28
III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April 2015 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose, autoclave model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca analitik Ainsworth AA-160, waterbath shaker incubator STUART SSL2, sentrifuga model 225 Fisher Scientific, lemari pendingin, mikropipet Eppendorff, waterbath HAAKE W19, penangas Precisterm JP’ selecta, magnetic stirrer STUART (stir CB161 dan heat-stir CB162), termometer, batang pengaduk, spatula, dan spektrofotometer UV-VIS Carry Win UV 32.
Adapun bahan-bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah NA (Nutrient Agar), CM-Sephadex G-100, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, glukosa, yeast, pepton, NaCl, akuades, alkohol, DNS (dinitrosalisilic acid), NaOH, fenol,
29 Na2SO3, Na(K)-tartarat, NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, CuSO4.5H2O, reagen follin ciocalteau, kantong selofan, dan kalsium alginat.
Sedangkan mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri B. subtilis ITBCCB148 penghasil enzim protease yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung.
C. Prosedur Penelitian
1.
Pembuatan media inokulum dan fermentasi, inokulasi B. subtilis ITBCCB148 dan produksi enzim protease
a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi Media inokulum dan fermentasi yang digunakan terdiri dari (gL-1) KH2PO4 0,1; MgSO4 0,005; glukosa 0,25; yeast 0,5, pepton 0,5, NaCl 0,25 yang dilarutkan dalam akuades, kemudian disterilkan pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm, selama ±15 menit dalam autoklaf.
b. Inokulasi B. subtilis ITBCCB148 Sebanyak 3 ose B. subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam 100 mL media inokulum secara aseptis lalu dikocok dalam waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 35ºC selama 24 jam.
30 c. Produksi enzim protease Produksi enzim protease dilakukan dengan cara memindahkan sebanyak 2% media inokulum dari jumlah media fermentasi ke dalam media fermentasi secara aseptis lalu dikocok dalam waterbath shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 35ºC selama 72 jam.
2.
Isolasi enzim protease
Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Media fermentasi yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4ºC selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim protease. Ekstrak kasar enzim protease kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Kunitz dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
3.
Uji aktivitas dan kadar protein enzim protease
a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas enzim protease metode Kunitz
Larutan kasein : 1 gram kasein dilarutkan dalam 100 mL bufer fosfat pH 7 pada penangas air mendidih. Larutan TCA
: 5 gram TCA dilarutkan dalam 100 mL akuades.
Larutan standar : larutan tirosin dengan kadar 50-350 g/mL.
31 b. Pengujian aktivitas enzim protease metode Kunitz
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 mL larutan kasein, 1 mL larutan enzim. Diinkubasi pada suhu 35ºC selama 30 menit, setelah itu inkubasi dihentikan dengan penambahan 3 mL larutan TCA secara tepat, larutan diaduk dengan baik dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar agar pengendapan berjalan sempurna.
Endapan
(gumpalan protein) yang terbentuk dipisahkan dengan penyaringan atau
sentrifugasi.
Absorbansi
filtrat
diukur
menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm. Kontrol dibuat dengan memasukkan 1 mL larutan enzim, 3 mL larutan TCA, kemudian diinkubasi dengan perlakuan yang sama pada sampel. Aktivitas enzim dihitung berdasarkan jumlah asam amino (peptida sederhana) yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar Tirosin.
c. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim protease metode Lowry
Pereaksi A
: 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N.
Pereaksi B
: 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan ke dalam 5 mL larutan Na(K)-tartarat 1%.
Pereaksi C
: 2 mL pereaksi B ditambah dengan 100 mL pereaksi A.
32 Pereaksi D
: reagen follin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.
Larutan standar
: larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 dan 140 ppm.
d. Penentuan kadar protein enzim protease metode Lowry
Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951). Penentuan kadar protein ini bertujuan untuk mengatur aktivitas spesifik dari protein enzim protease. Sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambah dengan 0,9 mL akuades. Lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C, diaduk rata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades. Selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk menentukan kadar protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).
4.
Pemurnian enzim protease
Pada penelitian akan dilakukan pemurnian enzim dengan fraksinasi menggunakan ammonium sulfat dan dialisis. Proses pengerjaannya sebagai berikut :
33 a. Pengendapan dengan ammonium sulfat [(NH4)2SO4]
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)% untuk mengetahui pada fraksi mana enzim protease terendapkan.
Skema proses
pengendapan protein enzim dengan penambahan garam ammonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 13.
Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer pada suhu 4ºC. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30 menit dan dicuci dengan bufer fosfat 0,1 M pH 6. Kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Kunitz, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi (0-20)% digunakan untuk diendapkan dengan fraksi kejenuhan selanjutnya dengan prosedur yang sama.
34
Ekstrak Kasar Enzim + (NH4)2SO4 (0-20%) Endapan(F1)
Filtrat + (NH4)2SO4 (20-40%)
Endapan(F2)
Filtrat + (NH4)2SO4 (40-60%)
Endapan(F3)
Filtrat + (NH4)2SO4 (60-80%)
Endapan(F4)
Filtrat + (NH4)2SO4 (80-100%)
Endapan(F5)
Filtrat
Gambar 13. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan ammonium sulfat
b. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M pH 5 selama ±24 jam pada suhu dingin.
Selama dialisis, dilakukan
pergantian larutan bufer selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam
35 kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl2.
Bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan
terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Kunitz serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
5.
Amobilisasi enzim protease hasil pemurnian dengan kalsium alginat
Sebanyak 2 mL enzim protease dimasukkan dalam 6 mL larutan Naalginat 4%, lalu diaduk hingga rata.
Kemudian campuran tersebut
dimasukkan dalam jarum suntik dan diteteskan dalam gelas kimia yang berisi CaCl2 0,1 M sebanyak 100 mL sambil digoyang-goyang hingga terbentuk gel Ca-alginat yang berisi enzim dan simpan dalam fryzer selama 20 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali. Lalu dikeringkan pada suhu kamar (Aliya et al., 2009).
6.
Karakterisasi enzim protease hasil pemurnian dan hasil amobilisasi
Karakterisasi enzim protease hasil pemurnian dan hasil amobilisasi yang dilakukan meliputi :
36 a.
Penentuan suhu optimum Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan memvariasikan suhu yaitu 50; 55; 60; 65; 70 dan 75 Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Kunitz.
b. Penentuan data kinetika enzim (nilai KM dan Vmaks) Nilai Michaelis – Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (VM) ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat (larutan kasein) yaitu, 0,25; 0,50; 0,75; 1,0 dan 1,25. Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metoda Kunitz. Selanjutnya data aktivitas enzim dengan konsentrasi substrat diplotkan ke dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan KM dan VM.
c.
Uji stabilitas termal enzim Uji stabilitas termal enzim dilakukan dengan variasi waktu inkubasi Waktu inkubasi dibutuhkan enzim untuk bereaksi dengan substrat secara optimum.
Pada penelitian ini, uji stabilitas termal enzim
dilakukan dengan variasi waktu inkubasi 0, 10, 20, 30, 40, 50,60 dan 70 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode Kunitz.
d. Pemakaian berulang Enzim amobil yang telah dipakai (direaksikan dengan substrat), dipakai kembali untuk direaksikan kembali dengan substrat dengan uji metode Kunitz. Pemakaian berulang ini dilakukan hingga 6 kali.
37 e.
Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), dan perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim protease hasil
pemurnian
dan
hasil
amobilisasi
dilakukan
dengan
menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan:
ln (Ei/E0) = - ki t
(1)
Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil
pemurnian
dan
hasil
amobilisasi
dilakukan
dengan
menggunakan persamaan (Yandri et al., 2007): ∆Gi = - RT ln (ki h/kB T)
(2)
Keterangan : R
= konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1)
T
= suhu absolut (K)
ki
= konstanta laju inaktivasi termal
h
= konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det)
kB
= konstanta Boltzmann (1,381 x 10-23 JK-1)
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang ditunjukkan dalam Gambar 14.
38
Produksi Enzim Ekstrak Kasar Enzim
Uji aktivitas enzim protease (metode Kunitz) dan penentuan kadar protein metode Lowry
Pemurnian Enzim : 1. Fraksinasi dengan ammonium sulfat 2. Dialisis
Amobilisasi
Karakterisasi Enzim
Enzim hasil amobilisasi
Penentuan suhu optimum
Penentuan Km dan Vmaks
Penentuan stabilitas termal
Gambar 14. Diagram alir penelitian
