Zpracování a využití biologického materiálu pro výzkumné účely od nemocných s monoklonální gamapatií Ing. Martina Almáši, Ph.D.
OKH-LEHABI FN Brno, Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno
Laboratoř LEHABI – OKH FN BRNO • Zpracování a archivace biologického materiálu: • Mnohočetný myelom
• MGUS • Raritní hematologická onemocnění (Waldenströmova makroblobulinémie, Castlemanova choroba, ErdhaimChesterova choroba, histiocytózy, hemangiomatózy, IgA Pemfigus, POEMS syndrom)
ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ PACIENTŮ S MG • Laboratorní analýzy MGUS a MM založeny na separaci plazmatických buněk (PB) z kostní dřeně • Patologické populace v kostní dřeni jsou heterogenní a mohou obsahovat méně zralé formy B lymfocytů
• Nedostatek nádorové frakce buněk
www.healblog.net
ZPRACOVÁVANÝ MATERIÁL • Kostní dřeň 1/ flowcytometrické rutinní vyšetření 2/ plazma KD 3/ separace PB • Periferní krev 1/ flowcytometrické rutinní vyšetření 2/ izolace DNA 3/ plazma PK 5/ sérum PK
Selekce PB z kostní dřeně 1. Odběr KD 2. Denzitní gradientová centifugace: separace mononukleárních buněk: - monocyty (20%), lymfocyty (70%) 3. Promytí peletu 4. Odstředění 5. Celkový počet mononukleárních buněk 6. Stanovení vstupní infiltrace PB 7. Separace PB
Separační techniky s použitím monoklonálních protilátek MACS (magnetic-activated cell sorting) - monoklonální protilátka konjugovaná s magnetickou partikulí, komerční soupravy k izolaci libovolné buněčné subpopulace FACS (fluorescence-activated cell sorting) - monoklonální protilátka konjugovaná s fluorochromem
SEPARAČNÍ TECHNIKY AutoMACSpro (Miltenyi Biotec)
Inkubace s protilátkou namířenou proti CD138
FACS Aria (BD Biosciences) Inkubace s 5ti fluorescenčně značenými protilátkami: CD138- PE, CD19-PC7, CD56-FITC, CD38-APC, CD45-PercP
MACS – magnetic-activated cell sorting • Buňky po inkubaci procházejí kolonou v silném magnetickém poli • Magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně a odděleny od neoznačených
• Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty
FACS –fluorescence-activated cell sorting
• Označená buňka procházející detektorem je pomocí el. výboje vychýlena ze své dráhy a směrována do sběrné zkumavky • Vysoká čistota separace
SEPARAČNÍ ALGORITMUS % plazmatických buněk v mononukleární frakci
<5%
FACS
≥5% ≥ 10 %
possel s
5 - 10 %
possel d2
MACS
Buresova et al, Clin Chem Lab Med, 2012
Přehled publikací – separace PB 1/ Fišerová A et al. Imunomagnetická separace myelomových buněk. Klin Onkol 2001; 14(2):46-50.
2/ Čumová J et al. Selekce plazmatických buněk. Klin Onkol 2008; 21(Suppl):190-194. 3/ Cumova J et al. Optimization of immunomagnetic selection of myeloma cells from bone marrow using magnetic activated cell sorting. Int J Hematol 2010;92(2):314-319.
4/ Burešová I et al. Srovnání selekce plazmatických buněk metodami MACS a FACS. Klin Onkol 2008;21(Suppl): 195-197. 5/ Buresova I et al. Bone marrow plasma cell separation – validation of separation algorithm. Clin Chem Lab Med 2012;50(6) 6/ Potacova A et al. Sample processing and methodological pitfalls in multiple myeloma research. Klin Oncol 2011; 24(Suppl):18-24.
Hlavní požadavky pro výzkumné analýzy
• Vstupní infiltrace = % CD38+138+ buněk v mononukleární frakci • Čistota PC = % plazmatických buněk v pozitivní frakci
Infiltrace vs. množství buněk Nízká inf. < 5% CD138+
Malé množství buněk
FACS sortování na mikroskopická skla
(< 40 000 buněk)
Velké množství buněk > 30 x 106
vario MACS+FACS
VarioMACS (Miltenyi Biotec)
Velmi malé množství
Vysoká inf. ≥ 5% CD138+
< 1 x 106
FACS
Normální / velké množství buněk
MACS
Buresova et al, Clin Chem Lab Med, 2012
Čistota nádorové frakce separovaných buněk (rok 2012)
MACS: CD138+CD38+ FACS: 1/ Abnormální populace PB (CD138+CD19-CD56+/-) 2/ Normální populace PB (CD138+CD19+CD56-) 3/ CD138+
Medián (min-max) [%]
Počet vzorků celkem N=195
87,6 (57,1-99,4)
N = 71
99,3 (80,8-100)
99,3 (91,3-99,9) 99,0 (85,9-99,9)
N= 124
MACS vs. FACS MACS metoda
FACS metoda
Separace podle jednoho znaku v jednom kroku
Separace podle několika znaků v jednom kroku
Čistota je závislá na vstupní infiltraci
Čistota nezávislá na vstupní infiltraci
Časově méně náročná
Časově náročná
Nižší náklady
Vyšší náklady
VÝZKUMNÉ AKTIVITY • Flow-cytometrické analýzy: - Studium detailního fenotypu B-lymfocytů a plazmocytů • Molekulárně biologické analýzy: - změny exprese genů na úrovni RNA a miRNA - dědičné predispozice (SNPs analýzy) • Proteomické analýzy: - hledání markerů lékové rezistence • Molekulárně cytogenetické analýzy: - I-FISH u MM a MGUS – del(13)(q14), del(17)(p13), disrupce IGH, t(4;14), t(11;14), t(14;16), zisk 1q21, hyperdiploidie - čipové technologie (array-CGH) - hodnocení prognostického významu chromozomových aberací ve vztahu k transformaci MGUS do MM
Čipové technologie array-CGH
Gene Expression Profile
Požadavky na čistotu a množství nádorové buněčné frakce Min. čistota
Min. množství buněk
FISH
70 %
0,04 – 0,1 x 106
aCGH
85 %
0,15 x 106
PCR
90 %
0,35 x 106
GEP
90 %
0,65 x 106
proteomika
90 %
1,0 x 106
Izolace DNA
Nanodrop ND-1000 MagNA Pure DNA izolátor (Roche)
Využití vzorků DNA z periferní krve - SNPs • Genetická variabilita populace • Single nucleotide polymorphism – záměny jedné báze v DNA
• Frekvence - 2- 40 % • Sledovány k: riziku vzniku onemocnění léčebné odpovědi
• V asociačních studiích sledováno tisíce SNPs najednou a hodnocena jejich souvislost s onemocněním • Multi-instituční studie
Kryogenní skladování
