iii ABSTRACT ABDUL KADIR . Induction of somaclone variation through gamma irradiation and in vitro selection to obtain drought tolerance patchouly. Under the supervision of Surjono H. Sutjahjo as a Promotor, G.A. Wattimena and Ika Mariska as a Co Promotor. Patchouly (Pogostemon cablin Benth.) is a source of patchouly oil. Indonesia is the biggest producer of patchouly oil in the world, reach to 90 % supply. Generally, patchouly is cultivated at dry land so that drought stress becomes the one of problem for this development. Low level of genetic diversity and limitation of clones are also the other problem to get superior clone that adaptive to drought stress. The use of gamma irradiation of fragment sub culture calli is the one alternative way to increase somaclonal variation and via in vitro selection using PEG as the selective agent is expected to obtain drought tolerance patchouly. The research was conducted at the Tissue Culture Laboratory of Research Center of Biotechnology and Genetic Resources, Bogor. Gamma irradiation treatment was done at the Center for Application of Isotope and Radiation Technology- BATAN, Jakarta from July 2004 to January 2007. Plant material was Tapak Tuan clone obtain from in vitro proliferation and the one of the most expection candidate clone that Balitbiogen collected. The result showed that the best medium for calli induction was MS+0.1 mg l -1 BA + 1.0 mg l -1 2,4-D while the best medium for calli proliferation was MS+0.1 mg l -1 BA + 0.5 mg l -1 2,4-D and the medium for shoot regeneration was MS+0.5 mg l -1 BA+ 100 mg l -1 Proline. The 20 % PEG could be chosen sub lethal dosage for in vitro selection.. Higher PEG and gamma dosage on all selection method caused the lower calli quality, the higher calli mortality and calli growth. Gamma irradiation from all in vitro selection method caused variance of shoot growth. Somaclone from 20 % PEG (on two method) had hight level of survival on rise huk charcod containing of 20 % PEG compared to somaclonal from lower of PEG on the whole selection method. Combination beeten gamma irradiation and in vitro selection induced variance of qualitative characters such as formation of primary branch in lower stem, trifoliate leaves, devided leaves, parabolic leaves, stundy plant, smaller leaves, double leaves, and yellowish green young leaves. Several quantitative of MV 1 and MV 2 generation were variant. Several quantitative character from somaclones were lower or higher than those from the parents. Based on sensitivity test, there was no drought tolerant somaclones. The TT00, TT05 and TT15 somaclones were categorized as moderate while the TT15, TT20 somaclones and the parent were categorized as susceptible. However based on analysis of tolerance level, there was 11 somaclones were categorized as tolerant. The moderate somaclones accumulated higher level of proline and total sugar compared to susceptible somaclones when they were exposured with drought stress. Furthermore, structure and stomata density moderate and tolerant somaclones were lower than those from susceptible somaclones. Key words : Calli, Somaclonal variation, gamma irradiation, polyetilene glycol (PEG), in vitro selection, and drought tolerance.
iv RINGKASAN ABDUL KADIR . Induksi Varian Somaklon Melalui Iradiasi Sinar Gamma dan Seleksi In vitro untuk Mendapatkan Tanaman Nilam Toleran terhadap Cekaman Kekeringan. Dibawah bimbingan Surjono H. Sutjahjo sebagai ketua, G.A. Wattimena dan Ika Mariska sebagai anggota. Tanaman nilam (Pogostemom cablin Benth.) merupakan salah satu tanaman penghasil minyak atsiri yang dikenal dengan minyak nilam (patchouly oil). Indonesia merupakan negara pemasok terbesar kebutuhan minyak nilam dunia, yang mencapai sekitar 90 % dari seluruh kebutuhan dunia. Tanaman nilam umumnya dibudidayakan pada lahan kering, sehingga salah satu resiko pengembangannya adalah masalah kekeringan. Sempitnya keragaman genetik dan terbatasnya jumlah klon yang tersedia merupakan salah satu kendala dalam melakukan seleksi untuk memperoleh klon unggul yang adaptif terhadap cekaman kekeringan. Penggunaan iradiasi sinar gamma pada kalus nilam yang telah mengalami subkultur berulang merupakan upaya yang dilakukan untuk meningkatkan variasi somaklonal, dan melalui seleksi in vitro menggunakan agen penyeleksi Polyethilene Glycol (PEG), diharapkan diperoleh tanaman nilam yang toleran terhadap cekaman kekeringan sebagaimana tujuan dari penelitian ini. Penelitian dilaksanakan di Lab.Biologi Sel dan Jaringan Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor. Iradiasi sinar gamma dilaksanakan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR) Badan tenaga Atom Nasional (BATAN) Jakarta. Penelitian berlangsung dari Juli 2004 s/d Januari 2007. Bahan tanaman yang digunakan adalah klon nilam Tapak Tuan (TT75) hasil perbanyakan secara in vitro dan merupakan salah satu klon harapan yang dikoleksi Balitbiogen. Penelitian ini terdiri atas empat percobaan yaitu, Percobaan 1: Induksi dan perbanyakan populasi kalus, regenerasi tanaman serta uji respon kalus terhadap konsentrasi PEG dan dosis iradiasi sinar gamma, betujuan untuk mendapatkan komposisi media kultur in vitro yang terbaik dalam menginduksi dan memperbanyak populasi kalus embriogenik menggunakan komposisi BA dan 2,4-D dalam media dasar MS serta untuk mendapatkan media regenerasi terbaik menggunakan berbagai komposisi auksin dan sitokinin, juga untuk mempelajari respon kalus embriogenik dalam media selektif PEG dan dosis iradiasi sinar gamma dalam menekan pertumbuhan kalus. Percobaan 2 : Iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro menggunakan PEG untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan, bertujuan untuk meningkatkan keragaman somaklonal pada eksplan kalus yang telah mengalami subkultur berulang dan melalui seleksi in vitro dengan menggunakan tiga metode seleksi diharapkan diperoleh varian yang toleran terhadap cekaman kekeringan, juga untuk mengetahui respon planlet hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro terhadap media arang sekam yang diberi larutan PEG 20 %. Percobaan 3 : Identifikasi varian somaklon hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro, bertujuan untuk mengidentifikasi frekuensi dan tipe varian somaklon hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro generasi MV 1 berdasarkan karakter kualitatif dan kuantitatif serta mengevaluasi klonal generasi MV 2 yang bersumber dari bahan tanaman generasi MV 1 . Percobaan 4 : Evaluasi varian somaklon hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro untuk
v toleransi terhadap cekaman kekeringan, bertujuan untuk mengevaluasi somaklon hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro yang toleransi terhadap cekaman kekeringan. Dari evaluasi tersebut diharapkan mendapatkan nomor somaklon yang mempunyai tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman induk berdasarkan karakter morfologi, agronomi dan fisiologi. Hasil percobaan 1 menunjukkan bahwa, media MS+BA 0.1 mg l -1 +2,4-D 1.0 mg l -1 dan MS+BA0.1 mg l -1 + 2,4-D 0.5 mg l -1 masing-masing merupakan media terbaik untuk induksi dan perbanyakan populasi kalus, sedangkan media terbaik untuk regenerasi adalah MS+BA0.5 mg l -1 + Prolin 100 mg l -1 . Semakin tinggi konsentrasi PEG dan dosis iradiasi sinar gamma, semakin meningkatkan persentase kalus yang mati serta menekan pertumbuhan kalus. Konsentrasi PEG 20 % menyebabkan kematian kalus 75.76 %, dan persentase kalus yang dapat bertunas 25.0 %. Konsentrasi PEG 20 % dapat dijadikan sebagai konsentrasi sub letal untuk seleksi in vitro pada percobaan berikutnya. Dosis iradiasi sinar gamma 20 Gy dapat mematikan kalus kurang lebih 20 % pada 90 hari setelah iradiasi, dosis 20 Gy merupakan batas dosis maksimal yang dapat dikombinasikan dengan seleksi in vitro PEG 20 %. Hasil percobaan 2 menunjukkan bahwa, semakin tingggi konsentrasi PEG dan dosis iradiasi sinar gamma semakin menurunkan kualitas kalus, meningkatkan persentase kalus mati, menekan pertumbuhan kalus. Seleksi in vitro menggunakan seleksi menyeluruh pada konsentrasi PEG 20 % pada dosis 0 , 5, 10, 15 dan 20 Gy persentase kalus mati berturut-turut : 65.3, 66.7, 90.5, 100.0 dan 85.0 %, Semua kalus yang diregenerasi pada perlakuan ini tidak beregenerasi. Pada metode seleksi in vitro langsung, persentase kalus mati mencapai 79.3 – 93.1 %, hanya dosis 0-10 Gy yang dapat beregenerasi 13.3 – 15.4 %. Pada metode seleksi bertahap menghasilkan persentase kalus mati 65.5- 68.8 % dan berarti lebih rendah dari seleksi menyeluruh dan langsung. Pada seleksi ini, semua level dosis iradiasi sinar gamma menghasilkan kalus beregenerasi 16.2 – 33.4 %. Iradiasi sinar gamma pada tiga metode seleksi in vitro dapat menyebabkan keragaman pertumbuhan tunas. Somaklon hasil seleksi in vitro PEG 20 % (metode bertahap) mempunyai kemampuan bertahan hidup pada media arang sekam yang diberi larutan PEG 20 %, dibandingkan dengan planlet somaklon hasil seleksi in vitro menggunakan PEG konsentrasi yang lebih rendah (seleksi menyeluruh). Hasil percobaan 3 menunjukkan bahwa, iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro dapat menginduksi varian yang dapat diamati dari tunas yaitu karakter batang bercabang, daun pucuk melilit, daun mengecil dan menggulung, akar tumbuh sepanjang ruas (akar semu), ruas memanjang dan memendek. Pada umumnya dosis iradiasi sinar gamma 20 Gy menginduksi frekuensi varian yang lebih banyak dibandingkan dengan dosis iradiasi sinar gamma yang lebih rendah. Kombinasi iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro juga menginduksi varian dengan karakter terbentuknya cabang primer pada pangkal batang, daun trifoliat, ujung daun terbelah, daun parabola, tanaman kerdil, tanaman berdaun kecil, tanaman berdaun ganda, dan varian daun muda warna hijau kekuningan. Beberapa karakter kuantitatif populasi somaklon generasi MV 1 dan MV 2 merupakan karakter varian yang dapat diturunkan secara genetik. Populasi somaklon TT10 mempunyai pertumbuhan lebih baik dibandingkan dengan somaklon lainnya, sebaliknya somaklon TT20 umumnya mempunyai karakter kuantitatif lebih rendah dari populasi somaklon lainnya. Beberapa karakter kuantitatif nomor
vi somaklon mempunyai rata-rata karakter kuantitatif lebih tinggi dan lebih rendah dari karakter tanaman induk. Hasil percobaan 4 menunjukkan bahwa cekaman kekeringan menekan pertumbuhan dan hasil tanaman. Somaklon TT00, TT05 dan TT10 merespon kondisi cekaman kekeringan lebih baik dibandingkan dengan tanaman induk, sedangkan somaklon TT15 dan TT20 relatif sama dengan tanaman induk. Dari hasil analisis sensitivitas, tidak diperoleh somaklon yang toleran. Somaklon TT00, TT05 dan TT10 dikategorikan moderat, sedangkan TT15, TT20 dan tanaman induk dikategorikan sebagai somaklon yang peka. Namun demikian berdasarkan analisis tingkat toleransi nomor somaklon, diperoleh 11 nomor yang dikategorikan toleran. Terdapat tujuh nomor somaklon diantaranya mempunyai kadar minyak 3.27 – 3.76 %. Somaklon yang dikategorikan moderat mengakumulasi prolin dan gula total lebih tinggi saat diberi cekaman kekeringan dibandingkan dengan somaklon yang peka. Struktur dan kerapatan stomata juga mempunyai hubungan dengan tingkat toleransi tanaman, dimana somaklon yang moderat dan nomor-nomor somaklon yang toleran mempunyai struktur dan kerapatan stomata yang lebih rendah dibandingkan dengan somaklon dan nomor somaklon yang peka. Kata kunci : Kalus, variasi somaklonal, iradiasi sinar gamma, polyetilene glycol (PEG), seleksi in vitro, dan toleran kekeringan.
