II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Lipase dan Sumbernya Lipase adalah nama trivial dari enzim glycerol-ester hydrolase yang mengkatalis reaksi hidrolisis lemak dan minyak. Di bidang industri lemak dan minyak, enzim lipase juga penting karena peranannya dalam mengendalikan proses produksi minyak dan lemak; misalnya pada minyak goreng dan margarin dalam proses menyingkirkan cita rasa dan bau-bauan yang tidak dikehendaki. Sebaliknya dengan menggunakan enzim lipase beberapa cita rasa yang dikehendaki dapat diatur sesuai dengan yang diinginkan (Winarno, 1995). Berdasarkan nomenklatur dari International Union of Biochemistry, enzim lipase berfungsi mengkatalisis reaksi hidrolisa trigliserida menjadi digliserida dan asam lemak, dengan mekanisme sebagai berikut : Trigliserida + H 2O
Lipase Digliserida + asam lemak
Ternyata reaksi tersebut belum lengkap karena lipase dapat menghidrolisis digliserida lebih lanjut menjadi monogliserida dan bahkan yang heterogen. Enzim lipase sangat lambat kerjanya pada larutan lemak dalam air. Tetapi sebaliknya, dalam keadaan emulsi, hidrolisis oleh lipase menjadi sangat cepat. Lipase mempunyai sifat yang spesifik tergantung dari asal dan substratnya, keaktifan optimum lipase sangat tergantung pada pH dan suhu. Dalam keadaan normal pH harus stabil sebab adanya perubahan akan menyebabkan pergeseran aktivitas enzim (Girinda, 1993). pH optimum enzim untuk bereaksi adalah 4,5 sampai 8 (Winarno, 1986). Keaktifan lipase tergantung juga dari senyawa pengemulsi yang digunakan dan ada tidaknya garam dalam substrat. Suhu optimal lipase pada umumnya berkisar antara 35oC dan 45oC. Lipase tersebar
4
7 luas pada hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Walaupun lipase dari banyak sumber yang berbeda telah banyak diuraikan, secara relatif hanya sedikit yang telah diteliti hingga detail. Beberapa sumber lipase diantaranya (Akoh, 2002) : a. Tumbuhan Penelitian tentang penyebaran lipase pada tanaman masih sangat sedikit kecuali pada biji dan buah-buahan. Biji yang sedang berkecambah memiliki aktivitas lipolitik yang tinggi dalam rangka memenuhi kebutuhan energi. Lipase terdapat pada biji atau buah tanaman palma, serealia, kapas, jagung dan timun. b. Lipase asal hewani Lipase terdapat pada organ dan cairan tubuh dari banyak spesies. Lipase ada pada cairan pancreas, lambung, dan air ludah. Sekresi intestinal juga mengandung lipase. Lipase terdapat pada plasma darah. Leukosit mengandung lipase, tetapi eritrosit tidak. Lipase terdapat pada fluida cerebrospinal dan limpa. Pada urin pun mengandung lipase yang sepertinya identik dengan lipase pada limpa. c. Mikoorganisme Lipase tersebar luas di antara bakteri, khamir dan kapang. Umumnya lipase asal mikroorganisme ini bersifat intraseluler. Akan tetapi lipase ekstraseluler yang dihasilkan mikoorganisme cukup banyak. Lipase ekstraseluler dihasilkan oleh Geotrichum candidum, Rhizopus niveus, Candida paralipolytica, Pseudomonas mephetica, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Rhizopus niveus, Rhizopus lipolytica. Lipase ekstraseluler lebih disukai dalam industri karena lebih mudah dalam hal penanganannya sehingga lebih menguntungkan secara ekonomi.
8
2.1.1 Regioselektifitas Lipase Regioselektivitas lipase merupakan sifat spesifik lipase untuk menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Lipase dikelompokkan selektivitasnya yang kuat pada triasilgliserol (TAG) yaitu terhadap posisi asil yang terikat pada gliserol (regioselectivity). Reaksi katalis umumnya pada posisi asil primer TAG serial number 1,3 (sn-1,3) atau pada semua posisi (sn-1,2 dan 3). Lipase dengan selektivitas posisi ke dua (sn-2) belum menunjukkan eksistensinya. Pengetahuan regioselektivitas lipase sangat penting untuk kimia lipid pada nutrisi dan sifat lemak dan dapat dimanipulasi dengan merubah konstituen rantai asil pada posisi spesifik (Chandler, 2001). Lipase dapat diklasifikasikan dalam tiga kelompok berdasarkan spesifikasinya (Macrae, 1983 dalam Suhendra, 2005) : a) Lipase non spesifik Kelompok pertama ini tidak menunjukkan spesifikasi seperti pada kelompok yang lainnya. Posisi molekul TAG (triasilgliserol) yang manapun diserang akan menghasilkan asam lemak alami. Lipase memutus semua ikatan TAG menjadi asam lemak bebas dan gliserol, tetapi di- dan mono- gliserida merupakan hasil antara. b) Lipase spesifik 1,3 Kelompok kedua merupakan lipase yang memutus asam lemak bebas dari posisi 1 dan 3 pada TAG. TAG dihidrolisis menghasilkan asam lemak bebas, 1,2 (2,3) - digliserida dan 2-monogliserida sebagai produk reaksi oleh lipase ini. c) Lipase spesifik asam lemak Kelompok ketiga merupakan lipase yang memutus asam lemak terutama pada tipe asam lemak spesifik dari molekul gliserida.
9 Peningkatan sangat besar terhadap penggunaan lipase disebabkan oleh kemampuan reaksi katalik pada kondisi suhu rendah, menunjukkan kemampuan selektifitas terhadap substrat dan kemampuan sterioisomernya. Lipase dikelompokkan selektifitasnya yang kuat pada TAG yaitu terhadap posisi asil yang terikat pada gliserol (regioselectivity). Reaksi katalis umumnya pada posisi asil primer TAG (sn-1,3) atau pada semua posisi (sn-1,2 dan 3). Lipase dengan selektivitas posisi ke dua (sn-2) belum menunjukkan eksistensinya. Pengetahuan regioselektivitas lipase sangat penting untuk kimia lipid pada nutrisi dan sifat lemak dan dapat dimanipulasi dengan merubah konstituen rantai asil pada posisi spesifik (Chandler, 2001).
2.1.2 Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim a. Waktu reaksi Aktivitas suatu enzim ditentukan dari jumlah substrat yang berubah bersama dengan perubahan waktu. Bila suatu enzim diinkubasi dengan substrat pada kondisi pH, suhu, dan kondisi lain yang sesuai, sampel dapat diambil pada selang waktu tertentu dan dilakukan analisis jumlah substrat yang berubah atau produk yang dihasilkan. Pada awalnya perubahan substrat terhadap waktu linear meningkat, tetapi kemudian menurun. Konsentrasi substrat akan semakin menurun dengan berjalannya waktu dan juga aktivitas enzim akan menurun karena berkurangnya substrat tersebut. Semua efek tersebut berkurang sampai minimum dengan pengukuran kecepatan reaksi awal yaitu laju perubahan substrat terhadap waktu (Nurhasanah dan Herasari, 2008).
10
b. Suhu Karena reaksi kimia sangat dipengaruhi oleh suhu maka reaksi yang dikatalis oleh enzim juga peka terhadap suhu. Enzim sebagai protein akan mengalami denaturasi jika suhunya dinaikkan. Akibatnya daya kerja enzim menurun. Mungkin sampai suhu 45°C efek predominannya masih memperlihatkan kenaikkan aktivitas sebagaimana dugaan dalam teori kinetik. Tetapi lebih dari 45°C efek yang berlawanan yaitu denaturasi termal lebih menonjol dan menjelang suhu 55°C fungsi katalitik enzim menjadi punah (Girindra, 1993).
c. Pengaruh pH Enzim hanya aktif pada kisaran nilai pH yang terbatas. Keragaman aktivitas enzim akibat pengaruh pH disebabkan oleh keadaan ionisasi protein enzim dan komponenkomponen lain dari campuran reaksi. Nilai pH saat aktivitas enzim maksimum disebut dengan pH optimal, yang merupakan sifat karakteristik suatu enzim, menunjukkan bahwa enzim stabil pada kondisi yang diamati. Adanya perubahan pH di atas atau di bawah optimal akan mengurangi aktivitas enzim (Winarno, 1986).
d. Konsentrasi
Aktivitas enzim akan bervariasi secara linier dengan perubahan konsentrasinya. Peristiwa ini merupakan hal yang sangat penting karena pengujian (assays) enzim biasanya dilakukan terhadap sejumlah atau sebagian kecil larutan bahan yang diperoleh. Contoh aktivitas enzim serum diperhitungkan per liternya, sedangkan penentuan atau pengukurannya dilakukan pada 0,1 ml atau 0,2 ml saja. Berbagai tipe yang dapat diperoleh secara normal diperoleh hubungan garis lurus dan adanya
11 penyimpangan (deviasi). Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat atau enzim sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi tetap. Pada keadaan tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum. (Nurhasanah dan Herasari, 2008).
2.1.3 Aktivitas Enzim Pada Perkecambahan Biji Proses perkecambahan biji merupakan suatu rangkaian kompleks dari perubahanperubahan morfologi, fisiologi, dan biokimia. Tahap pertama suatu perkecambahan biji dimulai dengan proses penyerapan air oleh biji, melunaknya kulit biji, dan hidrasi dari protoplasma. Tahap kedua dimulai dengan kegiatan-kegiatan sel dan enzim-enzim serta naiknya tingkat respirasi benih. Pada saat inilah terjadi perombakan kandungan-kandungan kimia penghasil energi pada biji seperti karbohidrat, lemak, dan protein oleh enzim pemecahnya masing-masing yaitu amilase, lipase, dan protease. Energi diperlukan untuk kegiatan pembentukan komponen dan pertumbuhan sel-sel baru, proses pembelahan biji, pembesaran dan pembagian sel-sel pada titik tumbuh dan yang terpenting adalah sebagai energi pada proses respirasi sel (Soetopo, 2002) Lemak dirombak oleh enzim lipase menjadi asam lemak dan gliserol. Asam lemak dan gliserol kemudian dipakai sebagai pembentuk glukosa, dan glukosa ini dipakai sebagai bahan bakar pada proses respirasi. Molekul-molekul lemak berfungsi sebagai pembentuk protoplasma (Soetopo, 2002). Pada saat yang sama biji juga memerlukan energi karbon skeleton yang sangat penting untuk pertumbuhan embrio dengan mensintesa lemak. Lipase mengatur kecepatan pemecahan lemak (hidrolisis) dan sintesa lemak (esterifikasi) pada tahap perkecambahan dan pertumbuhan embrio (Huang dkk., 1988).
12 Senanayake dan Shahidi (2000) melaporkan komponen total dan lemak netral biji borage (Borage officinalis L) menjadi glikolipid dan phospolipid selama perkecambahan dalam kondisi gelap pada suhu 25oC selama 10 hari. Kandungan TAG menurun dan kandungan monoasilgliserol (MAG) dan asam lemak bebas (FFA) meningkat dan diasilgliserol (DAG) tidak banyak berubah. Aktivitas lipase juga diketemukan berada dalam dorman dan biji berkecambah pada biji Jatropa curcas L. (Abigor dkk., 2002).
2.2 Biji Adas (Foeniculum vulgare Miller) Adas (Foeniculum vulgare Miller, suku adas-adasan atau Apiaceae) telah lama dikenal sebagai salah satu komponen pengobatan tradisional. Minyak adas yang dikandung bijinya menjadi salah satu komponen minyak telon. Tumbuhannya berbentuk herba yang berbau harum, berwarna hijau terang, tegak, dan dapat mencapai dua meter tingginya. Daun tumbuh sehingga 40 cm panjang, berbentuk pita, dengan segmen terakhir dalam bentuk rambut, kirakira selebar 0,5 mm. Bunga yang dihasilkan di ujung tangkai adalah bunga majemuk yang berdiameter 5 hingga 15 cm. Setiap bagian umbel mempunyai 20-50 kuntum bunga kuning yang amat kecil pada pedikel-pedikel yang pendek. Buahnya adalah biji kering dengan ukuran panjang 4 hingga 9 mm, dan ukuran lebar separuh dari panjangnya, serta mempunyai alur. Bijinya yang dikeringkan dikenali sebagai biji adas (Dalimartha, 1999). Adas berasal dari daerah Laut Tengah timur (Italia ke timur hingga Suriah). Adas merupakan satu dari sembilan tumbuhan obat yang dianggap bermukjizat di Anglo-Saxon. Di Indonesia adas telah dibudidayakan dan kadang digunakan sebagai tanaman bumbu atau tanaman obat. Tumbuhan ini dapat hidup dari dataran rendah sampai ketinggian 1.800 m di atas permukaan laut, namun akan tumbuh lebih baik pada dataran tinggi (Anon, 1978).
13 Adas menghasilkan minyak adas yang merupakan hasil sulingan serbuk buah adas yang masak dan kering. Ada dua macam minyak adas, manis dan pahit. Keduanya digunakan dalam industri obat-obatan. Adas juga dipakai untuk bumbu, atau sebagai bahan yang memperbaiki rasa (corrigentia saporis) dan mengharumkan ramuan obat. (Anon, 2000) Telah dikenal sekitar dua belas macam varietas buah adas (atau dalam perdagangan dikenal dengan biji) yang berbeda dalam hal rupa, bau dan flavor. Hal yang sama juga ditemui dalam minyak atsirinya yang diperoleh dari buah masak kering dengan cara penyulingan uap. Foeniculum vulgare Miller terdiri dari dua subspesies antara lain (Anon, 1972) : 1. Varietas vulgare (Miller) thellung ada yang dibudidayakan dan ada yang tumbuh liar. Varietas ini menghasilkan minyak adas pahit. Minyak disuling sebagian besar dari seluruh bagian tanaman , terutama dari bagian pucuk dan buah (biji). 2. Varietas dulce (Miller) thellung biasanya dibudidayakan; tanaman ini tidak tumbuh liar. Varietas ini menghasilkan minyak adas manis atau adas Roma. Minyak disuling dari biji. Minyak tipe ini memiliki bau dan flavor terbaik diantara tipe minyak adas. Biji adas asal Eropa Timur dengan mutu yang terbaik menghasilkan rendemen minyak sekitar 4-5 persen; dan nilai rendemen dapat serendah 2,5 persen.
Biasanya biji tua
menghasilkan rendemen minyak lebih rendah daripada biji hasil panen terakhir. Berdasarkan pengamatan kadar minyak atsiri dari berbagai tipe biji adas komersial, rendemen minyak berkisar antara 1,0-6,0 persen, dengan nilai rata-rata 3,51 persen (Fischer, Tornow dan Proper, 1945 dalam Guenther, 1990). Adas mengandung minyak asiri (Oleum Foeniculi) 1-6 persen, 50-60 persen anetol, lebih kurang 20 persen fenkon, pinen, limonen, dipenten, felandren, metilchavikol, anisaldehid, asam anisat, dan 12 persen minyak lemak. Kandungan anetol yang menyebabkan adas mengeluarkan aroma yang khas dan berkhasiat karminatif. Akar mengandung bergapten. Akar dan biji mengandung stigmasterin (serposterin) (Dalimartha, 1999).
14 Kandungan nutrisi pada biji adas per 100 gram biji dapat dilihat pada Tabel 1 sebagai berikut:
Tabel 1. Kandungan nutrisi biji adas per 100 gram biji
Senyawa
Jumlah
Lemak total
15 g
Lemak jenuh
0 g
Kolesterol
0 g
Sodium
88 mg
Total karbohidrat
52 g
Serat makanan
40 g
Gula
0 g
Protein
16 g
Vitamin A
135 IU
Vitamin C
21 mg
Besi
18,54 mg
Kalsium
1196 mg
Sumber : Anon (2006)
2.3 Esterifikasi Fungsi alami lipase adalah mengkatalisa proses hidrolisa trigliserida. Akan tetapi reaksi ini dapat balik dan enzim juga dapat mengkatalisa pembentukan gliserida dari gliserol dan
15 asam lemak bebas. Reaksi esterifikasi ini mungkin tidak signifikan dalam biosintesa lipida, tetapi dapat dipergunakan dalam produksi lemak dan asam lemak termodifikasi. Esterifikasi yang merupakan reaksi antara asam karboksilat dan alkohol untuk membentuk ester adalah reaksi ionik yang merupakan kombinasi dari adisi dan penyusunan kembali. Trigliserida akan terbentuk bila asam lemak beresterifikasi dengan satu molekul gliserol sebagai berikut: O H2C – OH
H2C – O – C – R1 +
3 RCOOH
O
+
3 HOH
H – C – OH H – C – O – C – R2 Gliserol H2C – OH
Asam lemak
Trigliserida O
Air
H2C – O – C – R3
Gambar 1. Reaksi esterikasi trigliserida (minyak/lemak) dengan mereaksikan gliserol dan asam lemak menghasilkan trigliserida dan air
Produk ester yang dihasilkan selama esterifikasi tergantung pada perbandingan asam dan alkohol. Untuk gliserida yang diesterifikasi sebagian digunakan jumlah stoikiometri kurang dari 3:1 antara asam lemak dan gliserol. Produk kasar yang diperoleh merupakan campuran dari asam-asam lemak dan gliserol yang tidak bereaksi, monogliserida, digliserida dan trigliserida. Asam-asam lemak dapat dikeluarkan dari campuran dengan penyabunan (saponification) dan gliserol dihilangkan dengan pencucian dengan larutan garam atau air sehingga akan diperoleh campuran monoasilgliserol, diasilgliserol, dan triasilgliserol
16 Penelitian tentang penyebaran lipase pada tanaman masih sedikit kecuali pada biji dan buah-buahan. Lipase juga terdapat pada biji atau buah tanaman palma, selada, bekatul beras, barley dan malt, gandum, oat, kapas, jagung dan timun. Walaupun demikian lipase juga terdapat pada kambium, kulit dan akar. Biji yang sedang berkecambah memiliki aktivitas lipolitik yang tinggi yang bermanfaat dalam pemenuhan kebututuhan energi (Akoh, 2002). Penggunaan lipase sebagai katalis reaksi biotransformasi komersial meningkat antara lain untuk produksi lemak pada makanan bayi dengan kandungan sn-2 palmitat yang tinggi, dan isopropyl miristat yaitu minyak pelumas yang dapat dirombak alam/ biodegradable (Quinlan dan Moore, 2001). Suhendra (2005) mengoptimasi kondisi perkecambahan terhadap aktivitas lipase indigenous ekstrak kecambah kacang-kacangan (kacang tanah, wijen dan koro benguk) menggunakan response surface design (RSM) dengan kecocokan model central composite design (CCD). Lipase ekstrak kecambah biji adas mempunyai aktifitas hidrolisis, spesifik hidrolisis, esterifikasi dan alkoholisis terbesar dibandingkan lipase dari ekstrak kecambah biji wijen dan kacang tanah.
