Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
Efektivitas Konsentrasi Sorbitol dalam Medium Purifikasi dalam Menghasilkan Jumlah Sel Viabel pada Isolasi Sel Mesofil Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban). Ika Puspitasari I*, Sri Haryanti*, Erma Prihastanti* *Laboratorium Biologi Struktur dan Fungsi Tumbuhan FMIPA UNDIP Abstract Research abaut used sorbitol on purification media for sum cell viable product and effective sorbitol consentration to highes sum viable cell isolation phase pegagan mesophyl cell. Randomized Complete Design with 6 treatmen and 4 block. Sorbitol consentration in purification media was treatmen 0 g/L, 25 g?L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L and 125 g/L. Parameter was sum of total cell, sum of viabel cell and cell viability. The result of this experiment indicated that the sorbitol in purification media gave the significant effect on the sum cell viabel and cell viability. Effective sorbitol consentration was 25 g/L with obtain sum cell 13,19 x 107 cell/ml and cell viability 99,39%. Key words : sorbitol, cell purification, cell viability Abstrak Telah dilakukan penelitian mengenai pengaruh penggunaan sorbitol dalam medium purifikasi untuk menghasilkan jumlah sel viabel dan konsentrasi sorbitol yang efektif untuk mendapatkan jumlah sel viabel yang paling tinggi pada tahap isolasi sel mesofil pegagan. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok terdiri dari 6 perlakuan dengan 4 kelompok/blok. Konsentrasi sorbitol dalam medium purifikasi yang digunakan sebagai perlakuan adalah 0 g/L, 25 g/L, 50g/L, 75g/L, 100g/L dan 125g/L. Parameter yang diamati meliputi perolehan jumlah sel total, jumlah sel viabel dan viabilitas sel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sorbitol dalam medium purifikasi mempengaruhi jumlah sel viabel dan viabilitas sel. Konsentrasi sorbitol paling efektif adalah 25 g/L dengan perolehan jumlah sel 13,19x107 sel/mL dan viabilitas sel 99,35%. Kata kunci : sorbitol, purifikasi sel, viabilitas sel
PENDAHULUAN
senyawa
triterpenoid
yaitu
asam
Pegagan (Centella asiatica (L.)
asiatikat, asam madekasat, asiatikosida
Urban) merupakan salah satu jenis
dan madekasosida. Kegunaan pegagan
tumbuhan yang memiliki khasiat sebagai
antara lain obat sakit perut, luka, obat
obat.
Khasiat obat dalam pegagan ini
cacing, kencing batu, demam, pembersih
berasal dari kandungan senyawa kimia
darah, batuk kering dan hidung berdarah.
hasil metabolisme sekundernya. Menurut
Senyawa metabolit sekunder
Handra (2002) pegagan mengandung
dapat diperoleh secara konvensional
30
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
yaitu ekstraksi langsung.
Cara ini
menjalankan metabolismenya dimana ini
membutuhkan bahan baku tumbuhan
merupakan faktor yang mempengaruhi
dalam jumlah banyak Sejalan dengan
keberhasilan
berkembangnya teknik kultur in-vitro
menghasilkan
maka semakin banyak penelitian yang
sekunder yang diinginkan (Prihastanti,
dilakukan
l999).
kultur
sel
,sehingga
senyawa
metabolit
dengan
metode
tersebut.
digunakan
untuk
metode
Dalam proses pemisahan sel
propagasi tumbuhan, teknik kultur in-
(isolasi sel) dan purifikasi sel diperlukan
vitro
untuk
adanya zat yang dapat mempertahankan
metabolit
tekanan osmotik sel, sehingga sel hasil
Selain
juga
dapat
digunakan
memproduksi
senyawa
sekunder
dengan cara
yaitu
kultur
suspensi sel.
isolasi
tidak
mudah
rusak
atau
mengalami plasmolisis karena kondisi
Kultur suspensi sel merupakan
lingkungan yang tidak sesuai (hipotonis
sel atau sekumpulan sel yang dikulturkan
maupun
dalam medium cair tertentu (Bhojwani
konsentrasi
and Razdan, l983). Dalam kultur ini
perpindahan air dari dalam sel maupun
biasanya menggunakan eksplan yang
ke luar sel. Sel akan tetap viabel apabila
berasal dari kalus, tetapi untuk studi
diletakkan
tertentu
sel mesofil daun lebih sesuai
sehingga pada kondisi tersebut tidak ada
karena kemampuan diferensiasinya lebih
kecenderungan air untuk masuk sel.
baik. Hal ini ditunjukkan dalam sel
Larutan
mesofil adanya keseragaman morfologi
mempertahankan
dan genetik, tersususn atas sel dalam
osmotik sel disebut dengan osmotik
jumlah banyak serta relatif tanpa mutasi.
stabilizer
Untuk melakukan kultur suspensi sel
Bhojwani and Razdan (1983) zat yang
harus
digunakan sebagai osmotikum adalah
melalui
tahapan
kerja
yaitu
hipertonis). larutan
dalam
yang
Perbedaan mempengaruhi
larutan
digunakan
untuk
stabilitas
(osmotikum).
tekanan Menurut
pemisahan sel dari jaringan, purifikasi sel
sorbitol,
dan kultur sel (Santoso dan Nursandi,
sukrosa.Sorbitol merupakan gula alkohol
2003).
,senyawa yang merupakan fotoasimilat Pada
dan
utama dalam banyak spesies familia
diperlukan banyak sel-sel viabel untuk
Rosaceae. Rumus kimianya C6H14O6.
dijadikan
mempunyai
Sorbitol merupakan alditol hasil reaksi
viabilitas tinggi.Viabilitas sel ditentukan
reduksi glukosa menggunakan natrium
dari kemampuan sel untuk hidup dan
borohidrida (NaBH4), dengan nama lain
eksplan
dan
suspansi
mannitol
sel
31
kultur
glukosa,
isotonis,
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
D-glucitol yang secara komersial sebagai
yang diperoleh dari hasil isolasi sel.
pemanis (Achmadi,2003)
Penghitungan
Pada beberapa penelitian disebutkan
menggunakan hemositometer (Gamborg
penggunaan
and Phillip,l995 dan Barker, l998)
sebagai
sorbitol
osmotokum
dan
mannitol
adalah
berkisar
antara 450 mmol/L – 800 mmol/L (81,9 g/L
–
145,6
menyebutkan
g/L).
Adapula
penggunaan
jumlah
sel
viabel
METODOLOGI
yang
Penelitian
ini
dilaksanakan
sorbitol
dengan menggunakan Rancangan Acak
sebesar 13% (130 g/L) untuk isolasi
Kelompok (RAK) dengan 6 perlakuan
protoplas (Reinert and Bajaj, 1989).
masing-masing ulangan sebanyak 4 kali.
Dixon (1987) menyatakan bahwa pada
Ulangan
medium purifikasi sel mesofil tumbuhan
karena dilakukan pada hari yang berbeda.
tomat digunakan sorbitol dengan kisaran
Perlakuan yang dimaksud adalah :
antara 54 g/L – 100g/L.
P0
=
Untuk memperoleh viabilitas sel yang optimal diperlukan konsentrasi sorbitol
yang
tepat.
P1
=
dan
purifikasi
sel.
P2
=
P3
=
and Gray (2000) menyatakan bahwa viabilitas yang bagus berkisar antara 90%
-
95%,
sedangkan
Medium
purifikasi
dengan
Medium
purifikasi
dengan
Medium
purifikasi
dengan
konsentrasi sorbitol 75 g/L P4
=
sebagai osmotikum akan menghasilkan jumlah sel viabel yang tinggi. Trigiano
dengan
konsentrasi sorbitol 50 g/L
Diharapkan
konsentrasi yang efektif dari sorbitol
purifikasi
(blok)
konsentrasi sorbitol 25 g/L
akan mempengaruhi jumlah sel viabel yang dihasilkan dari proses isolasi sel
Medium
kelompok
konsentrasi sorbitol 0 g/L
Perbedaan
konsentrasi sorbitol sebagai osmotikum
dijadikan
Medium
purifikasi
dengan
konsentrasi sorbitol 100 g/L P5
=
Medium
purifikasi
dengan
konsentrasi sorbitol 125 g/L Cara Kerja
menurut
a. Pemilihan
Prihastanti (l999) dalam penelitiannya
Eksplan
dan
Sterilisasi
mengenai isolasi sel mesofil pegagan
Sumber ekplan berupa daun
diperoleh viabilitas sel yang tinggi
pegagan (Centella asiatica (L.) Urban)
berkisar antara 93,5% - 100%..Untuk
diambil dari daerah Tembalang. Daun
mengetahui
sel
sebagai eksplan dipilih yang bagus dan
dilakukan dengan cara membandingkan
segar tanpa serangan penyakit. Daun
jumlah sel viabel dengan seluruh sel
yang digunakan adalah urutan ke 2, lalu
32
persentase
viabilitas
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
ditimbang 1 g kemudian dicuci dengan
lapisan sel dalam tabung sentrifus.
deterjen selama 2 menit dan dibilas air
Supernatan pada permukaan dan lapisan
mengalir Eksplan dimasukkan dalam
bawahnya dibuang. Sel pada bagian
larutan pemutih pakaian 5% selama 2
dasar tabung sentrifus diambil sebanyak
menit lalu dibilas akuades 3 kali. Eksplan
1 mL, ditetesi larutan safranin 1% lalu
yang telah steril dutaruh dalam cawan
dihitung
petri
yang
dialasi
tisu
basah lalu
disimpan di almari pendingin besuhu 0
20 C selama 24 jam.
jumlahnya
dengan
hemositometer,
diamati
viabilitasnya
serta
selnya
diukur
menggunakan
mikrometer.
b. Isolasi Sel
d. Parameter
Ekplan diambil lalu dicuci
1. Jumlah sel (sel/mL) l dihitung
akuades dan diletakkan dalam cawan
menggunakan
petri.
hati-hati
di bawah mikroskop. Rumus =
epidermis bawah daun dibuang dan juga
5n x 104 per mL, dimana n =
tulang daunnya, lalu dipotong ± 1 mm,
jumlah sel pada triple line
lalu masukkan ke labu Erlenmeyer 25
square (Dixon dan Gonzales,
mL
l994).
Kemudian
yang
secara
berisi
medium
maserasi
hemositometer
sebanyak 10 mL lalu diinkubasi 15 menit
Sel
dengan magnetis stirer berkecepatan 300
menggunakan larutan safranin
rpm.
1%, sel yang viabel tidak akan
dengan
terwarnai, sedangkan sel yang
c. Purifikasi Sel Setelah
diamati
mencapai
masa
mati berwarna merah
inkubasi sel disaring dengan nylon mesh
2. Viabilitas sel (%) .Rumus =
untuk membuang sisa jaringan yang
n/m x 100% , dimana n =
tidak tercerna. Filtrat yang diperoleh
jumlah sel viabel dan m =
dicuci
jumlah sel total.
dengan
medium
purifikasi
sebanyak 10 mL dan disentrifugasi
Data yang diperoleh dianalisis
dengan kecepatan 500 rpm 5 menit.
dengan anova pada taraf 95%, dan hasil
Supernatan pada lapisan pertama dan ke
yang berbeda nyata antar perlakuan
2 diambil dengan pipet kemudian pelet
dilanjutkan uji DMRT taraf kepercayaan
yang tersisa dicuci kembali dengan
95%
medium purifikasi dan disentrifugasi. Perlakuan tersebut diulang 3 kali. Pada akhir purifikasi akan diperoleh 1 - 3
33
(Sastrosupadi,2000)
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
HASIL DAN PEMBAHASAN Tabel l. Rerata jumlah sel, viabilitas sel dan ukuran sel mesofil pegagan (Centella asiatica (L.)Urban) setelah perlakuan perbedaan konsentrasi sorbitol dalam medium purifikasi
Jumlah
Jumlah
sel Total
sel Viabel
(sel/mL)
(sel/mL)
P0
2,89 × 107e
P1
Perlakuan
Viabilitas sel
Ukuran Sel
(%)
(µm)
2,87 × 107e
98,88c
13,32 – 28,86
13,28 × 107a
13,9 × 107a
99,35ab
13,32 – 28,86
P2
9,76 × 107b
9,70 × 107b
99,42a
13,32 – 28,86
P3
7,68 × 107c
7,62 × 107c
99,08abc
13,32 – 28,86
P4
6,34 × 107d
6,18 × 107d
98,97bc
13,32 – 28,86
P5
0,53 × 107f
0,51 × 107f
96,47d
13,32 – 28,86
(g/L)
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama diikuti dengan abjad yang sama
menunjukkan
tidak ada beda nyata berdasarkan Uji Duncan Multiple Range Test pada taraf kepercayaan 95%
Perolehan
jumlah sel
viabel
(125 g/L) menunjukkan beda nyata. Hal
berdasarkan Hasil Uji Sidik Ragam
ini
dengan Rancangan Acak Kelompok
konsentrasi
(RAK)
purifikasi
menunjukkan
ada
pengaruh
perlakuan terhadap jumlah sel viabel,
menunjukkan
menunjukkan
untuk
kelompok
pengaruh
tidak
terhadap
perbedaan
dalam
mempengaruhi
medium perolehan
jumlah sel viabel.
karena F hitung lebih besar dari F tabel. Sedangkan
sorbitol
bahwa
Data pada tabel 01 menunjukkan bahwa perolehan jumlah sel viabel tertinggi
diperoleh pada
perolehan jumlah sel viabel karena F
sorbitol
25
hitung lebih kecil daripada F tabel.
konsentrasi 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 0
Setelah dilakukan uji lanjut dengan Uji
g/L dan 125 g/L. Sedangkan untuk
DMRT (Duncan’s Multiple Range Test)
viabilitas sel, konsentrasi sorbitol 50 g/L
pada taraf kepercayaan 95% seluruh
menunjukkan
perlakuan P1 (0 g/L), P2 (25 g/L), P3 (50
tinggi, namun untuk seluruh perlakuan
g/L), P4 (75 g/L), P5 (100 g/L), dan P6
34
g/L,
konsentrasi
diikuti
viabilitas
yang
dengan
paling
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
menunjukkan
viabilitas
sel
yang
cenderung sama/ seragam.
bersifat isotonis, dimana tekanan osmotik di dalam sel dan diluar sel adalah sama,
Perlakuan konsentrasi 0 g/L
sehingga kemungkinan hanya sedikit
menunjukkan jumlah sel viabel dan
atau bahkan tidak terjadi perpindahan air
viabilitas
rendah
kedalam maupun keluar sel. Sorbitol
dibandingkan dengan konsentrasi 25 g/L,
mempertahankan tekanan osmotik sel
50 g/L, 75 g/L, dan 100 g/L, karena
dengan cara mempertahankan tekanan
kemungkinan medium purifikasi masih
osmotik lingkungan luar sel. Konsentrasi
bersifat hipotonis. Apabila sel diletakkan
sorbitol
dalam medium yang bersifat hipotonis
purifikasi akan menghasilkan jumlah sel
secara terus-menerus maka sel akan
viabel dan viabilitas sel yang tinggi.
pecah akibat masuknya air dari medium
Dalam penelitian tentang kultur suspensi
ke dalam sel. Hal tersebut disebabkan
sel Ipomoea batata, Wang et al (1999)
karena belum ada zat yang berperan
menyebutkan
sebagai
untuk
kultur tidak masuk dan dimetabolisme
tekanan
dalam sel melainkan hanya sebagai
sel
yang
lebih
osmotikum
mempertahankan
stabilitas
osmotik sel. Sel-sel yang telah terisolasi
yang
tepat
pada
sorbitol
dalam
medium
media
osmotikum.
memiliki sifat peka terhadap lingkungan
Viabilitas sel pada perlakuan P3
luar, sehingga diperlukan adanya zat
(50 g/L) menunjukkan persentase yang
terbaik serta konsentarsi yang paling
paling
tepat untuk mengatasi sel agar tidak
viabelnya lebih rendah dibandingkan
pecah. Zat tersebut dikenal dengan
dengan
osmotic stabilizer (osmotikum). Menurut
Kemungkinan
Bhojwani and Radzan (1983) zat yang
tersebut kondisi medium purifikasi sudah
digunakan sebagai osmotikum adalah
mulai
sorbitol.
semakin bertambahnya sorbitol pada
Jumlah sel viabel mengalami peningkatan
yang sangat tajam dari
tinggi,
namun
perlakuan
P2
dengan
bersifat
jumlah (25
sel g/L).
konsentrasi
hipertonis.
Karena
medium purifikasi akan menyebabkan konsentrasi medium semakin hipertonis.
perlakuan P1 (0 g/L) ke perlakuan P2 (25
Viabilitas sel berdasarkan Hasil
g/L). Perlakuan konsentrasi sorbitol P2
Uji DMRT (Duncan’s Multiple Range
(25 g/L) menunjukkan hasil perolehan
Test)
jumlah sel viabel yang paling tinggi dan
menunjukkan adanya beda nyata antar
viabilitas
perlakuan.
yang
tinggi
pula,
karena
kemungkinan medium purifikasi mulai
35
pada
taraf Hal
kepercayaan 95% ini
berarti
bahwa
perbedaan perlakuan konsentrasi sorbitol
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
berpengaruh
terhadap
perolehan
menyebutkan bahwa sorbitol yang dapat
viabilitas sel. Perlakuan P1 (0 g/L) tidak
menyebabkan
beda nyata dengan P4 (75 g/L) dan P5
plasmolisis
(100 g/L), dimana ketiga perlakuan
konsentrasi 0,6 M (109,2 g/L). Menurut
tersebut mempunyai viabilitas sel yang
Raven et al. (1986) apabila sel tumbuhan
cenderung sama. Perlakuan P2 (25 g/L),
ditempatkan dilarutan yang hipertonis,
P3 (50 g/L), dan P4 (75 g/L) juga tidak
maka akan terjadi peristiwa kehilangan
menunjukkan
air dalam sel melalui proses osmosis, hal
beda
nyata,
karena
stress adalah
sorbitol
dan
dengan
memiliki persentase viabilitas sel yang
ini
tidak jauh berbeda, artinya perbedaan
terlepas dari dinding sel (plasmolisis).
perlakuan konsentrasi tersebut memiliki
Meskipun tekanan
osmotik
persentase viabilitas sel yang cenderung
purifikasi
hipertonis,
seragam. Tetapi perlakuan P6 (125 g/L)
menyebabkan seluruh sel mati pada
berbeda nyata dengan P1 (0 g/L), P2 (25
proses isolasi sel, karena kemungkinan
g/L), P3 (50 g/L), P4 (75 g/L) dan P5
masih ada sel yang dapat beradaptasi
(100 g/L). Perlakuan P6 (125 g/L)
dengan konsentrasi tersebut. Menurut
menghasilkan viabilitas sel yang paling
Street (1974) banyak sel mengalami
rendah diantara perlakuan yang lainnya,
kematian ketika suspensi sel ditransfer ke
karena kemungkinan sudah banyak sel
dalam medium yang memiliki tekanan
yang
osmotik tinggi, tetapi masih ada sel yang
mati
karena
plasmolisis.
menyebabkan
osmotik
telah
membran
medium tidak
Konsentarsi sorbitol 125 g/L mungkin
memperlihatkan
telah menyebabkan kondisi medium
berangsur-angsur untuk tumbuh di bawah
purifikasi bersifat hipertonis.
tekanan osmotik yang tinggi tersebut.
Perlakuan konsentrasi sorbitol
Berdasrkan
adaptasi
plasma
hasil
secara
penelitian
125 g/L menunjukkan perolehan jumlah
isolasi sel menggunakan urutan daun
sel viabel dan viabilitas sel yang paling
kedua diperoleh sel dengan ukuran yang
rendah dibandingkan dengan perlakuan
hampir seragam yaitu berkisar antara
konsentrasi
lain.
13,32 μm – 28,86 μm. Menurut Santosa
Kemungkinan hal ini disebabkan sel
dan Nursandi (2003) sel-sel penyusun
sudah banyak yang mati dan pecah
mesofil memiliki ukuran 15 μm – 100
karena
bersifat
μm dan masih mengalami pertumbuhan.
hipertonis. Menurut Wang et al. (1999)
Sedangkan menurut Fahn (1991) jaringan
dalam penelitiannya mengenai kultur
mesofil disusun oleh sel-sel parenkim
suspensi
palisade dan spongiosa yang ukuran 10
36
sorbitol
medium
sel
yang
purifikasi
Ipomoea
batatas
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
μm – 100 μm. Sel mesofil hasil isolasi pada penelitian ini memiliki ukuran yang relatif kecil karena diduga
masih
mengalami pertumbuhan. Hal ini sesuai pendapat Prihastanti (1999) bahwa daun urutan kedua memiliki viabilitas lebih tinggi dibandingkan
urutan daun lain
serta memiliki ukuran sel yang relatif kecil, seragam dan jumlahnya banyak, karena daun tersebut masih mengalami pertumbuhan Pengamatan
sel
dilakukan
dengan menggunakan pewarna safranin 1% dimana sel yang mati akan berwarna merah dan sel yang viabel tidak akan terwarnai. safranin
Menurut adalah
merupakan
zat
Suntoro
(1983)
suatu
klorida
dan
warna
basa
yang
kuat.Safranin dapat masuk
dalam sel
karena dinding sel dan membran sel telah rusak karena plasmolisis. KESIMPULAN 1. Perbedaan konsentrasi sorbitol dalam medium purifikasi sel mempengaruhi
perolehan
jumlah sel viabel 2. Konsentrasi
efektif
dan
penggunaan
sorbitol
dalam
medium purifikasi adalah 25 g/L. Perolehan
jumlah sel
viabel
tertinggi yaitu 13,19 x 107 sel/mL dengan viabilitas sel sebesar 99,35%
37
DAFTAR PUSTAKA Achmadi, S.S. 2003. Kimia Organik Suatu Kuliah Singkat. Edisi kesebelas. Erlangga. Jakarta. Barker, K. l998. At The Bench A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New york. Bhojwani, S.S and Razdan. L983. Plant Tissue Culture: Theory and Practice. Elsevier Science Publisher.Amsterdam. Dixon, R.A. l987. Plant Cell Culture a Practical Approach. IRL Prass. Oxford. Washington DC. Dixon, R.A and R.A Gonzales. L994. Plant Cell Culture A Practical Approach. Secon edition. Oxford University Press. New York. Fahn. A. l99l. Anatomi Tumbuhan. Edisi 3. Universitas Gadjah Mada Press. Yogyakarta. Gamborg and G.C. Phillips. L995. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Springer – Verlag Berlin Heidelberg. New york. Handra, H. 2002.Pegagan, Tumbuhan Terlupakan kaya Manfaat Anti Cellulite. http//www.kompas/kompas cetak/0404/02/ilpeng/html. Prihastanti, E. L999. Isolasi Sel Mesofil Daun Pegagan (Centella asiatica (L) Urban). Sellula, Vol 7 No 2 Oktober l999. MIPA UNDIP Semarang. Raven, P.H ; R.F. Evert; S.E.Eichorn. l986. Biology of Plants. Fourth Edition Hort Publiser, Inc. New York Reinert, J and Y.P.S. Bajaj. l989. Aspect of applied and Fundamental Plant cell, Tissue and Organ Culture. Narosa Publishing House. New Delhi Santoso, U dan F.Nursandi.2003. Kultur Jaringan Tanaman. Universitas Muhammadiyah Malang Press, Malang
Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XIV, No. 2, Oktober 2006
Sastrosupadi, A. 2000. rancangan percobaan Praktis Bidang Pertanian. Kanisius. Yogyakarta. Street, H.E. l974. Tissue Culture and Plant Science. Botanical laboratorie University of Leicester. England. Suntoro. H. l983. Metode pewarnaan. Penerbit Bhatara Karya Aksara.Jakarta. Trigiano. N.R and D.J Gray. 2000 Plant Tissue Culture and Laboratory 2 nd. CRC Press Washington DC
38
Wang, Heng-Long; Ping-Du Lie; Li –Fei Liu; Jong-ching Su. L999. Effect of Sorbitol Induced Osmotic Stress On The Change of Carbohidrate and Free Amino Acid Poll in Sweet Potato (ipomoea batatas) Cell Suspention Culture.http://www.osti:gov/energ ycitationes/product.Biblib.Jsp?Osti _ide6550115
