40
III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2015 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, beaker glass, jarum ose, pipet tetes, mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar spirtus, biuret dan statif, sentrifuga, magnetik stirer, autoclave model S-90N, oven, laminar air flow CRUMA model 9005-FL, waterbatch shaker incubator HAAKE, pH meter, waterbath, incubator, ayakan 100 mesh dan spektrofotometer UV-VIS Cary Win UV 32.
Bahan-bahan yang digunakan adalah Nutrient Agar, aquades, Gum arab, minyak zaitun, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, Na2CO3, KH2PO4, MgCl.6H2O, CaCl2. 2H2O, NaOH, Na(K)-Tartarat, NaH2PO4, Na2HPO4, Phenolphtalein (PP), reagen folinciocalteu, HCl, HF, Buffer fosfat pH 7, lautan Bovine Serum Albumin (BSA),
41
Asam Oksalat (H2C2O4 . 2H2O), kantong selofan dan Bentonit. Mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi Lampung.
C. Prosedur Penelitian
1.
Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi
a.
Pembuatan media pertumbuhan bakteri dengan induser minyak zaitun 2,8 gram nutrient agar (NA) dan 2 ml minyak zaitun, dilarutkan dalam 100 mL aquades kemudian disterilkan pada temperatur 120 ºC tekanan 1 atm, setelah itu dituang ke dalam tabung, dimiringkan dan simpan pada suhu kamar.
b.
Pembuatan media inokulum Media yang digunakan adalah media cair M.Sarley yang dimodifikasi. Media inokulum dibuat dengan cara menimbang bahan-bahan yang terdiri dari pepton 1 g; Gum arab 5 g; minyak zaitun 10 ml; NaNO3 0,1 g; KH2PO4 0,1 g; MgCl2 .6H2O 0,05 g; CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam 1000 ml buffer posfat pH 7 kemudian media disterilkan pada temperatur 121 °C, tekanan 1 atm selama 15 menit dalam autoclave.
c.
Pembuatan media fermentasi Media fermentasi yang digunakan (gL-1) terdiri dari pepton 1 g; Gum arab 5 g; minyak zaitun 10 ml; NaNO3 0,1 g; KH2PO4 0,1 gr; MgCl2 .6H2O 0,05 g;
42
CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam buffer posfat pH 7 sebanyak 1000 mL dalam labu erlenmeyer dan media fermentasi tersebut disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit. d.
Pembuatan larutan pereaksi
Pereaksi yang digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim lipase metode Titrimetri (Pereira et al., 2001). -
Larutan NaOH 0,05 N, dengan menimbang 2 gram NaOH kemudian dilarutkan ke dalam 1000 ml aquades.
-
Campuran etanol dan aseton perbandingan (1:1), dengan mencampurkan 100 ml etanol dan 100 ml aseton.
-
Larutan standar primer asam oksalat 0,05 N, dengan menimbang 0,63 gram H2C2O4 . 2H2O yang dilarutkan dalam 100 ml aquades.
Pereaksi yang digunakan untuk penentuan kadar protein metode Lowry (Lowry et al., 1951). -
Pereaksi A
: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 NaOH 0,1 N
-
Pereaksi B
: 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan kedalam 5 mL larutan Na(K) tartarat 1%
-
Pereaksi C
: 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A
-
Pereaksi D
: reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.
-
Larutan standar
: larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.
43
2.
Penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Penentuan kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasi bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pada media cair inokulum M.Sarley dalam buffer fosfat pH 7 pada suhu ruang yang diinkubasi selama 24 jam. Kondisi optimum meliputi: variasi suhu (ºC ) 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60, variasi pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9, dan variasi waktu inkubasi selama 120 jam dengan interval waktu sampling per 24 jam. Setiap perlakuan ditentukan aktivitas enzim lipase dengan metode Titrimetri.
3.
Produksi enzim lipase
Sebanyak 2% inokulum bakteri ditambahkan ke dalam media fermentasi dan diinkubasi pada suhu optimum, pH optimum dan waktu fermentasi optimum untuk memperoleh jumlah maksimum enzim yang diproduksi.
4. Isolasi enzim Lipase
Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara pemusingan. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah suhu kamar) untuk menjaga kehilangan aktifitas enzim (Suhartono, 1989). Media fermentasi
44
yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim lipase. Ekstrak kasar enzim lipase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
5. Uji aktivitas enzim lipase metode Titrimetri (Pereira et al., 2001).
a. Uji aktivitas lipase menggunakan larutan NaOH 0,05 N, yaitu, sebanyak 2 mL substrat minyak zaitun, ditambah 1 mL buffer posfat 0,05 M pH 7 dan 1 mL larutan enzim. Campuran larutan substrat dan enzim ini kemudian di inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 30 menit. Kemudian substrat enzim diinaktifkan dengan menggunakan 1 mL campuran aseton : etanol (1:1) , lalu tambahkan 5 tetes indikator PP 1% dan titrasi dengan larutan standar NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan pada saat terjadi perubahan warna larutan menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. b. Untuk penentuan blanko dilakukan dengan komposisi larutan yang sama, tetapi saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 mL, lalu titrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel. Analisis aktivitas lipase dihitung berdasarkan selisih volume titran sampel dengan blanko, seperti persamaan dibawah ini; Aktivitas Lipase = ( V. Sampel - V. Blanko x NaOH x 1000 ) V. Enzim x t
45
Keterangan : V.sampel
: Volume titran sampel (mL)
V.blanko
: Volume titran blanko (mL)
[NaOH]
: Konsentrasi NaOH (Normalitas)
V.enzim
: Volume enzim (mL)
t.
: waktu inkubasi (menit)
1000
: nilai konversi dari mmol kedalam satuan µmol
6. Penentuan kadar protein metode Lowry (Lowry et al., 1951).
Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan diaduk rata. Kemudian dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).
7. Pemurnian Enzim Lipase
Enzim lipase yang diperoleh dimurnikan melalui 2 tahap sebagai berikut: a.
Fraksinasi dengan amonium sulfat [(NH4)2SO4]
46
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20 %; (20-40)%; (4060)%; (60-80)%; dan (80-100)%. Skema proses pengendapan ditunjukkan pada Gambar 8. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer pada suhu 4°C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30 menit. Kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Ekstrak Kasar Enzim + (NH4)2SO4 (0-20%) Endapan(F1)
Filtrat + (NH4)2SO4 (20-40%)
Endapan(F2)
Filtrat + (NH4)2SO4 (40-60%)
Endapan(F3)
Filtrat + (NH4)2SO4 (60-80%)
Endapan(F4)
Filtrat + (NH4)2SO4 (80-100%)
Endapan(F5)
Filtrat
Gambar 8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan ammonium sulfat
47
b. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,05 M pH 7 selama ±24 jam pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian larutan bufer selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Titrimetri serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
8. Amobilisasi enzim lipase menggunakan bentonit.
a. Preparasi matriks bentonit Serbuk bentonit diayak dengan ayakan 120 mesh. Sebanyak 40 gram serbuk bentonit dikocok dengan 160 ml HCl 2 M kemudian di centrifuge 150 rpm selama 4 jam. Campuran di saring dengan kertas saring whatman dan endapan dicuci dengan aquades sampai pH 7 lalu dikeringkan dalam oven 105ºC sampai beratnya konstan (Adel dan Haerudin, 2003).
48
b.
Penentuan pH untuk proses pengikatan enzim lipase pada bentonit Enzim lipase sebanyak 1 ml diikatkan pada 1 gram bentonit dengan variasi pH 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8 menggunakan buffer fosfat 0,05 M, kemudian, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut dibiarkan hingga terpisah antara endapan dan filtrat lalu endapan dan filtrat diuji aktivitas enzim lipase dengan metode titrimetri.
c. Amobilisasi enzim lipase Sebanyak 1 mL enzim lipase di amobil dengan 1 gram bentonit pada pH pengikatan. Kemudian campuran diaduk hingga rata dan simpan dalam fryzer selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali, dicentrifuge dan endapan (enzim amobil) diuji aktivitasnya untuk pemakaian berulang dengan metode Titrimetri.
Pemakaian berulang enzim amobil
1. Endapan (enzim amobil) ditambah 2 mL minyak zaitun dan 1 mL buffer fosfat 0,05 M pH 7. 2. Untuk blanko ditambahkan 1 ml campuran aseton : etanol (1:1) 3. Campuran diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 30 menit 4. Kemudian disaring sampai diperoleh filtrat dan endapan 5. Filtrat di titrasi dengan NaOH 0,05 N menggunakan indikator PP 1% 6. Endapan sebagai enzim lipase amobil yang telah dipakai dilakukan pengulangan sampai enam kali dan setiap pengulangan ditentukan aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri.
49
9. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi
a.
Penentuan suhu optimum Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan memvariasikan suhu yaitu 30, 35; 40; 45; 55; 60; 65; dan 70; . Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Titrimetri.
b.
Penentuan KM dan Vmaks Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks) enzim lipase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0.5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5% dalam buffer fosfat pada pH 8 dan suhu 35 ºC selama 30 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode Titrimetri dan data aktivitas enzim dan konsentrasi substrat diplotkan ke dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan nilai KM dan Vmaks.
c.
Uji stabilitas termal enzim lipase (Yang et al., 1996) Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama periode waktu 60 menit pada suhu dan pH optimum. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan setelah interval waktu 10 menit. Aktivitas awal enzim (tanpa proses pemanasan) diberi nilai 100%.
50
Perhitungan aktivitas sisa (Virdianingsih, 2002).
d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), dan perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim lipase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan: ln (Ei/E0) = - ki t
Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan (Yandri et al., 2007): ∆Gi = - RT ln (ki h/kB T) Keterangan : R
= konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1)
T
= suhu absolut (K)
ki
= konstanta laju inaktivasi termal
h
= konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det)
kB
= konstanta Boltzmann (1,381 x 10-23 JK-1)
51
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang ditunjukkan dalam Gambar 9. Produksi Enzim
Isolasi Enzim Ekstrak Kasar Enzim
Uji aktivitas enzim lipase (metode Titrimetri) dan penentuan kadar protein metode Lowry Pemurnian Enzim : 1. Fraksinasi dengan ammonium sulfat 2. Dialisis
Amobilisasi Enzim
Karakterisasi Enzim
Enzim Lipase amobil
Penentuan suhu optimum
Uji pemakaian berulang enzim amobil
Penentuan Km dan Vmaks
Gambar 9. Diagram alir penelitian
Penentuan stabilitas termal
