ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK, KARAKTERISASI, DAN APLIKASI ENZIM PROTEASE PADA KOKON Cricula trifenestrata
ABDI GUNAWAN
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK ABDI GUNAWAN. Isolasi Bakteri Proteolitik, Karakterisasi, dan Aplikasi Enzim Protease pada Kokon Cricula trifenestrata. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DEDY DURYADI SOLIHIN. Sutra emas adalah benang sutra hasil olahan manusia yang diperoleh dari kokon ulat sutra Cricula trifenestrata. Keberadaan bakteri proteolitik dari kokon berpotensi mempengaruhi kualitas sutra emas. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri proteolitik, mengkarakterisasi enzim protease dan mengaplikasikan protease pada kokon sutra emas. Sebanyak 26 isolat bakteri proteolitik berhasil diisolasi dari kokon asal pupa baik dan kokon asal pupa buruk. Media yang digunakan berupa media cair Nutrient Broth (NB) dan media padat Nutrient Agar (NA) yang ditambah 1% susu skim. Isolat CKH 7 dan CKK 7 dipilih untuk produksi protease karena memiliki aktivitas spesifik tertinggi. Hasil identifikasi CKH 7 dan CKK 7 ialah Aeromonas salmonicida ssp salmonicida dan Vibrio fluvialis. Produksi protease CKH 7 tertinggi pada jam ke-9. Aktivitas optimum protease CKH 7 pada pH 8 dan suhu 25°C. Aktivitas protease CKH 7 meningkat dengan penambahan 2 mM kation Na2+ dan Ca2+ . Protease CKK 7 optimum pada pH 5, jam ke-12 dan suhu 35°C. Aktivitas protease CKK 7 meningkat dengan penambahan 2 mM kation Cu2+, Co2+ dan Ca2+. Protease CKH 7 tergolong metaloprotease. Perendaman kokon dalam protease dan dilanjutkan dengan NaOH 0,1 N menghasilkan benang sutra emas yang bersih, mengkilap dan tidak mudah putus. Kata kunci: Cricula trifenestrata, isolasi, karakterisasi enzim, aktivitas protease, sutra emas.
ABSTRACT ABDI GUNAWAN. Isolation of Proteolytic Bacteria, Characterization, and Application of Protease Enzymes on Cricula trifenestrata Cocoon. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and DEDY DURYADI SOLIHIN. Goldsilk is silk fiber that made by human which it get from Cricula trifenestrata cocoon. Existence of proteolitic bacterias from cocoon have potential to influence quality of goldsilk. The aims of the experiment were to get proteolytic bacteria, characterize the protease enzyme and apply protease on goldsilk cocoon. A total of 26 proteolytic bacteria were isolated from good and bad cocoons. Nutrient Broth (NB) and Nutrient Agar (NA) containing 1% skim milk used as growth media. Isolate CKH 7 and CKK 7 are selected for protease production because they have the highest protease activity. CKH 7 and CKK 7 were identified as Aeromonas salmonicida ssp salmonicida and Vibrio fluvialis. Highest protease productivity reached after 9 hour incubation. Optimum protease activity of isolate CKH 7 at pH 8 and temperature 25 °C. Its activity increased by the presence of 2 mM Na2+ and Ca2+. Activity isolate CKK 7 optimum showed at pH 5, reached after 12 hour incubation and temperature 35°C. Its activity increased by the presence of 2 mM Cu2+, Co2+ and Ca2+. Protease of CKH 7 characterized as metalloprotease. Result of submerge cocoon in protease and continued by NaOH 0,1 N are fiber be clean, shiny, and not easy cut off. Keywords: Cricula trifenestrata, isolation, enzyme characterization, protease activity, goldsilk.
ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK, KARAKTERISASI, DAN APLIKASI ENZIM PROTEASE PADA KOKON Cricula trifenestrata
ABDI GUNAWAN
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul skripsi : Isolasi Bakteri Proteolitik, Karakterisasi, dan Aplikasi Enzim Protease pada Kokon Cricula trifenestrata Nama : Abdi Gunawan NIM : G34080023 Departemen : Biologi
Disetujui
Pembimbing I
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. NIP. 196711271993022001
Pembimbing II
Dr. Dedy Duryadi Solihin, DEA. NIP. 195611021984031003
Diketahui Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 196410021989031002
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Mahaesa atas rahmat dan karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Judul penelitian ini ialah Isolasi Bakteri Proteolitik, Karakterisasi, dan Aplikasi Enzim Protease pada Kokon Cricula trifenestrata. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari hingga Mei 2012, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Nisa Rachmania, M.Si dan Bapak Dr. Dedy Duryadi Solihin, DEA selaku pembimbing, serta kepada Ibu Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc sebagai Wakil Komisi Pendidikan atas saran dan diskusi yang diberikan. Ucapan terima kasih diberikan kepada DIKTI yang telah membiayai penelitian ini melalui program PKMP tahun 2012. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ayah, Mama, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bu Heni dan Pak Jaka selaku teknisi yang telah membantu dalam penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi dan teman-teman “Biologi 45” atas bantuan dan dukungannya, khususnya Lilia Ardhiani, Fany Soraya, Prima Novitasari, dan Ahmad Budi Hasibuan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat, bagi penulis maupun pembaca.
Bogor, 25 Juli 2012
Abdi Gunawan
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pekanbaru pada tanggal 2 Februari 1990 dari ayah H. Nasaruddin dan ibu Sarniati. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 8 Pekanbaru dan lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (USMI) IPB pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2010/2012, Ekologi Dasar pada tahun ajaran 2010/2011, dan Vertebrata pada tahun ajaran 2011/2012. Penulis telah melaksanakan Praktik Kerja Lapang di The Learning Farm Yayasan Karang Widya pada bulan Juni hingga Juli 2011 dengan judul Pengaruh Pemberian Air Lindi pada Pertumbuhan Tanaman Hortikultura di The Learning Farm Yayasan Karang Widya Kabupaten Cianjur. Penulis aktif dalam Badan Pengawas Himabio 2011 sebagai Ketua dan BEM TPB IPB 2008 sebagai anggota Departemen Kewirausahaan. Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitian seperti panitia Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) 2010, dan Koordinator Publikasi dan Dokumentasi pada Biologi Interaktif 2010. Selain itu, Penulis pernah menjadi finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional (PIMNAS) 2012 di Universitas Muhammadiyah Yogyakarta dan mendapatkan medali perak untuk kategori PKM-P dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik Asal Kokon Cricula trifenestrata yang Mempengaruhi Kualitas Sutra Emas. Hasil penelitian ini juga telah disampaikan secara lisan oleh penulis dalam IGN-TTRC International Conference tanggal 18 Juli 2012 di IPB Convention Centre.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. vii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................................... viii PENDAHULUAN Latar Belakang ....................................................................................................................... 1 Tujuan .................................................................................................................................... 1 Waktu dan Tempat ................................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE Bahan .................................................................................................................................... 1 Metode ................................................................................................................................... 1 HASIL Isolasi, Seleksi, dan Identifikasi Bakteri Proteolitik............................................................... 2 Kurva Pertumbuhan dan Produksi Protease dari Isolat Proteolitik Terpilih .......................... 4 Karakterisasi Protease dari Isolat Terpilih ............................................................................ 4 Aplikasi Protease pada Kokon Sutra Emas ........................................................................... 5 PEMBAHASAN ........................................................................................................................ 6 SIMPULAN ............................................................................................................................... 7 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 8 LAMPIRAN ............................................................................................................................... 9
DAFTAR TABEL Halaman 1 Ciri-ciri bakteri proteolitik terpilih isolat CKH 7 dan CKK 7 ................................................. 3 3 2 Aktivitas spesifik bakteri proteolitik terpilih ...........................................................................
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Zona bening bakteri proteolitik terpilih isolat CKH 7 dan CKK 7 .......................................... 3 2 Laju pertumbuhan dan produksi protease isolat CKH 7 dan CKK 7 ...................................... 4 3 Aktivitas protease CKH 7 dan CKK 7 pada berbagai pH dan suhu ........................................ 4 4 Pengaruh penambahan senyawa kation dan EDTA konsentrasi 2 mM terhadap aktivitas protease isolat CKH 7 dan CKK 7 ............................................................. 5 5 Serat sutra emas setelah perendaman pada kondisi optimum aktivitas protease dari isolat CKH 7, CKK 7, dan kontrol ................................................................................... 5 6 Serat sutra emas setelah direndam dalam NaOH konsentrasi 0,05-0,3 N pada suhu 80 oC ..... 5 7 Serat sutra emas direndam protease dan NaOH 0,1 N pada suhu 80 oC dari isolat CKH 7, CKK7, dan NaOH 0,1 N (kontrol) ............................................................ 6
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Siklus hidup Cricula trifenestrata .......................................................................................... 10 2 Kokon Cricula trifenestrata yang digunakan sebagai sampel ............................................... 10 3 Kurva standar isolat CKH 7 dan CKK 7 ............................................................................... 10 4 Log jumlah sel isolat CKH 7 .................................................................................................. 11 5 Log jumlah sel isolat CKK 7 ................................................................................................. 11 6 Metode pengukuran aktivitas protease (Walter 1984) ........................................................... 12 7 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) .............................................................. 12 8 Kurva standar Bradford ......................................................................................................... 13 9 Aktivitas protease pada berbagai pH ..................................................................................... 13 10 Aktivitas protease pada berbagai suhu .................................................................................. 13 11 Aktivitas protease pada berbagai senyawa kation dari garam dan EDTA 2 mM .................. 14 12 Indeks proteolitik (IP) dari 26 isolat proteolitik .................................................................... 14 13 Ciri-ciri morfologi dari 10 isolat proteolitik terpilih ............................................................. 14
PENDAHULUAN Latar Belakang Cricula trifenestratata merupakan salah satu spesies dari famili Saturniidae. Famili ini ditandai dengan adanya spot, pola cincin konsentrik seperti jendela (fenestra) pada sayapnya (Lampiran 1). Meskipun umumnya Saturniidae menghasilkan sutra, namun berkerabat jauh dengan Bombyx mori, ngengat penghasil sutra yang telah dikenal selama ini (Tuskes el al. 1996). Saturnaiidae (Saturniid) ialah ulat sutra liar. Saturniidae merupakan superfamili Bombycoidea dengan anggota terbesar, meliputi sekitar 1.861 spesies, 162 genus dan sembilan subfamili. Saturniid meliputi beberapa ngengat yang banyak dimanfaatkan seperti Antheraea, Actias, Attacus, Saturnia, dan Cricula (Kakati & Chutia 2009). Cricula trifenestratata mengalami metamorfosis sempurna, sehingga ditemukan tiga bentuk tubuh berbeda selama siklus hidupnya, yaitu larva, pupa dan imago (Lampiran 1) (Kakati & Chutia 2009). Pupa dari ngengat ini ditutupi pelindung yang disebut kokon. Kokon ialah polimer protein yang diperoleh dari pemintalan serat larva Lepidoptera (Shao & Vollrath 2002). Kokon sutra terdiri atas dua bahan pokok yaitu serat sutra (protein fibroin) dan perekat atau Gum yaitu protein serisin (Altman et al. 2003). Benang sutra emas hasil olahan kokon C. trifenestratata memiliki nilai ekonomi yang tinggi di pasaran. Salah satu keunggulan dari sutra emas ini ialah memiliki serat bewarna keemasan yang merupakan warna khas dari kokon ini (Mondal et al. 2007). Ulat sutra emas C. trifenestratata belum didomestikasi atau masih bersifat liar, sehingga kualitas kokon sangat tergantung pada kondisi lingkungan. Kondisi lingkungan yang tidak sesuai dapat menghasilkan kokon berkualitas buruk sehingga berdampak menurunkan harga benang sutra emas yang dihasilkan. Benang sutra umumnya dihasilkan dengan merendam kokon sutra di dalam bahan kimia, misalnya NaOH berkonsentrasi tinggi (Aini 2009). Perlakuan ini dapat mengurangi warna asli pada sutra, sehingga dalam penelitian ini dilakukan suatu metode dengan menggunakan enzim protease yang dihasilkan bakteri proteolitik asal kokon sutra emas untuk menghasilkan benang sutra emas berkualitas baik.
Tujuan Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri proteolitik asal kokon Cricula trifenestrata, melakukan karakterisasi protease, serta mengaplikasikan protease pada kokon sutra emas. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari hingga Mei 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB, Bogor.
BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan ialah kokon Cricula trifenestrata asal pupa baik (good cocoon) dan pupa buruk (bad cocoon) yang hidup pada pohon alpukat di Desa Cikoneng Bogor, Jawa Barat (Lampiran 2). Metode Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik. Sampel yang digunakan yaitu kokon Cricula trifenestrata asal pupa baik dan asal pupa buruk. Sebanyak 0,3 g kokon dimasukkan ke dalam 30 ml media Nutrient Broth (NB) yang mengandung 1% susu skim (Anlene, Selandia Baru) dalam Erlenmeyer 250 ml, kemudian diinkubasi dalam inkubator berpenggoyang (Eyela, Jepang) dengan suhu ruang (± 25°C) selama 24 jam. Pengenceran serial sampel 10-1 hingga 10-5 dilakukan dalam garam fisiologis NaCl 0,85%. Selanjutnya suspensi dituang pada media Nutrient Agar (NA) 15 ml yang mengandung 1% susu skim. Koloni yang membentuk zona bening dipindahkan ke media NA lain dengan metode cawan gores. Isolat murni disimpan pada media agar-agar miring NA dan diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 25°C (Hadioetomo 1990). Setiap isolat tunggal ditumbuhkan dengan cara ditotol pada media NA ditambah 1% susu skim. Setelah diinkubasi dalam inkubator (Gemmyco, USA) selama 24 jam, zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni dihitung indeks proteolitiknya, yaitu nisbah antara selisih diameter zona bening dan diameter koloni dengan diameter koloni. Indeks proteolitik (IP) merupakan indikator kualitatif bakteri dalam menghasilkan protease. Selanjutnya diambil satu isolat dari masing-masing jenis sampel yang memiliki indeks proteolitik tertinggi untuk produksi protease.
2
Identifikasi Isolat Proteolitik Terpilih. Isolat proteolitik terpilih dari sampel kokon yang berasal dari pupa baik dan pupa buruk dengan jumlah masing-masing sebanyak satu isolat diidentifikasi menggunakan Kit API 20 NE untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif berbentuk batang berdasarkan ciri-ciri fisiologi bakteri. Perhitungan Sel Bakteri dari Isolat Proteolitik Terpilih. Metode yang digunakan untuk perhitungan sel bakteri ialah metode hitungan cawan dan turbiditas untuk membuat kurva standar (Lampiran 3). Sebanyak dua lup isolat terpilih pada biakan agar-agar miring NA ditumbuhkan di media NB dalam 50 ml erlenmeyer dan diinkubasi pada suhu 25°C dengan kecepatan 120 rpm selama 18 jam. Selanjutnya, sebanyak 10% (109 sel/ml) suspensi bakteri dimasukkan ke dalam 100 ml NB dalam Erlenmeyer 500 ml dan diinkubasi pada suhu 25°C dengan kecepatan 120 rpm selama 18 jam. Tahap berikutnya dilakukan pengenceran serial hingga 10-7 untuk menghitung jumlah sel bakteri dengan metode Total Plate Count (Hadioetomo 1990). Selanjutnya dibuat grafik yang menyatakan hubungan OD terkoreksi dan jumlah organisme/ml (Hadioetomo 1990). Laju Pertumbuhan dan Produksi Protease dari Isolat Proteolitik Terpilih. Sebanyak 2 lup bakteri ditumbuhkan di media cair NB ditambah 1% susu skim dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 25°C. Biakan dikocok dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ± 25°C. Produksi protease dilakukan dengan memasukkan 108 sel/ml inokolum ke dalam media produksi. Turbiditas sel diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan spektrofotometer U-2001 (Hitachi, Jepang) setiap selang waktu 3 jam selama 24 jam (Lampiran 4 dan 5). Kultur disentrifugasi dengan sentrifus berpendingin B. Braun (Sigma, Amerika Serikat) pada kecepatan 10000 rpm suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan yang mengandung protease ekstrak kasar dipisahkan dari endapannya dan diuji aktivitasnya (Anggarani 2003). Uji Aktivitas Protease dan Penentuan Kadar Protein. Metode Walter yang telah dimodifikasi digunakan untuk mengukur aktivitas protease (Walter 1984, Lampiran 6). Kadar protein diukur dengan metode Bradford (Bradford 1976). Sebanyak 100 µL sampel enzim ditambahkan dengan 0,5 ml pereaksi Bradford, dikocok kuat dan dibiarkan selama 10 menit lalu diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Standar menggunakan Bovin Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0-0,1 mg/ml protein. Blanko menggunakan 100 µl akuades dicampur dengan 1 ml pereaksi Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya (Lampiran 7 dan 8). Kurva hubungan log sel dan aktivitas spesifik protease dibuat berdasarkan hasil pengamatan laju pertumbuhan dan produksi protease isolat terpilih. Karakterisasi Protease dari Isolat Terpilih. Protease dikarakterisasi pada rentang pH 4-9 (Lampiran 9), sedangkan suhu diukur pada rentang 25-60°C (Lampiran 10). Karakterisasi berikutnya dengan mereaksikan enzim dengan senyawa penghambat spesifik protease logam yakni etilendiamin tetrasetat (EDTA) dengan konsentrasi 2 mM, dan dengan berbagai senyawa kation logam dari garam NaCl, MgCl2, CaCl2, ZnCl2, MnCl2, dan FeCl2 dengan konsentrasi 2 mM (Lampiran 11) (Raunsay 2011). Aplikasi Protease pada Kokon Sutra Emas. Sebanyak 0,1 g kokon direndam selama 1 jam dalam beberapa larutan yang mengandung protease asal isolat yaitu: a) protease ekstrak kasar dari kokon asal pupa baik, b) protease ekstrak kasar dari kokon asal pupa buruk 7, c) NaOH 0,05-0,3 N, dan d) protease ekstrak kasar campuran a) dan b) yang dilanjutkan dalam NaOH konsentrasi optimum e) akuades steril (kontrol). Rendaman dilakukan suhu ruang dan suhu optimum. Suhu optimum rendaman NaOH sebesar 80oC. Struktur kokon hasil rendaman diamati dengan mikroskop stereo.
HASIL Isolasi, Seleksi, dan Identifikasi Bakteri Proteolitik Isolasi menggunakan sampel kokon asal pupa baik yang bewarna kuning keemasan dan kokon asal pupa buruk yang bewarna coklat kehitaman. Penggunaan sampel yang berbeda ini bertujuan untuk memperoleh jenis bakteri proteolitik yang bervariasi. Sebanyak 26 bakteri proteolitik berhasil diisolasi dari kedua jenis sampel dan dihitung indeks proteolitiknya (Lampiran 12). Sebanyak 18 isolat bakteri yang diperoleh dari kokon asal pupa baik (kode: CKH) dan dari kokon asal pupa buruk (CKK) sebanyak 8 isolat. Aktivitas protease dari bakteri proteolitik dilihat dari
3
pembentukan zona bening pada medium padat (Gambar 1). Sebanyak 10 isolat dengan indeks proteolitik tertinggi (IP) dipilih untuk diidentifikasi secara morfologi (Lampiran 13). Satu bakteri yang memiliki IP paling tinggi dari masing-masing sampel dipilih sebagai isolat proteolitik terpilih, yaitu bakteri dengan kode isolat CKH 7 dan CKK 7. Selanjutnya kedua isolat diidentifikasi secara fisiologi menggunakan Kit API. Selain itu, kedua isolat dihitung jumlah sel bakterinya, dan dihitung aktivitas protease serta kadar protein dari protease ekstrak kasar yang dihasilkan. Hasil pengamatan secara morfologi kedua isolat menunjukkan kesamaan
karakter (Tabel 1). Hasil identifikasi secara fisiologis menggunakan Kit API 20 NE menunjukkan bakteri dengan kode CKH 7 merupakan Aeromonas salmonicida ssp salmonicida dan CKK 7 sebagai Vibrio fluvialis. Kedua isolat mampu melisis sel darah merah yang ditunjukkan dengan nilai positif dari uji hemolisin (Tabel 1). Hasil penghitungan jumlah sel bakteri, aktivitas protease, dan kadar protein isolat CKH 7 dalam pH 7 dan suhu kamar memiliki nilai yang lebih besar dibanding CKK 7, sedangkan nilai aktivitas spesifik yang merupakan ukuran kemurnian protease, nilai protease CKK 7 lebih besar dibanding CKH 7 (Tabel 2).
Zona bening
b
a Gambar 1 Zona bening bakteri proteolitik terpilih isolat a) CKH 7 dan b) CKK 7. Tabel 1 Ciri-ciri bakteri proteolitik terpilih Kode Isolat
Warna Elevasi koloni koloni
Tepian koloni
Bentuk koloni
Bentuk sel
Gram
IP Hemolisin Hasil identifikasi
CKH 7
putih
timbul
berlekuk
tak beraturan
batang
-
5,88
+
CKK 7
putih
timbul
berlekuk
tak beraturan
batang
-
2,54
+
Aeromonas salmonicida ssp salmonicida Vibrio fluvialis
Keterangan : IP = Indeks Proteolitik Tabel 2 Aktivitas spesifik bakteri proteolitik terpilih Kode Isolat
Jumlah bakteri (sel/ml)
Aktivitas protease (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg protein)
CKH 7
5x109
0,044
0,011
4,000
CKK 7
1x109
0,027
0,003
9,000
4
Karakterisasi Protease dari Isolat Terpilih Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum dan sifat dari protease kedua isolat. Karakterisasi
0,030 0,020 0,010 0,000 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Waktu (jam) Aktivitas spesifik
Aktivitas protease (U/mg protein)
0,040
Log jumlah sel (sel/ml)
9,10 9,00 8,90 8,80 8,70 8,60 8,50 8,40
0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000
10,00 9,80 9,60 9,40 9,20 9,00 8,80 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Waktu (jam)
Kurva tumbuh
Aktivitas spesifik
Kurva tumbuh
Aktivitas protease (U/ml)
(a) (b) Gambar 2 Laju pertumbuhan dan produksi protease isolat a) CKH 7 dan b) CKK 7. 0,0030 0,0025 0,0020 0,0015 0,0010 0,0005 0,0000 4
5
6 pH
7
8 9 CKH 7 CKK 7
(a) Aktivitas protease (U/ml)
Aktivitas protease (U/mg protein)
0,050
0,0080 0,0060 0,0040 0,0020 0,0000 25
30
Log jumlah sel (sel/ml)
dilakukan dengan mengukur aktivitas protease pada berbagai pH, suhu, serta menguji pengaruh penambahan kation dan EDTA 2 mM terhadap aktivitas protease. Protease CKH 7 memiliki aktivitas optimum pada pH 8 dan suhu 25oC, sedangkan protease CKK 7 pada pH 5 dan suhu 35oC (Gambar 3). Aktivitas protease CKH 7 meningkat dengan penambahan kation Na+ dan Ca2+, sedangkan protease CKK 7 meningkat aktivitasnya dengan penambahan Cu2+, Co2+, Ca2+, dan EDTA. Penambahan EDTA 2 mM pada protease CKH 7 menyebabkan aktivitas proteasenya menjadi turun (Gambar 4).
Kurva Pertumbuhan dan Produksi Protease dari Isolat Proteolitik Terpilih Pengukuran pertumbuhan dan produksi protease kedua isolat dilakukan pada pH 7 dan suhu kamar. Produksi protease isolat CKH 7 tertinggi pada jam ke-9 yang terdapat pada fase pertumbuhan eksponensial. Isolat CKK 7 menunjukkan aktivitas protease tertinggi pada jam ke-12 yang menjadi fase stasioner pertumbuhannya (Gambar 2).
35 40 45 50 55 60 CKH 7 CKK 7 Suhu (oC)
(b) Gambar 3 Aktivitas protease CKH 7 dan CKK 7 pada berbagai a) pH dan b) suhu.
Senyawa
Kontrol
EDTA
ZnCl2
Kontrol
EDTA
ZnCl2
CaCl2
CoCl2
CuCl2
0,0000
CaCl2
0,0100
CoCl2
0,0200
CuCl2
0,0300
0,1200 0,1000 0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0,0000 NaCl
0,0400
Activitas protease (U/mg)
0,0500
NaCl
Aktivitas protease (U/mg)
5
Senyawa
(a) (b) Gambar 4 Pengaruh penambahan senyawa kation dan EDTA konsentrasi 2 mM terhadap aktivitas protease isolat a) CKH 7 dan b) CKK 7. Aplikasi Protease pada Kokon Sutra Emas Aplikasi protease dilakukan dengan merendam kokon sutra emas selama satu jam pada larutan protease asal isolat CKH 7 dan CKK 7. Kokon yang telah direndam diamati strukturnya menggunakan mikroskop stereo dengan perbesaran 32 kali. Perendaman kokon dalam akuades menghasilkan kokon yang kotor dan kusam.
Perendaman kokon dalam protease kedua isolat menghasilkan kokon yang bersih dan mengkilap (Gambar 5). Benang sutra dihasilkan dengan merendam kokon dalam larutan NaOH pada konsentrasi 0,05-0,3 N (Gambar 6). Perendaman kokon dalam NaOH 0,1 N menghasilkan benang sutra berkualitas baik yaitu benang sutra yang tidak mudah putus (Gambar 7).
Kokon kotor dan kusam
Kokon bersih dan mengkilap
a
b
c
Gambar 5 Serat sutra emas setelah proses perendaman pada kondisi optimum aktivitas protease dari isolat a) CKH 7, b) CKK 7, dan c) akuades (kontrol).
a
b
c
Benang sutra emas
d
e
f
Gambar 6 Serat sutra emas setelah direndam dalam NaOH konsentrasi a) 0,05 N, b) 0,1 N, c) 0,15 N, d) 0,2 N, e) 0,25 N, f) 0,3 N pada suhu 80oC.
6
a Benang sutra bersih, mengkilap, tidak mudah putus
b
c
Benang sutra tidak bersih, tidak mengkilap
Gambar 7 Serat sutra emas setelah direndam protease dan NaOH 0,1 N pada suhu 80 oC dari isolat a) CKH 7, b) CKK 7, dan c) NaOH 0,1 N (kontrol).
PEMBAHASAN Isolat bakteri yang diperoleh dari isolasi berjumlah 26 isolat dan memiliki aktivitas proteolitik. Aktivitas proteolitik ini ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni (Gambar 1). Zona bening bakteri disebabkan adanya aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler yang dihasilkan bakteri dalam menghidrolisis kasein yang berada di dalam susu skim (Madigan et al. 2003). Sebanyak 2 isolat dengan indeks proteolitik (IP) terbesar dipilih sebagai isolat proteolitik terpilih. Pemilihan bakteri dengan menggunakan IP didasari kemampuan bakteri dalam mendegradasi protein kasein yang terkandung di dalam susu skim. Bakteri yang memiliki IP tertinggi mampu mendegradasi kasein lebih banyak dibanding bakteri proteolitik lainnya (Madigan et al. 2003). Hasil yang pewarnaan Gram kedua isolat menunjukkan bakteri Gram negatif dan berbentuk batang (Tabel 1). Bakteri Gram negatif ialah bakteri yang memiliki sistem membran ganda dengan membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya (Madigan et al. 2003) Melalui identifikasi secara fisiologi menggunakan KIT API 20 NE, CKH 7 berjenis Aeromonas salmonicida ssp salmonicida dan CKK 7 sebagai Vibrio fluvialis (Tabel 1). Ciri fisiologi kedua bakteri ini yang ditunjukkan dari hasil Kit API 20 NE ialah fermentatif terhadap glukosa, menghasilkan katalase, dan oksidase sitokrom positif. Berbeda dengan A. salmonicida ssp salmonicida, V. fluvialis mampu mengasimilasi arabinosa dan manosa.
Selain itu, kedua bakteri ini mampu melisis sel darah merah sehingga diduga bakteri ini tergolong bakteri patogen. Hal ini didukung oleh Ingilae et al. (2000) dan Kumar (2011) yang menyatakan bahwa kedua isolat ini ialah bakteri patogen di daerah perairan dan dapat menyebabkan septikemia, pendarahan, luka otot, radang usus, pembesaran limpa, dan kematian pada populasi ikan air tawar. Aeromonas salmonicida ialah patogen udara yang dapat melakukan perjalanan ke atmosfer dan kembali ke air tanpa inang (Wooster & Bowser 1996). Vibrio fluvialis sebenarnya adalah penghuni darat (terestrial) dan air tawar. Keberadaannya di laut disebabkan terbawa oleh aliran sungai atau air buangan (Feliatra 1999). Jumlah sel CKH 7 dan CKK 7 ialah 5x109 dan 1x109 sel/ml, sedangkan aktivitas spesifik masing-masing isolat ialah 4,000 dan 9,000 U/mg (Tabel 2). Aktivitas tertinggi enzim protease isolat CKH 7 berada pada fase eksponensial (fase pertumbuhan) dengan aktivitas sebesar 0,039 U/mg protein, sedangkan isolat CKK 7 berada pada fase stasioner menjelang fase kematian dengan aktivitas 0,058 U/mg protein. Enzim dihasilkan dalam jumlah yang sedikit selama fase pertumbuhan, tetapi terakumulasi dalam jumlah besar selama fase stasioner (Gambar 2) (Madigan et al. 2003). Hal ini disebabkan pada fase pertumbuhan eksponensial sel mengalami represi katabolit, sehingga sintesis eksoenzimnya terhambat, sedangkan pada fase stasioner, represi katabolit terangkat, sehingga biosintesis eksoenzim meningkat. Represi katabolit ialah kemampuan senyawa di dalam rangkaian reaksi katabolik yang dikatalisis enzim untuk menekan sintesis enzim katabolik (Priest 1985). Karakterisasi protease dilakukan untuk mengetahui kondisi produksi dan aktivitas
7
optimum enzim dalam mendegradasi protein menjadi asam amino. Enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu dan pH tertentu, aktivitas enzim akan meningkat dengan bertambahnya suhu dan pH. Tetapi setelah suhu dan pH optimum tercapai maka kenaikan suhu dan pH akan menyebabkan aktivitas enzim menurun karena denaturasi protein (Madigan et al. 2003). Aktivitas protease optimum isolat CKH 7 dan CKK 7 masing-masing pada suhu 25 dan 35 °C, sedangkan pH optimum pada pH 8 dan 5. Hasil ini didukung oleh penelitian Ingilae et al. (2000) yang menunjukkan Aeromonas salmonicida ssp salmonicida tumbuh optimum pada suhu 20-22 °C, pH 5-9 dan tegolong metaloprotease, sedangkan menurut Kumar (2011) Vibrio fluvialis tumbuh optimum pada suhu 30-40 °C dan pH 5 dalam fase stasioner. Beberapa enzim membutuhkan ion logam sebagai kofaktor untuk mendukung efisiensi katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam pengikatan antara enzim dengan substrat, beberapa logam juga dapat terikat pada enzim secara langsung untuk menstabilkan konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu enzim (Madigan et al. 2003). Kation logam yang menaikkan aktivitas isolat CKH 7 hingga 446,88% ialah Ca2+ dengan aktivitas sebesar 0,035 U/mg protein dan kation logam yang menaikkan aktivitas isolat CKK 7 hingga 252,59% ialah Cu2+ dengan aktivitas sebesar 0,0885 U/mg protein (Gambar 4). Senyawa EDTA merupakan senyawa pengkelat logam yang dapat membentuk kompleks yang kuat dengan ion logam. Kompleks ion logam dengan EDTA merupakan kompleks yang sangat stabil. Beberapa ion logam yang membentuk kompleks dengan EDTA di antaranya ialah Mg2+, Ca2+, Ba2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Ag2+, Zn2+, Cd2+, dan Pb2+ (Harvey 2000). Aktivitas protease CKH 7 menurun hingga 70,31% dengan penambahan EDTA 2 mM sehingga enzim protease digolongkan ke dalam metaloprotease. Metaloprotease atau protease logam merupakan protease yang aktivitasnya tergantung pada peranan kation logam. Kation-kation yang dapat mengaktifkan enzim golongan ini ialah Mg, Zn, Co, Fe, Hg, Cd, Cu, dan Ni (Suhartono 1992). Oleh karena itu penambahan senyawa EDTA menyebabkan terganggunya kofaktor
enzim sehingga terjadi penurunan aktivitas enzim, karena senyawa EDTA mengkelat kation logam yang berperan dalam aktivitas enzim. Perendaman kokon Cricula trifenestrata selama satu jam dalam protease CKH 7 dan CKK 7 pada suhu optimum menjadikan kokon menjadi lebih bersih dan mengkilap dari sebelum perlakuan. Hal ini disebabkan adanya aktivitas protease dalam mendegradasi protein yang mengikat kokon dengan kotoran yang menempel, seperti serpihan daun, debu, pasir, dan serat halus lainnya yang menyelimuti kokon sehingga kokon menjadi lebih bersih dan mengkilap. Perendaman pada suhu ruang menjadikan kokon tampak sama seperti perendaman di dalam akuades steril (kontrol) yaitu kokon tampak kotor dan kusam (Gambar 5). Benang sutra emas terbentuk dari kokon yang direndam dengan NaOH 0,05-0,3 N dengan pemanasan 80oC (Gambar 6), sedangkan di dalam suhu ruang tidak menghasilkan benang. Hal ini didukung penelitian Aini (2009) yang menyatakan benang sutra dihasilkan dengan merendam kokon dalam larutan NaOH dengan konsentrasi 0,5-3 g/l pada suhu 80oC. Hal ini disebabkan larutan NaOH yang digunakan mampu melarutkan serisin sebagai protein perekat dari benang sutra, sehingga diperoleh benang sutra murni (fibroin). Proses pemisahan serisin dan fibroin ini disebut Deguming (Mondal et al. 2007). Perendaman serat sutra emas dalam NaOH dengan konsentrasi 0,1 N menghasilkan serat atau benang dengan kualitas baik, yaitu apabila ditarik tidak mudah putus. Perendaman pada konsentrasi 0,15-0,3 N menghasilkan benang yang rapuh dan mudah putus disebabkan pengikisan kokon secara berlebihan oleh NaOH. Perendaman kokon dalam protease dan dilanjutkan dalam NaOH 0,1 N (deguming) menghasilkan benang sutra emas berkualitas baik yaitu bersih, mengkilap, dan tidak mudah putus.
SIMPULAN Terpilih dua isolat yaitu CKH 7 dan CKK 7 dari 26 isolat bakteri proteolitik yang diisolasi dari kokon asal pupa baik dan asal pupa buruk Cricula trifenestrata asal Desa Cikoneng Bogor, Jawa Barat. Hasil identifikasi isolat CKH 7 dan CKK 7 masing-masing menunjukkan Aeromonas
8
salmonicida ssp salmonicida dan Vibrio fluvialis. Protease CKH 7 memiliki aktivitas optimum pada pH 8 dan suhu 25°C. Aktivitas protease CKH 7 meningkat dengan penambahan 2 mM kation Na2+ dan Ca2+ . Protease CKK 7 optimum pada pH 5 dan suhu 35°C. Aktivitas protease CKK 7 meningkat dengan penambahan 2 mM kation Cu2+, Co2+ dan Ca2+. Protease CKH 7 tergolong metaloprotease. Perendaman kokon sutra emas dalam protease ekstraseluler dan dilanjutkan dengan NaOH (deguming) menghasilkan benang sutra emas terbaik yaitu benang sutra bersih, mengkilap dan tidak mudah putus.
DAFTAR PUSTAKA Aini HN. 2009. Pengaruh beberapa konsentrasi media dan lamanya perubahan kokon Attacus atlas L. terhadap kualitas filamen yang dihasilkan [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Altman GH et al. 2003. Silk-based biomaterials. Biomaterials 24:401-416. Anggarani M. 2003. Isolasi bakteri penghasil proteae alkalin dan karakterisasi enzim [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254. Feliatra. 1999. Identifikasi bakteri patogen (Vibrio sp.) di Perairan Nongsa Batam Provinsi Riau. J Natur Indonesia 1I:2833. Hadioetomo RS. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT. Gramedia. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Boston: McGraw-Hill. Ingilae M et al. 2000. Vaccination of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus L., and spotted wolffish Anarhichas minor L., against atypical
Aeromonas salmonicida. Aquaculture 183:31-44. Kakati LN, Chutia BC. 2009. Diversity and ecology of wild sericigenous insect in Nagaland India. J Trop Ecol 50:137146. Kumar A. 2011. Characterization of protease from Alcaligens faecalis and its antibacterial activity on fish pathogens. J Environ Biol 32:781-786. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-10. New Jersey: Prentice Hall. Mondal M, Trivedy K, Kumar SN. 2007. The silk protein, sericin, fibroin in silkworm, Bombyx mori Linn. A review. J Environ Sci 5:63-67. Priest, FG. 1985. Extracellular enzymes. Di dalam: Young MM, editor. Comprehensive Biotechnology: The Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture, and Medicine Vol. I. Oxford: Pergamon Press. hlm 587-604. Raunsay SS. 2011. Isolasi bakteri proteolitik asal Danau Gili Meno Nusa Tenggara Barat dan karakterisasi enzim protease [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shao Z, Vollrath F. 2002. Suprising strenght of silkworm silk. Nature 418:741. Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor: Depdikbud, DIKTI, Pusat Antar Universitas, IPB. Tuskes PM, Tuttle JP, Collins MM. 1996. The Wild Silk Moths of North America. New York: Cornell University Press. Walter HE. 1984. Method with haemoglobin, casein, and azocoll as substrate. Di dalam: Bergmeyer HU, editor. Methods of enzymatic analysis. Ed ke-3. Weinheim: Verlag Chemie. hlm 270–278. Wooster G, Bowser P. 1996. The aerobiological pathway of a fish pathogen: survival and dissemination of Aeromonas salmonicida in aerosols and its implications in fish health management. J World Aquacult Soc. 27:7-14.
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Siklus hidup Cricula trifenestrata
fenestra
Pupa
Larva
Telur
Imago
Lampiran 2 Kokon Cricula trifenestrata yang digunakan sebagai sampel Jenis kokon Kokon asal pupa baik (Good cocoon)
Lokasi pengambilan Daun yang masih menempel pada ranting alpukat
Ciri-ciri Bewarna kuning keemasan dan tidak berbau
Kokon asal pupa buruk (Bad cocoon)
Serasah alpukat
Bewarna coklat kehitaman dan berbau
Lampiran 3 Kurva standar isolat CKH 7 dan CKK 7
CKH 7
OD (620 nm)
1,2 1 0,8
y = 0,7451x - 6,063 R² = 0,9956
1,063 0,886
0,623
0,6 0,435
0,4 0,2
0,167
0 8,00
8,50
9,00 9,50 Log jumlah sel/ml
10,00
CKK 7 OD (620 nm)
1,2 y = 0,7046x - 6,2823 R² = 0,9926 0,798
1 0,8 0,6
0,539
0,4 0,2 0 9,00
0,949
0,367 0,104 9,50 10,00 Log jumlah sel/ml
10,50
Gambar
11
Lampiran 4 Log jumlah sel isolat CKH 7 Jam ke-
Log jumlah sel
Aktivitas protease (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg)
0
8,47
0,0000
0,0000
0,0000
3
8,54
0,0050
0,2490
0,0190
6
8,62
0,0040
0,2020
0,0190
9
8,80
0,0070
0,1900
0,0390
12
8,86
0,0050
0,2140
0,0230
17
9,01
0,0010
0,1570
0,0050
20
8,99
0,0010
0,1330
0,0100
23
8,88
0,0020
0,1370
0,0160
26
8,87
0,0030
0,1520
0,0180
Lampiran 5 Log jumlah sel isolat CKK 7 Log jumlah
Aktivitas protease
Kadar protein
Aktivitas spesifik
sel
(U/ml)
(mg/ml)
(U/mg)
0
8,93
0,0000
0,0000
0,0000
3
9,00
0,0020
0,4150
0,0060
6
9,38
0,0070
0,2330
0,0280
9
9,61
0,0020
0,1890
0,0110
12
9,70
0,0070
0,2170
0,0300
17
9,75
0,0020
0,1660
0,0100
20
9,55
0,0050
0,1230
0,0400
23
9,81
0,0050
0,1370
0,0340
26
9,83
0,0080
0,1610
0,0470
Jam ke-
12
Lampiran 6 Metode pengukuran aktivitas protease (Walter 1984) Pereaksi Blanko (ul) Kasein 1% (dalam bufer fosfat 50 mM) 500 Bufer fosfat 0,1 M 50 Tirosin 5mM Enzim dalam CaCl2 2mM -
Standar (ul) 500 50 -
Sampel (ul) 500 50
Diinkubasi 10 menit pada suhu optimum TCA 0,3 M Enzim dalam CaCl2 Buffer fosfat 0,1 M Diinkubasi 10 menit
500 50 -
500 50 -
500 50
Pada kecepatan 14000 rpm ; 10 menit Na2CO3 0,4 M Filtrat Folin ciocalteu (1:2) Diinkubasi ≤ 20 menit : λ= 578 nm
2000 600 400
2000 600 400
2000 600 400
Aktivitas enzim dihitung menurut rumus: UA = A sampel - A blanko x F/T A standar - Ablanko Keterangan: UA = Jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk tirosin per menit (U/ml) A = Absorbansi F = Faktor pengenceran T = Lama inkubasi (°C) Lampiran 7 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) Komposisi pereaksi Bradford lima kali terdiri atas: Coomasie brilliant blue G-250 Ethanol 95% Asam ortofosfat Akuades
0,025 g 12,5 ml 25 ml 250 ml
Sebelum digunakan untuk mengukur kadar protein, pereaksi diencerkan lima kali dengan akuades (perbandingan 1:4) dan larutan BSA 1 mg/ml diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:9). Kurva standar BSA dibuat dengan menambahkan sebanyak 5 ml pereaksi Bradford ke dalam 0,1 ml larutan BSA (bovine serum albumin) dengan konsentrasi 0,00 mg/ml - 0,6 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 595 nm, sedangkan blanko dibuat dengan mencampurkan 0,1 ml akuades dengan 5 ml pereaksi Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm. Sampel yang akan diukur kadar proteinnya diperlakukan sama. Sebanyak 5 ml pereaksi Bradford ditambahkan ke dalam 0,1 ml sampel dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm.
13
Lampiran 8 Kurva standar Bradford 0,7 0,6
y = 1,2859x - 0,0986 R² = 0,9837
OD (595 nm)
0,5 0,4
0,6 0,5
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0
0 0,1
0 -0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Konsentrasi (mg/ml)
Lampiran 9 Aktivitas protease pada berbagai pH pH 4 5 6 7 8 9
Aktivitas protease (U/ml) CKH 7
CKK 7
0,0009 0,0008 0,0007 0,0003 0,0012 0,0009
0,0016 0,0022 0,0013 0,0010 0,0017 0,0021
Lampiran 10 Aktivitas protease pada berbagai suhu Suhu (oC) 25 30 35 40 45 50 55 60
Aktivitas protease (U/ml) CKH 7 0,0027 0,0009 0,0015 0,0016 0,0019 0,0017 0,0009 0,0012
CKK 7 0,0029 0,0037 0,0064 0,0046 0,0054 0,0020 0,0037 0,0025
0,6
14
Lampiran 11 Aktivitas protease pada berbagai senyawa kation dari garam dan EDTA 2 mM Aktivitas spesifik (U/mg)
Kation
CKH 7
CKK 7
NaCl
0,0249
0,0245
CuCl2
0,0020
0,0885
CoCl2
0,0039
0,0279
CaCl2
0,0350
0,0300
ZnCl2
0,0004
0,0129
EDTA
0,0019
0,0500
Kontrol
0,0064
0,0251
Lampiran 12 Indeks proteolitik (IP) dari 26 isolat proteolitik Kode isolat IP CKH 1 1,87 CKH 2 1,01 CKH 3 1,5 CKH 4 1,81 CKH 5 0,92 CKH 6 0,75 CKH 7 5,88 CKH 8 2,60 CKH 9 2,83 CKH 10 1,08 CKH 11 1,70 CKH 12 1,11 CKH 13 0,28 Keterangan: IP = Indeks proteolitik
Kode isolat CKH 14 CKH 15 CKH 16 CKH 17 CKH 18 CKK 1 CKK 2 CKK 3 CKK 4 CKK 5 CKK 6 CKK 7 CKK 8
IP 0,36 0,31 0,33 0,55 0,25 0,71 0,55 0,52 1,65 1,66 1,64 2,54 1,87
Lampiran 13 Ciri-ciri morfologi dari 10 isolat proteolitik terpilih Kode isolat
Warna
Elevasi
Tepian
Bentuk
Bentuk sel
Gram
CKH 1 CKH 4 CKH 7 CKH 8 CKH 9 CKK 4 CKK 5 CKK 6 CKK 7 CKK 8
putih putih putih putih putih putih putih putih putih putih
timbul timbul timbul timbul timbul timbul timbul timbul timbul timbul
berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk berlekuk
tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan tak beraturan
kokus basil basil basil basil kokus basil kokus basil basil
+ + + + +
Indeks proteolitik (IP) 1,87 1,81 5,88 2,60 2,83 1,65 1,66 1,64 2,54 1,87
