MASTABLOT™ BORRELIA Western Blot pro detekci IgG / IgM protilátek proti Boreliím ze séra a plazmy
Pouze pro in vitro diagnostiku
Návod na použití
Test
Kód
MASTABLOT BORRELIA IgG MASTABLOT BORRELIA IgM
665101 665102
MASTABLOT BORRELIA IgG MASTABLOT BORRELIA IgM
665122 665123
Kit pro 8 testů 8 testů
24 testů 24 testů
Skladování: 2–8 °C
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 Strana 1 / 9
MAST
Obsah
Strana
1. Úvod
3
2. Použití
3
3. Princip testu
3
4. Součásti soupravy
4
5. Potřebný materiál, který není součástí soupravy
4
6. Upozornění a zvláštní opatření
4
7. Uchovávání a trvanlivost reagencií
5
8. Odběr vzorku a příprava testu
5
9. Pracovní postup
6
10. Odběr a manipulace se vzorkem
6
11. Charakteristika testu
9
12. Literatura
9
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 2 / 9
MAST
1.
Úvod Lymská borelióza je jedním z infekčních onemocnění nejčastěji přenášených klíšťaty. Etiologické agens je charakterizováno jako Borrelia sp., spirocheta s devíti klasifikovanými sérotypy po celém světě. Ve střední a východní Evropě mají klinický význam pouze B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi. Borreliové infekce nejsou omezeny pouze na kožní příznaky, ale mohou se také projevit v mnoha jiných tkáních a tím způsobovat mnohočetná postižení, včetně centrálního nervového systému. Klinické příznaky lze rozdělit do tří fází: Fáze I: Časné onemocnění – vyskytující se několik dní až několik týdnů po infekci. Klinické příznaky: Erythema migrans, chřipkové příznaky, horečka, zvracení, třes atd. Lab. diagnostika: IgM protilátky jsou detekovatelné u 50–90 % všech pacientů; IgG titry protilátek jsou nízké nebo nedetekovatelné. Fáze II: Časně rozšířená infekce – několik týdnů až několik měsíců po infekci. Klinické příznaky: neuroborreliosis (meningitida, encefalitida), srdeční komplikace, artralgie, myalgie apod. Lab. diagnostika: protilátky proti boreliím jsou detekovatelné u 70–80 % . V počáteční II. fázi infekce mouhou být IgM protilátky stále detekovány, později jsou zjistitelné pouze IgG protilátky. Fáze III: Chronický projev – měsíce až roky po infekci. Klinické příznaky: neurologické relapsy, progresivní encefalitidy, chronická artritida, Acrodermatitis chronica atrophicans atd. Lab. diagnostika: IgM protilátky nejsou detekovatelné ve většině případů; IgG je převládající u 90–100 % patientů. Příznaky se mohou lišit individuálně v rámci těchto 3 fází klasifikačního systému. Subklinické průběhy infekce mohou být pozorovány ve fázích I a II.
2.
Použití MASTABLOT™ BORRELIA je citlivý western blot pro detekci IgM/ IgG protilátek proti Boreliím z lidského séra nebo plazmy. Tento test je pouze pro in vitro diagnostiku.
3.
Princip testu Evropské kmeny Borrelia burgdorferi byly upraveny SDS a elektroforeticky rozděleny podle molekulové hmotnosti pomocí polyakrylamidového gelu. Gel je nanesen na nitrocelulózovou (NC) membránu a inkubován v tlumícím roztoku k nasycení všech volných vazebných míst. Po vysušení jsou NC rozděleny na proužky a vakuově zabaleny ke skladování. Proužky jsou připraveny k použití. Při skladování v chladu a suchu jsou proužky stabilní až do data expirace. Vazba sérových protilátek proti Boreliím, tvorba sendvičových komplexů a enzymy katalyzovaná barevná reakce probíhá ve třech různých reakčních krocích: Krok 1: Specifické protilátky se váží k antigenům, které jsou na pevné fázi, a tím vzniká stabilní imunokomplex. Po 60-ti minutové inkubaci při laboratorní teplotě jsou stripy promyty předem zředeným promývacím pufrem, čímž se odstraní všechny nereaktivní sérové komponenty.
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 3 / 9
MAST
Krok 2: Konjugát (anti-lidský IgG nebo IgM) s alkalickou fosfatázou je přidán na NC strip. Po 30-ti minutové inkubaci při laboratorní teplotě je přebytečný konjugát odstraněn promytím promývacím pufrem. Krok 3: Na každý NC strip je přidán chromogenní substrát obsahující BCIP/NBT. Během 15-minutové reakce se protein naváže na NC a objeví se temně fialové zbarvení. BCIP / NBT roztok se odstraní a zabarvení se zastaví přidáním 2 ml destilované vody. NC stripy se vyjmou z inkubátoru a usuší na vzduchu na filtračním papíře. Porovnání jednotlivých proužků s konkrétními proteiny pomocí šablony, která je součástí soupravy, umožňuje detekci specifických protilátek proti Boreliím. 4.
5.
Součásti soupravy 8 Testů 8 ks
24 Testů 24 ks
1 ks 25 ml 25 ml 1 ml
3 ks 2 x 25 ml 25 ml 2.8 ml
9 ml 0.4 ml 1 ks
25 ml 1.0 ml 1 ks
Nitrocelulozové membrány (NC) potažené elektroforeticky oddělenými antigeny B.afzelii, B.garinii a B.burgdorferi s.s. Jednorázové inkubační nádoby s 8. jamkami Roztok k ředění vzorků, připraven k použití Promývací pufr, 25 x koncentrovaný Enzymový konjugát IgG nebo IgM, alkalická fosfatáza konjugovaná ovčími anti-lidskými IgG, 10 x koncentrovaný Substrátový roztok BCIP/NBT, připraven k použití Cut-off kontrola pro IgM i IgG, lidská, 5x koncentrovaná Protokol s kontrolním stripem
Potřebný materiál, který není součástí soupravy 1. Destilovaná nebo deionizovaná voda 2. Přesné mikropipety. 3. Odměrné válce pro 10 ml, 250 ml a 1000 ml. 4. Vakuová pumpa (např. vodní vakuová pumpa). 5. Třepačka. 6. Pinzety.
6.
Upozornění a zvláštní opatření 1. Všechny reagencie dodávané v této soupravě jsou určeny pouze pro in vitro diagnostiku. 2. Přečtěte si pozorně návod před provedením testu. Neupravujte postup. 3. Nezaměňujte reagencie mezi jednotlivými šaržemi. Reagencie byly optimalizovány pro každou šarži. 4. Všechny reagencie by měly být skladovány při teplotě 2–8 °C a před použitím vytemperovány na laboratorní teplotu. 5. Vyvarujte se vzájemné kontaminaci reagencií nebo záměně víček na lahvičkách. Použijte jinou pipetu nebo pipetovací špičku pro každý vzorek nebo činidlo. 6. Vzorky by neměly být tepelně inaktivovány, mohlo by dojít k nespecifickým výsledkům. Vyhněte se opakovanému zamrazování vzorků. 7. Z etických důvodů bylo použití vzorků CSF hodnoceno pouze testováním párů vzorků CSF a případně vzorků sér (pouze pokud byly k dispozici). Vzorky byly distribuovány Institutem pro dokumentaci a standardizaci (INSTAND) v Německu. Proto použití vzorků CSF by mělo být prokázáno testováním dostatečného počtu takovýchto vzorků. 8. BCIP / NBT substrát je klasifikován jako zdraví škodlivý. Vyhněte se kontaktu s pokožkou, očima a sliznicemi a udržujte jej stranou od zdrojů tepla a otevřeného ohně. 9. Všechny komponenty soupravy jsou negativní proti HCV, HBsAg a HIV. Nicméně zacházejte se všemi séry a činidly jako s potenciálně infekčním materiálem za všech okolností.
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 4 / 9
MAST
7.
-
Nejezte, nepijte a nekuřte v místech, kde se nakládá se vzorky nebo reagenciemi kitu.
-
Nepipetujte ústy.
-
Používejte jednorázové rukavice při manipulaci se vzorky nebo reagenciemi a poté si důkladně umyjte si ruce.
Uchovávání a trvanlivost reagencií MASTABLOT™ BORRELIA western blot kit (všechny jeho komponenty) mohou být použity až do uplynutí doby expirace uvedené na štítku soupravy, jestliže jsou skladovány při 2–8 °C. BCIP/NBT substrát uchovávejte ve tmě. Po otevření skladujte všechny reagencie při teplotě 2–8 °C. Promývací roztok lze skladovat v těsně uzavřených lahvích při teplotě 2–8 °C po dobu až jednoho měsíce.
8.
Odběr vzorku a příprava testu Všechny reagencie musí být před použitím vytemperovány na laboratorní teplotu. Odběr vzorku: V testu by měl být použit čerstvý vzorek nebo kontrola. Od krve asepticky odebrané ze žíly, přirozeně vysrážené, by mělo být odděleno sérum okamžitě, aby se zabránilo hemolýze. Antikoagulační látky mohou způsobit nesprávné výsledky. Kontaminovaná, hemolyzovaná, ikterická nebo lipemická séra mohou interferovat s testem. Teplem inaktivovaná séra by neměla být v testu použita. Vzorky mohou být skladovány při teplotě 2–8 °C po dobu 1 týdne nebo po delší dobu při -20 °C. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování a zmrazování vzorku. Některá séra mohou ukázat výrazně barevná pozadí, v takových případech není interpretace možná. Poznámka: Naředěná séra by měla být testována týž den. Promývací roztok:
Ředění vzorku: Ředění kontroly: Ředění konjugátu:
Řeďte koncentrovaný promývací roztok 1:25 destilovanou nebo deionizovanou vodou např. 10 ml koncentrovaného promývacího roztoku s 240 ml destilované vody, dobře promíchejte. Naředěný promývací roztok je stabilní 4 týdny při 2–8 °C. Sérum zřeďte 1:51 roztokem na ředění vzorků; např. 20 µl séra + 1 ml roztoku na ředění vzorků, dobře promíchejte. Zřeďte cut-off kontrolu 1:5 roztokem na ředění vzorků, např. 200 µl negativního kontrolního séra + 800 µl roztoku na ředění vzorků, dobře promíchejte. Nařeďte vhodný objem konjugátu 1:10 s roztokem na ředění vzorků podle ředícího schématu níže: Počet stripů Ředění konjugát konečný objem vzorku (konc.) 1 0.9 mL + 0.1 mL 1 mL 2 1.8 mL + 0.2 mL 2 mL 3 2.7 mL + 0.3 mL 3 mL 4 3.6 mL + 0.4 mL 4 mL 5 4.5 mL + 0.5 mL 5 mL 6 5.4 mL + 0.6 mL 6 mL 7 6.3 mL + 0.7 mL 7 mL 8 7.2 mL + 0.8 mL 8 mL 9 8.1 mL + 0.9 mL 9 mL 10 9.0 mL + 1.0 mL 10 mL 11 9.9 mL + 1.1 mL 11 mL 12 10.8 mL + 1.2 mL 12 mL
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 5 / 9
MAST
9.
Pracovní postup NC stripy jsou označeny 1-24 nebo 1-8, respektive, v závislosti na jejich poloze na polyakrylamidovém gelu. Stripy by měly být použity ve stejném pořadí. Vyjměte požadovaný počet stripů z nádoby uchopením pomocí pinzety za číslo na konci stripu. Nedotýkejte se stripů prsty! Umístěte každý strip do jedné jamky inkubačního zásobníku s čísly nahoru. Po vyjmutí stripů ihned kontejner uzavřete. Stripy by měly být vždy pokryty tekutinou během inkubace. Vždy inkubuje při laboratorní teplotě. Doporučuje se provést kontrolu s každým testem. 1. Inkubace séra Pipetujte naředěný vzorek nebo kontrolu (1000 µl) na příslušný strip. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě; jemně třepejte během inkubace. 2. První promývací krok Opatrně odstraňte sérum z každé jamky. 1x promyjte strip 1 ml promývacího roztoku. Okamžitě odstraňte veškerou kapalinu z každé jamky. Promyjte každou jamku 3x 2 ml promývacího roztoku, pomocí 5-ti minutového promytí na třepačce. Zcela odstraňte tekutinu z jamek. Během prvního promývacího kroku připravte požadované množství konjugátu. 3. Inkubace konjugátu Dávkujte 1 ml čerstvého připraveného roztoku konjugátu do každé jamky. Inkubujte na třepačce po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Druhý promývací krok Odstraňte všechen konjugát z jamek. Vymyjte stripy 1 x 1 ml promývacího roztoku. Okamžitě odstraňte veškerou kapalinu z každé jamky. Promyjte každou jamku 3x 2 ml promývacího roztoku, pomocí 5-ti minutového promytí na třepačce. Zcela odstraňte tekutinu z jamek. 5. Reakce se substrátem a zastavení reakce Přidejte 1 ml BCIP / NBT substrátu do každé jamky; inkubuje na třepačce po dobu 15 minut při laboratorní teplotě. Okamžitě odstraňte substrát z jamek. Nedovolte, aby stripy vyschly. Přidejte 2 ml destilované vody k zastavení reakce. V případě potřeby promyjte stripy znovu 2 ml destilované vody. Opatrně vyjměte stripy z jamek a nechte je uschnout na filtračním papíru. Interpretujte reaktivní proužky pomocí šablony dodávané v soupravě. Stripy mohou být uchovány v suchu a temnu pro dokumentaci.
10.
Odběr a příprava vzorku Každý NC strip obsahuje sérový kontrolní proužek a kontrolní proužek konjugátu. IgG a IgM kontrolní proužky jsou samostatné. Oba kontrolní proužky musí být viditelné, aby byl test platný. V případě, že obě kontroly konjugátu (IgG a IgM) reagují na stejném stripu, pak silnější označuje konjugát použitý v testu. Interpretace cut-off kontrolních proužků: Cut-off Referenční proužek v testech IgG: Cut-off Referenční proužek v IgM testech:
VlsA band P25
Proužky antigenů, které mají slabší intenzitu zabarvení v porovnání s cut-off proužky, nemohou být interpretovány. Proteiny P41 kDa a P39 kDa jsou pouze vysoce specifické pro IgM. Šířka proužku se může lišit v závislosti na koncentraci protilátek ve vzorku. IgG proužky bývají obvykle silnější než ty s IgM.
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 6 / 9
MAST
Pro interpretaci postupujte následovně: Umístěte suché NC stripy přímo na protokol s kontrolním stripem dodávaným v této soupravě. Kontrolní proužek séra se zobrazí jako linka a musí vyjít na stejné pozici jako na kontrolním stripu. Jednotlivé reaktivní proužky s imunitně specifickými antigeny lze určit porovnáním s reakcemi těch proužků, které jsou na dodávaném kontrolním stripu. Antigeny pozitivních proužků lze identifikovat z kontrolního stripu. Dokumentace reaktivních proužků, jakož i jejich intenzita, může být provedena přímo na protokolu vedle stripů. Pozitivní kontrolní strip a šablony pro interpretaci jsou specifické pro konkrétní šarže! Imunitní reaktivní proteiny Molekulární hmotnost >101 kDa (92-100kDa) p100 kDa p83-91 kDa p59/62 kDa p45 kDa (p41-43 kDa) p41 kDa (p39-40kDa) p39 kDa
p36-38 kDa p35 kDa
p31 kDa p30 kDa p28/29 kDa (p23-26) p25 kDa
p20/p21 kDa p17/p19 kDa
Antigen
Specifičnost nespecifické TM povrchové membránové vesikulární vysoce specifické v MASTABLOT proteiny (pozdní fáze infekce) degradační proteiny specifické, v pozdní fázi infekce proteiny tepelného šoku vysoce specifický dvojitý proužkek v TM membránové proteiny MASTABLOT TM důležité v IgG testech specifické v MASTABLOT flagellinový protein nespecifické, potencionální zkřížená asociovaný s flagellin komplexem reaktivita intenzivní reakce naznačuje nedávnou infekci Boreliemi, (vysoce specifické pro IgM) pravděpodobně specifické TM Osp B vysoce specifické v MASTABLOT , vnější povrchový protein přítomný ve všech fázích infekce, ačkoliv je pozorována především slabá reaktivita Osp A specifický, pozorována pouze slabá imunitní odpověď TM často pozitivní v testech IgG, a to vysoce specifické v MASTABLOT zejména u nemocí ve stadiu I a III pravděpodobně specifické TM Osp C vysoce specifické v MASTABLOT Část Osp C komplexu. Protilátky zjistitelné v časné a pozdní fázi infekce. TM často pozitivní v testech IgG, a to vysoce specifické v MASTABLOT zejména u nemocí ve stadiu II a III TM protoplasmatický cylindrický protein vysoce specifický v MASTABLOT
Diagnostický význam a interpretace výsledků Sérologické nálezy u Boreliových nákaz závisí na fázi a trvání nemoci, závažnosti symptomů a také na předchozí antibiotické léčbě. Chcete-li získat konečnou diagnózu pacienta, musí být vzata v úvahu také klinická historie a příznaky. IgM protilátky jsou detekovatelné především ve fázi I, ačkoli někteří pacienti zůstávají IgM negativní. V případě dlouhého trvání choroby a v pozdní fázi jsou téměř všechny zjistitelné protilátky třídy IgG. Prudký nárůst protilátek IgG je pozorován během re-infekce. Pokud jsou přítomny neurologické příznaky, měly být posouzeny dodatečně i vzorky CSF. Borrelia IgG Při posuzování MASTABLOT™ Borrelia, je třeba vzít v úvahu intenzitu a pozici proužků. p41 a 39kDa je jistě rodově specifický antigen, ale p41 je také zkříženě reaktivní, a proto je třeba zvážit výsledek s opatrností. Důležité: Pouze jeden proužek v komplexu bude považován za výsledek. Výjimka: Dvojitý proužek p59 p62 je v této kombinaci považován za více pozitivní. MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 7 / 9
MAST
Vyskytující se proužky: vysoce specifické a proužky specifických antigenů: p100kD / p59 62kDa komplex / p45kDa / p35kDa / Osp A / p30kDa / p25kDa / p21 p20kDa komplex / p19 p17kDa komplex proužky vysoce specifických antigenů VlsA Interpretace Borrelia IgG: -
negativní
slabý antigen dvojitého proužku p59 p62 1 zřetelný proužek 1 pozitivní proužek pouze 1 zřetelný proužek v komplexu p59 p62 žádný nebo velmi slabý proužek VlsA
hraniční/diskutabilní - 1 výrazný proužek antigenu - 2 pozitivní proužky - 1 pozitivní proužek a nejméně 2 další slabé proužky (= cut off kontrola) - 1 zřetelný antigen dvojitého proužku p59 p62 - slabý proužek VlsA, intenzita = VlsA cut off kontrola -
pozitivní
zřetelný VlsA proužek, intenzita = VlsA cut off kontrola zřetelný dvojitý proužek p59 p62 a nejméně 1 další slabý proužek nejméně 3 zřetelné proužky antigenů nejméně 1 silný proužek a nejméně 1 zřetelný proužek nejméně 2 silné proužky
Zvláště u pacientů v pozdní fázi boreliové infekce se může objevit mnoho proužků specifických antigenů. Borrelia IgM: TM
Při posuzování stripů MASTABLOT Borrelia je třeba vzít v úvahu intenzity zabarvení proužků. Ačkoliv p39 a p41kDa jsou rodově specifické antigeny (také zkříženě reaktivní), v MASTABLOT™ Bor relia testu by měla být přítomnost reaktivního proužku p39 a p41 kDa posouzena jako pozitivní reakce IgM. IgM protilátky, které jsou považovány za časné markery boreliové infekce, jsou často namířeny proti flagellinu (p41) a Osp C (P25). Pokud se objeví komplexní proužky, je třeba brát v úvahu i jen jeden z nich. Vyskytující se proužky: proužky vysoce specifických antigenů: p41kDa / p39kDa / / p25kDa / p21 p20kDa komplex / p19 p17kDa komplex Interpretace Borrelia IgM: negativní
-
diskutabilní pozitivní
-
neobjeví se žádný proužek s antigenem 1 slabý proužek antigenu 2 slabé proužky antigenů (= Cut-Off kontrola) nejméně 1 zřetelný antigenní proužek, zvláště Flagellin (p41 u p39) a Osp C (p25)
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 8 / 9
MAST
11.
Charakteristika testu Specificita / Senzitivita Senzitivita a specificita MASTABLOT porovnáním metod. Specificita: Specificita:
IgG 97.9% IgM 100%
TM
soupravy je zjištěna na základě výsledků získaných
Senzitivita: Senzitivita:
IgG 87.8% IgM 82.6%
Zkřížená reaktivita • V počáteční fázi infekce může být nedostatečný počet protilátek, a proto je možný negativní výsledek testu. • Pokud je klinické podezření na boreliovou infekci s negativním nebo sporným výsledkem testu, dopo ručuje se provedení konfirmačního testu po dvou týdnech. • Léčba antibiotiky může potlačit tvorbu detekovatelných protilátek v časných fázích. • Navzdory přítomnosti detekovatelných protilátek IgG nemusí být aktivní boreliová infekce přítomna, protože IgG protilátky mohou přetrvávat po dlouhou dobu po předchozí infekci. • Leptospirové a Treponemové infekce jsou známy zkříženou reaktivitou s boreliovými antigeny. • Akutní EBV infekce může vést ke stimulaci protilátek proti boreliím. V případě nejasného klinického obrazu by se měla tato infekce vyloučit vhodnými testy. • Sérologické údaje by měly být vzaty v úvahu s klinickou historií pro komplexní určení diagnózy. V případě, že výsledky jsou sporné, doporučuje se testování opakovat. Přesnost a reprodukovatelnost Intra-assay reprodukovatelnost testu byla stanovena testováním vzorků s různými aktivitami protilátek v jednom testovacím cyklu. Stanovení vzorků neukázala žádné podstatné rozdíly v detekci jednotlivých antigenních proužků a jejich intenzity. Inter-assay reprodukovatelnost byla stanovena testováním vzorků s různými aktivitami protilátek v různých testovacích cyklech. Stanovení vzorků neukázala žádné podstatné rozdíly v detekci jednotlivých antigenních proužků a jejich intenzity. Interní kontrola kvality Negativní kontrola by měla být provedena při každém testu. Doporučení: Pro každou novou šarži je doporučeno provádět interní kontrolu kvality testováním jednoho nebo více kontrolních vzorků, které by měly být jasně specifikované. 12.
Literatura - Karlsson, M. J. Clin. Microbiol., 28 (5), 2148-2150 - Putzker, M.; Zöller, L. Clin. Lab. 41 (9) 655-666
MASTABLOT™ BORRELIA – 2012-10-19 – Strana 9 / 9
MAST
