESTARI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
Judul : Nama : NIM :
Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak Udang Desy Lestari G34102033
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Iman Rusmana, M.Si. NIP 131 956 713
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. NIP 132 045 531
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi, Jawa barat pada tanggal 18 September 1984 dari pasangan bapak Alm.Yuyun Junaedi dan Ibu Hodijah. Penulis merupakan putri ke tujuh dari sembilan bersaudara. Penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cibadak, Sukabumi dan diterima di IPB melalui jalur Penelusuran Minat Dan Kemampuan (PMDK) pada tahun 2002. Penulis memilih jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, Penulis aktif pada berbagai kegiatan kampus yaitu: staf Departemen Informasi dan Komunikasi Dewan Keluarga Mesjid Alhurriyah dan staf Departemen Kewirausahaan Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) pada tahun 2002, staf Departemen Kajian Strategis dan Advokasi Badan Eksekutif Mahasiswa FMIPA IPB pada tahun 2003, serta menjabat sebagai sekretaris I Himpunan Mahasisiwa Biologi pada tahun 2004. Penulis mendapat beberapa program Beasiswa pendidikan diantaranya dari Perhimpunan Orang tua Mahasiswa (POM), Student Equity, serta Beasiswa Pengabdian Masyarakat dari PT. Indonesia Power Unit Bisnis Pembangkitan Kamojang, Garut. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten pada mata kuliah Biologi dasar dan Botani umum pada tahun ajaran 2003/2004. Penulis juga pernah melaksanakan Praktek Lapang selama satu bulan di bagian produksi PT. Indomeiji Dairy Food Sukabumi.
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Illahi Rabbi karena atas rahmat dan hidayah-Nyalah karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak Udang ini dilaksanakan sejak bulan Desember hingga Agustus 2006 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Iman Rusmana, M.Si. dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dengan penuh perhatian dan kesabaran, sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini, dan Ir. Sulistijorini, MS. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan sehingga turut membantu menyempurnakan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada staf laboratorium Mikrobiologi atas segala fasilitas dan bantuan yang diberikan, rekan-rekan BIO’39 atas kenangan terindah selama di Bogor, PT. Indonesia Power yang telah mendukung pendidikan melalui bantuan beasiswa, serta Prof. AM Satari yang telah memberikan dukungan materiil dan juga spirit di saat penulis ditempa ujian. Penghargaan tertinggi penulis persembahkan untuk Alm. Bapak, Mamah, kak Dadang, kak Rahmat, suami tercinta Bayu Ferdiman dan seluruh keluarga Besar M. Toha atas segala dukungan, do’a dan kasih sayangnya selama ini. Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2008
Desy Lestari
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL............................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... viii PENDAHULUAN Latar Belakang............................................................................................. 1 Tujuan.......................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat ...................................................................................... 1 Bahan........................................................................................................... 1 Metode Penelitian........................................................................................ 1 Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp........................................................... 1 Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator ................ 2 Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih ....................................... 2 Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator ........... 2 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil ............................................................................................................ 2 Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp....................................................... 2 Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator............ 2 Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih. .................................. 3 Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator....... 4 Pembahasan ................................................................................................. 5 SIMPULAN ........................................................................................................ 7 SARAN .............................................................................................................. 7 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 7 LAMPIRAN........................................................................................................ 9
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil isolasi Bacillus sp. secara umum ............................................................ 3 2 Seleksi delapan isolat Bacillus sp. terpilih....................................................... 3 3 Karakter morfologi ketiga isolat Bacillus sp. terpilih ...................................... 3
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. menggunakan metode lapis ganda terhadap E. coli dan V. harveyi ..................................... 2 Populasi E. coli pada uji tantang secara in vitro .............................................. 3 Populasi V. harveyi pada uji tantang secara in vitro ........................................ 4 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi E. coli dan V. harveyi ........................................................................................
3 4 5 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 3 4 5 6
Hasil isolasi dan seleksi awal Bacillus sp. dari berbagai macam sampel .... . 10 Seleksi 28 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda ........................... . 15 Seleksi 18 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda ........................... . 16 Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan motilitas ke-18 isolat Bacillus sp . 17 Populasi E. coli pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp... ............ . 18 Populasi V. harveyi pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp... ...... . 19
PENDAHULUAN Latar Belakang Salah satu faktor yang menekan keberhasilan budidaya ikan dan udang di Indonesia ialah masalah penyakit pada tingkat pembenihan dan pembesaran. Kegagalan tersebut terutama disebabkan belum teratasinya permasalahan penyakit, yang tidak saja dapat berakibat pada kematian massal, namun juga menurunkan mutu (Fryer et al. 1972). Di lain pihak, tantangan yang harus dihadapi pasar dunia bagi komoditi ekspor perikanan budidaya ialah menyangkut mutu dan sanitasi (food safety) seperti masalah kandungan hormon dan antibiotik, bakteri patogen, racun hayati (biotoksin laut) dan pestisida (Djazuli 2002). Lightner (1993) melaporkan terdapat beberapa kelompok bakteri penyebab penyakit udang yaitu: Vibrio berpendar, Aeromonas, Pseudomonas, dan Flavobacterium. Kelompok Vibrio berpendar merupakan penyebab utama serangan penyakit pada udang, baik pada tingkat larva maupun dewasa (Lavilla-Pitogo et al. 1992). Penggunaan antibiotik untuk pemberantasan penyakit telah menyebabkan resistensi bakteri Vibrio terhadap beberapa jenis antibiotik (Tjahjadi et al. 1994). Penyakit vibriosis terjadi karena adanya infeksi sekunder oleh patogen oportunistik, sedangkan penyebab utamanya ialah infeksi oleh patogen lain, defisiensi nutrisi, kondisi lingkungan yang memburuk, dan stress (Lavilla-pitogo et al. 1992, Lightner et al. 1993). Organisme lain yang termasuk bakteri patogen diantaranya Escherichia coli, spesies ini dapat dijadikan sebagai indikator buruknya sanitasi, yaitu terkontaminasi feses manusia dan hewan berdarah panas lainya (Kanduri 2002). Oleh karena itu, salah satu syarat mutu udang ialah bebas dari cemaran mikrob seperti E. coli (SNI 01-2728-1992). Salah satu upaya untuk menjamin kelangsungan produksi, mencegah dan menanggulangi penyakit pada budidaya udang ialah melalui pendekatan biokondisioner atau biokontrol, antara lain penggunaan aktivitas bakteri probiotik yang biasa disebut dengan uji kompetisi (Widiyanto 1996). Istilah probiotik didefinisikan sebagai mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, memperbaiki nilai nutrisi, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki lingkungan kualitas ambang
batas. Bakteri yang direkomendasikan sebagai agen biokontrol dalam akuakultur ialah bakteri asam laktat (seperti Lactobacillus dan Corinebacterium), genus Vibrio (seperti Vibrio alginolyticus), genus Bacillus dan genus Pseudomonas. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat Bacillus sp. yang mampu menghambat pertumbuhan E. coli dan V. harveyi.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Desember 2005 sampai dengan Agustus 2006 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, Baranangsiang-Bogor. Bahan Bahan penelitian yang digunakan ialah sampel berupa air, sedimen serta udang segar dari tambak di kabupaten Tulangbawang, provinsi Lampung. Sedangkan bahan penelitian hidup yaitu: E. coli diperoleh dari koleksi isolat laboratorium mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, dan Vibrio harveyi berasal dari koleksi isolat laboratorium mikrobiologi Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Kelautan IPB. Media yang digunakan untuk isolasi, kultur dan pengujian bakteri ialah: Sea Water Complete atau SWC 50% (air laut 75%, akuades 25%, gliserol 1.5 ml, bactopeptone 2.5 g, yeast extract 0.5 g dan 2.0% agar, pH 7.0) cair dan padat, Eosin Methylene Blue (EMB) dan Thiosulphate-Citrate-Bile-Salt (TCBS). Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp. Sebanyak 1 g sampel sedimen atau 1 ml air tambak disuspensikan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis steril dengan konsentrasi 98%. Kemudian dikocok dengan vorteks dan diencerkan secara serial dan diberi renjatan panas (heat shock) pada suhu 80 ºC selama 15 menit. Sebanyak 100 µl larutan diencerkan secara serial lalu disebar pada media SWC 50% agar dan diinkubasi selama 48 jam secara aerob. Koloni yang tumbuh dimurnikan kembali pada media yang sama. Sampel berupa udang segar ditimbang beratnya, lalu dengan menggunakan cutter steril udang dibedah pada bagian dorsal. Saluran usus diambil secara aseptik lalu
2
dimasukkan ke dalam NaCl fisiologis steril dengan konsentrasi 98%. Kemudian usus udang digerus hingga halus dan membentuk suspensi, lalu 1 ml suspensi diencerkan secara serial. Bakteri indikator berupa E. coli dan V. harveyi diremajakan masing-masing pada media EMB dan TCBS. Seleksi awal dilakukan dengan menggunakan metode lapis ganda. Satu lup biakan bakteri indikator diinokulasikan ke dalam 50 ml SWC 50% cair. Kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 110 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Sebanyak 1 ml biakan bakteri indikator disuspensikan ke dalam 100 ml SWC 50% semi solid. Lapis ganda dibuat dengan menuangkan 5 ml agar semisolid ke dalam media SWC padat. Setelah agar menjadi padat, setiap isolat Bacillus sp. yang telah dimurnikan ditotol di atas permukaaan agar dengan menggunakan tusuk gigi steril secara duplo. Biakan diinkubasi pada suhu 28 °C selama 24 jam dan diukur indeks penghambatannya. Panjang diameter zona bening diukur berdasarkan diameter seluruh zona dikurangi diameter isolat. Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator Tahap ini dilakukan dengan metode yang sama seperti seleksi awal untuk menguji isolat yang memiliki diameter zona bening terbesar. Konsentrasi sel bakteri indikator telah ditentukan yaitu 106 sel/ml untuk E. coli dan 107 sel/ml untuk V. harveyi. Seleksi lanjut dilakukan selama tiga kali berturut-turut dengan dua kali ulangan. Zona hambatan yang terbentuk diukur pada tiga posisi lalu dirataratakan. Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih Morfologi, sifat pewarnaan gram, dan motilitas isolat Bacillus sp. diidentifikasi menggunakan prosedur mikrobiologi standar (Hadioetomo 1993). Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator Tiga isolat Bacillus sp. yang memiliki indeks penghambatan terbesar dan paling stabil dijadikan kandidat biokontrol untuk diuji tantang. Uji tantang secara in vitro dilakukan menggunakan media kaldu SWC dalam labu erlenmeyer. Kepadatan bakteri E. coli dan V. harveyi dibuat menjadi 106 sel/ml dan 107 sel/ml. Hasil uji pada penelitian
sebelumnya menunjukkan bahwa V. harveyi bersifat patogen pada kepadatan 107 sel/ml (Rengpipat et al. 1998) dan kepadatan bakteri penantang (LTS36, LTS40, dan LTW54) sebesar 108 sel/ml (Hala 1999). Kontrol dibuat dengan menginokulasikan Bacillus sp. dan bakteri indikator secara terpisah. Kemudian dari masing-masing kultur diambil sebanyak 100 µl, diencerkan dan disebar pada media SWC 50% padat. Penyebaran dilakukan pada jam ke-0, 24, 48, dan 96. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam dan dihitung jumlah populasi E. coli dan V. Persentase harveyi yang terbentuk. penghambatan bakteri indikator oleh isolat Bacillus sp. diperoleh melalui cara : % Penghambatan = X-Y x 100% X Keterangan X = Jumlah sel bakteri indikator pada kontrol Y = Jumlah sel bakteri pada perlakuan
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp. Dari contoh berupa air tambak, sedimen sifon, sedimen tambak umur 138 hari dan usus udang diperoleh total 175 isolat yang didominasi oleh isolat asal air tambak sebanyak 64 isolat. Sedangkan jumlah isolat yang paling sedikit diperoleh dari usus udang yaitu sebanyak 32 isolat (Lampiran 1). Seleksi awal isolat terhadap bakteri indikator menghasilkan persentase penghambatan paling besar ialah isolat yang berasal dari sedimen sifon masing-masing sebesar 17,5% dan 42,5% (Tabel 1). Dari total 175 isolat Bacillus sp. dilakukan penyeleksian kembali sehingga diperoleh 18 isolat yang memiliki indeks penghambatan yang sama dengan atau lebih dari 0.5 (Lampiran 2 dan 3). Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator. Seleksi lanjutan dilakukan untuk mencari kandidat biokontrol yaitu isolat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator dilihat dari besar nilai dan kestabilan indeks penghambatan.
3
Tabel 1 Hasil isolasi Bacillus sp. secara umum Jumlah isolat yang menghambat Jenis sampel
Jumlah sampel
Jumlah isolat Jumlah
E. coli Persentase (%) 9.37
V. harveyi Persentase Jumlah (%) 11 17.19
Air tambak
2
64
6
Sedimen sifon Sedimen tambak umur 138 hari Usus udang
7
40
7
17.50
17
42.5
2
39
9
23.00
16
41.02
6
32
1
3.13
10
31.25
Total
17
175
23
13.14
54
30.85
Tabel 2 Seleksi delapan isolat Bacillus sp. terpilih Nomor
Asal
Kode
isolat
Indeks Penghambatan * E. coli
V. harveyi
1
Sedimen tambak umur 138 hari
LTC5
0.71 ± 0.29
0.92 ± 0.2
2
Sedimen tambak umur 138 hari
LTC8
0.91 ± 0.69
0.92 ± 0.08
3
Sedimen tambak umur 138 hari
LTC13
0.87 ± 0.47
0.59 ± 0.05
4
Air tambak
LTW54
1.17 ± 0.06
1.55 ± 0.12
5
Sedimen sifon
LTS36
1.2 ± 0.54
1.54 ± 0.04
6
Sedimen sifon
LTS39
0.56 ± 0.43
1.33 ± 0.07
7
Sedimen sifon
LTS40
1.61 ± 0.06
2.25 ± 0.25
8
Air tambak
LTW4
0.68 ± 0.18
0.65 ± 0.05
* Data menunjukkan rataan ± SE, n = 2 Dari delapan isolat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator terdapat tiga isolat yaitu LTW54, LTS36, dan LTS40 yang memiliki nilai indeks penghambatan masing-masing sebesar 1.55 1.54, dan 2.25 terhadap V. harveyi. Sedangkan pengujian terhadap E. coli menunjukkan indeks penghambatan masing-masing sebesar 1.17 untuk LTW54, 1.20 untuk LTS36, dan 1.61 untuk LTS40 (Tabel 2). Pada penelitian ini tidak diperoleh kandidat biokontrol atau isolat Bacillus sp. terpilih yang berasal dari saluran pencernaan udang, maupun dari sedimen tambak umur 138 hari, karena nilai indeks penghambatan yang diperoleh tidak stabil dan relatif kecil (Gambar 1).
(a)
(b) Gambar 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. menggunakan metode lapis ganda terhadap E. coli (a) dan V. harveyi (b) (1. LTC5 2. LTC8 3. LTC13 4. LTW54 5. LTS36 6. LTS39 7. LTS40 8. LTW4).
4
Tabel 3 Karakter morfologi ketiga isolat Bacillus sp. terpilih Ciri morfologi
Isolat Bacillus sp. terpilih LTS36
LTS40
LTW54
positif
positif
positif batang
Pewarnaan gram Bentuk
batang
batang
Motilitas
motil
nonmotil
motil
Bentuk
bundar
bundar
Tepian
berombak
bundar tak beraturan
Elevasi
seperti kawah
Warna koloni Endospora
putih susu dengan bintik di bagian tengah ada
berombak
timbul
seperti kawah
putih susu
putih susu
ada
ada
12 Log C FU /ml
Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih. Pewarnaan gram dan spora menunjukkan bahwa semua isolat Bacillus sp. terpilih bersifat gram positif, berbentuk batang, dan membentuk spora (Lampiran 4). Pengamatan morfologi menunjukkan bahwa isolat LTS36 bersifat motil, bentuk bundar, tepian berombak, elevasi seperti kawah dengan bentuk koloni putih dengan bintik coklat pada bagian tengah koloni. Isolat LTW54 memiliki kemiripan dengan LTS36, hanya warna koloni yang berbeda yaitu putih susu. Sedangkan koloni isolat LTS40 bersifat nonmotil, bentuk bundar, tepian tak beraturan, elevasi timbul, serta warna putih susu (Tabel 3).
10 8 6 4 2 0 0
24
48
72
96
Waktu (jam)
E. coli E. coli
+ LTW54 E. E. colicoli + LTW54
E. coli + LTS36 E. coli + LTS36
E. E. colicoli + LTS40 + LTS40
Gambar 2 Populasi E. coli pada uji tantang secara in vitro. Populasi V. harveyi pada semua perlakuan biokontrol mengalami pola yang sama yaitu penurunan dari hari ke-1 sampai hari ke-4 sejak diinokulasi. Penurunan paling tinggi terjadi pada perlakuan yang menggunakan isolat LTW54, yaitu dari 3.7 x 6 4 10 CFU/ml pada jam ke-0 menjadi 3.5 x 10 CFU/ml pada jam ke-96 (Gambar 3, Lampiran 6). Sedangkan isolat LTS36 dan LTS40 memperlihatkan pola penghambatan terhadap perkembangan populasi V. harveyi yang relatif hampir sama, yaitu dari hari ke-1 sampai ke-4, penurunan jumlah bakteri indikator tidak setajam pada perlakuan dengan menggunakan isolat LTW54. 12
Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator. Hasil penelitian uji tantang isolat Bacillus sp. terhadap E. coli memperlihatkan adanya kemampuan penghambatan yang hanya terjadi pada percobaan dengan menggunakan isolat LTW54. Perubahan populasi bakteri indikator awal yakni sebesar 7.0 x 104 CFU/ml pada jam ke-0 menjadi 3.4 x 103 CFU/ml pada jam ke-96 pascainokulasi (Lampiran 5). Sedangkan percobaan E. coli bersama isolat LTS36 dan LTS40 menunjukkan pola yang berbeda yaitu mengalami kenaikan populasi mulai dari jam ke-24 hingga jam ke-96 pascainokulasi (Gambar 2).
L og C F U /m l
10 8 6 4 2 0 0
24
48
72
96
Waktu (jam)
Vibrio
Vibrio + LTW54
V. harveyi
V. harveyi + LTW54
LTS36 V.Vibrio harveyi + + LTS36
V.Vibrio harveyi++ LTS340 LTS40
Gambar 3
Populasi V. harveyi pada uji tantang secara in vitro.
Pada uji tantang yang terjadi pada ke tiga isolat Bacillus sp. dengan E. coli, tidak semua isolat dapat menekan pertumbuhan bakteri target dengan baik. Isolat LTS36 memiliki daya hambat terendah terhadap E. coli yaitu sebesar 91.89%. Pada inkubasi 96 jam, isolat Bacillus sp. LTW54 dapat menghambat
5
% Penghambatan terhadap E. coli
E. coli dengan persen penghambatan mencapai 99.99% (Gambar 4a). Penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap pertumbuhan V. harveyi ditunjukkan dengan nilai persentase penghambatan yang tinggi pada ketiga isolat LTW54, LTS36 dan LTS40 yaitu masing-masing sebesar 99.98%, 99.80% dan 99.79% (Gambar 4b). Secara umum nilai persentase penghambatan ketiga isolat Bacillus sp. terhadap bakteri target tergolong tinggi, akan tetapi isolat LTW54 mampu menekan pertumbuhan kedua bakteri target lebih baik dibandingkan kedua isolat lainnya. Hal ini dapat dilihat berdasarkan nilai persentase penghambatan yang tinggi terhadap E. coli dan V. harveyi yaitu masing-masing sebesar 99.99% dan 99.98%. 104 102 100 98 96 94 92 90 88 86 LTW54
LTS40
LTS36
Isolat Bacillus sp.
(a) % Penghambatan terhadap V. harveyi
100.1 100 99.9 99.8 99.7 99.6 LTW54
LTS40
LTS36
Isolat Bacillus sp.
(b) Gambar 4 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi E. coli (a) dan V. harveyi (b). Pembahasan Sedimen sifon adalah sedimen yang berada pada bagian dasar tambak dan dikeluarkan secara periodik dari tambak selama masa budidaya udang, sedangkan jenis sedimen tambak umur 138 hari diperoleh dari tambak pada saat pascapanen. Peremajaan isolat bakteri indikator pada media selektif bertujuan untuk melihat kemurnian isolat. Biakan E. coli berwarna hijau logam pada media EMB. Medium ini bersifat selektif
terhadap mikroorganisme Gram negatif karena zat warna yang terkandung di dalamnya melancarkan efek bakteriostatik terhadap bakteri Gram positif. Selama pertumbuhannya dalam medium tersebut, bakteri Gram negatif yang dapat memfermentasi laktosa akan mengambil sebagian dari zat warna yang terkandung di dalam medium sehingga koloninya akan tampak ungu atau gelap dibagian tengahnya. (Hadioetomo 1993). Biakan V. harveyi diremajakan pada media TCBS, medium ini bersifat selektif untuk bakteri dari genus Vibrio dengan menampilkan koloni berwarna hijau dan berpendar jika diamati pada ruang gelap (Lavilla-Pitogo et al. 1992). Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan memberi perlakuan renjatan panas (80 ºC selama 15 menit), perlakuan ini akan mematikan semua sel reproduktif dan sel vegetatif, dan hanya menyisakan endospora (Lindquist 2001). Endospora merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies Bacillus sp. (Pelczar et al. 1986). Inkubasi secara aerob akan menyebakan endospora dari spesies Bacillus sp. yang dapat berkecambah (Anonim 2005). Selain dari sedimen tambak, Bacillus sp. juga diisolasi dari usus udang, hal ini sesuai laporan Lavilla-Pitogo et al. (1992) mengemukakan bahwa kolonisasi bakteri terjadi pada organ-organ saluran pencernaan dan jarang ditemukan pada eksoskeleton. Hasil isolasi dari lingkungan lebih banyak dibanding dengan hasil isolasi dari usus udang, hal ini diduga karena kelimpahan Bacillus sp. di lingkungan lebih banyak dibanding pada usus udang. Pernyataan ini diperkuat oleh Verschuere et al. (2000), bahwa spesies Bacillus sp. umumnya ditemukan pada sedimen laut dan dicerna secara alami oleh hewan seperti udang. Moriarty (1999) melaporkan bahwa Bacillus sp. adalah gram positif, nonpatogen, organisme pembentuk spora dan secara normal terdapat di udara, air, tanah dan sedimen. Bakteri ini diperkirakan dapat masuk ke saluran pencernaan melalui asosiasi dengan makanan (Farzanfar 2006). Isolat yang berasal dari sedimen sifon dan sedimen tambak umur 138 hari menghasilkan persentase penghambatan yang relatif besar daripada isolat yang berasal dari sampel lain, hal ini diduga berkaitan dengan kelimpahan bahan organik yang mengendap pada bagian dasar sedimen. Sugama (2002) melaporkan bahwa kelebihan sisa pakan diperairan dapat menyebabkan bakteri
6
menjadi subur, rendahnya kelarutan oksigen dan menyebabkan peningkatan senyawa metabolit seperti NH4, H2S, nitrit dan SO2. Isolat Bacillus sp. LTW54, LTS36 dan LTS40 merupakan isolat terpilih yang memiliki penghambatan paling baik terhadap E. coli dan V. harveyi, yakni dibuktikan dengan dihasilkannya zona hambat yang luas dan jelas. Adanya zona bening pada uji daya hambat menunjukkan kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menghambat kolonisasi dari bakteri indikator. Penghambatan ini diduga karena ketiga isolat Bacillus sp. tersebut dapat memproduksi senyawa antimikrob yang dapat berdifusi melalui media semisolid sehingga diperoleh zona bening yang terlihat jelas. Rachmaniar (1997) menyatakan bahwa faktor yang mempengaruhi besar kecilnya zona hambat zat antimikrob antara lain: aktivitas zat antimikrob gugus fungsi dari substansi sendiri, resistensi terhadap substansi zat antimikrob, kadar substansi aktif serta kepadatan bakteri uji. Efek antibakteri disebabkan oleh faktor berikut: produksi antibiotik, bakteriosin, siderofor, lisozim, protease, dan atau hidrogen peroksida dan perubahan nilai pH melalui produksi asam organik. Komponen penghambat populasi mikrob yang dihasilkan oleh suatu organisme yaitu kemampuan untuk melepaskan substansi kimia yang memiliki efek bakterisida atau bakteriostatik terhadap populasi mikrob lain (Anonim 2000). Pada awalnya sejumlah bakteri tidak memproduksi senyawa aktif apapun dan produksi akan dilakukan pada saat bakteri tersebut terpapar oleh produk ekstraselular yang dihasilkan oleh bakteri lain (Armstrong et al. 2001). Secara umum, nilai persentase penghambatan isolat Bacillus sp. pada uji daya hambat terhadap bakteri indikator tidak terlalu besar. Hal ini diduga berkaitan erat dengan sifat dari bakteri indikator yaitu E. coli dan V. harveyi termasuk kelompok bakteri gram negatif. Ballow et al. (2000) mengemukakan bahwa kebanyakan antimikrob yang diproduksi oleh Bacillus sp. aktif menyerang organisme gram positif. Pelczar dan Chan (1988) menambahkan, bahwa pada umumnya bakteri gram negatif mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antimikrob dibandingkan bakteri gram positif karena struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antimikrob masuk ke dalam sel. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai struktur yang lebih
kompleks yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa polisakarida dan paling dalam ialah peptidoglikan. Aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Oleh karena itu, untuk mengetahui daya hambat zat antimikrob dilakukan uji tantang antara isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator secara in vitro. Hasil uji menunjukkan isolat LTW54 mampu menghambat E. coli dan V. harveyi secara kuat, hal ini dilihat berdasarkan jumlah sel bakteri indikator yang terus berkurang hingga jam ke-96. Isolat LTW54 diduga memiliki zat antimikrob yang bersifat bakterisida sehingga mengakibatkan sel bakteri indikator lisis. Williams et al. (1996) menyebutkan bahwa mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri dapat dilakukan melalui hambatan terhadap pembentukkan dinding sel target, menghambat pembentukkan asam nukleat dan protein, serta mengganggu permebilitas membran sel melalui pembentukkan pori-pori pada membran sel. Pola penghambatan isolat LTS36 dan LTS40 mengindikasikan bahwa kedua isolat tersebut memiliki aktivitas antimikrob yang hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri indikator (bakteriostatik). Hal ini dilihat berdasarkan pertumbuhan sel E. coli yang tetap meningkat pada perlakuan dengan penambahan kedua isolat tersebut. Kedua isolat ini tumbuh lambat diduga karena penginokulasian isolat Bacillus sp. dan bakteri indikator secara bersamaan. Berbeda halnya dengan penelitian lanjutan (Suparnika 2007) dan (Isramilda 2007) yakni uji tantang dilakukan dengan menumbuhkan isolat Bacillus sp. terlebih dahulu sehingga dapat langsung melakukan penghambatan dengan mengekskresikan senyawa antimikrobnya ketika diuji dengan bakteri indikator. Isramilda (2007) melaporkan hasil karakterisasi zat antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTS40 berupa bakteriosin. Bakteriosin adalah senyawa polipeptida yang disintesis melalui ribosom dan banyak dihasilkan oleh spesies Bacillus sp. Senyawa ini memiliki efek bakteriostatik atau bakterisida terhadap bakteri yang berkerabat dekat dengan biakan penghasil, akan tetapi mudah didegradasi oleh enzim proteolitik dalam pencernaan hewan (Jack et al. 1995, Klaenhammer 1993). Jack et al. (1995) mengemukakan bahwa bakteriosin
7
dapat dibedakan dari antibiotik diantaranya dari proses produksi yakni dihasilkan pada saat fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat akhir fase stasioner. Uji daya hambat dalam cawan petri dan uji tantang secara in vitro dalam gelas erlenmeyer menunjukkan bahwa isolat LTW54 lebih baik kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri indikator dibandingkan dengan ke dua isolat lainnya. Nilai persentase penghambatan isolat LTW54 terhadap E. coli dan V. harveyi tergolong tinggi yaitu masingmasing sebesar 99.99% dan 99.98%. Berdasarkan kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri target, isolat LTW54 laik untuk dijadikan sebagai kandidat probiotik. Kemampuan penghambatan isolat Bacillus sp. LTW54 disebabkan oleh adanya produksi senyawa inhibitor berupa antimikrob. Akan tetapi, untuk memastikan jenis senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTW54 perlu dilakukan uji lanjut.
SIMPULAN Tiga dari 175 isolat Bacillus sp. yang diisolasi dari sedimen sifon dan tambak udang memiliki nilai zona bening terbesar yaitu LTW54, LTS36, dan LTS40. Isolat LTW54 yang diisolasi dari air tambak memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan E. coli dan V. harveyi tertinggi yaitu masing-masing sebesar 99.99 % dan 99.98 %.
SARAN Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk melihat sifat patogenisitas dari Bacillus LTW54 serta kemampuan pelekatan pada larva udang untuk melihat kelaikan bakteri tersebut untuk dijadikan agen biokontrol.
DAFTAR PUSTAKA Armstrong E, Yan L, Boyd KG, Wright PC, Burgess JG. 2001. The symbiotic role of marine microbes on living surfaces. Hydrobiologia 461:37-40. Anonim. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol Mol Biol 64 (4): 655-671. Anonim. 2005. Todar’s online textbook of bacteriology: the genus Bacillus. Kenneth Todar University of WinconsinMadison Departement of Bacteriology. http://www. [1 Juli 2005].
[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1992. Standar Nasional Indonesia Produk Perikanan: SNI 01-2728-1992 Udang Segar. Jakarta: Badan Standarisasi Nasional. Ballow CH, Bhavnani SM. 2000. New agents for gram-positive bacteria. Curr. Op. Microbiol 3: 528-534. Djazuli N. 2002. Penanganan dan Pengolahan Produk Perikanan Budidaya dalam Menghadapi Pasar Global: Peluang dan Tantangan. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. http://rudyct.tripod.com/sem1_023/nazor i_djazuli.htm. [8 Mei 2005]. Farzanfar A. 2006. The use of probiotic in shrimp squaculture. Federation of European Microbiological Societies (FEMS) Immunol Med microbiol XX: 110.http://www.blackwellsynergy.com/doi /abs/10.1111/j.1574-695X.2006.00116X. [5 Agustus 2006] Fryer JL, JS Nelson, RL Garison. 1972. Vibriosis in fish. Progress in fishery and food science. Fish New Series 5: 129-133 Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama. Hala Y. 1999. Penggunaan gen penanda molekular untuk deteksi pelekatan dan kolonisasi Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon). J Mikrobiol Indones hlm 13-18. Isramilda. 2007. Karakterisasi zat antimikrob penghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. asal tambak udang. [tesis]. Bogor: Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev 59: 171-200. Kanduri L, Eckhardt RA. 2002. Food Safety in Shrimp Processing. New York: Fishing New Books. Klaenhammer TR. 1993. Bacteriocins of lactid acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 12: 39-86. Lavilla-Pitogo RC, Albright LJ, Panner MG, Sunaz NA. 1992. Studies on the Source of Luminecent Vibrio harveyi in Penaeus monodon Fab. Hatcheries. Di dalam: M Sharrif, RP Subagshinge, JR Arthur, editor. Disease in Asian Aquaculture I. Manila: Asian Fisheries Society. hlm 157-164.
8
Lightner DV. 1993. Disease of culture penaeid shrimp. Di dalam: Mc Vey PJ, editor. Handbook of Mariculture: Crustacean Aquaculture. Florida: CRC Press Inc. hlm 393-487. Lindquist J. 2001. Isolation of Bacillus. University of Winconsin-Madison. http://www.splammo.net/bact102/102bac illus.html. [1 Juli 2005]. Moriaty DJW. 1999. Disease control in shrimp aquculture with probiotic bacteria. Di dalam: Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor. Microbial Biosystem: New Frontiers. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology; Halifax, 9-14 Agustus 1998. Halifax: Atlantic Canada Society for Microbial Ecology. hlm 237243. Pelczar MJ, Chan ECS. 1988. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Volume ke-2. Hadioetomo RS, Tedja-Imas. Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Rachmaniar R. 1997. Potensi spon asal kepulauan spermonde sebagai antimikroba. Seminar Perikanan Indonesia II; Makasar 2-3 Desember 1997. Makasar: Badan Penelitian dan Pengembangan Perikanan. hlm 13-22. Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, Menavesta P. 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth. J Aquaculture 167: 301-313. Sugama K. 2002. Status budidaya udang, introduksi serta prospek pengembangannya dalam tambak air tawar. Warta Penelitian Perikanan Indones 8: 19-22. Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diiolasi dari tambak udang. [skripsi]. Bogor: Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Tjahjadi MR, Angka SL, Suwanto A. 1994. Isolation and evaluation of marine bacteria for biocontrol of luminous bacterial diseases in tiger shrimp larvae (Penaeus monodon Fab.). Aspac J Mol Biol Biotechnol 2:234-352. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol Mol Biol 64 (4):655-671. http://mmbr.asm.org/cgi/ content/abstract/64/4/655. [8 Mei 2005].
Widiyanto T. 1996. Bakteri fotosintetik anoksigenik sebagai biokontrol di tambak udang: pengurangan produksi H2S dan pengaruhnya pada pertumbuhan Vibrio harveyi. [tesis]. Bogor: Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB.
9
10
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Hasil isolasi dan seleksi awal Bacillus sp. dari berbagai macam sampel A. Sampel berupa sedimen tambak umur 138 hari
No isolat
Kode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
LTC1 LTC2 LTC3 LTC4 LTC5 LTC6 LTC7 LTC8 LTC9 LTC10 LTC11 LTC12 LTC13 LTC14 LTC15 LTC16 LTC17 LTC18 LTC19 LTC20 LTC21 LTC22 LTC23 LTC24 LTC25 LTC26 LTC27 LTC28 LTC29 LTC30 LTC31 LTC32 LTC33 LTC34 LTC35 LTC36 LTC37 LTC38 LTC39
Ø zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator: E. coli (mm) V. harveyi (mm) ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2 6 6 5 4 * 6 * * 4 5 7 7 * * * * 6 7 8 7 4 4 6 7 * * * * 5 5 * 7 * * * * * * * * * * * * 5 * * * 4 14 7 * 4 9 * * 7 * * * 6 * * * 3 5 * * * * * * * * * * * 4 * * * * * * 3 9 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 9 6 * * * 5 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 22 *
(*) = tidak ada penghambatan (**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur
11
Lampiran 1 (Lanjutan) B. Sampel dari saluran pencernaan udang No. Isolat
Kode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
INT1 INT2 INT3 INT4 INT5 INT6 INT7 INT8 INT9 INT10 INT11 INT12 INT13 INT14 INT15 INT16 INT17 INT18 INT19 INT20 INT21 INT22 INT23 INT24 INT25 INT26 INT27 INT28 INT29 INT30 INT31 INT32
Ø zona bening Bacillus sp pada bakteri indikator: V. harveyi (mm) E. coli (mm) ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2 * * * * * * * * 12 6 * * ** ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 20 6 10 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * ** * * * ** * * * * ** * * * * * * * * * * 9 11 * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** ** * * ** * * * * * * *
(*) = tidak ada penghambatan (**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur
12
Lampiran 1 (Llanjutan) C. Sampel dari sedimen sifon No. Isolat
Kode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
LTS1 LTS2 LTS3 LTS4 LTS5 LTS6 LTS7 LTS8 LTS9 LTS10 LTS11 LTS12 LTS13 LTS14 LTS15 LTS16 LTS17 LTS18 LTS19 LTS20 LTS21 LTS22 LTS23 LTS24 LTS25 LTS26 LTS27 LTS28 LTS29 LTS30 LTS31 LTS32 LTS33 LTS34 LTS35 LTS36 LTS37 LTS38 LTS39 LTS40
Ø zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator: V. harveyi (mm) E. coli (mm) ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2 11 * * * ** * * * 14 * * * ** ** * * 7 4 9 * * * * * * * * * 12 * * * * * * * * * * * * * * * 5 * * * ** * 6 * * * * * * * 6 * 6 6 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * 11 14 8 10 11 8 9 ** * * * * 11 12 12 * * 11 7 ** * 9 * * 9 15 7 9 * 12 12 9
(*) = tidak ada penghambatan (**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur
13
Lampiran 1 (Lanjutan) D. Asal sampel dari air tambak No. Isolat
Kode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
LTW1 LTW2 LTW3 LTW4 LTW5 LTW6 LTW7 LTW8 LTW9 LTW10 LTW11 LTW12 LTW13 LTW14 LTW15 LTW16 LTW17 LTW18 LTW19 LTW20 LTW21 LTW22 LTW23 LTW24 LTW25 LTW26 LTW27 LTW28 LTW29 LTW30 LTW31 LTW32 LTW33 LTW34 LTW35
ukuran zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator: V. harveyi (mm) E. coli (mm) ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2 * * * * * * * * * * * * 0,5 0,6 * 6 * * * * * * * * * * * * 0,7 * * * * * * * * * 10 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * ** * *
(*) = tidak ada penghambatan (**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur
14
Lampiran 1 (Lanjutan)
No. Isolat
Kode
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64
LTW36 LTW37 LTW38 LTW39 LTW40 LTW41 LTW42 LTW43 LTW44 LTW45 LTW46 LTW47 LTW48 LTW49 LTW50 LTW51 LTW52 LTW53 LTW54 LTW55 LTW56 LTW57 LTW58 LTW59 LTW60 LTW61 LTW62 LTW63 LTW64
Ø zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator: V. harveyi (mm) E. coli (mm) ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2 * ** * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 7 * * * * * * * * * * * * * * 11 * * * * 4 8 * * * * * * * * 4 21 4 9 * * * * 5 * 6 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 5 11 * *
(*) = tidak ada penghambatan (**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur
15
Lampiran 2 Seleksi 28 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda
Jenis sampel
Usus udang
Sedimen tambak umur 138 hari
Air tambak
Sedimen sifon
Indeks penghambatan
Kode isolat INT3 INT10 INT30 LTC1 LTC3 LTC5 LTC6 LTC8 LTC13 LTC22 LTC24 LTC25 LTC30 LTC32 LTC39 LTW4 LTW10 LTW51 LTW54 LTW55 LTW56 LTW64 LTS33 LTS34 LTS36 LTS37 LTS39 LTS40
(*) = zona bening tidak terdeteksi
ulangan 1 * * 1.67 0.9 2 3 1.25 3 6.33 0.75 * * * * * 0.8 * * 2 * 4.5 3 1.33 0.23 4 3 3 4
E. coli ulangan 2 * 1.5 * * 2.25 3.75 0.66 1.75 10 3 * * * * * 3.67 * * 7.5 * 2.25 2 2 2 2.33 1 2 4.5
rataan * 0.75 0.84 0.45 2.13 3.4 0.96 2.38 8.17 1.88 * * * * * 2.24 * * 1.38 * 3.38 2.5 1.67 1.12 3.17 2 2.5 4.25
ulangan 1 * 0.33 0.33 0.45 4.3 10 1.75 0.33 2 4 * * * * * 1.33 * * 1.33 * * 1.9 0.6 0.66 0.5 0.33 0.33 0.75
V. harveyi ulangan 2 * 6 0.18 0.8 * 1.33 1.75 2.75 2.5 1.33 * * * * * 1.5 * * 2.5 * 2.7 0.7 * 0.66 1.8 0.5 2.67 0.75
rataan * 3.17 0.26 0.63 2.15 5.67 1.75 1.54 2.25 2.67 * * * * * 1.42 * * 1.92 * 2.7 2.6 0.3 0.66 1.15 0.42 1.5 0.75
16 15
Lampiran 3 Seleksi 18 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda A. Tabel penghambatan pada E. coli Jenis sampel
Air Tambak
Sedimen Sifon
Sedimen tambak umur 138 hari
Usus Udang
Kode isolat LTW4 LTW54 LTW56 LTW64 LTS33 LTS34 LTS36 LTS37 LTS39 LTS40 LTC3 LTC5 LTC6 LTC8 LTC13 LTC22 INT10 INT30
ulangan 1 1.80 3.00 0.50 1.45 0.33 0.63 2.35 1.38 1.73 2.00 1.28 2.58 1.25 1.00 1.63 0.75 1.00 0.87
Indeks penghambatan ulangan 2 rataan 1.67 1.74 2.50 2.75 * 0.25 0.83 1.14 1.00 0.67 2.00 1.32 2.33 2.34 0.46 0.92 1.90 1.57 2.55 2.27 0.5 0.89 1.24 1.41 0.66 0.95 1.85 1.43 1.20 1.42 3.00 1.88 0.45 0.73 1.41 1.14
B. Tabel penghambatan pada V. harveyi jenis sampel
Air Tambak
Sedimen Sifon
Sedimen tambak umur 138 hari
Usus Udang
Kode isolat LTW4 LTW54 LTW56 LTW64 LTS33 LTS34 LTS36 LTS37 LTS39 LTS40 LTC3 LTC5 LTC6 LTC8 LTC13 LTC22 INT10 INT30
(*) = zona bening tidak terdeteksi
Indeks penghambatan ulangan 1 ulangan 2 1.33 1.50 2.33 2.50 * * * * 0.60 * 0.66 0.66 1.50 1.80 0.33 0.50 1.33 2.67 1.75 2.75 4.30 * 3.33 1.33 0.50 0.75 1.34 1.78 2.00 1.50 0.85 1.33 0.33 3.00 0.33 0.98
rataan 1.42 2.42 * * 0.30 0.66 1.65 0.42 2.00 2.25 2.15 2.33 0.63 1.56 1.75 1.09 1.65 0.65
16 17
Lampiran 4 Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan motilitas ke-18 isolat Bacillus sp. No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Isolat INT10 INT30 LTC3 LTC5 LTC6 LTC8 LTC13 LTC22 LTW4 LTW54 LTW56 LTW64 LTS33 LTS34 LTS36 LTS37 LTS39 LTS40
Gram Positif Negatif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif
Motilitas motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil motil nonmotil nonmotil nonmotil
18 17
Lampiran 5 Populasi E. coli pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp. Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTW54
Jam ke 0 24 48 72 96
Kontrol [X] *) 7.9 x 104 9.6 x 105 5.1 x 106 3.9 x 107 5.8 x 107
Jumlah sel E. coli (CFU) Uji tantang [Y] Ulangan 1 Ulangan 2 7.3 x 104 6.7 x 104 4 5.1 x 10 1.5 x 104 3 8.3 x 10 7.1 x 103 1.1 x 103 2.4 x 103 3 2.1 x 10 4.7 x 103
% penghambatan Rataan 7.0 x 104 3.3 x 104 7.7 x 103 6.9 x 103 3.4 x 103
11.39 96.56 99.84 99.98 99.99
Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTS36
Jam ke
Kontrol [X] *)
Jumlah sel E. coli (CFU) Uji tantang [Y] Ulangan 1 Ulangan 2
% penghambatan Rataan
0 24
7.9 x 104 9.6 x 105
4.9 x 104 1.9 x 104
2.1 x 104 6.7 x 104
3.5 x 104 4.3 x 105
55.69 55.20
48
5.1 x 106
4.6 x 105
8.8 x 105
6.7 x 105
86.86
72
3.9 x 10
7
5
5
6
91.53
96
5.8 x 107
4.7 x 106
91.89
2.1 x 10
2.3 x 105
4.5 x 10
7.1 x 105
3.3 x 10
Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTS40 Jumlah sel E. coli (CFU) Jam ke 0
Kontrol [X] *)
% penghambatan
Uji tantang [Y] Ulangan 1
Ulangan 2
Rataan
7.9 x 104
1.4 x 104
5.0 x 104
3.2 x 104
59.49
5
4
4
4
91.87
24
9.6 x 10
48
5.1 x 106
6.3 x 10
8.8 x 104
1.1 x 104
9.7 x 104
98.09
72
3.9 x 10
7
5
5
5
98.95
96
5.8 x 107
6.7 x 105
98.84
5.1 x 10
1.0 x 105
Keterangan: % penghambatan = X-Y x 100% X Konsentrasi awal = 106 sel/mL *) Bukan uji tantang (inokulasi secara terpisah)
9.3 x 10 3.1 x 10
3.2 x 105
7.8 x 10 4.1 x 10
19 18
Lampiran 6 Populasi V. harveyi pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp. Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTW54
Jam ke 0
Kontrol [X] *)
Jumlah sel V. harveyi (CFU) Uji tantang [Y] Ulangan 1 Ulangan 2
% penghambatan Rataan
2.7 x 106
5.5 x 106
1.9 x 106
3.7 x 106
7
6
6
6
24
2.5 x 10
48
3.7 x 107
3.1 x 105
5.3 x 105
4.2 x 105
98.86
72
2.5 x 108
1.0 x 104
6.1 x 104
8.1 x 104
99.96
96
8
4
4
3.5 x 104
99.98
3.2 x 10
2.7 x 10
1.8 x 10
7.1 x 10
5.2 x 10
4.9 x 10
-37.03 80.4
Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTS36 Jumlah sel V. harveyi (CFU) Jam ke 0 24
% penghambatan
Ulangan 1
Uji tantang [Y] Ulangan 2
Rataan
2.7 x 106
7.8 x 106
3.2 x 106
5.5 x 106
-103.7
2.5 x 10
7
1.5 x 10
6
8.7 x 10
6
5.1x 106
79.6
7
5.2 x 10
6
4.0 x 10
6
6
87.56
Kontrol [X] *)
48
3.7 x 10
72
2.5 x 108
1.2 x 105
5.3 x 105
4.6 x 10
8.3 x 105
99.67
96
3.2 x 108
9.8 x 105
2.8 x 105
6.3 x 105
99.8
Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTS40
Jam ke 0 24 48 72 96
Kontrol [X] *) 2.7 x 106 2.5 x 107 3.7 x 107 2.5 x 108 3.2 x 108
Jumlah sel V. harveyi (CFU) Uji tantang [Y] Ulangan 1 Ulangan 2 6 2.2 x 10 7.4 x 106 6 3.6 x 10 5.0 x 106 5 1.0 x 10 9.6 x 105 4.7 x 105 1.2 x 105 5 2.4 x 10 1.1 x 105
Keterangan: % penghambatan = X-Y x 100% X Konsentrasi awal = 107 sel/mL *) Bukan uji tantang (inokulasi secara terpisah)
% penghambatan Rataan 4.8 x 106 4.3 x 106 9.9 x 105 8.3 x 105 6.5 x 105
-77.77 82.8 97.32 99.67 99.79
