III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Februari hingga Juni 2015 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung, UPT LaboratoriumTerpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung serta Laboratorium Mikrobiologi RSUDAM Provinsi Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoclave (All American), laminar air flow (Esco), mikroskop(Olympus), timbangan digital (Acis), inkubator, mikrosentrifuga (Thermo), magnetic stirer, hotplate, tabung sentrifuga, mikropipet berbagai ukuran 5 µl, 10µl, 200µl dan 500 µl (Bio-Rad), tips mikropipet (Biologix), vortex(Genie Z), microwave, oven, aparatus elektroforesis horizontal (Bio-Rad), perangkat elektroforesis (Advance Mupid- ex), UV transiluminator (Bio-Rad), lemari pendingin (sharp), freezer suhu -20°C, shaker orbital inkubator (GFL 109), sarung tangan, masker, parafilm (Sigma), mikrometer, kasa, kapas, rak tabung, jarum ose, dan alat-alat gelas lain seperti tabung reaksi, cawan petri, Erlenmeyer, beaker gelas, gelas ukur, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk, dan pemanas bunsen.
36
Adapun bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah larutan salin steril, BaCl22H2O, H2SO4, disk yang mengandung antibiotik : ampicillin (10 mcg), amikasin (30 mcg), trimetropim (5 mcg), ceftriaxone(30 mcg), cefotaxime (30 mcg), cefixime (5 mcg), aztreonam (30 mcg) dan siprofloxacine (5 mcg), Reagen Kovacks, Mac Conkey (MC) Agar, Muller Hinton Agar (MHA) plate, Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Simon Citrat (SC), Urea, Sulfur Indol Motility (SIM) medium, yeast ekstrak, tryptone, NaCl, Natrium Ampisillin, Gliserol 40%, akuadest steril , Mini Plasmid Kit Presto TM (Geneaid), agarosa powder (Invitrogen), buffer TBE 10X (Ultrapure), etidium bromida (Syber Safe), loading dye (Invitrogen), dan penanda DNA 1kb (Geneaid). Sedangkan bahan pemeriksaan yang digunakan adalah isolat Escherichia coli yang diisolasi dari urin penderita infeksi saluran kemih.
C. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan a. Persiapan Alat Semua peralatan gelas dicuci bersih, dikeringkan dan dilakukan sterilisasi agar alat-alat tersebut terhindar dari mikroba yang tidak diinginkan. Sterilisasi alat dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C dengan tekanan 1 atm selama 20 menit. Sebagian besar kegiatan dilakukan secara aseptik di dalam laminar air flow. b. Pembuatan larutan, buffer, dan media Cara pembuatan larutan, buffer, dan media yang digunakan dalam penelitian adalah
37
Mac Conkey (MC) agar : Ditimbang 50 g MC agar, dilarutkan dalam 1 L air suling dan dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna, kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah steril dituang ke cawan petri sebanyak 15-20 mL. Muller Hinton Agar ( MH) agar : Ditimbang 38 g MH agar, dilarutkan dalam 1 L air suling dan dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna, kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah steril dituang ke cawan petri sebanyak 15-20 mL. Triple Sugar Iron (TSI) Agar : 65 g serbuk media TSI Agar dilarutkan dengan 1 L air suling, lalu dipanaskan di hot plate sampai larut sempurna, setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, dibiarkan membeku pada posisi miring. Simon Citrat (SC) : Ditimbang 22 g SC, dilarutkan dalam 1 L air suling. lalu panaskan di hot plate sampai larut sempurna, setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit, dibiarkan membeku pada posisi miring. Sulfur Indol Motility (SIM) : 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 L air suling, dipanaskan hingga melarut di hot plate, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 5 mL, disterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C kemudian dibekukan. Urea Agar : 24,02 g serbuk media Urea Agar dilarutkan dengan 1 L air suling, disterilkan dengan autoclave selama 20 menit pada suhu 121°C,
38
kemudian di tempat terpisah, larutkan 400 g Urea dalam 1 L air suling, disterilkan dengan penyaringan, secara aseptik dicampurkan 50 mL larutan urea ke dalam 95 mL larutan urea agar, dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL dan dibiarkan membeku dalam posisi miring. NaCl 0,85% steril : Ditimbang 0,85 g NaCl, dilarutkan dalam 100 mL air suling kemudian dibagikan kedalam tabung masing- masing 3 mL, selanjutnya disterilkan selama 20 menit pada suhu 121°C. Standar Mac Farlan ( Standar Kekeruhan ) : Dipipet 0,5 mL larutan BaCl22H2O 1,175% ditambahkan 99,5 mL H2SO4 1%, dimasukan dalam tabung bertutup rapat. Reagen Kovacks : Ditimbang 5 g para dimethyl amino benzaldehyde, dilarutkan kedalam 75 mL amyl alkohol dan asam klorida p.a. Luria Bertani (LB) Cair : Ditimbang 10 g peptone, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g NaCl campur dilarutkan dalam 800 mL air suling kemudian diukur pH nya hingga 7 lalu ditambahkan akuades hingga 1 L dan dibagikan ke dalam tabung masing-masing 5 mL, selanjutnya disterilkan dengan autoclave selama 20 menit pada suhu 121°C. LB Ampicillin Cair : Dibuat larutan natrium ampisilin 1mg/µl dalam akuades steril yaitu 1000 mg natrium ampisilin dilarutkan dalam 1000 µl akuadest steril kocok dan larutkan, kemudian diambil 100 µl larutan ampisillin dan diencerkan pada labu ukur 100 mL hingga tanda batas, lalu disimpan dalam aliquot-aliquot pada suhu -20ºC. Untuk medium dasar dibuat dengan konsentrasi akhir 35-50µg/ml dengan cara : diambil 200 µl kemudian masukkan kedalam 5 mL media luria bertani cair.
39
Reagen Kit : Kit yang digunakan dalam penelitian adalah Mini Plasmid Kit Presto TM (Geneaid) untuk isolasi plasmid. Komponen-komponen kit terdiri dari PD1 buffer mengandung Tris,EDTA,glukosa, dan RNase A, PD2 buffer mengandung NaOH dan detergen SDS (Sodium Dodesil Sulfat), PD3 buffer mengandung Kalium Asetat, true blue lysis buffer, w1 buffer, wash buffer (add ethanol), elution buffer, R-Nase A (50mg/ml), PDH columns, 2 mL collection tubes. Buffer TBE 10X : Sebanyak 108 g Tris base, 55 g asam borat, 40 ml EDTA 0,5 M, (pH 8,0) dilarutkan dalam akuades hingga volume tepat 1000 mL untuk menghasilkan larutan stock buffer TBE 10x. Buffer TBE 1x : Buffer TBE 1x dibuat dengan mencampurkan 50 mL buffer TBE 10x dan akuabides hingga volume tepat 500 mL. Gel Agarosa 1% : Sebanyak 0,5 gram agarosa powder dilarutkan dalam 50 mL buffer TBE 1x dalam Erlenmeyer, didihkan sampai larut dalam microwave selama 4 menit, dinginkan sampai suhu 60°C dalam suhu kamar, kemudian tambahkan 10 µL etidium bromide (Syber Safe) dan dikocok hingga merata. Tuang kedalam tray yang sebelumnya telah dipasang sisir (comb).
2. Pengambilan Sampel Sampel diperoleh dari urin aliran tengah stream urin (clean voided midstream urin). Urin dikeluarkan langsung dan ditampung ke dalam botol steril, urin yang pertama-tama keluar tidak ikut serta ditampung (Washington et al., 1997).
40
3. Isolasi dan Identifikasi isolat Escherichia coli
Isolasi dan identifikasi isolat E. coli dilakukan selama 3(tiga) hari melalui tahapan sebagai berikut : (Soemarno, 2000; Washington et al., 1997; Frankel et al., 1970). Hari pertama spesimen urin tanam dengan menggunakan ose standar yang bervolume (10-3), kemudian goreskan secara zig-zag tiga kuadran pada media Nutrien agar plate dan MC agar, lalu diinkubasi 37°C selama 18-24 jam. Hari kedua dilakukan hitung jumlah koloni yaitu jika didapatkan bakteri kurang dari 10000 per ml urin dilaporkan kemungkinan tidak ada ISK, jika jumlah bakteri 10000-100000 per ml urin maka pemeriksaan hitung kuman diulangi dan jika jumlah bakteri lebih dari 100000 per ml urin, dilaporkan kemungkinan adanya ISK, kemudian dilakukan pengecatan Gram dan pembacaan terhadap hasil pertumbuhan pada media Nutrien agar dan Mac conkey agar, bila terdapat koloni dengan ciri-ciri koloni yaitu ukuran sedang, warna merah, smooth, cembung dan memfermentasi laktosa maka koloni tersebut kemudian dipilih untuk dilakukan uji biokimia dengan ditanam secara gores ke media agar miring yaitu TSIA, SC, dan Urea, kemudian ditanam dengan cara tusuk ke medium SIM dan diinkubasi 37° C selama 24 jam. Hari ketiga dilakukan pembacaan hasil uji biokimia TSIA, SC, SIM, dan Urea. Perubahan yang terjadi diamati dan dicatat, hasil yang diperoleh dicocokkan pada tabel biokimia untuk E. coli (Tabel 1). Hasil yang sesuai dilanjutkan pada uji resistensi (Washington et al., 1997; Frankel et al., 1970).
41
4. Uji Resistensi Isolat Escherichia coli
Uji resistensi isolat E. coli terhadap antibiotik yang berbeda menggunakan metode cakram (Disc Difusion) Kirby-Bauer (Bauer et al., 1996) dengan kekeruhan standar Mac Farlan 0.5 melalui tahapan sebagai berikut : a. Sebanyak 2 (dua) ose bakteri uji disuspensikan dalam NaCl fisiologis steril dalam tabung reaksi dan dihomogenkan dengan vortex, sehingga kekeruhannya sama dengan kekeruhan standar Mac Farlan 0.5. b. Ambil lidi kapas steril kemudian celupkan kedalam suspensi kuman dan diputar beberapa kali kemudian ditekan-tekan pada dinding tabung untuk membuang kelebihan inokulum, lalu lidi kapas steril dihapuskan secara merata pada permukaan MH Agar. Cawan petri ditutup dan biarkan cawan tersebut 3-5 menit. c. Disk antibiotik ditaruh hati-hati di atas biakan bakteri tersebut dan ditekan perlahan dengan pinset steril supaya benar-benar kontak dengan yang terdapat pada media. Jarak disk dengan tepi cawan petri 15 mm dan jarak antar disk 24 mm. Biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16-18 jam. d. Karakterisasi dengan mengukur diameter zona hambatan yang berwarna jernih disekitar disk dan membandingkan diameter daerah hambatannya terhadap standar dari National Commite of Clinical Laboratory standart (Tabel 2) (CLSI, 2012). Sensitif (S), Intermediate (I), dan resisten (R) terhadap antibiotik disimpulkan berdasarkan diameter zona hambatan yang berwarna jernih di sekitar disk antibiotik. Pengukuran dilakukan dua kali (duplo).
42
5. Penyimpanan Isolat Bakteri
Isolat bakteri yang telah dilakukan uji resistensi disimpan dalam kultur stok gliserol (Sambrook et al., 1989). Adapun penyimpanan dilakukan dengan cara, yaitu koloni yang dipilih dari media MH agar dikultur pada media Luria bertani cair yang mengandung ampisilin sebanyak 500 µL dalam sample cup eppendorf steril kemudian diinkubasi pada 37ºC selama 12 jam. Setelah 12 jam ditambahkan gliserol 40% sebanyak 500 µL, dihomogenkan dan disimpan di freezer -20°C, jika akan dilakukan isolasi plasmid, kultur stok dikeluarkan di suhu kulkas terlebih dahulu, kemudian biarkan mencair di suhu ruang.
6. Persiapan Isolasi Plasmid
Kultivasi pada media Luria bertani cair dilakukan dengan cara : diambil 50 µL suspensi bakteri dari kultur stok dengan mikropipet, masukan dalam Luria bertani cair 5 mL dalam tabung reaksi yang mengandung ampicillin, kemudian diinkubasi pada shaker orbital incubator 37oC selama 16 jam (Overnight). Suspensi bakteri siap dilakukan isolasi DNA plasmid.
7. Isolasi Plasmid Isolasi plasmid bakteri menggunakan PrestoTM Mini Plasmid Kit dari Geneaid. Tahapan kerja kit tersebut menggunakan prinsip metode alkaline lysis solution (Sambrook et al., 1989). Isolasi plasmid diawali dengan kultivasi bakteri pada media Luria bertani cair 5 mL dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 16 jam.
43
Proses isolasi dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : a. Pemanenan Sebanyak 1,5 mL kultur bakteri dalam Luria bertani cair dipindahkan kedalam tabung mikrosentrifuga dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 x g selama 1 menit pada suhu kamar untuk membentuk pelet sel. Supernatan mengandung medium dibuang. Tambahkan lagi kultur sel bakteri dan sentrifugasi kembali 14.000 x g selama 1menit, ulangi hingga kultur habis. b. Resuspensi Sel Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan 200 µl PD1 buffer ke dalam tabung mikrosentrifuga yang baru dan ditambah 2 µl true blue lisis buffer ke tabung tersebut, kemudian divortex hingga larut. c. Pemecahan sel Larutan yang telah diresuspensi ditambah 200 µl PD2 buffer kemudian campur dengan dibolak-balik 4-6 kali (jangan di vortex). Diamkan selama 2-5 menit pada suhu kamar untuk membentuk lisat yang homogen. Pencampuran sempurna jika semua suspensi berwarna biru. d. Netralisasi Campuran tersebut ditambahkan 300 µl PD3 buffer lalu dibolak-balik cepat 4-6 kali (jangan divortex) dan disentrifugasi 14.000 x g selama 3 menit di suhu kamar. Setelah menambahkan PD3 buffer, suspensi menjadi tidak berwarna.
44
e. Pengikatan DNA Semua supernatan dipindah ke coloumn spin dan disentrifugasi 14.000 x g selama 30 detik pada suhu kamar lalu larutan pada tabung mikrosentrifuga dibuang kemudian letakkan kembali coloumn spin ke tabung mikrosentrifuga. f. Pencucian Tambahkan 400 µL W1 buffer kedalam coloumn spin dan disentrifugasi 14.000 x g selama 30 detik, larutan dalam tabung mikrosentrifuga dibuang kemudian letakkan kembali column spin ke tabung mikrosentrifuga dan disentrifugasi kembali 14.000 x g selama 30 detik untuk menghilangkan residu wash solution. g. Proses Elusi Pindahkan coloumn spin kedalam tabung mikrosentrifuga baru kemudian ditambah 50 µl Elusion buffer, diamkan 2 menit dan disentrifugasi 14.000 x g selama 2 menit pada suhu kamar. Hasil isolasi DNA plasmid diperiksa dengan teknik elektroforesis gel agarosa 1%.
8.
Elektroforesis Gel Agarosa
Hasil isolasi plasmid dielektroforesis menggunakan gel agarosa dengan konsentrasi 1% (Sambrook and Russel, 2001). Gel agarosa 1% dibuat dengan mencampur 0,5 g bubuk agarosa dengan 50 ml larutan TBE 1x. Campuran bubuk agarosa dan buffer TBE 1x kemudian dihomogenkan dan dipanaskan di atas microwave sampai larutan gel berwarna bening, dinginkan larutan pada suhu kamar dan tambahkan etidium bromida (Syber safe)10 µL.
45
Larutan gel dituang dalam cetakan yang sudah disiapkan. Sisir (cetakan sumur) dipasang dengan posisi tegak dan tidak sampai pada permukaan cetakan gelas (3-5 cm dari permukaan gelas). Gel dibiarkan mengeras (15-45 menit), sisir diangkat setelah gel mengeras, kemudian gel diletakan di dalam aparatus elektroforesis dan direndam dengan larutan TBE 1x. Sampel hasil isolasi plasmid (Eluen) sebanyak 10 µL dicampur dengan loading dye sebanyak 2 µL. Proses pencampuran dilakukan diatas parafilm dan dilakukan dengan cara pipeting. Campuran dimasukan masing-masing ke dalam sumur pada gel. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan tegangan listrik sebesar 100 volt selama ± 45 menit. Pita DNA divisualisasi dengan UV transiluminator, kemudian hasil elektroforesis didokumentasikan menggunakan kamera digital.
D. Analisis Hasil
1 . Analisis Univariat Hasil penelitian disajikan secara kualitatif (deskriptif), ditampilkan persentase isolat E.coli yang sensitive, intermediate, dan resisten terhadap ampisilin, amikasin, trimethoprim, cefotaxime,ceftriaxone, cefixime, aztreonam dan siprofloxacin dan hasil pola elektroforesis dengan melihat pita-pita plasmid dibandingkan dengan pola elektroforesis pita plasmid standar (marker).
46
2. Analisis Bivariat Analisis bivariat digunakan untuk mencari korelasi pola resistensi antibiotik dengan adanya plasmid. Dalam penelitian ini digunakan uji statistik TIndependent (T-test).
47
E. Diagram Alir Penelitian
Sampel Urine
Isolasi bakteri E.coli
E. coli
Bakteri lain
Sensitif Uji Resistensi Resisten
Isolat Sensitif Ampisilin disimpan dalam stok gliserol tanpa Ampisilin Isolat Resisten disimpan dalam stok gliserol Ampisilin
Isolasi Plasmid
Elektroforesis
Data
Analisis Data
Kesimpulan
Gambar 4. Diagram alir penelitian
