INLEIDING ACHTERGROND

→ FOOD FROM SPIRULINA

→ INLEIDING De “FOOD FROM SPIRULINA” kit en het meegeleverd materiaal vormen een interessante en vernieuwende manier om fotosynthese te bestuderen. Gebruik makend van licht, kweken de leerlingen spirulina cellen. Hierbij kunnen ze zelf vaststellen dat de suspensie donkerder groen wordt wanneer de microben toenemen in aantal. Door het gebruik van een controle medium wordt de noodzaak van koolstof gedemonstreerd, en de mate waarin fotosynthese plaatsvindt wordt ingeschat door de geproduceerde zuurstof op te vangen. De context van bemande ruimtevaart toont meteen de toepasbaarheid aan van het experiment, want zuurstof en voedsel zijn beide nuttige producten die eruit voortkomen. Op die manier worden de leerlingen gemotiveerd en worden ze aangezet tot verder denken dan het klasexperiment zelf.

→ ACHTERGROND Spirulina (Arthropira platensis - Figuur 1) is een eenvoudige, eencellige, fotosynthetische microbe. Ze behoort tot de groep van Cyanobacterieën vanwege haar blauwgroene kleur. Dikwijls wordt deze groep de blauwgroene algen genoemd, maar dit is een misleidende naam. Algen zijn immers eukaryoten (hun cellen hebben een celkern), terwijl cyanobacterieën prokaryoten zijn (hun cellen hebben geen celkern). Cyanobacterieën worden beschouwd als één van de eerste organismen die de planeet aarde koloniseerden 3,5 jaar geleden. Waarschijnlijk werd onze atmosfeer toen van zuurstof voorzien vanwege hun vermogen om aan fotosynthese te doen. Sindsdien is de atmosfeer rijk aan zuurstof, waardoor de biodiversiteit vanaf dan sterk kon toenemen. De cyanobacterieën zijn groter dan de meeste andere bacteriële cellen. Daardoor kunnen ze – in tegenstelling tot de meeste andere bacterieën – onder een gewone lichtmicroscoop bekeken worden. Ze vormen lange, groene, spiraalvormige strengen van aan elkaar hangende eencelligen. Net zoals planten is spirulina een autotroof. Dit betekent dat ze hun eigen voedsel maken: gebruik makend van zonlicht zetten ze koolstofdioxide om in glucose. In dit proces wordt water geoxideerd tot zuurstofmoleculen. De samenvattende chemische vergelijking voor fotosynthese is: 6CO2 + 6H2O -> C6H12O6 + 6O2 In deze behoorlijk eenvoudige vergelijking ziet men niet dat fotosynthese eigenlijk in 2 aparte stappen verloopt. De eerste stap staat bekend als de lichtafhankelijke stap, aangezien deze niet kan plaatsvinden zonder een bron van lichtenergie. Dit licht wordt gebruikt om watermoleculen te splitsen in zuurstof en waterstof. Bovendien wordt in deze stap ook energie opgeslagen, dat verder gebruikt zal worden – samen met waterstof – in het proces van fotosynthese. De vrije zuurstof is een afvalproduct van het totale proces, hoewel het ook door de cel zelf gebruikt wordt voor respiratie.

2

Figuur 2: Spirulina onder een lichtmicroscoop (X250)

De tweede stap staat bekend als de lichtonafhankelijke stap, want het kan ook in het donker plaatsvinden. Hier worden de opgeslagen energie en de vrijdekomen waterstof gebruikt om koolstofdioxide om te zetten in suikers met zes koolstofatomen, meestal glucose. Van deze suikers worden nadien complexere koolhydraten, aminozuren en andere biochemische componenten gemaakt. Fotosynthetische organismen hebben een sleutelrol in de koolstofcyclus omdat ze koolstofdioxide kunnen opnemen uit de lucht en fixeren in suikers. Meerdere processen voegen koolstofdioxide toe aan de atmosfeer, maar enkel via fotosynthese kan het terug verwijderd worden. Hoewel ze individueel heel kleine eencellige microben zijn, spelen spirulinabacterieën een belangrijke rol in de koolstofcyclus vanwege hun talrijk voorkomen. In een gesloten systeem is er geen netto uitwisseling van materie tussen het systeem en daarbuiten. In dat geval is het van vitaal belang dat de koolstofcyclus in perfect evenwicht is. Aangezien een gesloten systeem wel energie krijgen van daarbuiten (zoals zonlicht), zou zoiets theoretisch kunnen gebruikt worden als levensonderhoudend systeem bij een langdurige ruimtemissie. Afvalproducten van het ene organisme moet tenminste door één ander organisme gebruikt worden, en men kan gemakkelijk inzien dat spirulina hierin een rol zou kunnen spelen. Spirulina zou niet alleen voedsel kunnen produceren voor astronauten, maar ook zuurstof. De uitgeademende koolstofdioxide van de astronauten kan dan weer gebruikt worden door spîrulina voor fotosynthese. Een gezonde voeding voor mensen bevat koolhydraten, vetten (vaste vetten en olieën), eiwitten, vitaminen, mineralen, voedingsvezels, en natuurlijk water. Spirulina kan een groot deel van deze voedingsstoffen voorzien. Het is ook bekend dat spirulina een belangrijke voedselbron was voor de Azteken tot in de 16de eeuw. Vooral in de omzetting van suikers naar eiwitten is spirulina zeer efficiënt. Het wordt wereldwijd verkocht als voedingssupplement in natuurvoedingswinkels vanwege haar hoge concentratie aan eiwitten. Ook wordt het gebruikt als kostenefficiënt supplement voor diervoeders. Maar vermoedelijk heeft het meest potentie als voedsel voor mensen. Spirulina bevat alle acht essentiële aminozuren. Dit zijn de aminozuren die mensen via voeding moeten binnen krijgen, omdat we ze zelf niet kunnen aanmaken. Daarom wordt het gezien als een onmisbaar onderdeel voor bemande ruimtevluchten bij ESA. Dit aspect wordt onderzocht in het MELISSA project. Het recycleren van CO2 dat uitgeademd wordt door astronauten tot O2 en het aanmaken van biomassa voor consumptie door astronauten, brengt ons op die manier dichter tot een kunstmatig gesloten systeem in de ruimte. Spirulina gnocchi zou wel eens het eerste voedsel kunnen zijn dat op Mars gegeten wordt!

3

→ EXPERIMENTELE ACTIVITEITEN Materiaal Spirulina kit inventaris (Figuur 2): •

2 proefbuisjes met 10 mL spirulina inoculum. De buisjes zullen donderkgroen zijn bij aankomst als de spirulina nog in gezonde conditie is. Wanneer de buisjes lichtgroen of geelachtig zijn, dan zou spirulina in slechte gezondheid kunnen verkeren. Enige klontering kan zichtbaar zijn.

•

Een Ziploc zakje met bicarbonaatpoeder voor het medium (+). Het bicarbonaat voorziet een extra bron van koolstof, want het uitgeademde koolstof van de leerlingen zal mogelijks niet volstaan voor de overleving van de spirulina cellen.

•

Een Ziploc zakje met mediumpoeder zonder bicarbonaat (-).

•

2 proefbuisjes met 1 mL opgeloste microvoeding

•

2 flessen voor de celculturen

•

2 rubber doppen voor de flessen

•

2 lange siliconen buisjes

•

1 kort siliconen buisje

•

0.2 µm luchtfilter met flexibele buisaansluitingen

Wat je zelf voorziet: •

Fijne marker om op plastic te schrijven

•

Schaar

•

Lat van 30 cm

•

Elastisch lint

•

Latex handschoenen (zonder poeder) of gelijkaardige labo handschoenen. Indien u deze niet hebt, was dan uw handen grondig alvorens het materiaal aan te raken.

•

Opvangvaten voor gassen. Twee gasflessen of 2 maatcylinders van minimum 100 mL om het geproduceerde zuurstofgas op te vangen (twee propere plastic flessen van 500 mL kunnen volstaan).

•

2 grote bekers of vaten die de gasfelssen kunnen omvatten.

•

Mineraalwater (200 mL) for de spirulina flessen en kraantjeswater voor het opvnagen van gassen.

•

Houten spateltje en lucifers of aansteker

•

Uurwerk of timer

•

2 thermometers en kleefband

•

Camera (ook een telefoon met camera volstaat)

•

Filterpapier en trechters

•

Bureaulamp, bij voorkeur gloeilamp of eventueel spaarlamp.

Figuur 2: Kit inventaris

4

Aanwijzingen om voor de spirulina te zorgen Als je de kit niet meteen gebruikt, bewaar het dan op kamertempoeratuur en in zwak licht (~20oC). Spirulina is een levend organisme en heeft behoefte aan licht en voedinsstoffen om te overleven. Daarom moet de kit zo snel mogelijk gebruikt worden, en niet langer dan 5 dagen na ontvangst. Spirulina is gevoelig aan temperatuur. Temperaturen van meer dan 40°C zullen het doden, en temperaturen van minder dan 25°C zullen de groei ernstig vertragen en de productie van zuurstof verhinderen. Zodra je experiment opgestart is, moet je de temperatuur voortdurend bijhouden, en het zoveel mogelijk op de optimale temperatuur van 30°C houden. Het experiment moet naast een warmtebron opgesteld worden om dit te bekomen (radiator of bureaulamp). Blijf weg van het raam, want daar kunnen temperaturen gemakkelijk schommelen. Gezondheid en veiligheid •

Zuig niet aan het kortere buisje van de luchtfilter.

•

Blaas of zuig niet aan de langere buisjes.

•

Blaas niet hard in de fles in stap 34.

•

Eet of drink niet van de producten van dit experiment!

•

Controleer of er leerlingen zijn die latex allergie hebben alvorens de handschoenen te gebruiken.

5

→ EXPERIMENTELE OPSTELLING Leerlingen kunnen de stappen van het experiment zelf uitvoeren mits voldoende begeleiding van de leraar. Stappen 13, 15 en 18 kunnen fysiek moeilijk zijn voor sommige leerlingen. Het is aangeraden dat een volwassene deze stappen utivoert. Opmerking: als het moeilijk is om de buisjes door de rubber doppen te krijgen, probeer dan opnieuw met toevoeging van wateroplosbaar glijmiddel, of, als dit niet beschikbaar is, met een beetje lip balsem op het buisje. Let goed op bij stap 13 als je glijmiddel gebruikt. Opstelling: het inschatten van afstand, temperatuur en lichtomstandigheden 1. Was grondig je handen, en gebruik labo handschoennen indien mogelijk. 2. Maak de kit open. 3. Ga na of de inventaris klopt, en of alle uitrusting intact is. 4. Label 1 fles met een “+” en de andere met een “-“ 5. Kies de plaats waar het experiment uitgevoerd zal worden. Vermijd koude of stoffige plaatsen. 6. Plaats 1 thermometer op 50 cm van de bureaulamp en registreer de temperatuur. Steek de lamp aan en registreer de temperatuur opnnieuw na 10 minuten. 7. Plaats de thermometer 10 cm dichter, en herhaal de meting na 10 minuten. 8. Herhaal stap 7 totdat de thermometer meer dan 40 graden aangeeft. Laat de thermometer NIET OVER DE MAX TEMPERATUUR gaan. 9. Noteer de afstand waarbij je een waarde had tussen 3à en 40 graden. Je flessen worden op deze afstand van de lamp gezet. 10. Als je over een lichtmeter beschikt, meet dan de lichtintensiteit op deze afstanden en zet ze uit op een grafiek. Hiervoor zijn verschillende eenvoudige phone apps ook geschikt. De ideale lichtintensiteit is tussen 5 en 50 kilolux. 11. Maak een grafiek van je resultaten, temperatuur en lichtintensiteit Opmerking: Extreem grote lichtintensiteit kan dodelijk zijn voor spirulina, vooral als de kweek een lage dichtheid heeft. Blijf dus binnen de opgegeven grenzen. De “+” opstelling 12. Doorprik de rubber stop met een schaar van brede naar smalle zijde zo dat er twee gaten naast elkaar zijn doorheen de stop. Opmerking: Als je lip balsem gebruikt, let dan op dat het ingewreven uiteinde er niet uitkomt aan de smalle kant van de rubber stop. 13. Neem het korte siliconenbuisje en duw het voorzichtig door één van de twee gaten in de rubber stop totdat het buisje 14 cm uit de smalle zijde van de stop uitsteekt. 14. Bevestig het zachte buisuiteinde van de luchtfilter aan het buisje dat uit de brede zijde van de rubber stop komt. 15. Neem een lange siliconen buis en duw het voorzichtig door het tweede gat langs de brede zijde van de stop, totdat het net uit de smalle zijde tevoorschijn komt. 16. Leg het geheel opzij.

6

De “-” opstelling 17. Doorprik met een schaar de andere rubber stop zodat er één gat ontstaat doorheen de stop. 18. Neem een lange siliconenbuis en duw het voorzichtig door het gat langs de brede zijde van de stop, totdat het net uit de smalle zijde tevoorschijn komt. 19. Leg dit opzij. Opstelling van het vat dat gas opvangt 20. Doe 2 grote bekers of andere vaten voor ongeveer ¾ vol met kraantjeswater. 21. Doe 2 maatcylinders of 500mL flessen helemaal vol met kraantjeswater. 22. Zet de cylinders of flessen omgekeerd (met opening naar onder) in de grote bekers. Probeer hierbij al het water in de cylinders/flessen te houden. Als er per ongeluk toch lucht bijgekomen is, markeer de huidige stand van het water dan als de nullijn. Deze opstelling zal al het gas opvangen dat door spirulina geproduceerd wordt. 23. Neem de langste siliconenbuis die uit de rubber stop steekt uit de “-“ opstelling (stappen 17-19), en breng deze in de omgekeerde cylinder/fles onder water. Het buisje moet zover mogelijk in de cylinder/fles gebracht worden. 24. Doe stap 23 ook met de siliconen buis uit de “+” opstelling (stappen 12-16). Het medium klaarmaken voor in de flessen 25. Giet 100mL mineraalwater op kamertemperatuur in elke fles (‘-‘ en ‘+’). 26. Doe de inhoud van 1 klein Eppendorfbuisje (+/- 1mL) voorzichtig in elke fles. 27. To each flask, carefully add the contents (~1mL) of one small tube (Eppendorf). Knip even met je vinger tegen het buisje om de inhoud maximaal eruit te krijgen. 28. Voeg aan de “-“ fles het poeder toe dat zich in het zakje bevindt met het label “-“. Snij hiervoor het zakje af onder de Ziploc sluiting, zodat de inhoud beter kan uitgegoten worden. 29. Voeg aan de “+“ fles het poeder toe dat zich in het zakje bevindt met het label “+“. Snij hiervoor het zakje af onder de Ziploc sluiting, zodat de inhoud beter kan uitgegoten worden. 30. Sluit de flessen opnieuw met de blauwe dop en schud ze voorzichtig om de inhoud volledig op te lossen in het water. Het experiment opstarten 31. Open de fles “-“ en voeg de volledige inhoud toe van één spirulina inoculum. 32. Schud deze fles zachtjes en zet er de rubber dop op die slechts 1 lange buis heeft (stappen 1719) zodat de opening van de fles afgesloten is. 33. Open de fles “+“ en voeg de volledige inhoud toe van één spirulina inoculum. 34. Schud deze fles zachtjes en steek er de buis in die uit de smalle zijde van rubber dop “+” steekt (stappen 12-16). SLUIT DEZE FLES NOG NIET AF.

7

35. Terwijl de fles nog open is, vraag aan een leerling om 20 seconden in de filter te blazen, zodat het uitgeademde gas licht doorheen de spirulina oplossing bubbelt. 36. Sluit nu de “+” fles stevig af met de rubber stop. 37. Sluit het apparaat af door de flexibele buis over te plooien naar de filter en af te binden in deze positie met de elastiekband. 38. Markeer de gasniveaus in elke opvangfles voor gassen. 39. Plaats de hele opstelling “+” en “-“ flessen en opvnagflessen voor gassen dicht bij elkaar in jouw gekozen locatie (stappen 5-10). 40. Bevestig een thermometer aan de zijkant van elke fles om de temperatuur bij te houden. Zorg dat alle flessen rechtop blijven gedurende het hele experiment. BELANGRIJK: Over de opstelling De ideale omstandigheden zijn 30 graden Celsius en helder zonlicht; maar uiteraard is dit niet gemakkelijk na te bootsen in de klas. Probeer echter zo dicht mogelijk deze omstandigheden te benaderen door de stappen 5 tot 10 op te volgen, en probeer de temperatuur constant zo dicht mogelijk bij 30 graden te houden. Vermijd vooral ook temperatuurschommelingen.

Figuur A1: de opstelling met “+” fles.

8

Dagelijkse opvolging (zie werkblad)* Opmerking: Het kan gemakkelijk meerdere dagen duren (5-7 dagen) voordat er duidelijke gasproductie zichtbaar wordt. Dit komt door een ‘vertragingsfase’ die spirulina oploopt nadat de kweek tot 1/10 verdund werd. 41. Neem elke dag dezelfde foto van de opstelling vanaf de opstart. 42. Roer de flessen om zodat de spirulinacellen terug verspreid worden over de vloeistof. 43. Bepaal de kleur van de kweek (na omroeren) volgens de schaal die voorzien is op het werkblad. 44. Beëindig het experiment wanneer er plots bacterieën (andere dan spirulina) of gisten in de fles groeien. Kijk bij twijfel na of er een plotse toename van gassen geweest is. 45. Herhaal de stappen 41-44 totdat je ervan overtuigd bent dat er (bijna) geen gasproductie meer is in de opvangfles. Dit zou twee weken kunnen duren. OPTIONEEL: Je zou andere parameters kunnen meten, zoals pH. Maar let erop dat het openen van de rubber stop invloed kan hebben op de samenstelling en hoeveelheid van het gas dat opgevangen wordt. Op het einde van het experiment 46. Zet je gegevens uit – volume van opgevangen gas versus tijd 47. Zet je gegevens uit – kleuranalyse (gebruik de geleverde kleurschaal of je eigen methode) 48. Test het opgevangen gas: haal de lange siliconenbuis uit de opvangflessen. Zorg dat er geen gas ontsnapt, en sluit de flessen af. Draai de gasflessen om terwijl ze afgesloten zijn. Houd een vlammetje/gloei bij de fles (houten spateltje dat brandt of gloeit), en maak een kleine opening die het gas laat ontsnappen. Als er zuurstof vrijkomt, dan zal de vlam vergroten (of de gloei zal duidelijk heviger worden). 49. Test de toegenomen biomassa: Weeg een propere papierfilter. Je hebt hiervoor een weegschaal nodig die een precisie heeft van microgrammen (µg). Filter de spirulina oplossing langzaam met gebruik van de papierfilter en een trechter. Probeer het filtraat zoveel mogelijk onderaan op de filter te concentreren. Laat de papierfilter daarna ongeveer 4 dagen spontaan drogen. Weeg daarna de filter opnieuw. Het verschil in gewicht is de massa van geoogste spirulina. Het oorspronkelijke spirulina inoculum wordt geschat op een massa van ongeveer 10µg. Op het einde van het experiment kan je een massa verwachten van naar schatting 100µg. 50. Als precisieweegschalen niet beschikbaar zijn, dan kan je wel de door spirulina ingenomen oppervlakte op de papierfilter vergelijken tussen de kweken van het controlevat (-) en het experimentvat (+). Opgelet: Eet deze spirulina niet op! Finale opmerking: Als je graag na het experiment de gebruikte spirulina wilt blijven kweken in het schoollabo, dan bezorgen we de SOP het recept hieronder.

9

→ WERKBLADEN

→ WERKBLADEN 1 Afstand (cm) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Lichtintensiteit

11

Temperatuur (C)

→ WERKBLADEN 2 Dag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Temperatuur (C)

Gas (+)

Gas (-)

Ander

LABORATORY FOR MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY

PROTOCOL VERSION :

02

DATE

STANDARD OPERATING PROCEDURE

: 2009-05-27

AUTHOR:

ZARROUK-UBP

PAGE :

Culture medium for Arthrospira sp PCC8005

Ilse Coninx

1/1

1. Introduction Zarrouk is an alkaline saline culture medium for the bluegreen photosynthetic cyanobacterium Arthrospira sp.

2. Composition The medium is prepared according to the optimization of G.Cogne from UBP (G. Cogne,2002 ) In this optimised composition, the macro-elements solutions (solution 1 and 2) slightly different from the original ZARROUK macro-elements solutions (Zarrouk, 1966 ). The number of products in the trace-element solution are decreased and some elements are reduced in concentration in the new protocol.

2.1. Macro-elements Solution 1

Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL

Component

g/L

Authorized supplier

K2HPO4

0.5 g

MERCK MERCK / VWR

NaHCO3

10.5 g

MERCK / VWR

Na2CO3

7.6 g

MERCK / VWR

Solution 2

Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL

Component

g/L

Authorized supplier

NaNO3

2.5 g

MERCK / VWR

K2SO4

1.0 g

MERCK / VWR

NaCl

1.0 g

MERCK / VWR

MgSO4. 7 H2O

0.08 g or 8 mL from 1% solution

MERCK / VWR

CaCl2

0.03 g or 3 mL from 1% solution

MERCK / VWR

FeSO4. 7 H2O

0.01 g or 1 mL from 1% solution

SIGMA

EDTA

0.08 g or 8 mL from 1% solution

SIGMA

LABORATORY FOR MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY STANDARD OPERATING PROCEDURE

ZARROUK-UBP

Culture medium for Arthrospira sp PCC8005       

PROTOCOL VERSION :

02

DATE

: 2009-05-27

AUTHOR: PAGE :

Ilse Coninx

1/1

All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total volume of 1 L milliQ water. All products should be dissolved before autoclavation! Check the pH of the solutions before autoclavation The pH should be around 9.5 Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes. After cooling of all the solutions, mix 250 mL macro-element solution 1 and 250 mL macro-element solution 2 Add macro-element solution to the agar, approximately 60 à 70°C Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution

4. Storage 

Liquid zarrouk medium should be stored at 4°C and used within 6 months.



Trace-elements should be stored at 4°C and used within 1 year

5. Disposal 

If the medium is contaminated or expired, disinfect and neutralise the medium before storage in liquid waste containers.

6. References G. Cogne et All; 2002, Uptake of Macrominerals and Trace Elements by the Cyanobacterium Spirulina platensis (Arthrospira platensis PCC 8005) Under Photoautotrophic Conditions: Culture Medium Optimization DOI: 10.1002/bit.10504

LABORATORY FOR MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY STANDARD OPERATING PROCEDURE

ZARROUK-UBP

Culture medium for Arthrospira sp PCC8005

PROTOCOL VERSION :

02

DATE

: 2009-05-27

AUTHOR: PAGE :

Ilse Coninx

1/1

2.2. Trace-elements Components for 1L medium, Component

g/L

Authorized supplier MERCK / VWR

MnCl2. 4H2O

0.23 g or 23 mL from 1% solution

ZnSO4. 7 H2O

0.11 g or 11 mL from 1% solution

CuSO4. 5 H2O

0.03 g or 3 mL from 1% solution

2.3. Agar Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL Component

g/L

Authorized supplier

Agar

15 g

INVITROGEN

3. Medium preparation Liquid 

     

Agar  



All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total volume of 500 mL milliQ water. All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total volume of 1 L milliQ water. All products should be dissolved before autoclavation ! Check the pH of the solutions, The pH should be around 9,5 Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes. After cooling of all the solutions, mix 500 mL macro-element solution 1 and 500 mL macro-element solution 2 Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution All products for the macro-elements should be double concentrated All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total volume of 250 mL milliQ water. 500 mL 1,5% agar solution is prepared

CONTACT EUROPEAN SPACE AGENCY www.esa.int/education