Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
1
INDIKATOR BIOLOGI SPORE STRIP SEBAGAI PENENTU JAMINAN STERILITAS Insan Sunan Kurniawan Syah Departemen Farmasetika dan Teknologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran E-mail :
[email protected] ABSTRAK Tujuan utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak tidak adanya kontaminasi mikroba. Kontaminasi dapat berasal dari beberapa penyebab diantaranya adalah sterilisasi media yang kurang sempurna, lingkungan kerja dan pelaksanaan cara kerja saat penanaman, eksplan, molekul-molekul atau benda-benda asing berukuran kecil yang jatuh atau masuk ke dalam botol kultur setelah penanaman dan ketika diletakkan di ruangan. Jika perkembangan mikroba terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini dapat mencerminkan pembacaan positif yang salah (false-positive reading) karena masalah kontaminasi accidental dari media kultur berlangsung. Masalah kontaminasi accidental merupakan batasan yang masih tidak dapat dihindari dari uji sterilitas. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengaplikasikan penggunaan indikator biologi spore strip terhadap proses sterilisasi dengan variasi waktu pemaparan berdasarkan nilai-D untuk mencapai tingkatan jaminan sterilitas yang dipersyaratkan. Dari hasil pengujian menunjukkan bahwa waktu pemaparan proses sterilisasi untuk mencapai Tingkatan Jaminan Sterilitas dari autoklaf yang digunakan bisa dicapai dalam waktu 12 menit, yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan mikroorganisme pada media uji. Kata kunci : autoklaf, indikator biologi, nilai-D, sterilisasi, tingkatan jaminan sterilitas.
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
2
ABSTRACT The main purpose of the manufacture of sterile preparations is the absolute absence of microbial contamination. Contamination can originate from several causes are sterilizing media less than perfect, the work environment and the implementation way of working when planting, explain, molecules or foreign objects are small the fall or get into the bottle culture after planting and when placed in the room. If the development of microbes is detected in the testing of sterility. Then this may reflect false-positive reading due to accidental contamination of the media culture taking place. Accidental contamination problem is a limitation that is still unavoidable test of sterility. The purpose of this research is to apply the use of biological indicators spore strip against the sterilization process with variation of the exposure time based on the D-values to achieve a level of assurance of sterility is required. The results showed that the exposure time of the sterilization process to achieve Sterility Assurance Level of an autoclave used can be reached within 12 minutes, shown with the absence of the growth of microorganisms on the media test. Keywords: autoclave, biological indicator, D-value, sterilization, sterility assurance level.
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
3
Tidak seperti syarat banyak sediaan
PENDAHULUAN Sterilisasi adalah suatu proses yang
yang lain, syarat sterilitas adalah nilai yang
digunakan untuk menghancurkan atau
mutlak.
mengurangi mikroorganisme yang dapat
sterilitas bersandar pada uji sterilitas
muncul pada atau dalam produk atau
lengkap yang resmi, namun sediaan akhir
kemasan. (Hagman, 2005) Sediaan steril
pengujian sterilitas mengalami banyak
memiliki beberapa sifat bentuk takaran
batasan. Batasan yang paling nyata adalah
yang
dari
sifat dasar dari uji sterilitas ini adalah uji
mikroorganisme, pirogen dan bebas dari
yang destruktif sehingga hal ini tergantung
partikulat serta memiliki standar yang
pemilihan
sangat tinggi dalam hal kemurnian dan
keseluruhan. Jika diketahui bahwa satu
kualitas. Tujuan utama pembuatan sediaan
unit dari 1000 unit terkontaminasi (yakni,
steril
adanya
angka kontaminasi = 0,1%) dan 20 unit di
kontaminasi mikroba. Kontaminasi dapat
sampel secara acak dari 1000 unit,
berasal
penyebab
kemungkinan unit yang terkontaminasi
diantaranya adalah sterilisasi media yang
dari 20 sampel itu adalah 0,02. dengan kata
kurang sempurna, lingkungan kerja dan
lain, hanya 2% peluang dari unit yang
pelaksanaan cara kerja saat penanaman,
terkontaminasi akan dipilih sebagai bagian
eksplan, molekul-molekul atau benda-
20 wakil sampel dari keseluruhan 1000
benda asing berukuran kecil yang jatuh
unit. Bahkan jika unit yang terkontaminasi
atau masuk ke dalam botol kultur setelah
satu dari 20 sampel dipilih untuk uji
penanaman
sterilitas, kemungkinan uji sterilitas akan
unik,
adalah
dari
dan
seperti
mutlak
bebas
tidak
beberapa
ketika
diletakkan
di
Secara
historis,
statistik
ruangan. (Agalloco and Carleton, 2008;
gagal,
masih
Irby, 1994)
kontaminasi.
ada
pertimbangan
sampel
untuk
Konsentrasi
acak
dari
mendeteksi kontaminan
mikroba mungkin saja terlalu rendah untuk
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
4
terdeteksi selama periode inkubasi atau
mengarahkan kepada hasil yang keliru.
dapat saja tidak cukup berkembang cepat
Untuk memberikan jaminan yang lebih
atau
karena
luas dan mendukung hasil dari uji sterilitas
inkubasi.
sediaan akhir, sebaiknya ruangan produksi
tidak
sama
ketidakcukupan
sekali
media
dan
(Lukas, 2006)
steril
Jika
perkembangan
mikroba
harus
memenuhi
persyaratan,
beberapa
diantaranya
terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini
mikroorganisme
dapat mencerminkan pembacaan positif
Government, 2006; Sandle, 2008) Salah
yang salah (false-positive reading) karena
satu alat dalam sterilisasi yang paling
masalah kontaminasi aksidental dari media
umum digunakan adalah autoklaf.
kultur pada saat uji sterilitas berlangsung.
Autoklaf
aktif.
bebas
adalah
(Australian
alat
untuk
Masalah kontaminasi aksidental adalah hal
mensterilkan berbagai macam alat dan
serius, merupakan batasan yang masih
bahan yang digunakan dalam mikrobiologi
tidak dapat dihindari dari uji sterilitas.
menggunakan uap air panas bertekanan.
Food and Drug Administration (FDA)
Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja
menerbitkan pedoman mengenai prinsip
dengan
umum dari proses validasi (Australian
memberikan
Government, 2006). Titik utama yang
digunakan mikroba penguji yang bersifat
ditekankan
termofilik dan memiliki endospora yaitu
pada
ketidakcukupan
pedoman
kepercayaan
adalah dari
uji
Bacillus
sempurna jaminan
sehingga
bisa
sterilitas,
dapat
stearothermophillus,
lazimnya
sterilitas sediaan akhir dalam memastikan
mikroba ini tersedia secara komersial
sterilitas dari kumpulan sediaan steril.
dalam bentuk spore strip. Kertas spore
Batasan-batasan utama ini menunjukkan
strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan
bahwa
disterilkan. Setelah proses sterilisasi lalu
sterilitas
kepercayaan produk
memastikan
pada
akhir
sterilitas
pengujian
saja
dalam
ditumbuhkan pada media. Jika media tetap
sediaan
dapat
bening maka menunjukkan autoklaf telah
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
5
bekerja dengan baik. (Capuccino and
Seluruh prosedur pengerjaan dilakukan
Natalie, 2000; Hugo and Russel, 1998)
didalam ruang Laminar Air Flow (LAF) yang telah dibersihkan dengan alkohol
BAHAN, ALAT DAN METODE
70% 1 jam sebelum pengerjaan dan
Bahan : Alkohol 70% (Brataco), Aqua
disinari sinar UV selama 1 jam, lalu
pro injectionum bidestilata bebas pirogen
lantai ruangan percobaan dibersihkan
(IPHA
Pharma),
aquadest,
karbol,
dengan
menggunakan
desinfektan
indikator pH universal (Merck), medium
(karbol). Semua alat dan bahan yang
agar (Tripton Soy Broth dan Nutrient
akan digunakan disterilkan dengan cara
Agar) (Merck), spiritus (Brataco).
yang sesuai.
Alat : Alat-alat yang digunakan dalam penelitian antara American),
lain autoklaf (All (Memmert),
inkubator
Laminar Air Flow (LAF) kabinet, lemari pendingin (Sharp), timbangan analitik digital (Metler Todello), indikator biologi (SGMStrip Dual Species™) dan alat-alat
2. Sterilisasi Alat Seluruh alat yang digunakan dibungkus menggunakan kemudian
kertas
disterilisasi
perkamen menggunakan
autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah itu, alat kualitatif yang telah disterilisasi dimasukan ke dalam oven dengan suhu 150 0C selama 1 jam.
gelas
yang
lazim
digunakan
di (Departemen
Kesehatan
Republik
Laboratorium Teknologi dan Formulasi Indonesia, 1995; Hagman, 2005) Sediaan Steril. 3. Pembuatan medium uji Metode penelitian : Pembuatan medium agar terdiri dari: Metode
yang
akan
digunakan a. Nutrient Agar (NA)
dalam penelitian ini adalah eksperimental Ditimbang 5,75 g NA, kemudian laboratorik dengan tahapan sebagai berikut dilarutkan dengan 250 ml aquadest, lalu : didihkan sampai semua larut. Larutan 1. Penyiapan alat dan bahan.
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
6
agar disterilkan dalam autoklaf pada
5. Aplikasi indikator biologi dalam proses
suhu 121 0C selama 15 menit. (Lukas,
sterilisasi autoklaf
2006)
Prosedur
b. Trypticase Soy Broth (TSB)
dalam proses sterilasi autoklaf yaitu :
aplikasi
indikator
biologi
Ditimbang 7,5 gram TSB, kemudian
a. Tempatkan tiga buah indikator
dilarutkan dalam 250 ml aquadest, lalu
biologi spore strip di dalam autoklaf
didihkan sampai semua larut. Larutan
untuk proses sterilisasi.
agar disterilkan dalam autoklaf pada
b. Lakukan proses sterilisasi dengan
temperatur 121 0C, selama 15 menit.
variasi waktu 9; 10,5; 12; 13,5 dan 15
(Lukas, 2006)
menit (berdasarkan perhitungan D-
4. Uji cemaran mikroba LAF (dengan metode
Value).
Apus)
c. Setelah mengalami proses sterilisasi,
Secara aseptik (di meja dengan aliran
pindahkan indikator biologi spore strip
udara laminer), batang apus
steril
segera setelah autoklaf dingin. Lalu
pro
pindahkan indikator biologi spore strip
injectionum bidestilata bebas pirogen.
ke ruang LAF untuk dilakukan uji pada
Semua bahan diatas dibawa ke ruang
media pertumbuhan.
yang akan diuji cemaran mikrobanya.
d. Di dalam ruang LAF; Menggunakan
Dengan hati-hati batang apus diapus
teknik aseptik yang benar dan sesuai
pada daerah seluas 25 cm2. Batang apus
sertifikat kelas 100, pindahkan masing-
kemudian diperas ke dalam cawan petri
masing indikator biologi spore strip ke
yang berisi cairan
dalam tabung yang berisi medium
dimasukkan
cawan
petri
ke
dalam
aqua
media NA, tutup
tersebut
kemudian
pertumbuhan TSB.
diinkubasikan pada suhu 37 0C, selama
e. Inkubasikan indikator biologi spore
18 - 24 jam. (Halls,1994)
strip di dalam TSB pada temperatur 5560 0C selama tujuh hari.
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
7 0
f. Jika spora bertahan selama proses
pada temperatur 55-60
sterilisasi, media pertumbuhan akan
kontrol positif dan medium TSB steril
menjadi keruh dan gelap.
sebagai kontrol negatif.
g. Inkubasi indikator biologi spore strip
C sebagai
6. Pengamatan hasil (McCauley, 2004)
dalam medium TSB tanpa perlakuan
HASIL 1. Uji cemaran mikroba LAF (dengan metode Apus) Ruang LAF yang telah disterilkan kemudian diuji cemaran mikrobanya selama 30-48 jam pada suhu 37 0C. Dari hasil pemantauan diperoleh hasil bahwa ruang LAF steril, yang ditunjukkan dengan tidak ada pertumbuhan mikroba dalam cawan media pertumbuhan, seperti yang terlihat pada Tabel 1 di bawah ini. Tabel 1. Hasil pemeriksaan ruang LAF Cawan I II
Hasil -
Keterangan : + : ada pertumbuhan mikroba - : tidak ada pertumbuhan mikroba
2. Aplikasi Indikator Biologi dalam proses sterilisasi autoklaf Tabel 4.2 Hasil pengamatan uji aplikasi indikator biologi dalam proses sterilisasi autoklaf dalam variasi waktu Hari KeWaktu Ind. 1 2 3 4 5 6 7 No Sterilisasi Biologi +/+/+/+/+/+/+/Sampel 1 + + + + + + 1 9’ Sampel 2 + + + + + + Sampel 3 + + + + + + Sampel 1 + + + + + + 2 10,5’ Sampel 2 + + + + + + Sampel 3 + + + + + + Sampel 1 3 12’ Sampel 2 + + + + + + Sampel 3 Sampel 1 4 13,5’ Sampel 2 -
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
5
8 Sampel 3 Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3
15’
-
-
-
-
-
-
-
Kete rang
an : (+) = ada pertumbuhan mikroba (-) = tidak ada pertumbuhan mikroba medium TSB steril = kontrol negatif medium TSB steril + indikator biologi tanpa perlakuan = kontrol positif Aplikasi indikator biologi spore
langitnya dari debu dan kotoran. Lalu
strip yang dilakukan pada saat proses
bagian-bagian tersebut dibersihkan dengan
sterilisasi dengan berbagai variasi waktu
cairan
berdasarkan nilai D, menghasilkan waktu
digunakan yaitu alkohol 70 % dan fenol.
yang
yang
Alkohol merupakan disinfektan dengan
digunakan pada saat proses sterilisasi
mekanisme kerja mendenaturasi protein
adalah 12 menit dengan suhu + 1250C
dengan daya bunuh yang cepat tetapi
dengan
mudah
efektif
dengan
indikasi
pertumbuhan
autoklaf
tidak
terjadinya
mikroogranisme
pada
disinfektan.
menguap
Disinfektan
dan
terbakar,
yang
tidak
bersifat sporoidal, dan perlu waktu kontak
medium uji (TSB).
minimum 5 menit untuk mencapai tingkat
PEMBAHASAN
disinfeksi.
Ruang
LAF
yang
merupakan
mekanisme
Sedangkan kerja
fenol
dengan
memiliki
berpenetrasi
ruangan produksi sediaan steril yang
terhadap dinding sel dan mengendapkan
dikategorikan sebagai ruang kelas I atau
protein sel. Fenol memiliki spektrum yang
white area yang harus memenuhi syarat
luas sebagai disinfektan tetapi bersifat
jumlah mikroba dan partikel (Badan
korosif terhadap karet dan sebagian plastik.
Pengawas Obat dan Makanan, 2006).
Dengan menggunakan kedua disinfektan
Untuk memperoleh ruangan yang steril dan
tersebut, ruang LAF sebagai ruangan
memenuhi persyaratan jumlah mikroba dan
produksi
partikel, ruang LAF dibersihkan terlebih
mikroorganisme (Sandle, 2008).
dahulu bagian dinding, lantai, dan langit-
sediaan
steril
bebas
dari
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
9
Nilai D adalah waktu dalam menit
menyebabkan penguraian gula, degradasi
dibutuhkan
mengurangi
vitamin dan asam-asam amino, inaktifasi
populasi mikroba sejumlah 90 % atau 1 log
sitokinin zeatin riboside dan perubahan pH
siklus (1/10 bagian yang hidup) pada suhu
yang
tertentu. Nilai D sering digunakan untuk
agar (Pelczar and Chan, 2005; Hugo and
menggambarkan keefektifan suatu proses
Russel, 1998)
yang
untuk
berakibatkan
depolimerisasi
sterilisasi. Dengan diketahui nilai D maka
Pada T = 12 menit sampel 2
waktu atau suhu yang diperlukan dalam
terdapat endapan di atas permukaan media
sterilisasi akan diketahui. Pada sterilisasi
uji, ini bisa disebabkan oleh kontaminan
bioburden
yang
digunakan
stearothermophillus biologis
bakteri sebagai
karena
Bacillus indikator
masuk
Sedangkan
pada
pada
saat
sampel
pengerjaan. 1
dan
3
merupakan
menunjukkan hasil negatif, yang berarti
mikroorganisme yang paling tahan panas
tidak ada pertumbuhan mikroba pada
pada sterilisasi uap panas. Adapun nilai D
waktu 12 menit.
dari Bacillus stearothermophillus sebesar
Autoklaf
1,5 menit (Hanida, 2006;
McCauley,
2004).
yang
lebih
komplit
menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan
Faktor suhu autoklaf yang dalam
thermostat. Bila pengatur automatis ini
pengamatannya mencapai suhu 125 ºC
berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat
menyebabkan sterilisasi bisa dicapai dalam
dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan
waktu 12 menit. Ini ditunjukkan dengan
lain. Kelemahannya adalah bila salah satu
tidak ada pertumbuhan di dalam media uji
pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan
TSB. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri
persiapan media menjadi sia-sia dan
Bacillus stearothermophillus yang berada
kemungkinan
di dalam indikator biologi spore strip telah
total pada autoklaf. Sebagai sumber uap,
mati. Sterilisasi media yang terlalu lama
juga berasal dari air yang ditambahkan ke
menyebabkan
kerusakan
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016 dalam autoklaf dan
10 didihkan.
Untuk
autoklaf sederhana diperlukan beberapa proses
yang
Health and Ageing. p. 34-36. Badan Pengawas Obat dan Makanan.
kelayakan autoklaf itu. Salah satunya
2006. Pedoman Cara Pembuatan
pengujian dengan menggunakan indikator
Obat yang Baik. Jakarta: Badan
biologi. Pengujian lain bisa dilakukan
POM RI. hal. 145-152.
menggunakan
bisa
Department of
menjamin
dengan
validasi
Goods. Australia:
indikator
kimia
Capuccino, JG and S Natalie. 2000.
ataupun indikator fisika (Irby, 1994)
Microbiology
SIMPULAN
Manual.
California:
Benjamin/Cummings
Publishing
Indikator biologi spore strip yang diaplikasikan
pada
proses
sterilisasi
menggunakan autoklaf dapat menentukan
A
Laboratory
Company Inc. p. 139-148 Departemen
Kesehatan
jaminan sterilitas, dimana waktu sterilisasi
Indonesia.
yang efektif untuk memberikan jaminan
Indonesia. Edisi Keempat. Jakarta:
sterilitas adalah 12 menit dengan suhu +
Departemen Kesehatan Republik
1250C dengan indikasi tidak terjadinya
Indonesia. hal. 9; 855; 1110-1114.
pertumbuhan
mikroogranisme
pada
1995.
Republik Farmakope
Hagman, DE. 2005. Sterilization. In:
medium uji.
Remington;
DAFTAR PUSTAKA
Practice of Pharmacy. 21st Edition.
Agalloco, J and FJ Carleton. 2008.
Philadelphia: Lippincott Williams
Validation
of
Pharmaceutical
Process. Third Edition. New York: Informa. p. 1-4: 187-222 Australian Government. 2006. Therapeutic Good Administration Guidelines for Sterility Testing of Therapeutic
The
Science
and
and Witkins. p. 776. Halls, NA. 1994. Achieving Sterility in Medical
and
Pharmaceutical
Products.
New
York:
Dekker. p. 82-86.
Marcel
Farmaka Vol. 14 No. 1 2016
11
Hagman, DE. 2005. Sterilization. In: Remington;
The
Science
Marcel Dekker Inc. New York. p.
and
Practice of Pharmacy. 21st Edition.
2-4. McCauley, K. 2004. Product d-value
Philadelphia: Lippincott Williams
studies:
and Witkins.
developing a sterilization process.
Hanida.
2006.
p.776.
Metode
bioburden.
overkill
dan
Tersedia
1(3).
di:
and
AD
Russel.
when
Available
at: Diakses
Pelczar, MJ and ECS Chan. 2005. Dasar-
1998.
dasar
Mikrobiologi.
Jakarta:
Pharmaceutical Microbiology. 6th
Universitas Indonesia Press. hal.
Edition.
131-135
London:
Blackwell
Science. p. 25-27.
Sandle,
Irby, T. 1994. Pembersihan, Sterilisasi dan Penyimpanan.
Tersedia
http://www.uaf.edu
di:
[Diakses
tanggal 16 April 2014] Lukas,
tool
tanggal 23 November 2014.
Diakses tanggal 14 April 2014. WB
critical
www.sgmbiotech.com
http://www.depkes.go.id.html
Hugo,
a
S.
2006.
Formulasi
Steril.
14; 82-84; 86-99. Marino, FJ and F Benjamin. 1986. Industrial sterilization. In: Kenneth E. Avis, Leon Lachman, and
Pharmaceutical
A
2008.
Environmental
Monitoring in a Sterility Testing Isolator.
Available
(editors). Dossage
Form:
Parenteral Medications. Vol 2.
at:
http://www.pharmig.org.uk/pages/a rticles/envmon.html
Yogyakarta: Penerbit Andi. hal. 9-
Herbert
T.
tanggal 16 April 2014]
[Diakses
