III. METODE DAN PRINSIP LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

III. METODE DAN PRINSIP LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Prosedur dan peralatan tertentu digunakan untuk memperlajari mikroorganisme, misalnya : memelihara, memisahkan (mengisolasi) dalam biakan murni, mengamati karakter dan mengidentifikasi. Telah diketahui bahwa mikroorganisme berada dimanamana dalam jumlah yang sangat banyak dan beranggotakan banyak spesies. Atas dasar bahwa jumlah dan jenis mikroorganisme yang sangat banyak serta ukurannya yang sangat kecil maka metode dan prosedur laboratorisnya sangat khusus. Oleh karena itu untuk mempelajari spesies atau jenis mikroorganisme tertentu maka langkah pertama adalah memisahkan mikroorganisme yang bersangkutan dari jenis mikroorganisme yang lain. Disampinng itu, karena ukuran mikroorganisme sangat kecil maka tidak terlihat jelas oleh mata, sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat pembesar, berupa mikroskop. Prosedur laboratoris harus dikembangkan atau diarahkan supaya mampu memisahkan setiap mikroorganisme untuk dikulturkan (ditumbuhkan) secara terpisah. Kumpulan atau massa mikroorganisme dari spesies sama yang dikulturkan secara terpisah dan bebas dari mikroorganisme lain disebut sebagai biakan murni. Massa mikroorganisme dari satu spesies yang sama disebut koloni. Oleh karena itu biakan murni idealnya hanya mengandung satu koloni saja. Biakan murni yang pertama, diperoleh J. Listar (1879) menggunakan metode seri pengenceran dalam medium cair, namun demikian biakan murni dalam medium cair sulit membentuk koloni yang terpisah sehingga akhirnya dikembangkan medium padat. Oleh karena itu, biakan murni harus dikembangkan dalam mikrobiologi karena sangat bermanfaat di segala bidang kegiatan mikrobiologi, baik untuk pengamatan karakter, penelitian sampai pemanfaatan keunggulannya atau mikrobiologi terapan. A. MIKROSKOP DAN MIKROSKOPI Mikrobiologi dapat dianggap dimulai sejak manusia dapat membuat alat pembesar yang cukup mampu melihat benda yang sangat kecil. Meskipun barangkali Antony van Leeuwen Hoek (1632-1723) bukan orang pertama yang melihat bakteri dan protozoa, tetapi dialah yang melaporkan pertama kali melihatnya, kemudian menggambar dan mendiskripsikan mikroorganisme. Alat pembesar yang digunakan Leeuwenhoek merupakan mikroskop pertama dengan menggunakan lensa tunggal. Mikroskop sekarang merupakan mikroskop menggunakan lensa majemuk. Mikroskop merupakan salah satu alat yang erat sekali hubungannya dengan mikrobiologi, khususnya untuk melihat bayangan mikroorganisme dan bagian-bagiannya yang ukurannya sangat kecil. Tubuh mikroskop pada dasarnya terdiri dari bagian mekanik, bagian optik dan beberapa jenis dilengkapi bagian elektrik, fotografi dan scanning. Bagian mekanik dan bagian optik selalu ada pada setiap jenis mikroskop, meskipun tidak semua subBambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

1

bagian ada. Bagian mekanik meliputi : statif, tubus, revolver, meja benda, pengatur tubus, pengatur kondensor, pengatur meja benda dan pengatur preparat. Bagian optiknya meliputi : lensa okuler, lensa obyektif, lensa kondensor, lensa filter dan sumber cahaya.

Bayangan benda (obyek) yang kita lihat dibentuk dan diperbesar oleh lensa obyektif, di dalam tubus mikroskop membentuk bayangan nyata terbalik dari obyek. Bayangan nyata tersebut selanjutnya dibalik dan diperbesar lagi oleh lensa okuler. Lensa okuler merupakan lensa yang berfungsi untuk membuat bayangan terakhir, sehingga bayangan tersebut dapat dilihat langsung oleh mata pengamat. Lensa yang baik diperoleh dengan memperhatikan pembesaran dan daya pisahnya. Semakin pendek jarak titik api lensa akan semakin kuat pembesarannya, sehingga semakin besar kemampuan suatu lensa akan semakin kecil jarak dua titik api yang berdekatan yang dapat dilihat secara terpisah menggunakan mikroskop. Beberapa lensa obyektif biasanya dipasang pada roda berputar yang disebut revolver. Setiap lensa obyektif dapat diputar ke tempat yang sesuai dengan pembesaran yang diinginkan. Lensa obyektif dibuat dalam beberapa pembesaran yang berbeda, yakni : 4x, 10x, 40x, dan 100x, demikian juga lensa okuler tersedia beberapa pembesaran, yakni : 4x, 10x, 16x, dan 20x. Lensa okuler dipasang paada ujung dalam tubus dan biasanya yang dipasang adalah yang pembesaaran 10x. Dengan demikian Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

2

jika kita mengamati obyek menggunakan lensa okuler pembesaran 10x dan lensa obyektif 40x, maka pembesaran obyek yang kita lihat menjadi 400x dibanding besarnya obyek yang sebenarnya. Pembesaran total merupakan pembesaran obyektif kali pembesaran okuler. Pada lensa obyektif biasanya tertera ukuran pembesarannya, aparatur numerik, panjang tubus lensa, dan tebal gelas penutup yang diperlukan. Contoh tulisan peneraan lensa obyektif di bawah ini, yang maksudnya: 1. Pembesaran lensa obyektif = 100 x 2. Aparatur numerik (AN) = 1,25 3. Panjang tubus = 160 mm (diukur dari lensa obyektif ke lensa okuler) 4. Tebal gela penutup preparat = 0,17 mm 5. Tulisan “Plan” menunjukan permukaannya datar, “POL” untuk mikroskop polarisasi, “Ph” untuk fase kontras Kondensor berfungsi sebagai pengatur intensitas caahaya yang masuk ke dalam mikroskop. Kondensor mempunyai dua bagian penting, yaitu : 1.

Susunan lensa untuk mengumpulkan sinar sebelum masuk ke dalam obyek dan lensa obyektif.

2.

Diafragma berfungsi untuk mengatur sinar tepi yang masuk ke dalam lensa obyektif dan okuler.

Hukum fisika menyatakan bahwa bagian terkecil yang dapat kita lihat disebut daya pisah, yaitu : kemampuan lensa untuk menghasilkan bayangan terpisah dari dua titik yang berdekatan. Daya pisah dibatasi oleh panjang gelombang (λ) cahaya yang digunakan untuk menerangi preparat dan aparatur numerik (AN) lensa-lensa dalam mikroskop. ‫ܽݏ݅݌ ܽݕܽܦ‬ℎ ሺ݀ ሻ =

݆ܲܽ݊ܽ݊݃ ݈݃݁‫ܽܿ ܾ݃݊ܽ݉݋‬ℎܽ‫ ܽݕ‬ሺߣሻ ܰ‫ܣ‬௢௕௬௘௞௧௜௙ + ܰ‫ݎ݋ݏ݊݁݀݊݋݇_ܣ‬

Untuk memperjelas hukum fisika tersebut, misalnya di dalam pengamatan menggunakan panjang gelombang cahaya 0,5 µm, NA lensa obyektif 1,20 dan lensa kondensor 0,8, maka daya pisah mikroskop tersebut : ‫ܽݏ݅݌ ܽݕܽܦ‬ℎ ሺ݀ ሻ =

଴,ହ ఓ௠ ଵ,ଶହା଴,ଽ

= 0,23 ߤ݉
maksudnya bahwa jika ada dua titik yang

jaraknya 0,23 µm atau kurang, dan diamati menggunakan mikroskop tersebut akan tampak hanya satu titik, sedangkan titik atau benda yang tampak terpisah jaraknya harus lebih dari 0,23 µm. Oleh karena itu, menurut rumus diatas, untuk meningkatkan Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

3

kemampuan mikroskop dilakukan dengan cara menurunkan daya pisah (d). Nilai daya pisah akan turun jika panjang gelombang cahaya dikecilkan atau dengan cara memperbesar aparatur numerik. Batas daya pisah pada cahaya biasa yang dapat dilihat mata ± 0,2 µm, sehingga dua benda yang jaraknya kurang dari 0,2 µm akan terlihat sebagai satu benda, begitu juga benda yang ukurannya kurang dari 0,2 µm tidak akan terlihat jika menggunakan sumber cahaya biasa. Oleh karena itu untuk melihat benda yang ukurannya kurang dari 0, 2 µm atau melihat dua benda yang jaraknya kurang dari 0, 2 µm diperlukan sumber cahaya lain yang mempunyai panjang gelombang lebih pendek. Panjang gelombang cahaya yang digunakan dalam mikroskop cahaya terbatas pada gelombang cahaya kasat mata yang berkisar dari 0,4 µm sampai 0,7 µm dan angka singkapan 0,85 pada medium udara dan 1,2 sampai 1,4 pada medium celup cair. Untuk menggambarkan daya pisah, misalnya panjang gelombang cahaya biasa yang digunakan untuk mengamati preparat kering maka daya pisahnya = 700 nm / 0,85 = 824 nm (= 0,824 µm) sedangkan jika kita menggunakan filter lensa hijau panjang gelombang turun menjadi 550 nm, maka daya pisahnya menjadi = 550 nm / 0,85 = 467 nm (0,467 µm). Jika menggunakan preparat celup minyak NA lensa menjadi sebesar 1,25 dan NA kondensor sebesar 0,9, sehingga daya pisahnya menjadi 550 nm/(1,25+0,9) = 225 nm (0,225 µm). Dengan demikian benda-benda dalam preparat kering yang diamati menggunakan mikroskop cahaya akan terlihat jika ukurannya lebih dari 0,824 µm dan terlihat terpisah jika jaraknya lebih dari 0,824 µm, sedangkan dengan memilih cahaya hijau ukuran benda yang terlihat dan jarak yang terpisah menjadi 0,467 µm dan jika menggunakan preparat celup minyak daya pisahnya menjadi lebih besar lagi atau ukuran benda yang terlihat dan jarak yang terpisah menjadi lebih kecil, yaitu 0,225 µm. Ada beberapa macam mikroskop cahaya, misalnya : mikroskop pantul cermin, mikroskop lampu listrik, mikroskop medan gelap, mikroskop fase kontras. Disamping mikroskop cahaya biasa, ada pula mikroskop sinar yang tak terlihat mata dan mempunyai daya pisah yang sangat tinggi, yaitu : mikroskop ultraviolet, mikroskop elektron transmisi, dan mikroskop elektron pemayaran (scanning, terfokus) Mikroskop biasa atau mikroskop medan terang yakni mikroskop yang sistem pencahayaannya menggunakan teknik medan terang. Mikroskop medan terang ada dua tipe, yaitu mikroskop pantul cermin dan mikroskop lampu listrik yang pada dasarnya keduanya mempunyai kemampuan yang sama, yaitu cahaya pantulan dari cermin dan cahaya langsung dari lampu listrik, yang mempunyai panjang gelombang antara 400 nm sampai 700 nm. Pada mikroskop ini, obyek disinari oleh cahaya dari Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

4

kondensor yang kemudian cahaya ditangkap oleh lensa obyektif. Bagian obyek atau preparat yang transparan atau medannya akan kelihatan lebih terang, sedangkan bagian yang berwarna atau tebal akan menyerap cahaya, sehingga lebih gelap. Oleh karena itu, mikroskop yang menggunakan sistem ini disebut mikroskop medan terang.

Mikroskop medan gelap (Dark-field microscope) pada prinsipnya sama dengan mikroskop biasa, tetapi menggunakan kondensor khusus dan lensa obyektif yang nilai NA-nya rendah. Kondensor yang digunakan akan mengarahkan berkas cahaya ke dalam medan preparat pada sudut yang sedemikian hingga hanyalah berkas-berkas cahaya yang mengenai obyek pada medan preparat dibiaskan dan memasuki lensa obyektif atau kondensor yang mampu membentuk kerucut hampa cahaya. Berkas cahaya dari kerucut hampa dipantulkan dengan sudut yang sangat kecil dari bagian permukaan gelas benda dan setiap berkas cahaya yang sampai ke preparat akan dipantulkan langsung ke dalam lensa obyektif, sehingga obyek menjadi terang dengan latar yang gelap. Mikroskop medan gelap digunakan untuk mengamati mikroorganisme yang masih hidup, khususnya yang selnya sangat tipis atau yang hampir mendekati batas daya pisah mikroskop. Mikroskop jenis ini akan mempunyai medan gelap total jika pada meja benda tidak terdapat preparat atau spesimen. Mikroskop fase kontras merupakan suatu tipe mikroskop cahaya yang memungkinkan terjadi kontras yang cukup besar antara obyek pada berbagai Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

5

ketebalan atau berbagai indeks bias. Terjadinya kontras tersebut disebabkan karena pada mikroskop ini menggunakan kondensor dan lensa obyektif yang khusus dapat mengendalikan iluminasi obyeknya pada perbedaan ketebalan dan indeks bias yang sangat kecil yang diwujudkan dalam tingkatan terang-gelapnya cahaya, sehingga bayangan obyek menjadi kontras lebih nyata. Mikroskop fluoresensi digunakan untuk memeriksa preparat yang telah diwarnai menggunakan pewarna fluorokrom. Zat pewarna ini menyerap cahaya gelombang pendek dan memancarkan cahaya gelombang panjang yang lebih banyak. Zat yang demikian disebut flouresen dan fenomenanya disebut flouresensi. Mikroskop elektron merupakan mikroskop yang menggunakan pencahayaan gelombang elektron. Mikroskop elektron memiliki kemampuan daya pisah yang besar karena sinar elektron mempunyai panjang gelombang yang sangat pendek dibandingkan dengan cahaya biasa. Panjang gelombang sinar elektron yang digunakan berkisar antara 0,005 µm (5 nm) sampai 0,0003 µm (0,3 nm), sedangkan mikroskop cahaya biasa menggunakan panjang gelombang 0,4-0,7 µm (400-700 nm). Pembesaran akhir pada mikroskop elektron dapat mencapai 1.000.000 kali. B. MEDIUM TUMBUH Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme diperlukan substrat yang disebut medium kultur atau medium biakan. Medium kultur ini mengandung ramuan zat hara (nutrien) tertentu. Zat-zat hara digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan, sintesis protein, kebutuhan energi untuk kehidupannya. Biasanya medium kultur mengandung air, sumber energi, zat hara (nutrien) untuk sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, dan unsurunsur mikro. Di dalam bahan dasar medium kultur dapat juga ditambahkan faktorfaktor pertumbuhan yang berupa asam amino, vitamin, hormon, maupun nukleotida. Supaya mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang dengan baik, medium kultur memerlukan persyaratan tertentu, yaitu: 1. Medium kultur harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan reproduksi 2. Medium kultur harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan, dan keasaman dalam (pH) yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. 3. Medium kultur harus dalam keadaan steril. (Sebelum ditanami medium kultur harus bebas dari mikroorganisme) Berdasarkan kepada persyaratan ketersediaan di atas, maka medium kultur dapat berupa medium alami dan medium buatan.

Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

6

1. Medium alami merupakan medium kultur yang disusun dari bahan-bahan alami tanpa ditambah bahan atau senyawa lain. Contoh: kentang, tepung jagung, daging, telur, ikan, umbi-umbian dan lain-lain. 2. Medium buatan merupakan medium kultur yang dibuat dari susunan berbagai senyawa kimia. Contoh: 1. Potato Dextrose Agar untuk kultivasi jamur secara umum komposisi per liter: Agar ..................................................................25.0g Glucose .............................................................20.0g Pancreatic digest of casein..................................2.5g Yeast extract........................................................0.5g MgSO4·7H2O......................................................0.3g CaCO3 .................................................................0.2g Potatoes, infusion from............................... 500.0mL pH 5.6 ± 0.2 at 25°C 2. Nutrient Agar untuk kultivasi bakteri secara umum, komposisi per liter: Agar.............................................................................15.0g Peptone ..........................................................................5.0g NaCl ..............................................................................5.0g Yeast extract ..................................................................2.0g Beef extract ...................................................................1.0g pH 7.4 ± 0.2 at 25°C 3. Deoxycholate Agar untuk bakteri Pseudomonas komposisi per liternya: Agar ............................................................................ 15.0g Lactose ........................................................................ 10.0g Peptone........................................................................ 10.0g NaCl .............................................................................. 5.0g K2HPO4......................................................................... 2.0g Ferric citrate .................................................................. 1.0g Sodium citrate ............................................................... 1.0g Sodium deoxycholate.................................................... 1.0g Neutral Red ................................................................. 0.03g pH 7.3 ± 0.2 at 25°C 4. Nutrient Agar untuk kultivasi bakteri heterotrophic komposisi per liter: Agar...............................................................................3.0g Lab-Lemco beef extract ................................................1.0g Peptone ..........................................................................1.0g NaCl ..............................................................................0.5g pH 7.3 ± 0.2 at 25°C

Berdasarkan sifat penggunaannya, medium kultur dapat dibedakan menjadi medium umum, pengaya, selektif, diferensial, dan penguji. 1. Medium umum biasanya berupa medium yang dapat digunakan untuk menumbuhkan kelompok mikroorganisme secara umum, misalnya: medium kultur Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

7

Nutrien Agar (NA) untuk menumbuhkan bakteri secara umum, dan medium potato dextrose agar (PDA) untuk menumbuhkan jamur secara umum. 2. Medium pengaya merupakan medium kultur yang ditambah senyawa-senyawa tertentu untuk memberi kesempatan kepada jenis atau kelompok mikroorganisme tertentu supaya dapat tumbuh lebih cepat dibanding dengan mikroorganisme lain yang sama-sama berada di dalam medium tersebut. Misalnya untuk memisahkan bakteri Salmonella typhi, penyebab penyakit tifus yang berada di dalam kotoran (tinja) manusia diperlukan senyawa pengaya menggunakan medium tetrationat yang menghambat mikroorganisme lain selama 18-22 jam, sehingga diharapkan bakteri Salmonella typhi sudah tumbuh dan dapat dipindahkan ke medium lain. Medium Tetrathionate Broth komposisi per liter: Na2S2O3....................................................................... 40.7g CaCO3 ......................................................................... 25.0g NaCl .............................................................................. 4.5g Peptone.......................................................................... 4.5g Yeast extract.................................................................. 1.8g Beef extract ................................................................... 0.9g Iodine solution .........................................................20.0mL 3. Medium selektif merupakan medium kultur yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau beberapa jenis mikroorganisme tertentu. Contoh medium SSA (SalmonellaShigella Agar) yang hanya ditumbuhi oleh bakteri genus Salmonella dan Shigella. Medium Salmonella Shigella Agar (SS Agar) komposisi per liter: Agar.............................................................................13.5g Lactose ........................................................................10.0g Bile salts ........................................................................8.5g Na2S2O3 .........................................................................8.5g Sodium citrate ...............................................................8.5g Beef extract ...................................................................5.0g Pancreatic digest of casein ............................................2.5g Peptic digest of animal tissue ........................................2.5g Ferric citrate .................................................................. 1.0g Neutral Red ............................................................... 0.025g Brilliant Green .........................................................0.33mg pH 7.0 ± 0.2 at 25°C 4. Medium diferensial merupakan medium kultur yang dipergunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme tertentu yang menampakkan ciri berbeda dengan lainnya. Contoh medium tetrazoliumclor (TZC) membedakan bakteri Pseudomonas solanacearum yang virulen dan avirulen. Tipe virulent strains tampak koloninya tak beraturan (irregular) dengan pusat berwarna pink dikelilingi warna keputihan, sedangkan yang avirulent tampak melingkar berwarna merah tua dengan garis kebiruan. Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

8

Medium TZC komposisi per liter: Agar.............................................................................17.0g Peptone ..........................................................................1.0g Glucose..........................................................................0.5g Pancreatic digest of casein ............................................0.1g 2,3,5-Triphenyltetrazolium·HCl solution ................ 10.0mL Medium kultur yang kita gunakan untuk membiakan mikroorganisme dapat berbentuk padat, semi padat, dan cair. Medium kultur padat dan semi padat dapat dibuat dari medium kultur cair yang ditambah ‘zat pemadat’. Zat pemadat yang sekarang digunakan berasal dari ganggang merah yang biasa kita sebut ‘agar-agar’. Agar-agar umumnya tidak dapat diuraikan oleh mikroorganisme dan membeku pada suhu di bawah 50oC. Kandungan agar-agar sebagai pemadat medium kultur berkisar 1,5-2% dan untuk semi padat (semi solid) kurang dari 1%. Setiap unsur nutrisi mempunyai peran tersendiri dalam fisiologi sel. Unsur tersebut diberikan ke dalam medium sebagai kation garam anorganik yang jumlahnya berbedabeda tergantung pada keperluannya. Beberapa golongan mikroorganisme misalnya diatomae dan alga tertentu memerlukan silika (Si) yang biasanya diberikan dalam bentuk silikat untuk menyusun dinding sel. Fungsi dan kebutuhan natrium (Na) untuk beberapa jasad belum diketahui jumlahnya. Natrium dalam kadar yang agak tinggi diperlukan oleh bakteri tertentu yang hidup di laut, algae hijau biru, dan bakteri fotosintetik. Natrium tersebut tidak dapat digantikan oleh kation monovalen yang lain. Jasad hidup dapat menggunakan makanannya dalam bentuk padat maupun cair (larutan). Jasad yang dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat tergolong tipe holozoik, sedangkan yang menggunakan makanan dalam bentuk cair tergolong tipe holofitik. Jasad holofitik dapat pula menggunakan makanan dalam bentuk padat, tetapi makanan tersebut harus dicernakan lebih dulu di luar sel dengan pertolongan enzim ekstraseluler. Pencernaan di luar sel ini dikenal sebagai extracorporeal digestion. Bahan makanan yang digunakan oleh jasad hidup dapat berfungsi sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor atau donor elektron. Dalam garis besarnya bahan makanan dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber nitrogen. 1. Air Air merupakan komponen utama sel mikroorganisme dan medium. Funsi air adalah sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme. 2. Sumber energi Ada beberapa sumber energi untuk mikroorganisme yaitu senyawa organik atau anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari. Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

9

3. Sumber karbon Sumber karbon untuk mikroorganisme dapat berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino, asam organik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganik misalnya karbonat dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama terutama untuk tumbuhan tingkat tinggi. 4. Sumber aseptor elektron Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahan elektron dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas, maka harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkap elektron ini disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Pada mikrobia yang dapat berfungsi sebagai aseptor elektron ialah O2, senyawa organik, NO3 -, NO2 -, N2O, SO4 =, CO2, dan Fe3+. 5. Sumber mineral Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H, dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur mineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn, Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang digunakan dalam jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo, dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke dalam medium lewat kontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu. Selain berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untuk mengatur tekanan osmose, kadar ion H+ (kemasaman, pH), dan potensial oksidasireduksi (redox potential) medium. 6. Faktor tumbuh Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan (sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat disintesis dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zat tumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Berdasarkan struktur dan fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino, sebagai penyusun protein; base purin dan pirimidin, sebagai penyusun asam nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif dari enzim. 7. Sumber nitrogen Mikroorganisme dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asam amino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantung pada jenis jasadnya. Beberapa mikroorganisme dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk gas N2 (zat lemas) udara. Mikroorganisme ini disebut mikrobia penambat nitrogen Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

10

C. STERILISASI BAHAN DAN ALAT LABORATORIUM Bahan dan alat-alat yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak mengandung mikroorganisme, baik yang mengganggu atau merusak bahan, alat, maupun proses laboratoris. Ada tiga kelompok cara sterilisasi bahan dan alat laboratorium, yaitu secara fisik, kimia, dan mekanik. 1. Sterilisasi secara fisik Sterilisasi secara fisik biasanya menggunakan proses pemanasan, pembakaran, atau radiasi. a. Pemanasan basah bertekanan menggunakan alat yang disebut otoklaf (autoclave). Otoklaf menyerupai bejana pengukus berisi air yang tertutup rapat. Otoklaf mempunyai ruang yang mampu menahan panas dan tekanan di atas 1 atm dan dilengkapi kleb-kleb pengaman ledakan.

Gambar: otoklaf (kiri) dan oven (kanan)

Mekanisme pada proses sterilisasi terjadi karena: air di dalam bejana yang dipanaskan akan membentuk uap air. Pada tahap awal, biarkan kleb pengaman dalam keadaan terbuka. Uap air akan ke ruang bejana dan mendesak keluar semua udara yang ada di dalamnya melalui kleb tersebut. Jika udara telah habis terdesak keluar bejana melalui kleb, maka kleb ditutup. Dengan tertutupnya kleb ini maka suhu dan tekanan ruang sterilisasi di dalam bejana akan naik terus sampai mencapai suhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer per cm2. Sedikit di atas suhu dan tekanan ini kleb pengatur secara otomatis akan membuka dan mengeluarkan uap air, sehingga suhu dan tekanan di dalam Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

11

bejana kembali ke suhu 121oC dengan tekanan 1 atm/cm2. Sterilisasi menggunakan otoklaf ini biasanya dilakukan selama 15-20 menit dihitung sejak kleb membuka pertama karena tekanan uap air. Pemanasan basah selain digunakan untuk sterilisasi juga digunakan untuk pasteurisasi dan tindalisasi. Pasteurisasi merupakan cara pemanasan, pertama kali dilakukan oleh Louis Pasteur untuk mengurangi jumlah mikroorganisme yang tidak kita inginkan di dalam suatu bahan menggunakan suhu ±70oC selama 30 menit. Tindalisasi merupakan proses pemanasan bertahap, pertama kali dilakukan oleh Tyndall untuk mengurangi jumlah mikroorganisme di dalam suatu bahan, menggunakan suhu 100oC bertahap (3x). Pada suhu 100oC biasanya hanya membunuh mikroorganisme pada bentuk vegetatif saja tetapi tidak yang dalam bentuk tahan (spora). Biasanya bahan dipanaskan basah (direbus, dikukus) selama beberapa menit (15-30 menit) kemudian dibiarkan selama >8jam pada suhu kamar tanpa membuka tutup bejana dan dipanaskan lagi selama 15-30 menit dan dibiarkan sekali lagi selama >8jam yang akhirnya dipanaskan lagi. Pada tindalisasi dilakukan 3 tahap dengan tujuan bahwa pada tahap pemanasan pertama digunakan untuk membunuh mikroorganisme bentuk vegetatif. Pada tahap pendiaman pada suhu kamar ditujukan untuk memberi kesempatan mikroorganisme bentuk alat tahan tumbuh menjadi vegetatif, sehingga ia akan mati pada pemanasan tahap kedua. Pendiaman tahap kedua bertujuan untuk memberi kesempatan alat tahan yang belum tumbuh menjadi vegetatif, sehingga akan mati pada pemanasan tahap ketiga. b. Pemanasan kering biasanya menggunakan alat yang disebut oven. Sterilisasi ini memanfaatkan udara panas dalam ruang oven. Suhu yang digunakan berkisar 160o-220oC. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi 1-2 jam, lebih lama dibanding menggunakan panas basah karena panas kering daya penetrasinya lebih lemah dibanding panas basah bertekanan. Sterilisasi ini hanya dapat digunakan untuk bahan dan alat yang memang tahan dan tidak rusak oleh panas kering, misalnya alat-alat gelas (cawan petri, pipet, tabung reaksi, gelas labu dan sejenisnya. c. Pembakaran merupakan cara sterilisasi menggunakan api secara langsung. Pembakaran merupakan cara sterilisasi yang paling efektif, tetapi hanya dapat digunakan untuk alat-alat tertentu yang tidak rusak karena dibakar. Cara ini biasanya digunakan untuk mensterilkan alat isolasi dan kultivasi mikroorganisme yang dari logam, seperti jarum ose, jarum enten, dan skalpel yang dibakar sampai memijar. d. Radiasi merupakan cara sterilisasi menggunakan penyinaran gelombang pendek. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang yang dapat Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

12

membunuh mikroorganisme berkisar pada 220-290 nm dan yang efektif pada λ = 253,7 nm. Penetrasi dari radiasi ultraviolet boleh dikatakan lemah sehingga hanya berfungsi pada permukaan benda saja atau benda-benda yang sangat tipis. Absorbsi sinar ultraviolet mengakibatkan modifikasi nukleoprotein karena menimbulkan hubungan silang pasangan timin dan menyebabkan salah baca kode genetika dan merusak fungsi vital mikroorganisme sehingga mematikan. 2. Sterilisasi secara kimia dilakukan dengan bahan kimia yang membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Bahan kimia yang biasa kita gunakan untuk pekerjaan laboratorium adalah antiseptik. Antiseptik kimia biasanya kita gunakan dan kita biarkan menguap, misalnya alkohol. Alkohol yang efektif dan murah adalah isopropil alkohol 70%-90%. Penambahan yodium (iodin) ke dalam alkohol akan meningkatkan daya antiseptiknya. Alkohol yang dicampur dengan formaldehid (formalin) akan mampu membunuh spora (alat tahan) mikroorganisme Mempertimbangkan efek samping bahan kimia, maka pemilihan antiseptik lebih diutamakan kepada kebutuhan dibanding tujuan. Banyak bahan kimia antiseptik yang beracun, menimbulkan iritasi kulit, dan bahaya-bahaya lain yang harus dipertimbangkan dalam penggunaannya. Zat-zat kimia yang dapat digunakan sebagai antiseptik antara lain alkohol, senyawa halogen (klorin, yodium), fenol, hidrogen peroksida, zat kristal violet, rosanalin, deterjen, logam berat (Hg, Ag, As, Zn), aldehid, gas formaldehid (formalin), gas oksida etilen, dan β-propilakton. 3. Sterilisasi secara mekanik digunakan untuk mensterilkan bahan atau alat yang berubah, terurai atau rusak jika disterilkan dengan pemanasan maupun cara kimia, misalnya ensim, serum, ekstrak sel, dan ruangan kerja. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini umumnya berupa saringan (filter) yang tidak dapat dilalui mikroorganisme, misalnya filter Berkefeld, filter Chamberland, dan filter Seitz.

Gambar: filter bakteri untuk cairan (kiri) laminar air flow bench (kanan) Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

13

Bahan-bahan yang berupa cairan (ensim, serum, ekstrak sel) disterilkan menggunakan filter dengan matasaring lebih kecil dari pada ukuran mikroorganisme. Ruang kerja mikrobiologis harus dirancang bebas dari mikroorganisme. Untuk mencegah pencemaran mikroorganisme udara maka udara yang masuk ke dalam ruang tersebut dilewatkan terlebih dulu melalui filter. Ruang kerja tersebut biasanya berupa kotak berukuran panjang 120 cm, lebar 75 cm, dan tinggi 75 cm, kita sebut laminar air flow bench atau kotak enten. D. KULTIVASI DAN ISOLASI (TEKNIK BIAKAN MURNI) Kultivasi adalah usaha menumbuhkan mikroorganisme pada atau dalam medium kultur. Isolasi adalah usaha memisahkan mikroorganisme dari suatu bahan atau medium ke medium lain yang biasanya ditujukan untuk mendapatkan biakan sejenis (biakan murni) tak tercampur oleh mikroorganisme lain. Pekerjaan tersebut harus dipersiapkan dan dilakukan secara teliti, steril, dan aseptik. Aseptik artinya berusaha mencegah atau mengurangi terjadinya kontaminasi (terikutnya mikroorganisme lain yang tidak kita kehendaki ke dalam proses yang kita lakukan). Beberapa langkah penting yang harus kita siapkan dan lakukan secara teliti, steril, dan aseptik yaitu: 1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat kultivasi dan isolasi mikroorganisme harus bersih, steril, dan bebas angin. Dinding dan alas yang basah dapat menyebabkan butir-butir debu menempel padanya, oleh karena itu ruang isolasi dapat diberi alas kain basah. Ruang tempat kultivasi dan isolasi ini biasanya berupa enkas (ent case) atau laminar air flow yang sudah dilengkapi dengan penyaring udara. Di laboratorium standar biasanya udara yang masuk ke dalam ruangan telah dilewatkan pada ventilasi yang selalu disinari dengan sinar ultraviolet (radiasi). 2. Pemindahan mikroorganisme Pemindahan mikroorganisme dari satu medium ke medium lainnya dapat dilakukan menggunakan jarum inokulasi (ose, jarum ent) atau menggunakan pipet. Pemindahan menggunakan jarum inokulasi dilakukan dengan ujung kawat (lebih baik kawat platina) yang sudah disterilkan dengan dibakar sampai pijar. Untuk mikroorganisme unisel atau bentuk cairan dapat menggunakan ujung kawat yang dibulatkan θ 1-3 mm (jarum ose) dan untuk mikroorganisme multisel menggunakan ujung kawat yang dilebarkan (jarum ent). Pemindahan menggunakan pipet dapat dilakukan jika mikroorganisme berada dalam cairan. Pipet yang digunakan pun harus selalu steril. 3. Isolasi dan inokulasi (teknik biakan murni) Di alam bebas tidak ada mikroorganisme yang hidup tersendiri terlepas dari mikroorganisme lain. Sering berbagai jenis maupun kelompok mikroorganisme kedapatan secara bersama-sama di suatu titik, tempat, maupun bahan tertentu. Oleh Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

14

karena itu, di dalam mempelajari suatu mikroorganisme diperlukan teknik untuk menyendirikan (isolasi) mikroorganisme yang bersangkutan dari mikroorganismemikroorganisme lainnya, kita sebut dengan teknik biakan murni. Di dalam pelaksanaan teknik biakan murni tidak hanya bagaimana memisahkannya tetapi juga bagaimana memelihara dan mencegah terjadinya kontaminasi (pencemaran) dari mikroorganisme yang tidak kita kehendaki. Ada beberapa cara untuk mendapatkan biakan murni, antara lain: a. Cara pengenceran (dilution)

Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister (1865) yang berhasil membiakan secara murnikan bakteri Streptococcus lactis yang diisolasi dari susu masam. Cara mengisolasinya dengan mengencerkan sampel susu sampai beberapa tingkat kemudian susu hasil pengenceran terakhir dipipet 100 µl untuk ditanam sebar pada medium kultur padat. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan murni. b. Cara penuangan (pour plate)

Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

15

Cara ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch (1843-1905). Cara ini sebenarnya tidak berbeda dari apa yang dilakukan oleh Lister, hanya saja Koch menggunakan medium kultur semi padat yang sudah dicampur dengan sampel yang diencerkan dituangkan ke dalam cawan, sedangkan Lister menanam sampel yang diencerkan pada permukaan medium kultur yang sudah membeku di dalam cawan. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan murni. Di cara penuangan ini ada dua orang pembantu Koch yang berjasa menciptakan cawan untuk wadah biakan, yaitu Petri dan seorang lagi yang menemukan agaragar sebagai pemadat medium kultur yang tidak mudah meleleh, yaitu Hesse. Cawan yang diciptakan oleh Petri disebut cawan Petri (petridish) dan karena yang dituang adalah medium kultur yang mengandung agar-agar maka teknik ini disebut teknik agar tuang. c. Cara penggoresan (streak plate)

Cara ini juga tidak jauh berbeda dengan cara Lister. Cara penggoresan dilakukan dengan menyiapkan sampel bahan dan medium kultur padat. Sampel bahan diambil menggunakan ose kemudian digoreskan pada permukaan medium kultur yang sudah beku. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan murni d. Cara penyebaran (spread plate) Cara penyebaran dilakukan dengan menyiapkan sampel bahan dan medium kultur padat. Sampel bahan diambil menggunakan pipet kemudian diteteskan di atas medium kultur yang telah membeku dan tetesan sampel bahan diratakan di permukaan atas medium kultur menggunakan gelas perata. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan murni Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

16

e. Cara pengucilan sel tunggal (single cell isolation) Cara pengucilan sel tunggal dilakukan menggunakan alat khusus yang dapat mengambil hanya satu sel mikroorganisme. Alat pengambilnya disebut mikropipet yang ditempatkan pada mikromanipulator. Pengambilan sel diawali dengan membuat tetesan bergantung pada gelas penutup preparat atau dalam gelas preparat cekung. Pengambilan sel menggunakan mikropipet dilakukan menggunakan mikroskop kemudian sel dipindah ke dalam medium kultur. Kultivasi ini akan menghasilkan koloni yang berasal dari keturunan satu sel. E. TEKNIK PEWARNAAN PREPARAT Prinsip pengamatan mikroorganisme menggunakan mikroskop adalah mengamati bayangan mikroorganisme yang terbentuk pada lensa dan tertangkap oleh mata kita. Pada umumnya mikroorganisme, terutama bakteri bersifat tembus cahaya, sehingga kalau diamati menggunakan mikroskop cahaya akan tidak atau kurang membentuk bayangan dan akibatnya tidak terlihat atau terlihat bening (transparan) oleh mata kita. Oleh karena itu, untuk menampakkan bagian-bagian sel tertentu perlu diwarnai. Zat pewarna yang diadsobsi oleh sel akan membiaskan cahaya sehingga akan terlihat kontras dengan sekelilingnya. Untuk menampakkan bagian inti sel diperlukan zat pewarna inti sel, untuk melihat flagela, spora, maupun organel-organel lain di dalam sel diperlukan zat pewarna khusus. Proses mewarnai sel, organel, atau benda lain disebut pewarnaan. Sebagai contoh, misalnya pewarnaan secara Feulgen digunakan untuk mewarnai inti, dan pewarnaan secara Gram digunakan untuk mewarnai dinding sel. Pewarnaan mikroorganisme biasanya bertujuan untuk: 1. Mempermudah mengamati bentuk organel dan sel mikroorganisme 2. Memperjelas ukuran dan bentuk organel maupun sel mikroorganisme 3. Mengamati struktur luar dan dalam sel mikroorganisme Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

17

4. Mengamati reaksi mikroorganisme terhadap zat kimia sehingga sifat-sifat fisik dan kimianya dapat diketahui. Dari segi kimia, zat pewarna merupakan garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif yang salah satu diantaranya berwarna. Zat pewarna akan bersifat basa jika warnanya terletak pada ion positif disebut juga zat pewarna positif (Ion+Cl-). Zat pewarna positif biasanya mempunyai ion negatif (anion) Cl, SO4, CH3COO, COOHOO. Zat pewarna akan bersifat asam jika warnanya terletak pada ion negatif disebut juga zat pewarna negatif (Na+Ion-). Zat pewarna negatif biasanya mempunyai ion positif (kation) Na, K, Ca, dan NH3 Hubungan sel mikroorganisme dengan zat pewarna basa yang menonjol terutama disebabkan oleh asam nukleat di dalam protoplasma sel. Jika sel mikroorganisme yang asam nukleatnya berjumlah besar dan diwarnai maka muatan negatif di dalam asam nukleat akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Contoh zat pewarna basa yaitu zat kristal violet, safranin, dan metil biru. Sebaliknya zat pewarna asam akan ditolak oleh muatan negatif dari mikroorganisme tersebut, sehingga mikroorganisme menjadi tidak atau kurang terwarnai, tetapi latar belakangnya yang terwarnai. Teknik ini sering sangat berguna untuk mengamati keseluruhan bentuk sel yang sangat kecil. Proses pewarnaan latar belakang sel ini disebut juga pewarnaan negatif. Langkah-langkah laboratoris dalam mempersiapkan pewarnaan mikroorganisme untuk diamati menggunakan mikroskop ada tiga tahap utama. 1. Penempatan obyek (spesimen) diusahakan setipis mungkin 2. Fiksasi spesimen dengan dipanasi supaya spesimen melekat erat pada gelas obyek 3. Aplikasi pewarna menggunakan pewarna sederhana (tunggal) atau serangkaian pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial) Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menambahkan pada obyek yang telah difiksasi menggunakan satu jenis pewarna. Stelah 30-60 detik, zat pewarna dibilas menggunakan air mengalir kemudian di kering anginkan dan diamati menggunakan mikroskop. Pewarnaan sederhana ini ada dua macam, yaitu pewarnaan positif dan pewarnaan negatif. Pewarnaan positif adalah pewarnaan pada sel mikroorganisme (dapat menggunakan salah satu dari: zat kristal violet, metil biru, safranin, dan sejenisnya), sedangkan pewarnaan negatif adalah pewarnaan pada latar belakang obyek (biasanya menggunakan tinta Cina). Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroorganisme atau organel dan bagian lain dari sel. Pewarnaan diferensial biasanya menggunakan zat pewarna lebih dari satu.

Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

18

Contoh pewarnaan diferensial adalah pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan Giemsa, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagela. Pewarnaan gram merupakan salah satu contoh pewarnaan diferensial yang paling luas digunakan untuk membedakan reaksi dinding sel mikroorganisme (terutama bakteri). Pada pewarnaan gram digunakan dua zat pewarna, satu zat penguat, dan satu zat peluntur. Ada empat tahap utama yang dilakukan pada pewarnaan gram, setelah penempatan spesimen dan fiksasinya, yaitu: a. Pewarnaan spesimen menggunakan zat kristal violet. Pada tahap ini semua sel akan berwarna ungu. b. Penguatan warna ungu menggunakan yodium. Pada tahap ini terjadi kompleks kristal violet dengan yodium yang tetap berwarna ungu. c. Pelunturan pewarna menggunakan alkohol. Pada dinding sel gram positif akan mengalami dehidrasi, pori-pori dinding menyempit, dan daya rembes membran menurun sehingga pewarna tidak dapat keluar dan tetap berwarna ungu. Pada dinding sel gram negatif lipidanya akan terekstraksi keluar dinding sel dan pori-pori dinding membesar sehingga pewarna keluar dari dinding sel dan menjadi tidak berwarna (transparan). d. Pewarnaan kedua menggunakan safranin. Pada sel gram positif pewarna kedua tidak dapat diabsorbsi oleh dinding sel karena pori-porinya menyempit, sehingga warnanya tetap ungu (warna kristal violet), sedangkan pada sel gram negatif pewarna kedua ini akan diabsorbsi dinding sel sehingga warnanya menjadi merah (warna safranin)

to be continue Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu

19