IgD

MASARYKOVA UNIVERZITA

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

Protilátková odpověď proti antigenům z extraktů Eudiplozoon nipponicum a příprava sekundární protilátky anti-Carp IgM/IgD Diplomová práce

Michaela Chmelíková

Vedoucí práce: RNDr. Martin Kašný, Ph.D

1

Brno 2015

Bibliografický záznam Autor:

Michaela Chmelíková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie

Název práce:

Protilátková

odpověď

proti

Eudiplozoon

nipponnicum

a

antigenům

z extraktů

příprava

sekundární

protilátky anti-Carp IgM/IgD Studijní program:

Biochemie

Studijní obor:

Analytická biochemie

Vedoucí práce:

RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Akademický rok:

2014/2015

Počet stran:

98

Klíčová slova:

Imunita ryb, Cyprinus carpio, parazit, helminth, E. nipponicum, imunoglobulin, IgM/IgD, ELISA, Western blot

2

Bibliographic Entry Author

Michaela Chmelíková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry The immune response to the antigenic molecules of

Title of Thesis:

Eudiplozoon nipponicum and preparation of secondary antibody anti-Carp IgM/IgD

Degree programme:

Biochemistry

Field of Study:

Analytical biochemistry

Supervisor:

RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Academic Year:

2014/2015

Number of Pages:

98

Keywords:

Fish immunity, Cyprinus carpio, parasite, helminth, E. nipponicum,

immunoglobulin,

Western blot

3

IgM/IgD,

ELISA,

Abstrakt Imunitní systém ryb je sloţen ze specifických a nespecifických sloţek buněčné a humorální imunity. Hlavní sloţkou specifické humorální imunity jsou protilátky (imunoglobuliny). Rybí imunitní systém produkuje pět typů imunoglobulinů – hlavní je ve formě tetrameru IgM a další, v menší míře zastoupené jsou IgD, IgZ, IgT a IgH. V experimentální části mé diplomové práce jsem se zaměřila na charakteristiku rybí imunitní odpovědi (Cyprinus carpio) proti Eudiplozoon nipponicum (Monogenea: Diplozoidae) hematofágním ektoparazitovi kaprovitých ryb. Exkrečně-sekreční produkty byly získány po inkubaci ţivých červů ve fosfátovém pufru pH 7.2, 50 mM a homogenát z celých červů byl připraven s vyuţitím sonikátoru. Oba typy vzorků byly přečištěny a vyuţity jako antigeny. Krevní séra získané z krve kaprů napadených parazitem E. nipponicum byly pouţity jako primární protilátky v metodách ELISA a Western blot. Po optimalizaci metody ELISA jsme dosáhli zajímavých výsledků, zatímco prostřednictvím Western blot byla detekována reakce pouze u jednoho pozitivního vzorku. Na částečné sekvence IgM/IgD získané z databází byly navrţeny primery za účelem amplifikace s vyuţitím PCR a RACE. Sestavit kompletní sekvenci se podařilo pouze u imunoglobulinu M.

4

Abstract The fish immune system consists of cellular or humoral specific and nonspecific factors. The dominant components of specific humoral immunity are antibodies (immunoglobulins); fish immune system produces five types of immunoglobulins – major is tetrameric IgM and insignificant are IgD, IgZ, IgT and IgH. The experimental part of my master thesis is focused on characterization of fish immune response (Cyprinus carpio) against Eudiplozoon nipponicum (Monogenea: Diplozoidae) – hematophagous ectoparasite of cyprinid fish. The excretory - secretory products were collected after incubation of live worms in phosphate buffer pH 7,2, 50 mM and homogenate from whole worm were prepared by using a sonicator. Both types of samples were purified and used as antigens. Blood serums were collected from carps parasitized by E. nipponicum and used as primary antibodies in ELISA and Western blot analysis. We achieved interesting results after optimization of the ELISA method, while Western blot detect reaction with only one positive sample. The primers were designed on the partial sequence IgM/IgD obtained from databases for amplification using PCR and RACE. Assemble the complete sequence managed only of immunoglobulin M.

5

6

7

Poděkování: Za podporu během přípravy diplomové práce bych na prvním místě ráda poděkovala svému školiteli RNDr. Martinu Kašnému, Ph.D., za velmi trpělivé vedení v průběhu celého mého studia, ze lidský přístup, cenné rady a zkušenosti, které mi za dobu naší spolupráce předal. Za ochotu a pomoc při práci v laboratoři děkuji Mgr. et Mgr. Janě Ilgové, Mgr. Elišce Šrámové, Bc. Lucii Škorpíkové a všem členům parazitologické laboratoře. Mé velké poděkování patří také mým nejbliţším, především mé rodině za finanční prostředky a psychickou podporu.

Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci Protilátková odpověď proti antigenům z extraktů Eudiplozoon nipponicum a příprava sekundární protilátky anti-Carp IgM/IgD vypracovala samostatně pod vedením mého vedoucího diplomové práce s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 17. května 2015

……………………………… Michaela Chmelíková

8

Seznam zkratek Ab - protilátka Ag - antigen BSA - bovinní sérový albumin

DNA - deoxyribonukleová kyselina ELISA - enzymově značený imunotest s vyuţitím pevné fáze ES - exkrečně-sekreční produkty IgD - imunoglobulin D IgH - imunoglobulin H IgM - imunoglobulin M IgT - imunoglobulin T IgZ - imunoglobulin Z SDS-PAGE - sodium dodecylsulfat polyakrylamid gel electrophoresis PBS - fosfátový pufr PCR - polymerázová řetězová reakce RNA - ribonukleová kyselina ZST - zinc sulphate turbidity test

9

Obsah 1

Úvod .......................................................................................................................... 12 1.1

2

Cíl práce.............................................................................................................. 12

Helminti..................................................................................................................... 13 2.1

Význam helmintů ............................................................................................... 13

2.2

Monogenea (Ţábrohlísti) .................................................................................... 13

2.3

Interakce monogeneí s hostiteli .......................................................................... 14

2.3.1

Modelový parazit - Eudiplozoon nipponicum ............................................. 16

3

Modelový hostitel - kapr obecný (Cyprinus carpio) ................................................. 17

4

Imunitní systém ryb................................................................................................... 18 4.1

4.1.1

Abiotické faktory ovlivňující imunitní systém ryb ..................................... 19

4.1.2

Biotické faktory ovlivňující imunitní systém ryb ....................................... 21

4.2

Tkáně imunitního systému ryb ........................................................................... 23

4.2.1

Ledviny ....................................................................................................... 23

4.2.2

Thymus ........................................................................................................ 24

4.2.3

Slezina ......................................................................................................... 24

4.2.4

Lymfatická tkáň asociovaná se střevem (GALT) ....................................... 24

4.3

Buňky imunitního systému ryb – imunocyty ..................................................... 25

4.3.1

Leukocyty .................................................................................................... 26

4.3.2

Ostatní krevní elementy .............................................................................. 31

4.4 5

Vztah mezi rybím hostitelem a jeho prostředím ................................................. 18

Imunoglobuliny ryb ............................................................................................ 33

Materiál a metodika................................................................................................... 36 5.1

Zisk a zpracování biologických vzorků .............................................................. 36

5.2

Biochemické metody .......................................................................................... 39

5.2.1

Barvení krevních roztěrů ............................................................................. 39

5.2.2

Krevní obraz ................................................................................................ 39

5.2.3

Stanovení hladiny celkových imunoglobulinů ............................................ 40

5.2.4

ELISA ......................................................................................................... 41

5.2.5

Western blot ................................................................................................ 43

5.3

Molekulární metody ........................................................................................... 47

5.3.1

Zisk RNA .................................................................................................... 47

5.3.2

Reverzní transkripce .................................................................................... 49

5.3.3

Návrh primerů ............................................................................................. 50 10

6

5.3.4

PCR ............................................................................................................. 51

5.3.5

DNA Elektroforéza ..................................................................................... 51

5.3.6

Purifikace PCR produktu z gelu .................................................................. 52

5.3.7

Klonovací reakce kitem CloneJET.............................................................. 53

5.3.8

Analýza kolonií (transformantů) a rozbití buněk ........................................ 55

5.3.9

Namnoţení plazmidové DNA ..................................................................... 56

5.3.10

Izolace plazmidu ......................................................................................... 57

5.3.11

RACE-PCR (rychlá amplifikace konců cDNA) ......................................... 58

Výsledky a diskuze ................................................................................................... 63 6.1

Biochemické metody .......................................................................................... 63

6.1.1

Krevní obraz ................................................................................................ 63

6.1.2

Stanovení hladiny celkových imunoglobulinů ............................................ 68

6.1.3

Porovnání výsledků počtu leukocytů a koncentrace imunoglobulinů ......... 71

6.1.4

ELISA ......................................................................................................... 74

6.1.5

Western blot ................................................................................................ 78

6.2

Molekulární metody ........................................................................................... 79

6.2.1

PCR ............................................................................................................. 81

6.2.2

Purifikace plazmidové DNA ....................................................................... 82

6.2.3

Analýza kolonií (transformantů) a rozbití buněk ........................................ 82

6.2.4

Izolace plazmidu ......................................................................................... 83

6.2.5

Sekvenace .................................................................................................... 83

6.2.6

5´/3´RACE-PCR (rychlá amplifikace konců cDNA) .................................. 84

6.2.7

Kompletní sekvence IgM ............................................................................ 87

7

Diskuze ...................................................................................................................... 89

8

Závěr ......................................................................................................................... 92

9

Pouţitá literatura ....................................................................................................... 93

10 Internetové zdroje ...................................................................................................... 98

11

1 Úvod Funkcí imunitního systému je obrana proti pronikajícím patogenům a cizorodým látkám. Imunitu ryb lze rozdělit na vrozenou (nespecifickou) a adaptivní (specifickou), ta se dále dělí na sloţku buněčnou a humorální. Buňky imunitního systému ryb jsou monocyty/makrofágy, granulocyty, nespecifické cytotoxické buňky a lymfocyty produkující protilátky. Buňky ryb jsou tvořeny v primárních lymfatických orgánech, kam patří brzlík a kostní dřeň. Po vytvoření buňky přecházejí do sekundárních orgánů, mezi které patří slezina, lymfatické uzliny a další orgány lymfoidní tkáně asociované se střevem. Objektem studia v této práci je interakce ektoparazita Eudiplozoon nipponicum ze třídy Monogenea čeledi Diplozoidae cizopasícího na ţábrech kapra (Cyprinus carpio) hostitelského organismu. Eudiplozoon nipponicum narušuje povrch ţaber svorkami opistohaptoru, coţ je spojeno se ztrátou krve v průběhu sání parazita a můţe být doprovázeno sekundární bakteriální či mykotickou infekcí. Interakce parazit-hostitel byla u monogeneí doposud definována pouze částečně na základě ultrastrukturálních popisů; molekulární a biochemická podstata této interakce není zatím známa a podobně zůstává neprobádaná i oblast imunitní odpovědi rybích hostitelů na nákazu. Součástí experimentální části diplomové práce je ověření imunitní odpovědi C. carpio na nákazu ektoparazitem E. nipponicum s vyuţitím metod ELISA a Western blot. Následně pak testování dostupné metodiky přípravy sekundárních protilátek. Data získaná z diplomové práce by mohla přispět k diagnostice rybích onemocnění a výsledky by mohly být důleţité pro zlepšení kvality a kontroly chovu ryb. Tato práce byla realizována na Ústavu botaniky a zoologie, v pracovní skupině parazitologie, Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně.

1.1 Cíl práce V diplomové práci by měly být utříděny dosavadní poznatky související s rybí imunitou a parazitickými červy ryb. Dílčí cíle této práce jsou: 

Zpracovat dostupnou literaturu zaměřenou na charakter imunitní odpovědi rybích hostitelů parazitovaných helminty.

12



Experimentálně ověřit imunitní odpověď Cyprinus carpio na nákazu Eudiplozoon nipponicum.



Ověřit dostupnou metodologii přípravy značených sekundárních protilátek a pokusit se připravit sekundární protilátku anti-Carp IgM/IgD.

2 Helminti 2.1 Význam helmintů Helminti (neboli červi) jsou různorodou skupinou ţivočichů. Tento termín označuje skupinu bilaterálně souměrných protostomních ţivočichů, avšak fylogeneticky mnohdy nepříbuzných. Helmint je organismus parazitující v určité fázi ontogenetického vývoje v obratlovci. Mezi helminty jsou zahrnováni hlavně zástupci neodermátních platihelmintů (Trematoda, Cestoda, Monogenea), hlístice (Nematoda) a vrtejši (Acanthocephala). Z pohledu ontogenetického vývoje jsou helminti velmi variabilní skupinou. Kromě vajíček a dospělců mohou jejich ţivotní cykly zahrnovat i velké mnoţství morfologicky odlišných larválních stádií, jeţ se vyvíjejí v různých druzích mezihostitelů. Mezihostitelem je organismus, u kterého dochází k larválnímu vývoji parazita a často asexuálnímu mnoţení. Definitivním hostitelem je ţivočich, v němţ dochází k pohlavnímu dospívání a sexuální reprodukci. V některých případech můţe vývoj probíhat v rámci jednoho hostitele (např. roup z rodu Enterobius). Velmi často se však naopak setkáváme i s dvouhostitelskými (např. tasemnic rodu Taenia) nebo tříhostitelskými (např. motolice rodu Paragonimus) cykly, do kterých jsou zapojeni 1 - 2 mezihostitelé (Volf and Horák 2007).

2.2 Monogenea (Žábrohlísti) Kosmopolitně rozšířená skupina platyhelmintů zahrnuje asi 5 000 známých druhů. Všeobecně se jedná o nejbohatší skupinu cizopasníku jak druhově tak i početně (Kearn 1994, Volf and Horák 2007). Jsou to ektoparaziti obojţivelníků, ţelv a především sladkovodních i mořských ryb, u nichţ se vyskytují převáţně na ploutvích, pokoţce a ţábrách, kde mohou působit jako 13

nebezpečné patogeny. Jen malé mnoţství monogeneí vyuţívá endoparazitismus jako hlavní ţivotní strategii (Buchmann and Bresciani 2006). V takových případech napadají střeva

ryb

(Enterogyrus

(Paraquadriacanthus nasalis)

cichlidarum) (Ergens

1988),

(Paperna močový

1963),

tělní

dutiny

měchýř

(Acolpenteron

willifordensis) (Du Plessis 1948) apod. Na rozdíl od většiny ostatních zástupců kmene Platyhelmintes je jejich vývoj přímý bez účasti mezihostitele. Jsou to hermafrodité, kteří ve vnějším prostředí uvolňují vajíčka a následuje líhnutí obrvené larvy - onkomiracidia, která aktivně vyhledává dalšího hostitele, na němţ dospívá (Volf and Horák 2007, Kearn 1994). Po přichycení na hostitele prodělává přeměnu na juvenilního jedince a následně na reprodukceschopného dospělce (Whittington 2005). Monogenea mohou být silně virulentní k a mechanickým poškozením ţaber hostitele se zvyšuje riziko sekundární bakteriální a mykotické infekce (Buchmann and Bresciani 2006). Hostitelské organismy proti parazitům během evoluce vytvořily obranné mechanismy a sloţité imunologické reakce. Jedním z hlavních mechanismů, jak se ryby jsou schopny bránit proti infekci parazity je produkce specifických protilátek (Buchmann 1999).

2.3 Interakce monogeneí s hostiteli K přenosu mezi hostiteli a jejich přeţívání v nich vyuţívají monogenea četných adaptací. Mezi takové adaptace se řadí speciální morfologické struktury slouţící např. k příjmu potravy či uchycení. Nejdůleţitější přichycovací aparát monogeneí se nazývá haptor a nachází se na zadní části těla (Obr. 1). Tento orgán je vybaven sklerotizovanými

i svalnatými útvary, coţ jsou háčky, přísavky nebo svorky. V krajních oblastech haptoru se často vyskytují malé marginální háčky, které jsou schopny způsobit silné poškození tkání hostitele (u čeledi Dactylogyridae, Gyrodactylidae) (Buchmann and Bresciani 2006, Roberts et al. 2009). U diplozoidních monogeneí jako E. nipponicum se svalovina svorek dělí na ovládací svaly svorky a svalovinu vlastních svorek. Samotné přichycení k hostiteli je pak zajišťováno kontrakcí vnější podélné svaloviny, zatímco trvalé připojení zajišťují vnitřní svaly svorek (Halton et al. 1998). Další mechanismy, které monogenea k přeţití vyuţívají, jsou adaptace na molekulární úrovni. Volně ţijící larvální stádia (E. nipponicum, Gyrodactylus salaris, Dactylogyrus vastator) jsou např. podle chemických signálů schopna nalézt vhodného 14

hostitele. Dospělci pak produkují řadu dalších molekul uplatňujících se v mnoha procesech souvisejících s interakcí parazit – hostitel (Dzik 2006). Zaţívací trakt těchto červů je morfologicky přizpůsoben příjmu krve, i kdyţ mechanismy zpracování krve jsou z větší části doposud neznámé. Známo však je, ţe ţláznaté buňky střeva produkují haemolysiny a peptidázy, které napomáhají degradaci krvinek. Ke konkrétním příkladům peptidáz známých u monogenei a pravděpodobně zapojených do procesu trávení krve patří cysteinová peptidáza katepsin L (Neobenedia melleni) (Rao and Yang 2007) a serinové peptidázy (Neobedenia girellae) (Hirazawa et al. 2006). Mezi další molekuly produkované diplozoidními zástupci monogeneí lze řadit cysteinové peptidázy katepsin B a D (Verity et al. 2001, Dvořáková et al. 2013).

Obr. 1: Haptor se svalnatými přísavkami a svorkami u juvenilního jedince E. nipponicum. Přichycovací aparát je sloţen z šesti svalnatých přísavek, rozdělených po třech párech do dvou řad. Šipka na obrázku vyznačuje místo, kde se v dospělosti utváří další pár svorek na kaţdé straně (Valigurová et al. 2011, upraveno).



15

2.3.1

Modelový parazit - Eudiplozoon nipponicum Tento parazit je řazen do kmene Platyhelmintes, třídy Monogenea, řádu

Mazocraeidae a čeledi Diplozoidae. Jedná se o vejcorodého, krevsajícího ektoparazita kapra obecného (Cyprinus carpio) s přímým ţivotním cyklem. Z roku 1983 pochází první zmínka o výskytu E. nipponicum u sádkového kapra (C. carpio) ve Francii, načeţ je výskyt tohoto druhu zaznamenáván v celé Evropě (Hodová, Matejusova and Gelnar 2010). Vývoj E. nipponicum zahrnuje pět základních stádií: vajíčko (s hladkým povrchem a jedním dlouhým vláknem), oknomiracidium (invazivní, volně se pohybující larva vybavena pohybovými řasinkami), diporpa (jsou vytvořeny další struktury – přísavka a papila), juvenilní jedinec (spárované diporpy) a dospělec (plně rozvinuté ústrojí). Diporpa je schopna rozpoznat vhodného partnera, přičemţ následně dochází k srůstu dvou jedinců v larválním stádiu, coţ je doprovázeno přeuspořádáním a propojením jejich tkáňových soustav. Dochází tak k vytvoření permanentního páru a vzniká pohlavně nedospělý jedinec (juvenilní), který postupně dospívá (Obr. 2), adult má pak charakteristický tvar písmene X (Valigurová et al. 2011, Zurawski et al. 2003).

Obr. 2: Vývojová stádia Eudiplozoon nipponicum. A – vajíčko, B – onkomiracidium, C – diporpa, D – juvenilní jedinec, E – dospělec (Hodová et al. 2010, upraveno)

16

3 Modelový hostitel - kapr obecný (Cyprinus carpio) Podle fylogenetických studií je kapr dělen na tři poddruhy: C. carpio carpio ţijící v Evropě, C. carpio haematopterus v Asii a C. carpio viridivlaceus z jihovýchodní Asie (Obr. 3) (Vandeputte 2003, Flajšhans and Hulata 2006). Je řazen mezi nejstarší domestikované druhy ryb chovaných za účelem masné produkce. Z hlediska ekologie se jedná o rybu pomalu tekoucích nebo stojatých mělkých vod (Takeuchi, Satoh and Kiron 2002). Přeţívá v rozsáhlém rozmezí teplot, a to od 1 °C do 35 °C, avšak optimální teplota je 23 - 30 °C a pH 6,5 – 9. Většinou toleruje i výrazné kolísání koncentrace kyslíku, ke které dochází především v létě ve stojatých vodách. Je to všeţravec ţivící se zooplanktonem, fytoplanktonem, přičemţ větší jedinci jsou schopni pozřít i menší ţivočichy, jako je hmyz, larvy hmyzu, měkkýše a červy (Flajšhans and Hulata 2006). Obr. 3: Geografické rozšíření C. carpio. (M. Chmelíková dle Flajšhans and Hulata 2006)

17

4 Imunitní systém ryb Základní funkcí imunitního systému je ochrana organismu před cizorodými agens a infekcí. Rybí imunitní systém je poměrně jednoduchý, a proto jsou ryby dobrým modelem pro studium imunitního systému obratlovců (Hoar et al. 1997). Vyuţívají podobné mechanismy imunitní obrany jako savci, tj. obrana specifická (získaná) a nespecifická (vrozená), z nichţ kaţdá se skládá ze dvou hlavních prvků - buněčné a humorální (látkové) imunity. Sloţky imunity ryb jsou uvedeny níţe (Bartůňková and Hořejší 2009, Hitzfeld 2005). Tab. 1: Složky imunity ryb

Buněčná imunita Humorální imunita

Specifická imunita T lymfocyty B lymfocyty Imunoglobuliny

Nespecifická imunita Monocyty/makrofágy Granulocyty Komplement Proteiny akutní fáze

Mechanismy nespecifické imunitní odpovědi zahrnují z obecného hlediska fagocytózu, aktivaci komplementového systému a antibakteriálních faktorů, zatímco specifická imunita je zaloţena na stimulaci lymfocytů a produkci specifických protilátek. Oba systémy mezi sebou velmi úzce spolupracují, čímţ se zvyšuje účinnost obranných reakcí. Jejich vzájemná komunikace vytváří rychlejší a efektivnější imunitní odpověď neţ kaţdý obranný systém samostatně. Zásadní rozdíl mezi nespecifickou a specifickou imunitní odpovědí je v rychlosti reakce přirozené - nespecifické imunity. Adaptivní specifická imunita vyrovnává pomalejší start rozpoznáním širšího spektra patogenů. Nespecifická reakce obvykle předchází specifické reakci a současně je jejím aktivátorem (Du Pasquier and Schwager 1989, Magnadóttir 2006, Kindt et al. 2007).

4.1 Vztah mezi rybím hostitelem a jeho prostředím Imunitní systém se můţe zdát z pohledu adaptivní imunity teplokrevných ţivočichů méně pokročilý, je však dostatečně funkční a přizpůsobivý, aby rybám umoţnil dlouhodobou existenci ve vodním prostředí zahrnujícím obrovské mnoţství patogenních organismů. Liší se od savčího zejména tím, ţe ryby jako poikilotermní ţivočichové jsou

18

zatíţeny více kolísáním úrovně abiotických i biotických faktorů, coţ ovlivňuje například i stav imunitního systému a celkovou odolnost (Toman 2000, Alvarez-Pellitero 2008). Za biotické faktory působící na rybího hostitele jsou povaţováni např. paraziti či jiné patogeny. Schopností parazita je modifikace různých vlastností svého hostitele, jako je např. regulace jeho metabolismu. V tomto úzkém souţití je parazit na svém hostiteli metabolicky závislý a můţe způsobit hostiteli energetické ztráty, poškodit tkáně či orgány nebo dokonce zapříčinit úhyn infikovaného hostitele (Ebert and Herre 1996). Hlavní tendencí parazita je rozmnoţování a přeţívání, k čemuţ vyuţívá nejrůznější strategie např. odolnost, vyhýbání se a manipulace s imunitním systémem hostitele. Hostitel se naopak snaţí vynaloţit úsilí k rezistenci proti parazitární infekci nebo alespoň o jistou toleranci k negativnímu působení parazita (Williams 2011). Rybí imunitní systém je velmi výrazně ovlivňován také abiotickými faktory prostředí, z nichţ nejvýznamnější jsou sezónní změny a s němi spojená teplota vody, znečištění okolí toxickými látkami a u ryb chovaných v zajetí zejména stres způsobený omezením prostoru, transportu a manipulací (Magnadóttir 2006).

4.1.1 Abiotické faktory ovlivňující imunitní systém ryb Mezi abiotické faktory patří především sezónní změny dané hlavně teplotními podmínkami vody a další faktory – znečištění, salinita, fotoperioda, rychlost vodního toku apod. (Lipský 1998, Bowden 2008). Vliv teploty vody stimuluje jak reprodukci a vývoj parazitů (Jansen and Bakke 1991), tak i imunitní odpověď hostitele (Lamková et al. 2007). Dle některých zpráv, niţší teplota způsobuje supresi specifické imunity, např. produkci protilátek a aktivitu lymfocytů, zatímco nespecifická imunita je na teplotě relativně nezávislá (Magnadóttir 2006). Podle studie Saha, Usami and Suzuki (2002) byla hladina imunoglobulinů u kapra obecného nejvyšší na jaře a naopak velmi nízká v zimě (Obr. 4). Tato vysoká hladina imunoglobulinů byla zapříčiněna vyšší produkcí protilátek v období tření kaprů. Teplota vody způsobená měnícím se ročním obdobím je důleţitým faktorem ovlivňující funkci imunity ryb – čím vyšší teplota vody, tím vyšší je produkce imunoglobulinů, ovšem toto platí jen do určité hranice, v případě příliš vysoké či nízké teploty dochází v bílkovinách k denaturačním změnám a jejich poškození.

19

Obr. 4: Sezónní měny v koncentraci IgM u samce i samice C. carpio. (Saha, Usami and Suzuki 2002). Nejvyšší koncentrace imunoglobulinů je v květnu, kdy průměrná hodnota dosahuje 12 mg/ml u samců a v dubnu 7 mg/ml u samic.

20

4.1.2 Biotické faktory ovlivňující imunitní systém ryb Mezi významné faktory ovlivňující imunitní systém ryb spadá především věk, velikost těla a geografické rozšíření hostitele. Studie Gregory (1990) dokazuje, ţe více rozšíření hostitelé mohou hostit větší spektrum parazitických druhů, coţ můţe ovlivňovat i imunitní systém ryb. Z experimentálního pohledu je velmi obtíţné zjistit dopad parazitismu na imunitu a fyziologii ryb, jelikoţ můţe být relativně obtíţné udrţet konstantní úroveň veškerých abiotických a biotických faktorů. Monogenea jsou významnými patogeny ryb, ale imunochemické interakce s hostitelem nejsou příliš známy (Rohlenová et al. 2011). Obecně platí, ţe větší hostitel téhoţ druhu bývá parazitován s větší intenzitou (MacArthur 1967). Studie Guégan and Hugueny (1994) dokazuje vztah mezi abundancí, druhovou bohatostí parazitů a velikostí hostitele, ale další studie Jarkovský et al. (2004) tento vztah nepotvrzuje. Věk hostitele je důleţitým faktorem souvisejícím s mírou parazitace. U juvenilních ryb, které dosahují několika málo centimetrů je velikostní poměr mezi rybou a cizopasníkem malý, lze tedy předpokládat, ţe starší ryby mají rozmanitější spektrum parazitů díky jejich větší velikosti (Fischer and Kelso 1990). Imunitní systém a obranné mechanismy u juvenilních ryb nejsou dostatečně vyvinuty a jsou tedy mnohem citlivější k parazitární infekci neţ ryby dospělé (Bagge and Valtonen 1999). Ve vědecké práci Rohlenová et al. (2011) je analyzováno, ţe sezónní změny hrají klíčovou roli v moţnosti napadení parazitem, a tedy zřejmě souvisí i se stavem imunitního systému ryb; ryby v horším zdravotním stavu jsou intenzivněji infikovány různými druhy monogeneí neţ ryby zdravé (Obr. 5).

21

Obr. 5: Graf zobrazující hojnost parazitů z rodu Monogenea u ryb v jednotlivých ročních obdobích. (Rohlenová et al. 2011)

I další charakteristiky hostitele mohou významně ovlivňovat jeho parazitofaunu, např. chování, potravní strategie, fylogenetická příbuznost nebo hustota populace hostitele (Gregory 1990, Šimková et al. 2006). Infekce monogenei mohou také ovlivňovat počet leukocytů v krevním oběhu i v lymfatických orgánech jako je slezina a ledviny (Secombes and Chappell 1996). Tento jev můţe být způsoben imunitní reakcí hostitele či manipulací parazita za účelem zvýšení krevního metabolismu (Lefebvre et al. 2004). Vyšší investice do imunitní obrany vede také k ovlivnění růstu, schopnosti přeţití a rozmnoţování ryb (Aydogdu and Altunel 2002). U samic napadených monogenei z rodu Dactylogyrus a Gyrodactylus byla pozorována změna ve velikosti pohlavních ţláz v období rozmnoţování, avšak u samců nikoli (Šimková et al. 2008). Ve studii Buchmann (1993) byla metodou Western blot zaznamenána tvorba specifických protilátek u úhoře říčního (Anguilla anguilla) proti ţabernímu parazitovi Pseudodactylogyrus bini. Ţaberní tkáň je vyplněna krví, čímţ jsou antigeny parazitů přiváděny snáze do krve a dochází k imunitní reakci. Vladimirov (1971) imunitní

odpověď

proti

rodu

Dactylogyrus.

Tito

parazité

patří

prokázal do

řádu

Monopisthocotylea, zatímco E. nipponicum je řazen do řádu Polyopisthocotylea, v tomto případě imunitní odpověď hostitelského organismu prozatím prokázána nebyla.

22

4.2 Tkáně imunitního systému ryb U kostnatých ryb jsou přítomny thymus, slezina, lymfatické struktury asociované se střevem (GALT), tělní ledvina (opistonefros) a hlavová ledvina (pronefros), která je ontogeneticky prvním orgánem, kde začíná krvetvorba. Kostnaté ryby nemají ještě diferencovanou kostní dřeň a lymfatické uzliny, tyto struktury se objevují aţ u evolučně vyšších skupin. Základním stavebním elementem lymfatické tkáně jsou retikulární buňky vytvářející síť, ve které jsou zachyceny populace migrujících i nemigrujících buněk (Press and Evensen 1999, Toman 2000). Obr. 6: Tkáně imunitního systému kostnatých ryb. (Tort, Balasch and Mackenzie 2003, upraveno)

4.2.1 Ledviny Patří mezi sekundární lymfatické orgány, v jejichţ melanomakrofágových centrech probíhá zpracování a prezentace antigenů lymfoidním buňkám a také tvorba protilátek. Histologická struktura ledvin je kostní dřeni velmi podobná (retikulární stroma a rozvětvené krevní sinusoidy), tím vytváří ideální prostředí pro krvetvorbu (Toman 2000, Turner et al. 1994). Obě ledviny slouţí také jako exkreční orgán, kdy v průběhu ontogeneze hlavová ledvina o tuto funkci přichází a slouţí pouze jako lymfatický a hemopoetický orgán. Produkuje kortikosteroidy a jiné hormony a zároveň je hnacím centrem interakcí mezi imunitním, endokrinním a nervovým systémem (Tort et al. 2003).

23

4.2.2 Thymus Je povaţován za primární lymfatický orgán řídící imunitu a humorální odpověď proti antigenům závislých na T-lymfocytech. U kostnatých ryb má podobu párových váčků uloţených v ţaberní dutině, kde dochází ke kontaktu s vodou z vnějšího prostředí. U některých ryb dochází i ke spojení těchto váčků v souvislý útvar, navíc není rozdělen na dřeň a kůru jako brzlík ostatních obratlovců (Zapata, Chibá and Varas 1997, Turner et al. 1994). U některých druhů lze v thymu prokázat přítomnost plazmatických buněk a tvorbu protilátek. K involuci tkáně dochází postupně s věkem, ročním obdobím či následkem odchytu a transportu (Toman 2000).

4.2.3 Slezina Je povaţována za největší sekundární lymfatický opouzdřený orgán vejcovitého tvaru u kostnatých ryb. Hraje hlavní roli ve spouštění imunitních odpovědí proti antigenům, které jsou roznášeny krví (Kachamakova et al. 2006). Slezina obsahuje výběţky členící ji na dva oddíly – tzv. bílou a červenou pulpu. Červená pulpa obsahuje červené krvinky a makrofágy, je také místem, kde jsou odstraňovány staré a defektní červené krvinky. Bílá pulpa obklopuje ţíly a tepny ve slezině a jsou v ní přítomné lymfoidní buňky, především lymfocyty a plazmatické buňky. Na rozdíl od savců u většiny ryb nelze zcela jasně oddělit od sebe červenou a bílou dřeň, např. u C. carpio můţe červená pulpa tvořit téměř celý orgán (Toman 2000, Turner et al. 1994). Kostnaté ryby (Teleostei) mají slabě vyvinutou slezinu, jelikoţ mají v ledvinách větší mnoţství lymfohematopoetické tkáně, zatímco u příčnoústých (Elasmobranchii), kteří v dospělosti tuto tkáň v ledvinách ztrácí, je slezina důleţitým orgánem (Secombes 1997).

4.2.4 Lymfatická tkáň asociovaná se střevem (GALT) Se střevem asociovaná lymfoidní tkáň obsahuje lymfoidní buňky lokalizované v lamina propria střeva a střevním epitelu. Vyskytuje se u všech ryb, avšak jako organizovaná struktura je poprvé zmíněna u paryb (Chondrichtyes) (Fichtelius, Finstad and Good 1968). Je různá v závislosti na druhu ryby a velmi podobná intestinální bariéře 24

savců. U kostnatých ryb vzniká rozšíření lymfoidní tkáně kolem střeva nebo je GALT rozdělena na dvě části, z nichţ jedna je specializovaná na vychytávání a zpracování antigenů (Hart et al. 1988). Vyskytují se zde lymfoidní shluky, které obsahují makrofágy, granulocyty, lymfoidní či plazmatické buňky tvořící protilátky (Toman 2000, Zapata et al. 1997).

4.3 Buňky imunitního systému ryb – imunocyty Efektorové buňky přirozeného imunitního systému vytvořené v kostní dřeni cirkulují v krvi a pronikají do tkání. Řadí se sem buňky myeloidní linie zahrnující mononukleární fagocyty (monocyty a makrofágy), granulocyty (neutrofily, eozinofily a basofili), dendritické buňky a buňky lymfoidní linie – natural killer buňky (Klontz 1994). Obr. 7: Schéma krvetvorby. (hematopoéza – z kmenových buněk vznikají progenitorové buňky, které jsou nasměrované k diferenciaci na základní typy krevních buněk), (Toman 2000).

25

4.3.1 Leukocyty Leukocyty se dělí na granulocyty a agranulocyty. Rozlišovacím znakem je tvar jádra, jeho velikost, vnitřní struktura a přítomnost či absence různě se barvících granul v cytoplazmě buněk. Mezi agranulocyty patří lymfocyty a monocyty, které mají cytoplazmu bez granul. Typická jsou pro ně velká, celistvá a kompaktní jádra. Do skupiny granulocytů patří leukocyty, v jejichţ cytoplazmě je značné mnoţství granul, která se rozlišují schopností barvit se bazickými, kyselými nebo obojími barvivy. Podle barvitelnosti granul lze rozlišit granulocyty na eozinofilní, bazofilní či neutrofilní (Svobodová, Pravda and Malá 2012).

4.3.1.1 Agranulocyty Lymfocyty Lymfocyty jsou typem bílých krvinek vyskytující se v krevním oběhu, tkáních či zánětlivých loţiscích zodpovědné za buněčnou odpověď. Jsou to jediné buňky, které jsou schopny specificky rozpoznat a odlišit různé antigenní determinanty. Existují různé subpopulace lymfocytů lišící se v jejich funkci a v rozpoznávání antigenů. B lymfocyty jsou zprostředkovatelé humorální imunity tvořící protilátky a rozpoznávají extracelulární antigeny. Po setkání s antigenem se B-buňky diferencují na plazmatické nebo paměťové buňky a proto zodpovídají za humorální (protilátkový) typ specifické imunity (Roberts 2012). T lymfocyty rozeznávají intracelulární mikroby a podporují jejich ničení uvnitř napadených buněk nebo takto nakaţené buňky celé ničí. Netvoří protilátky, ale rozpoznají např. peptidové antigeny související s přítomností cizorodých agens, tyto peptidy jsou pak vystavovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk. Podle funkce je můţeme rozlišit na dva typy, pomocné T lymfocyty (TH buňky) a cytotoxické lymfocyty (TC buňky). TH buňky vylučují cytokiny stimulující proliferaci a diferenciaci T lymfocytů a aktivují jiné buňky, například B lymfocyty a makrofágy. TC lymfocyty přímo zabíjí buňky produkující cizí antigen, například buňky infikované viry a jinými intracelulárními patogeny (Roberts 2012). Velikost lymfocytů se pohybuje mezi 7 - 9 µm a jejich počet v krvi je výrazně vyšší u ryb neţ u savců, u kapra kolísají hodnoty mezi 76 - 97,5 % všech leukocytů (Obr. 8). Jádro buňky je vţdy poměrně velké a kulovité s vysokým obsahem chromatinu 26

stočeného v hustou spleť vláken a uzlů. Cytoplazma je bez granulí a obepíná jádro jako nepřetrţitý lem s občasnými výběţky (Roberts 2012, Svobodová et al. 2012). Obr. 8: Lymfocyt – C. carpio. (Tripathi, Latimer and Burnley 2004)

Přirození zabíječi (NK buňky) Funkcí Natural killer cells je usmrcení vlastních nádorových buněk a buněk infikovaných viry. Vyznačují se spontánní cytotoxicitou vůči nakaţeným buňkám. Tvoří 5-10% z celkového počtu lymfocytů a rozeznatelné jsou pomocí velkých granul (lyzozomů), kde mají uloţeny specifické perforiny a granzymy. Perforiny slouţí k vytvoření otvoru do cytoplazmatické membrány napadené buňky, zatímco granzymy pronikají skrz otvor a navodí uvnitř buňky proces apoptózy. NK buňka po kontaktu s cílovou buňkou tyto látky uvolní, coţ umoţní, aby se buňka od terčové buňky odpoutala a v aktivitě pokračovala u dalších buněk (Ferenčík 2005). NK-buňky byly identifikovány u kostnatých ryb, ale v mnoha případech je nelze dobře charakterizovat z důvodu vysoké morfologické variability (Whyte 2007).

27

Monocyty Patří mezi největší buněčné elementy s velikostí 15 - 18 µm a výjimečně i více. Procentové zastoupení monocytů u C. carpio se pohybuje mezi 3 - 5 %. Jsou tvořeny světlejším kulovitým aţ laločnatým jádrem s obsahem chromatinu, jeţ je utvářeno ve formě sítě s výraznými uzly (Obr. 9) (Svobodová et al. 2012). Monocyty mají schopnost migrovat ve tkáních, kde zrají a diferencují se z nich makrofágy, coţ způsobuje jejich tvarovou variabilitu. Základní funkcí monocytů a makrofágů u ryb je fagocytóza. Svou produkcí aktivních látek vyvolávají zánět a zabití cizorodých mikroorganismů. Mezi tkáňové makrofágy se řadí makrofágy ledvin, sleziny, melanomakrofágy a podpůrné buňky (Hrubec and Smith 2000, Campbell and Ellis 2013).

Obr. 9: Monocyt – C. carpio. (Tripathi et al. 2004)

4.3.1.2 Granulocyty Granulocyty ryb jsou charakteristické vysokou morfologickou a funkční heterogenitou mezi jednotlivými druhy ryb. Jedná se o kulaté buňky s výrazným jádrem a hojně zastoupenou cytoplazmou (Ranzani-Paiva et al. 2003). Terminologie rybích granulocytů a jejich vývojových stádií není zcela jednotná. Rybí granulocyty se dělí na neutrofily, bazofily a eozinofily. Přičemţ neutrofily se často vyskytují pod pojmem heterofily, coţ je jejich zvláštní podskupina (Ainsworth 1992). Ryby produkují obvykle

28

buď neutrofily nebo heterofily, přičemţ funkční rozdíly mezi nimi nebyly určeny (Hrubec and Smith 2000). Šíření granulocytů v krvi, tkáních a dalších tělních tekutinách je závislé na sezónních změnách, nemocech, čistotě prostředí a různých stresových vlivech (Ainsworth 1992). Neutrofilní granulocyty Velikost buněk se pohybuje mezi 5 - 10 µm a procentové zastoupení mezi leukocyty kolísá v rozmezí 20 - 25%, v případě infekce dosahuje aţ 31 %. Do této buněčné kategorie je zařazeno mnoho vývojových stádií těchto buněk, jejichţ společným znakem je přítomnost různého mnoţství granul, které částečně či zcela vyplňují cytoplazmatický prostor (Obr. 10) (Tavares-Dias et al. 2008, Svobodová et al. 2012).

Obr. 10: Neutrofilní granulocyt – C. carpio. (Tripathi et al. 2004)

Eozinofilní granulocyty Velikost se pohybuje od 8 - 12 µm a v krvi kostnatých ryb se nachází pouhé 1 %. Jsou to buňky s řidším jádrem a okrouhlým tvarem, jejichţ granule obsahují histamin s detoxikační funkcí (Obr. 11) (Hine 1992, Svobodová et al. 2012).

29

Obr. 11: Eozinofilní granulocyt – C. carpio. (Tripathi et al. 2004)

Bazofilní granulocyty Bazofilní granulocyty dosahují velikosti od 8 - 10 µm a jejich procentové zastoupení v krvi ryb se pohybuje od 0 - 0,5 %. Mají okrouhlý tvar s excentricky uloţeným jádrem a cytoplazmu překrytou granulemi (Obr. 12) (Tripathi et al. 2004, Svobodová et al. 2012).

Obr. 12: Bazofilní granulocyt – C. carpio. (Tripathi et al. 2004)

30

4.3.2 Ostatní krevní elementy V krvi kapra se nacházejí velmi běţně zastoupené erytrocyty a trombocyty, ale tyto buňky nemají z hlediska imunitního systému ryb ţádnou zásadní funkci, přesto pro úplnost níţe uvádím jejich základní charakteristiky.

Erytrocyty Funkcí červené krvinky je přenos kyslíku z plic nebo ţaber do tělních tkání. Obsahují červené krevní barvivo hemoglobin, které ve zralém rybím erytrocytu je difúzně rozloţeno a váţe kyslík (Krejsek and Kopecký 2004). Savčí erytrocyty jsou bikonkávního tvaru a bez jádra, zatímco u ryb jsou erytrocyty plnohodnotné buňky s oválně se vyvinutým jádrem ve středu erytrocytů (Hrubec and Smith 2000). Jejich velikost a tvar závisí na pohlavní a druhové příslušnosti a také na faktorech prostředí (C. carpio 12 x 8,5 µm) (Obr. 13). Počet erytrocytů u ryb také závisí na mnoţství faktorů jako je stáří, pohlaví, druhová příslušnost, výţiva, roční období, koncentrace kyslíku, pH vody apod. Červené krvinky se také podílejí na přenosu ţivin, především proteinů. Rybí druhy ţijící v chladných polárních vodách postrádají hemoglobin i erytrocyty a vystačí si s kyslíkem rozpuštěným v krevní plazmě (Tripathi et al. 2004, URL 1).

Obr. 13: Erytrocyty - Cichla temensis. (Tavares-Dias et al. 2011)

31

Trombocyty Trombocyty (krevní destičky) v krvi savců jsou bezjaderné úlomky buněk, zatímco u ryb, ptáků a plazů mají větší rozměr a obsahují jádro. Funkcí trombocytů je hemokoagulace, tedy ochrana organismu před ztrátou většího mnoţství krve (Amin and Mortensen 1992). Krevní destičky savců, ryb, obojţivelníků, ptáků i plazů mají stejnou funkci, pohybují se cévním řečištěm a pokud narazí na poškozenou cévu, prodělají vápníkem řízenou aktivaci. Dochází k jejich okamţitému shlukování (Obr. 14), produkci tromboplastinu, polymerizaci fibrinogenu a vzniku sraţeniny, která utěsní poškozenou cévu (Campbell and Ellis 2013, Lucas and Jamroz 1961). U ryb sráţení krve urychluje koţní sliz, který obsahuje vysoké mnoţství enzymu trombokinázy zahajujícího hemokoagulaci. Rychlost také závisí na stresových stavech, kdy silný stres můţe zkrátit dobu sráţení krve o 45% (URL 1). Obr. 14: Trombocyty – C. temensis. (Tavares-Dias et al. 2011)

32

4.4 Imunoglobuliny ryb Patří mezi biologicky velmi významné biomolekuly účastnící se především specifické humorální imunitní odpovědi (Mix, Goertsches and Zett 2006). Molekuly imunoglobulinů mají dvě základní funkce: 

Rozpoznávací (specifická vazba s cizorodým antigenem)



Efektorovou (odstranění antigenu z organismu)

Imunoglobuliny jsou produkovány B lymfocyty a především jejich terminálním stádiem vývoje – plazmatickými buňkami (Toman 2000). V souvislosti s rybami byly podrobně

zkoumány imunoglobuliny jen některých druhů, mezi které patří losos (Salmo) a pstruh (Oncorhynchus) z čeledi lososovitých (Salmonidae), sumeček (Ictalurus) z čeledi sumečkovití (Ictaluridae) a kapr (Cyprinus) z čeledi kaprovití (Cyprinidae) (Pilstrom and Bengtén 1996). I kdyţ imunitní odpovědi se mohou lišit u různých druhů ryb, některé hlavní rysy sdílí se savci. Tyto společné znaky zahrnují základní strukturu imunoglobulinů nebo roli, kterou hrají protilátky v mnoha imunitních reakcích jako je rozpoznání antigenu, opsonizace, neutralizace a komplementová fixace (Vesely et al. 2006). Jde o glykoproteiny, které se odlišují na základě rozdílných molekulových hmotností a podílem zastoupení jednotlivých aminokyselin. Molekula imunoglobulinu je sloţena ze čtyř podjednotek a to z dvou těţkých řetězců (H), které jsou navzájem propojeny disulfidickými (cystinovými) můstky pohromadě společně s dvěma lehkými řetězci (L). Na N-konci H a L řetězců se nachází variabilní (VH a VL) doména a uvnitř řetězce je doména konstantní (CH a CL) (Obr. 15) (Pilstrom and Bengtén 1996).

33

Obr. 15: Struktura monomeru Ig. (Mix et al. 2006, upraveno)

Donedávna byl za jediný imunoglobulin kostnatých ryb povaţován IgM. Existují však i studie, které potvrdily přítomnost dalších tříd imunoglobulinů, IgD (Hirono et al. 2003), IgZ (Danilova et al. 2005), IgT (Hansen, Landis and Phillips 2005) a IgH (Savan et al. 2005). U kostnatých ryb je většinou molekula IgM tetrametr skládající se ze čtyř podjednotek a celkem osmi vazebných míst (Obr. 16). Avšak u některých ryb byly nalezeny IgM v séru také jako monomery či dimery, kde monomery mají stejnou strukturu jako imunoglobuliny savců (Kaattari and Piganelli 1996, Clem and Small 1967). Velikost molekuly IgM se liší podle druhu ryby, ale většinou se pohybuje v hodnotách ±760 kDa. Kdyby byl imunoglobulin IgM rozštěpen na jednotlivé těţké a lehké řetězce, pak by se jejich molekulární hmotnosti pohybovaly u těţkého řetězce okolo 70kDa a u lehkého řetězce okolo 25 kDa (Vesely et al. 2006, Saha et al. 2002). Tvorba protilátek je silně ovlivněna teplotou vody. V případě klesání teploty pod hranici optima dochází ke zpomalení produkce protilátek, čímţ dojde ke sníţení titru

34

protilátek, ale i k omezení schopnosti eliminovat patogenní mikroorganismy (Dubanský a Svobodová, 1995). Obr. 16: Hypotetická struktura tetrametrického IgM. (Pilstrom and Bengtén 1996)

35

5 Materiál a metodika 5.1 Zisk a zpracování biologických vzorků Biologický materiál byl odebrán ze sladkovodní ryby kapra obecného (Cyprinus carpio) (Obr.17) řazeného do čeledi kaprovitých (Cyprinidae), řádu maloostní (Cypriniformes) zahrnujících více jak 3000 druhů ryb, z nich pouze zhruba 30 druhů ţije na území České republiky (Billard 1999). Jednalo se o sádkové kapry získané z rybníku v Rajhradicích a z lokalit nedaleko polského města Olsztyn. Kontrolní vzorek negativní krve byl odebrán z kapra chovaného v akvakultuře z Ústavu experimentální biologie na Masarykově univerzitě. Výlov kaprů byl proveden roku 2014 v měsících červen, září a říjen. Celkově bylo odebráno 41 vzorků sér. Obr. 17: Kapr obecný (C. carpio).

Potřebný materiál 

sonikátor UP100H (Schoeller Pharma Praha)



ELISA reader – SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices)



chlazená centrifuga 5415 R (Eppendorf)



kolonky Amicon Ultra – 0,5 ml Centrifugal Filters (Merck millipore)



Quant-itTM Protein Assay kit (Molecular Probes)



96-jamkové černá mikrotitrační destička (Nunc)



automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení

36

Postup Pitva ryb (C. carpio) 1. Ryby byly pitvány a vyšetřeny na přítomnost ţaberního parazita E. nipponicum za pouţití standardního protokolu dle protokolu Ergens and Lom (1970) . Krev byla odebrána aţ po usmrcení ryb prostřednictvím pipety nebo z ţivého kapra pomocí heparinizované jehly punkcí ocasní ţíly. Jehlu bylo nutno zavést kraniodorzálním směrem pod úhlem 45° od osy páteře (Obr. 18). Hrot se zavádí pomalu a mírným tlakem, jímţ je překonán pouze odpor okolní svaloviny. 2. Krev byla zpracována za účelem získání séra centrifugací 10 min 1 500 x g a uchována při -20 °C.

Obr. 18: Odběr krve kapra metodou punkce ocasní žíly. (Svobodová, Paláčková and Pravda 1986)

Sběr parazitů a exkrečně-sekrečních produktů (ES produktů) 1. Skřele byly odstřiţeny a ţaberní oblouky prohlédnuty pod mikroskopem na případné parazity v různých vývojových stádiích, které byly pomocí preparačních jehel izolovány a přesunuti do zkumavek s PBS. 2. Dospělci červů byli homogenizováni mechanicky a za pomocí sonikátoru. 3. Poté byli centrifugováni 10 min, 16 000 x g při 4 °C. 4. Supernatant z červů a ES produkty byly pipetovány do kolonky a filtrovány (cut off 3 kDa) 14 000 x g 10 min při 4 °C. 37

5. Homogenát a jejich uvolněné exkrečně-sekreční produkty byly následně uchovány při -20 °C. Měření koncentrace 1. Koncentrace vzorků homogenátu a ES produktů byla měřena pomocí kitu Quant-itTM Protein Assay a ELISA readeru při pokojové teplotě, excitace/emise – 470/570 nm. Měření vzorků bylo provedeno na 96 jamkové černé mikrotitrační destičce s plochým dnem. 2. Kalibrační křivka byla vynesena dle měření s proteinovými standardy Quant-iT v rozmezí 0 – 5 µg/µl. Detailní postup měření je uveden v příbalovém manuálu, který je součástí kitu. 3. Vzorky byly následně pouţity ke zjištění specifické aktivity rybích protilátek metodou ELISA a Western blot. Krevní roztěr 1. Bezprostředně po odběru krve byl proveden krevní roztěr. 2. Na očištěné podloţní sklíčko etanol : etherem v poměru 1:1 byla nanesena kapka krve za pomocí skleněné tyčinky. 3. Druhé roztěrové sklíčko bylo poloţeno do úhlu 45° před kapku krve tak, ţe se při dotyku s krví rozlilo po celé délce hrany roztěrového sklíčka. Takto přiloţeným sklíčkem byl zhotoven rovnoměrný roztěr pomalým a souvislým roztaţením krevní kapky směrem k opačnému konci podloţního sklíčka. 4. Zhotovený krevní roztěr musí mít rovné okraje a přecházet do „ztracena― (Obr. 19). Obr. 19: Zhotovení krevního roztěru. (dle M. Chmelíková)

38

5.2 Biochemické metody 5.2.1 Barvení krevních roztěrů Potřebný materiál 

barvicí skleněná nádoba podle Schiefferdeckera



barvící roztok Giemsa-Romanowsky, Modified Solution (Sigma-Aldrich)



methanol

Postup 1. Krevní roztěr byl pokapán methanolem, čímţ došlo k fixaci. 2. Podloţní sklo bylo vloţeno do barvící kyvety s roztokem Giemsy-Romanowskeho (1:9 barviva Giemsa-Romanowski a dH2O). 3. Bylo barveno po dobu 10 minut. 4. Sklíčko bylo vyjmuto a opláchnout dH2O. Po zaschnutí se vytvořil trvalý preparát.

5.2.2 Krevní obraz Potřebný materiál 

Mikroskop laboratorní Olympus BX50



Inverzní olej



Krevní roztěrová sklíčka

Postup 1. Po zaschnutí obarvených krevních roztěrů je provedena jejich mikroskopická analýza. Prohlíţeno v olejové inverzi při zvětšení 100 x. 2. Nejprve byl posouzen charakter buněk – jejich velikost, barvitelnost, buněčný rozpad a další. 3. Preparát byl posouván v rozsahu opaleskující zóny pod objektivem mikroskopu (Obr. 20) a přitom byly tříděny i počítány nalezené leukocyty a evidovány do vhodné tabulky. 4. Po zaznamenání 100 buněk bylo stanoveno procentové zastoupení jednotlivých druhů.

39

Obr. 20: Prohlížení krevního roztěru (Pecka et al. 2010)

5.2.3 Stanovení hladiny celkových imunoglobulinů Sráţení imunoglobulinů síranem zinečnatým je jednoduchá, levná a velmi rychlá metoda pro stanovení hladiny všech protilátek v krevním séru. Potřebný materiál 

automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení



analytické váhy - S3102 (Bel engineering)



ELISA reader – SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



vortex – V1 plus (Biosan)



DCTM Protein Assay kit (Bio-Rad)



destička mikrotitrační „P― s plochým dnem (Merci)



zkoumané kapří sérum



roztok 0,7 mM síranu zinečnatého, pH = 5,8 208 mg ZnSO4 . H2O do 1000 ml dH2O



fyziologický roztok 0,85 g NaCl do 100 ml dH2O

Postup 1. K 1,5 ml roztoku síranu zinečnatého bylo přidáno 25 μl vzorku (kapří nebo kontrolní sérum). Zkumavky byly promíchány na vortexu a inkubovány při pokojové teplotě 2 h. 2. Do dalších zkumavek bylo naneseno naředěné sérum 1:60 dH2O (5 μl vzorku : 295 μl dH2O). 40

3. Po 2 h inkubace vzorky s obsahem ZnSO4 byly centrifugovány 6 000 x g, 10 min při 20 °C. 4. Následně byla v roztocích změřena koncentrace bílkovin pomocí DCTM Protein Assay kit (Bio-Rad). Vzorky v mikrotitrační destičce byly ponechány 15 min v temnu za účelem vyvinutí barevné reakce. 5. Poté byla změřena koncentrace proteinů v supernatantu a v naředěných sérech při 700 nm na ELISA readeru. 6. Na závěr koncentrace bílkovin naměřené v supernatantu byly odečteny od koncentrace naměřené v naředěném séru. Ze získaných dat kontrolních sér byla sestavena kalibrační přímka a podle rovnice této křivky spočítána koncentrace proteinů v sérech.

5.2.4 ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) je jednou z nejpouţívanějších imunodetekčních metod slouţících k detekci i kvantitativní analýze protilátek. Imunoenzymatickou reakcí je molekula antigenu imobilizována na pevnou fázi (povrch jamky mikrotitrační destičky), na antigen se specifickou vazbou váţe protilátka a na tento komplex se nakonec naváţe značená sekundární protilátka. Reakce je vizualizovaná substrátem, který je přidán v posledním kroku experimentu. V případě navázání substrátu na sekundární protilátku dochází k barevné reakci, jejíţ intenzita je měřena pomocí spektrofotometru (Crowther 2000). Potřebný materiál 

analytické váhy – S3102 (Bel engineering)



pH metr – 3505 pH meter (Jenway)



ELISA reader – SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



vortex – V1 plus (Biosan)



třepačka – Orbital Shaker PSU-10i (Grant-bio)



automatické pipety, multikanálové pipety a další standardní laboratorní vybavení



monoklonální protilátky C16-HRP (IgG2b) značené křenovou peroxidázou proti kapřím IgM), Aquatic Diagnostic Ltd., Stirling (Skotsko), naředěný v 1 ml PBS rozpipetován po 200 μl aliquotech a zamraţeno při -20 °C.



destička mikrotitrační „P― s plochým dnem (Merci) 41



zkoumané kapří sérum



3,3´,5,5´ tetrametylbenzidin (TMB) substrát (Sigma-Aldrich)



uhličitanový pufr, pH = 9,6 0,159 g Na2CO3, 0,293 g NaHCO3 do 100 ml dH2O. Před kaţdým pouţitím je třeba namíchat čerství pufr.



fosfátový pufr, pH = 7 A) Na2HPO4 . 2H2O 14,2 g rozpustit v 500 ml dH2O B) NaH2PO4 . 2H2O 15,6 g rozpustit v 500 ml dH2O Na poţadované pH bylo smícháno 305 ml roztoku A a 195 ml roztoku B a doplněno dH2O do 1 000 ml.



promývací pufr (PBS-T) 0,1 M PBS + 0,05 % Tween-20



blokovací pufr (1%roztok BSA) 1g BSA + 100 g PBS-T



roztok pro zastavení reakce 1M HCl, ředěno v dH2O (1,04 ml HCl + 8,96 ml dH2O)

Postup Navázání antigenu na mikrotitrační destičku 1. Na destičku byly naneseny antigeny (exkrečně - sekreční produkty a homogenát parazita E. nipponicum) 1 μl/jamka naředěné v uhličitanovém pufru (pH 9,6) 100 μl/jamka. Poté byly přikryty víčkem a umístěny přes noc do lednice při teplotě 4 °C, aby nedošlo k odpaření během inkubace. 2. Druhý den byly jamky promyty promývacím pufrem, 3 x 1 min (PBS-T). 3. Blokování nespecifických vazeb bylo provedeno pomocí 1 % BSA + PBS-T po dobu 1 h.

Po navázání antigenu na dno mikrotitrační destičky 1. Byly připraveny potřebné primární protilátky ředěné 1:100 v PBS-T, naneseny po 100 μl do jamek a inkubovány při laboratorní teplotě po dobu 3 h. 2. Promyty 3 x 1 min pufrem PBS-T.

42

3. Peroxidázou značená C16-HRP sekundární protilátka proti kapřímu IgM byla ředěna v PBS-T pufru v poměrech 1:500 nebo 1:1000. Inkubace se sekundární protilátkou probíhala 1 h při pokojové teplotě. 4. Poté byly jamky promyty 3 x 1 min v PBS-T pufru. 5. V posledním kroku bylo ke vzorkům přidáno 100 μl TMB-substrátu. 6. Pro vyhodnocení experimentu byla změřena absorbance ELISA readerem při 630 nm. 7. Kontrolní skupiny zahrnovaly jamky bez antigenu a jamky, do kterých byl místo primární protilátky přidán pouze PBS-T pufr.

5.2.4.1 Optimalizace ELISA je metoda, která se velice obtíţně a zdlouhavě optimalizuje. Při optimalizaci byla vyzkoušena monoklonální anti-carp protilátka poskytnutá Ing. Tomášem Veselým, CSc. (VÚVL, Brno), ale ţádné z naměřených hodnot nebyly dost vysoké pro věrohodné stanovení hladiny imunoglobulinů v krvi kapra. Následně jsme metodu optimalizovali dle Kořínková et al. (2008). Byla sníţena inkubace primární a sekundární protilátky naředěné v PBS-T + 1% BSA na 1 h při 37 °C.

5.2.5 Western blot Tato metoda je vyuţívána za účelem kvalitativního zhodnocení reakce specifických protilátek se spektrem elektroforeticky separovaných antigenů bílkovinné povahy. Provedení Western blot je zcela přesnější neţ ELISA, avšak je finančně nákladnější a časově náročnější (Dupouy-Camet and Murrell 2007).

Obecně známý postup je sloţen ze třech fází: 1. Separace vzorků pomocí SDS-PAGE gelové elektroforézy. 2. Blotování proteinů z gelu na PVDF membránu. 3. Vlastní imunodetekce – inkubace s primárními, sekundárními protilátkami a vyvinutí membrány pomocí substrátu, kdy v místě specifické vazby antigenu na protilátky vzniká barevná reakce.

43

Potřebný materiál 

aparatura na elektroforézu – Wet/Tank Blotting Systems (Bio-Rad)



třepačka – Orbital Shaker PSU-10i (Grant-bio)



blotovací přístroj – Trans-Blot® Turbo™ Blotting System (Bio-Rad)



vortex – V1 plus (Biosan)



automatické pipety, odměrné válce, pinzeta, nůţky a další standardní laboratorní vybavení



skener – WB-GS-900TM calibrated densitometer (Bio-Rad)



polyakrylamidový gel – Mini-PROTEAN® TGX stain-free™ Precast gels (BioRad)



marker – BrechMarkTM Prestained Protein Ladder (Life technologies)



protein ladder (Life technologies)



PVDF membrána (polyvinylidenfluorid) - Sequi-Blot PVDF Membrane (BioRad)



Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad)



filtrační papír – Extra thick blot paper (Bio-Rad)



inkubační vanička (Bio-Rad)



TGS 10x TGS + dH2O (1:9)



commasie blue QC Colloidal Coomasie Stain (Bio-Rad)



destaining solution 250 ml CH3OH, 250 ml dH2O, 50 ml CH3COOH



fosfátový pufr (PBS), pH = 7,2 PBS (10x) naředit s dH2O v poměru 1:9



promývací pufr (PBS-T) 0,1 M PBS + 0,05 % Tween-20



blotovací pufr 50 ml TGS 10x, 350 ml dH2O, 100 ml CH3OH



blokovací pufr 5 % BSA v 0,1 M PBS+0,05 Tween-20

44

Postup Elektroforéza 1. Na elektroforézu bylo potřeba sestavit aparaturu s polyakrylamidovým gelem, prostor vyplnit TGS pufrem a nanést vzorky exkrečně - sekrečních produktů a homogenátu 4:1 smíchané se vzorkovým pufrem a proteinové markery (165 V, 1 h). Elektrotransfer „blotování― 1. Jedna část gelu byla nabarvena Coomasie blue a zbylá část byla pouţita pro vlastní imunodetekční experiment. 2. Z druhé části byl sestaven „blotovací sendwich― (Obr. 21), který byl umístěn mezi katodu a anodu blotovací aparatury v elektrickém poli, kde dojde k přenosu proteinů z gelu na membránu. Blokace nespecifických vazeb 1. Membrána byla rozstříhána podle polohy vzorku a umístěna do inkubační vaničky. 2. Následně zablokována za účelem vzniku nespecifických reakcí 5 % odtučňovacím mlékem, 2,5 % BSA v PBS-T přes noc při 4 °C. Inkubace s protilátkami 1. Séra byla ředěna v poměru 1:100 s PBS-T + 2,5 % BSA a přidána ke vzorkům na membránách. Inkubace s primární protilátkou probíhala 1 h 30 min za stálého míchání při pokojové teplotě. 2. Po inkubaci byly membrány promyty roztokem PBS-T 3 x 5 min. 3. Následovala inkubace se sekundární protilátkou ředěnou 1:1000 v PBS-T + 2,5 % BSA 1 h za stálého míchání při pokojové teplotě. 4. Po inkubaci byly membrány opět promyty roztokem PBS-T 3 x 5min.

Detekce reakce 1. Reakce byla vizualizována vyuţitím reakce enzym-substrát (Opti-4CN Substrate Kit) a vyfocena.

45

Obr. 21: Skladba vrstev pro blotování (URL 2, upraveno)

46

5.3 Molekulární metody 5.3.1 Zisk RNA Jako biologický materiál byla pouţita kapří slezina a krev. Byla izolována RNA s vyuţitím soupravy High Pure Ria Tissue kit (Roche) a izolací za pomocí TRIzolu dle následujícího postupu.

5.3.1.1 Izolace RNA pomocí kitu –High Pure Ria Tissue kit Reagencie od společnosti Roche umoţňují rychlou a spolehlivou izolaci čisté RNA.

Potřebný materiál 

kapří sérum a homogenát kapří sleziny



High Pure Ria Tissue kit (Roche)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



vortex – V1 plus (Biosan)



automatické pipety



ethanol

 RNase-free špičky, zkumavky a destilovaná voda

Postup 1. Tkáň byla homogenizována ve 400 µl vázacího pufru a centrifugována 2 min při 13 000 x g. 2. K supernatantu bylo přidáno 200 µl 96 % ethanolu a dobře promícháno. 3. Vzorek byl napipetován na sestavenou kolonku. Centrifugováno 1 min při 13 000 x g. 4. Bylo přidáno 90 µl DNase inkubovacího pufru a 10 µl DNázy, promícháno a inkubováno 15 min při pokojové teplotě. 5. .Přidáno 500 µl promývacího pufru I a centrifugováno 30 s 8 000 x g. 6. Přidáno 500 µl promývacího pufru II a centrifugováno 30 s 8 000 x g. 7. Přidáno opět 300 µl promývacího pufru II a centrifugováno 2 min 13 000 x g.

47

8. Nakonec bylo přidáno 100 µl eluovacího pufru a centrifugací 1 min 8 000 x g RNA protekla do čisté zkumavky.

5.3.1.2 Izolace RNA chloroform - izopropanolovou extrakcí s TRIzolem TRIzol Reagent je komerčně dostupný RNA stabilizační roztok od společnosti Lifetechnologies, obsahující guanidin isothiokyanát (inhibitor RNáz), kyselý fenol a další komponenty potřebné k izolaci celkové RNA z buněk nebo tkání. Celý postup izolace veškeré RNA se provádí v čistém laminárním boxu. Potřebný materiál 

kapří sérum a homogenát kapří sleziny



TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



vortex – V1 plus (Biosan)



automatické pipety

 chloroform, isopropanol a 75% roztok ethanolu  RNase-free špičky, zkumavky a destilovaná voda

Postup 1. K 50 – 100 mg vzorku tkáně byl přidán 1 ml TRIzolu a vše bylo důkladně homogenizováno a inkubováno 5 min při pokojové teplotě. 2. Centrifugováno 12 000 x g 10 min při 4 °C, následně byl supernatant přenesen do nové zkumavky. 3. K supernatantu bylo přidáno 200 µl chloroformu a intenzivním třepáním v ruce po dobu 15 s promícháno. Nakonec ponecháno stát v klidu 2 - 3 min při laboratorní teplotě. 4. Centrifugováno 12 000 x g 15 min při 4 °C. 5. K horní vodné fázi odebrané do čisté mikrozkumavky bylo přidáno 500 µl isopropanolu. 6. Směs byla inkubována 10 min při laboratorní teplotě a centrifugována 10 min při 12 000 x g a 4 °C. 48

7. Supernatant byl odebrán a pelet byl přečištěn 1 ml 75 % ethanolu na 1 ml TRIzolu. 8. Vortexováno a centrifugováno 7 500 x g 5 min 2 - 8 °C. 9. Supernatant byl dostraněn a pelet RNA vysušen. RNA byla rozpuštěna v RNAse free H2O. Uchováno v -80 °C. Koncentrace a čistota RNA byla změřena spektrofotometricky na přístroji NanoDrop ND-8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies). Absorpční maximum nukleových kyselin se nachází v oblasti 260 nm. Z absorbance při této vlnové délce je počítána koncentrace RNA.

5.3.2 Reverzní transkripce Izolovaná RNA byla přepisována do cDNA s vyuţitím kitu Transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche) s primerem Anchored-oligo (dT)18, dle doporučení výrobce.

Komponenty RNA Anchored-oligo (dT)18Primer dH2O

Množství 0,518 μl (Slezina TRIzol) 4,97 μl (Krev TRIzol) 7,28 μl (Slezina Roche) 1 µl do 13 μl

Koncentrace 1 μg/µl 2,5µM

1. Denaturováno 10 min při 65 °C v termobloku. Množství 4 μl 0,5 μl 2 μl 0,5 μl 13 μl 20 μl

Komponenty Reakční pufr ProtectorRNase Inhibitor Směs deoxynukleotidů, 10mM Reverzní transkriptáza, 20U/μl dH2O Celkem

2. Inkubováno při 55 °C 30 min a inaktivováno po dobu 5 min při 85 °C. 3. Koncentrace a čistota cDNA byla změřena spektrofotometricky na přístroji NanoDrop ND-8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies).

49

5.3.3 Návrh primerů Z online dostupné databáze NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) byly získány částečné kapří sekvence imunoglobulinu M (AB004108.1) a Imunoglobulinu D (AB774152.1) (Tab. 2), podle nichţ byly navrţeny specifické primery.

Tab. 2: Částečná sekvence imunoglobulinů z databáze NCBI. Barevně jsou označeny navrţené forward a reverse primery.

IgM

IgD

ATGGTCACTGTCTCGTCAGTTCAACCATCTGCACCAAAGTCAATCTTCGGCATGT CTCAGTGTACTTCTGATTCTGATGGGTTCCTCACAATCGGCTGCTTGGCAAGAGG TTTCTCAGAACCCAAGAGACCCTCTGCCTGCGGACTCGCTTACATTCAAATGGA AGGATTCTGATAAAAAAGAGTTGAGTGGTTTTGTGCAGTATCCGGCATTTGGAC GGGATGGAGACTATAGCAAAATCAGCCATCTGCGCGTGAGGAAAAGTGATTGG GATGCTAAAAAACCTTACAAATGCGAAGCTTCAAATTCTGAAGGCAGTAAAGA AACTACTCTTGTTCCATCACCCCCACCGCCAGATCAGCATGCAGATGTGTACTTA ACAGTACCTACAAAAATGGAGTTAGACAATGGAACAGCAACCTTCATGTGTTTA GCCCAGCGGTTTTCACCTAAAACATATGCGTTTAAGTGGTATCAGGATGGTAAG GAGGTGACAGATGCAATAGACAAATATGACAAAAGTGAGAAGAAAGGCTCAGT AACCGAATATAGTGCCACAAGCATTTTGCAAATCAGTGCCGACAAATGGAATCA CCCAAACAACAAAATTAAGTGTGAGTTCGTGCACAAGACAGGAAAGAAAGTTA TTGTGGCAGAATATGCAGTTCCTATTCAAGATTGCACCAATATTGCTGTTGATAT AGTGCCTCCCTCCCTTGAAGACATGCTGAAAAATAGACAAGGAGTGCTGAAGTG CAAAGCTTCAGCAGACAATTCAGGTTTCACCAAAATAACAATAGAAGCGAATA ATAATATCATCGCTGAGGCAGCAATAACTGAAAACAAAAAAGTTGTGGAACTT GACGCCCCGATTGGCTATGAAGAATGGAGCAATGGAACCGAATTTACATGCACC GTTGAACACAAAGAGCTAGCAGAGCCCAAGGCAACTAAGTTCATCAGAGAAAA TGGTAAATTTATATATTAGCACCCCCAGAGCACAAAGAGGGTGACAAGATGACC CTGACG ATGGAAGATGGACGTATGAAAGCATACAGTGAGATACTGGTGCCACAGCAAGA GTGGAATCAAGGGATCACTTACACCTGTCAGATAAATAACGGACACGATGGGA AAACTGCTGAGAAACGCACCAGTATTTGCACAGTGATTGCGCCATCCAGTCAGC GGGCAGAGGTCTACCTAGTGGGTCCATCCCTCAGTAGTGTGAGATCTGAGACCT CTGTGAGTTTGACATGTTTGGTTGTTGGTCAGAGTGTCAAGTTGTTCTCCATTCA GTGGAAAGAGAATGGCATCGTTCACAATCCAAATGGCCATGAACAAGAGCCTA GAGATCATAACAATGGGACTCAAAGCAAAGAAAGCATTTTGAAGGTTTCAGTTA GAGACTGGAATGCATATGCTGTCTTTGCCTGTGAGGTTAAGCATCT

Tab. 3: Forward a reverse primery genů IgM a IgD Gen IgM IgD

Forward

Reverse

5´- ATGGTCACTGTCTCGTCAGTT - 3´

5´- CGTCAGGGTCATCTTGTCACC - 3´

5´- ATGGAAGATGGACGTATGAAA - 3´

5´- AGATGCTTAACCTCACAGGCA - 3´

50

5.3.4 PCR Potřebný materiál 

zásobní primery z předchozího bodu



master mix Max PCR (Emerald)



MgCl2, sterilní voda



DNA templát



uzavíratelné zkumavky, pipety, špičky



termocykler Mastercycler® pro (Eppendorf)

Postup Provedení PCR: Za pouţití výše uvedených primerů byla provedena PCR dle následujícího postupu. Zásobní primery bylo potřeba naředit na koncentraci 10 μM (10 μl primeru 100 μM + 90 μl dH2O). Množství 12,5 μl 1 μl 1 μl 0,5 μl 5 μl 25 μl

Komponenta MasterMix (Emerald) Primer (Forward) Primer (Reverse) cDNA (přidat aţ nakonec) dH2O Celkem

Nastavení teplotního cyklu termocykleru:

Kapří IgM a IgD

Teplota (°C) 94 94 55 72 72

Čas (min) 5 1 1 1 10

Počet cyklů 1 30 30 30 1

Část cyklu Počáteční denaturace Denaturace Nasedání primerů Elongace Koncová elongace

5.3.5 DNA Elektroforéza Nakonec byla provedena agarózová elektroforéza pro ověření úspěšnosti reakce.

51

Potřebný materiál 

PCR produkt



agaróza



GoldView fluorescenční barva



GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas)



Erlenmeyerova baňka, mikrovlnná trouba, pipeta, špičky



forma a hřeben na přípravu gelu



Elektroforéza Gel XL Plus (Labnet)



TBE pufr 5x (54 g Tris-báze, 3,72 g EDTA, 27,5 g kyseliny borité, 1000 ml dH2O) Naředit na TBE pufr 0,5x (50 ml 5x TBE, 450 ml dH2O)

Postup Příprava gelu 1. Bylo připraveno 40 ml 1 % agarózového roztoku v Erlenmayerově baňce a rozvařeno v mikrovlnné troubě. 2. Po částečném vychladnutí bylo přidáno 1,6 μl fluorescenční barvičky GoldView (0,2 µg/ml) a směs byla lehce promíchána. 3. Agarózový roztok byl nalit do připravené formy s hřebenem. 4. Gel tuhl 20 min. Provedení elektroforézy 1. Po vyjmutí hřebenu byl gel umístěn do vany s TBE pufrem v elektroforetické aparatuře. 2. Do jamek bylo napipetováno 20 μl vzorků PCR produktů a 2 μl standardu GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder. Nakonec byla elektroforéza spuštěna na dobu 30 min 100 V, 0,8 A.

5.3.6 Purifikace PCR produktu z gelu V současné době se pro purifikaci PCR produktu pouţívají komerčně dostupné kity a centrifugační kolonky, které tuto metodu zjednodušily a urychlily.

52

Potřebný materiál  získané produkty po elektroforéze 

isopropanol



Termocykler Mastercycler® pro (Eppendorf)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



NanoDrop ND-8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies)



MinElute Gel Extraction kit (Qiagen)

Postup 1. Gel byl vyříznut a vloţen do trojnásobného objemu QG pufru (na 1 mg gelu/1 ml pufru). 2. V termobloku byla zkumavka inkubována 10 min při 50 °C , neţ se agarózový bloček rozpustil. 3. 100 µl isopropanolu bylo přidáno a lehce promícháno. 4. Vzorek byl nanesen na kolonku se zkumavkou a vše bylo centrifugováno při 13 000 x g 1 min. 5. Přidáno 500 µl QG pufru a centrifugováno 13 000 x g 1 min, obsah ve sběrné zkumavce byl odstraněn. 6. Přidáno 750 µl pufru PE, inkubováno 2 - 5 min při pokojové teplotě, opět centrifugováno 1 min 13 000 x g. 7. Nakonec byl vzorek v kolonce propláchnut 10 µl vody a znova centrifugován 1 min 13 000 x g do čisté sběrné zkumavky. 8. Byla změřena koncentrace a čistota spektrofotometricky na přístroji NanoDrop ND-

8000 Spectrophotometer a produkty byly uchovány v lednici při 4 °C.

5.3.7 Klonovací reakce kitem CloneJET Klonování genu znamená vytvoření mnoha jeho kopií v vyuţitím ţivého systému např. bakterií.

Potřebný materiál  purifikovaný PCR produkt 

XL1 Blue kompetentní E. coli 53



třepačka (37 °C)



vodní lázeň (42 °C)



LB médium na Petriho miskách obsahující 100 μg/ml ampicilinu



pipety, špičky, mikrobiologické hokejky pro rozetření bakterií



S.O.C. médium 2% trypton, 0,5% kvasinkový extrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO 4, a 20 mM glukóza

Postup Ligace Sloţení reakční směsi za pouţití reagencií v uvedeném pořadí: Množství 10 µl 1 µl 5 µl 1 µl 18 µl

Komponenta 2X reakční pufr PCR product dH2O DNA blutin enzym Celkem

1. Směs byla vortexována, centrifugována a inkubována v termocykleru 5 min při 70 °C. pJET 1,2/blunt klonovací vektor (50ng/µl) T4 DNA ligase (5U/µl) Celkem

1 µl 1 µl 20 µl

2. Ligační směs byla opět vortexována, centrifugována a inkubována při 18 °C 5-20 min.

Transformace 1. 5 µl z reakce bylo napipetováno do sterilní 1,5 ml zkumavek a uchováno na ledu. 2. Bylo přidáno 50 µl buněk XL1 Blue a inkubováno 20 min na ledu. 3. Po inkubaci bylo potřeba provést tepelný šok 45 - 50 s ve vodní lázni při 42 °C. 4. Zkumavky byly vráceny zpět na led a inkubovány 2 min. 5. Do kaţdé zkumavky bylo přidáno 400 µl S.O.C média ohřáté na pokojovou teplotu. Inkubováno na třepačce (37 °C, 200 rpm, 1,5 h) a centrifugováno 3 000 x g 10 min. 6. Supernatant byl odpipetován a buňky byly rozpuštěny ve zbytku média. 7. Byly připraveny LB plotny s ampicilinem (100 µg/ml).

54

8. Nakonec bylo naneseno 50 µl kaţdého vzorku na předehřátou selektivní plotnu a pomocí mikrobiologické hokejky rozetřeno. 9. Inkubováno přes noc v 37 °C dnem vzhůru. Všechny kolonie by měly být bílé s obsahem inzertu.

5.3.8 Analýza kolonií (transformantů) a rozbití buněk Potřebný materiál  LB plotny s pomnoţenými transformovanými buňkami z předchozího kroku 

LB plotny s ampicilinem



Master mix (dNTP + Taq), MgCl2, dH2O



pJET 1,2 primery (Fw a Rv)



inkubátor



Termocykler Mastercycler® pro (Eppendorf)



mikrozkumavky, pipety, špičky

Postup 1. Z kolonií, které vyrostly přes noc na LB plotnách (inserty IgM/IgD vţdy ze sleziny a z krve) bylo vybráno z kaţdého vzorku 8 kolonií a jejich část byla přenesena na LB plotnu s ampicilinem (100 μg/ml). 2. Součastně druhá část totoţných kolonií byla přenesena do mikrozkumavek s 10 μl dH2O pro následné rozbití neboli crack buněk. 3. LB plotnu byla ponechána v inkubátoru přes noc při 37 °C.

Rozbití buněk bylo provedeno v termocykleru dle následujícího schématu. Zkumavky obsahují vţdy 10 μl dH2O a část buněčné kolonie. Teplota (°C) 96 50 96 45 96 40 4

Čas (min) 5 1,5 1,5 1 1

1 2

55

Počet cyklů

1

Po rozbití buněk do microzkumavek přidat: Množství 12,5 μl 1 μl 1μl

Komponenty MasterMix (Emerald) Primer (Forward) pGET 1.2 JET Primer (Reverse) pGET 1.2 JET

Provést PCR dle následujícího schématu: Teplota (°C) 94 94 55 72 72

Čas (min) 5 0,5 1 1,5 10

Počet cyklů 1 35 35 35 1

Část cyklu Počáteční denaturace Denaturace Nasedání primerů Elongace Koncová elongace

Po provedení PCR byly ověřeny kontrolní PCR produkty gelovou elektroforézou.

5.3.9 Namnožení plazmidové DNA Potřebný materiál 

5 kolonií od kaţdého vzorku



LB médium bez agarózy a s ampicilinem



zkumavky typu Falcon



třepací inkubátor (37 °C, 200 rpm)

Postup Na základě výsledků z kontrolní PCR bylo vybráno od kaţdého vzorku 5 kolonií se správným počtem bází. Jednalo se kolonie: krev IgM (1), (2), (3), (4), (5), krev IgD (1), (3), (4), (6), (7), slezina IgM (1), (3), (4), (6), (7) a slezina IgD (1), (3), (5), (6), (8). 1. Do zkumavek s 5 ml LB média byl přidán ampicilin (100 μg/ml). 2. Následně do LB média byly přeneseny jednotlivé kolonie a inkubovány přes noc v třepacím inkubátoru při 37 °C, 225 rpm.

56

5.3.10 Izolace plazmidu Potřebný materiál 

pomnoţené buňky z předchozího kroku



LB pufr s ampicilinem



FastPlasmid™ Mini kit (Eppendorf)



NanoDrop ND-8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)

Postup 1. Po vytaţení buněk z třepacího inkubátoru byly centrifugovány 5 min při 2 000 x g. 2. Médium bylo odlito a přidáno 400 µl lyzačního roztoku. 3. Všechny zkumavky byly zvortexovány 30 s, poté byl lyzát inkubován 3 min při pokojové teplotě. 4. Lyzát byl přenesen na kolonku z kitu a centrifugován 1 min při 13 000 x g. 5. Poté do kolonek byl nepipetován promývací pufr a opět centrifugováno 1 min při 13 000 x g. 6. Filtrát byl vylit a lyzát v kolonkách následně centrifugován. 7. Kolonky byly přesunuty do sběrných zkumavek, přidáno 20 µl H2O na eluaci DNA a naposled centrifugováno 1 min 13 000 x g.

U vzorků byla změřena koncentrace vyizolované DNA pomocí spektrofotometru NanoDrop a následovalo osekvenování na šesnáctikapilárním přístroji 3130xI Genetic Analyzer 2010 (Applied Biosystems) v laboratoři sekvenace DNA biologické sekce PřF Univerzity Karlovy v Praze. Výsledné sekvence byly porovnány v programu Geneious a vytvořeny tzv. koncenzuální sekvence. Jedná se o konvenční sekvence bazí DNA, která jsou společná většímu počtu stejných genů.

57

5.3.11 RACE-PCR (rychlá amplifikace konců cDNA) Vzhledem k tomu, ţe mé sekvence jsou u obou genů pouze částečné, proto jsem vyuţila metodu RACE-PCR, kterou lze vyuţít k získání 5´ a 3´ konce genu prostřednictvím 5´/3´ RACE kit 2nd Generation (Roche). Metoda RACE-PCR spočívá v syntéze kompletní cDNA na základě znalosti pouze krátkého úseku uvnitř mRNA. RACE se dělí na 5´ RACE a 3´ RACE podle toho, ve kterém směru probíhá prodluţování molekuly mRNA. U 3´RACE probíhá od 3´poly(A)-konce mRNA zpětná transkripce. Při 5´RACE dochází od 3´-konce téţ ke zpětné transkripci, ale řetězec cDNA je po svém vzniku oddělen od primeru a terminální transferázou vybaven 3´-poly(A)-koncem.

5.3.11.1 5´RACE-PCR Postup Při 5´RACE byla cDNA syntetizována za pouţití zpětné transkriptázy a genově specifického primeru SP1. Reakční produkt zpětné transkripce byl purifikován a vybaven 3´-poly(dA)-koncem připojeným terminální transferázou. Úsek cDNA s napojeným koncem byl amplifikován PCR s pouţitím vnějšího genově specifického primeru SP2, sloţeného primeru oligo(dT) s kotevním adaptorem a Taq DNA-polymerázy. Nakonec byl pouţit specifický primer SP3 k nested PCR za vzniku produktu, který byl kontrolován elektroforeticky na agarózovém gelu.

Gen IgM (SP1) IgM (SP2) IgM (SP3) IgD (SP1) IgD (SP2) IgD (SP3)

Reverse primer 5´- GAGGAACCCATCAGAATCAG -3´ 5´- GACATGCCGAAGATTGACTT -3´ 5´- CTGACGAGACAGTGACCAT -3´ 5´- AAGTGATCCCTTGATTCCACT -3´ 5´- GCTGTGGCACCAGTATCT -3´ 5´- CTTTCATACGTCCATCTTCCAT -3´

Syntéza cDNA dle RNA templátu byla provedena smícháním následujících reagencií: Množství 4 μl 2 μl 1 μl

Komponenty Pufr pro syntézu cDNA Směs deoxynukleotidů (10 mM) Specifický primer SP1 58

1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 9 μl 20 μl

RNA Kontrolní primer Kontrolní RNA Reverzní transkriptáza dH2O Celkem

Roztok byl promíchán a inkubován 60 min při 55 °C a dalších 5 min při 85 °C.

Purifikace K přečištění nově syntetizované cDNA byl pouţit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). 1. K cDNA bylo přidáno 100 µl vazebného pufru. 2. Roztok byl napipetován na kolonku a centrifugován 30 s 6 000 x g. 3. Na kolonku bylo přidáno 500 µl promývacího pufru a centrifugováno 2 min 13 000 x g. 4. Filtrační kolonka byla přemístěna do nové sběrné zkumavky s přídavkem 50 µl elučního pufru a následnou centrifugací 30 s 8 000 x g. 5. Byla změřena koncentrace přečištěného PCR produktu při 260/280 nm. 6. Do nové sterilní mikrozkumavky bylo napipetováno 20 µl purifikované cDNA, 2,5 µl reakčního pufru (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH 8,3) a 2,5 µl dATP (2mM). 7. Roztok byl promíchán a inkubován 3 min při 94 °C, následně chlazen na ledě a byl přidán 1 µl terminální transferázy a vše bylo inkubováno dalších 20 min při 37 °C. 8. Terminální transferáza byla inaktivována při 70 °C po dobu 10 min.

Polyadenylovaná cDNA byla podrobena PCR reakci s druhým genově specifickým primerem, oligo(dT) primerem a dalšími komponentami v teplotním programu s časovým gradientem. Množství 5 μl 1 μl 1 μl 1 μl

Komponenty cDNA Oligo dT-kotva Primer Specifický primer SP2 Směs deoxynukleotidů (10 mM) 59

Reakční enzymy Reakční pufr

0,75 μl 5 μl 36,25 μl 50 μl

dH2O Celkem

Teplotní profil reakce: Čas Počet cyklů Část cyklu Teplota (°C) 94 2 min 1 Počáteční denaturace 94 15 sec 10 Denaturace 55 30 sec 10 Nasedání primerů IgM/IgD 72 40 sec 10 Elongace 94 15 sec 25 Denaturace 55 30 sec 25 Nasedání primerů * 72 40 sec 25 Elongace 72 10 1 Koncová elongace *kaţdý následující cyklus je o 20 sec delší, tedy 1. = 40 sec, 2. = 60 sec, 3. = 80 sec, atd.

Reakční směs byla namíchána na druhou PCR reakci dle tabulky s přídavkem třetího genově specifického primeru (SP3). Množství 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 0,75 μl 5 μl 40,25 μl 50 μl

Komponenty PCR produkt PCR kotva Primer Specifický primer SP3 Směs deoxynukleotidů (10 mM) Reakční enzymy Reakční pufr dH2O Celkem

Teplotní profil reakce:

IgM/IgD

Teplota (°C) 94 94 55 72 72

Čas (min) 5 1 1 1 10

Počet cyklů 1 30 30 30 1

Část cyklu Počáteční denaturace Denaturace Nasedání primerů Elongace Koncová elongace

Úspěšnost amplifikace cDNA první i druhé PCR reakce byla ověřena pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. PCR produkt byl vyříznut, purifikován, transformován a následně osekvenován.

60

5.3.11.2 3´RACE-PCR U 3´RACE je vyuţívána výhoda přirozeného poly(A)-konce na mRNA jako místa pro zahájení PCR amplifikace. Potřebný materiál 

5´/3´ RACE kit, 2nd Genetarion (Roche)



Expand High Fidelity PCR systém kit (Roche)



Termocykler Mastercycler® pro (Eppendorf)



chlazená centrifuga – Microcentrifuge 5415 R (Eppendorf)



specifické primery



pipety, mikrozkumavky, špičky

Postup Přepis mRNA do cDNA 1. Do zkumavek umístěných na ledu byly napipetovány následující sloţky dle tabulky. Množství 4 µl 2 µl 1 µl 5 µl 1 µl 7 µl 20 µl

Komponent Pufr pro syntézu cDNA Směs deoxynukleotidů Oligo dT-Anchor Primer RNA Reverzní transkriptáza dH2O Celkem

2. Obsah byl vortexován a centrifugován. 3. Následně byla směs inkubována 1 h při 55 °C a poté 5 min při 85 °C v termocykleru. Amplifikace genů pro IgM a IgD Amplifikace proběhla pomocí primerů uvedených v tabulce a cDNA z předešlého kroku. Dále byla provedena PCR s vyuţitím navrţených forward primeru a reverse primeru z kitu.

Gen IgM (SP) IgD (SP)

Forward primer 5´- GCACCCCCAGAGCACAAAGAG -3´ 5´- GTGTGAGATCTGAGACCTCTGT -3´

61

Sloţení reakční směsi: Množství 0,5 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,375 μl 2,5 μl 20,125 μl 25 μl

Komponenty cDNA produkt PCR primer Anchor s kotvou Specifický forvard primer Mix deoxynukleotidů Expand High Fidelity enzymový mix Expand High Fidelity pufr s MgCl2 dH2O Celkem

Teplotní profil reakce:

IgM/IgD

Teplota (°C) 94 94 55 72 72

Čas (min) 5 1 1 1 10

Počet cyklů 1 30 30 30 1

Část cyklu Počáteční denaturace Denaturace Nasedání primerů Elongace Koncová elongace

Pro ověření úspěšnosti byla provedena elektroforézu na agarózovém gelu. Gen z gelu byl vyříznut a purifikován. Poté bylo postupováno stejně jako při izolaci cDNA, tedy klonovací reakcí, analýzou transformace, izolací plazmidu a sekvenací. Výsledky sekvence byly opět zpracovány v programu Geneious.

62

6 Výsledky a diskuze 6.1 Biochemické metody 6.1.1 Krevní obraz U všech krevních roztěrů byly pozorovány pomocí světelného mikroskopu krevní buňky a současně bylo stanoveno procentuální zastoupení. Při vyhodnocování hodnot krevních indexů ryb, je důleţité určit, zda se jedná o normální rozptyl hodnot fyziologického rozmezí (Tab. 4) (Luskova 1998).

Tab. 4. Referenční hodnoty buněk imunitního systému u C. carpio. (Svobodová, Pravda and Modrá 2012). Procentuální zastoupení (%) 76 - 97,5 3–5 20 - 27

Leukocyt Lymfocyty Monocyty Granulocyty

Obr. 22: Lymfocyty C. carpio.

63

Obr. 23: Monocyty C. carpio.

Obr. 24: Granulocyt C. carpio.

Obr. 25: Erytrocyty C. carpio.

64

Obr. 26: Trombocyty C. carpio.

Tab. 5. Procentuální zastoupení leukocytů u jednotlivých krevních rozměrů.

Legenda: Pozitivní séra Negativní séra Lokalita

Datum

Vzorek č.

Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko

9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lymfocyt % 96 89 98 92 44 63 82 94 87 97 91 83 98 97 77 71 62 76 79 63 63 90 65

Granulocyt% 0 11 0 8 30 15 8 6 8 1 9 12 2 2 20 22 29 16 14 31 36 8

Monocyt % 4 0 2 0 24 22 10 0 5 3 0 5 0 1 3 7 9 8 7 6 1 2

Polsko Polsko Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice

MU

7.9. 2014 7.9. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014

10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5

23.11.2014

1

81

14

5

84

10

13

83 79 79 34 66 79 23 64 68 64 71 56 64 99 84 51 85

15 13 16 61 24 18 75 30 26 28 27 44 22 1 13 40 12

2 8 5 5 10 3 2 6 6 8 2 0 14 0 3 9 3

Obr. 27: Zastoupení jednotlivých leukocytů. Lymfocyty (A), Granulocyty (B), Monocyty (C)

66

67

6.1.2 Stanovení hladiny celkových imunoglobulinů Všechny vzorky kapřího séra byly zpracovány metodou sráţení síranem zinečnatým. Pomocí absorbance byla změřena koncentrace bílkovin v plném séru a po vysráţení imunoglobulinů i v supernatantu. Z těchto hodnot byla vypočítána koncentrace celkových imunoglobulinů (mg/ml). Následující tabulka ukazuje hodnoty naměřené u jednotlivých ryb. Statisticky významné rozdíly v hladině imunoglobulinů u pozitivních i negativních kaprů nebyly nalezeny.

Tab. 6: Koncentrace celkového množství imunoglobulinů v kapřím séru

Legenda: Pozitivní séra Negativní séra

Lokalita

Datum

Vzorek č.

Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Rajhradice

9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 13.10. 2014

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1

68

Koncentrace Ig (mg/ml) 25,3 37,5 3,9 54,9 0,7 19,6 78 1,6 58,1 55,3 2,1 6,2 3,8 1,5 22,0 2,1 1,6 0,8 5,1 15,2 1,2 32 9,6 25 5,9

Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice MU

13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 23.11.2014

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 1

9,9 4,4 13,3 21,2 7,5 málo vzorku 13,0 8,3 9,3 14,6 30,6 13,5 18,0 2,9 38 1,8

Obr. 28. Dynamika hladiny imunoglobulinů u C. carpio.

80 60 40

Carp+ Carp-

20 0 č.5 (9.6.) č.7 (9.6.) č.9 (9.6.) č.6 (7.9.) č.8 (7.9.) č.7 (13.10.) č.10 (13.10.) č.4 (16.10.) č. 1 (9.6.) č.3 (9.6.) č.10 (9.6.) č.13 (9.6.) č.2 (7.9.) č.4 (7.9.) č.9 (7.9.) č.11 (7.9.) č.2 (13.10.) č.4 (13.10.) č.8 (13.10.) č.2 (16.10.) č.1 (23.11.)

Koncentrace Ig (mg/ml)

100

69

Obr. 29: Srovnání průměrných hodnot koncentrace celkových imunoglobulinů u pozitivních a negativních ryb. Chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku vyjadřující rozptyl hodnot kolem střední hodnoty. 100

Koncentrace Ig (mg/ml)

80

60

40

20

0 Carp+

Carp-

70

6.1.3 Porovnání výsledků počtu leukocytů a koncentrace imunoglobulinů Bylo prokázáno, ţe při zvýšené imunitní reakci dosahuje u ryb hladina granulocytů a monocytů vyšší úrovně. Abychom zjistili vztah mezi celkovými imunoglobuliny a leukocyty vypočítali jsme poměrový koeficient: koncentrace Ig (mg/ml)/leukocyt (%) (Tab. 8).

Tab. 7: Porovnání koncentrace celkových imunoglobulinů s procentuálním zastoupením buněk u vzorků převyšující fyziologické rozmezí.

Legenda: Pozitivní séra Negativní séra

Lokalita Rajhradice Rajhradice Rajhradice Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice

Datum

Vzorek č.

9.6. 2014 9.6. 2014 9.6. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014

5 6 7 3 4 5 6 7 8 11 2 4 5 6 7 8 9 10 1 2 5

Koncentrace Granulocyt% Ig (mg/ml) 0,7 30 19,6 15 78 8 2,1 22 1,6 29 0,8 16 5,1 14 15,2 31 1,2 36

Monocyt % 24 22 10 7 9 8 7 6 1

32

10

13

9,9 13,3 21,2 7,5 málo vzorku 13 8,3 9,6 30,6 13,5 38

13 61 24 18 75 30 26 28 44 22 40

8 5 10 3 2 6 6 8 0 14 9

71

Tab. 8: Koeficienty podílu celkového množství imunoglobulinů s procentuálním zastoupením granulocytů a monocytů.

Legenda: Pozitivní séra Negativní séra

Lokalita

Datum

Vzorek č.

Koeficient podílu celkového Ig s granulocyty

Rajhradice Rajhradice Rajhradice Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Polsko Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice Rajhradice

9.6.2014 9.6.2014 9.6.2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 7.9. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 13.10. 2014 16.10. 2014 16.10. 2014 16.10.2014

5 6 7 3 4 5 6 7 8 11 2 4 5 6 7 8 9 10 1 2 5

0,023 1,307 3,125 0,095 0,055 0,050 0,364 0,490 0,033 3,200 0,762 0,218 0,883 0,417 málo vzorku 0,433 0,319 0,332 0,694 0,818 0,950

72

Koeficient podílu celkového Ig s monocyty 0,029 0,89 2,500 0,300 0,178 0,100 0,729 2,533 1,2 2,461 1,234 2,660 2,120 2,500 málo vzorku 2,167 1,383 1,163 0 1,286 4,222

Obr. 30: Poměrové koeficienty s granulocyty (A) a s monocyty (B).

koncentrace

73

celkových

imunoglobulinů

6.1.4 ELISA Reakce homogenátu E. nipponicum

a jeho ES produktů s kapřími séry byla

testována klasickou metodou ELISA. Byla měřena změna absorbance při rostoucím mnoţství antigenu i primární protilátky. Po optimalizaci metody ELISA byly zaznamenány rozdíly mezi jednotlivými pozitivními (Carp+) a negativními (Carp-) kapřími séry.

Obr. 31: ELISA s homogenátem (A) a ES produkty (B) E. nipponicum s kapřím sérem z parazitovaných a neparazitovaných ryb. Homogenát E. nipponicum (1,6 μg, 3,2 μg, 4,8 μg) a ES produkty (0,06 μg, 0,12 μg, 0,18 μg) po reakcích s primárními protilátkami-pozitivní parazitovaní kapří sérum (Carp+) a negativní kapří sérum (Carp-) (1:100). V obou případech pouţita sekundární protilátka C16-HRP (IgG2b) značená křenovou peroxidázou proti kapřím IgM. BA: kontrolní skupiny bez přidání antigenu. Měření absorbance při 630 nm.

74

Obr. 32: ELISA s homogenátem (A) a ES produkty (B) E. nipponicum a kapřím sérem z parazitovaných i neparazitovaných ryb. Homogenát E. nipponicum (1,6 μg) po reakcích s primárními protilátkami-pozitivní parazitovaní kapří sérum (Carp+) a negativní kapří sérum (Carp-) (1:100), (1:50), (1:10), (1:5). V obou případech pouţita sekundární protilátka C16-HRP (IgG2b) značená křenovou peroxidázou proti kapřím IgM. Měření absorbance při 630 nm.

75

Obr. 33: ELISA s homogenátem (A) a ES produkty (B) E. nipponicum s kapřím sérem z parazitovaných a neparazitovaných ryb. V grafu (C) hodnoty znázorněny pomocí box-plot grafu. Chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku. Homogenát E. nipponicum (1,6 μg) a ES produkty (0,06 μg) po reakcích s primárními protilátkamipozitivní parazitovaní kapří sérum (Carp+) a negativní kapří sérum (Carp-) (1:100). Pouţita sekundární protilátka C16-HRP (IgG2b) značená křenovou peroxidázou proti kapřím IgM. Měření absorbance při 630 nm.

76

77

6.1.5 Western blot Velikost těţkého řetězce imunoglobulinu M je 70kDa, v této velikosti nebyla zaznamenána ţádná reakce s ES proteiny a homogenátem E. nipponicum. U pozitivního vzorku č. 7 byl viditelný jeden proteinový prouţek v oblasti 20kDa, ale pravděpodobně jde o nespecifickou reakci.

Obr. 34: Western blot analýza. 1,2,3,4: ES produkty s protilátkami pozitivních sér, 5: ES produkty s protilátkami negativního séra, 6: kontrola - ES produkty bez přídavku séra, 7,8,9,10: homogenát s protilátkami pozitivních sér, 11: homogenát s protilátkami negativního, 12: kontrola - homogenát bez přídavku séra, M: marker

78

6.2 Molekulární metody Nalezené částečné sekvence kapřích imunoglobulinů v online databázi NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov byly porovnány s jinými sekvencemi kaprovitých ryb za účelem

zjištění podobnosti jednotlivých sekvencí.

Tab. 9: Porovnání nukleotidové sekvence imunoglobulinů u kaprovitých ryb se sekvencí IgM C. carpio (AB004108.1) v databázi NCBI. ID v databázi (NCBI) KC894945.1 DQ417927.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

Podobnost v nukleotidové sekvenci s IgM vyjádřená v% 82% 81%

Tab. 10: Porovnání nukleotidové sekvence imunoglobulinu IgD C. carpio (AB774152.1) s imunoglobuliny kaprovitých ryb v databázi NCBI. ID v databázi (NCBI) KC894947.1 GQ429174.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

Podobnost v nukleotidové sekvenci s IgD vyjádřená v% 78% 78%

Tab. 11: Porovnání aminokyselinové sekvence imunoglobulinu IgM C. carpio (BAA34721.1) s imunoglobuliny kaprovitých ryb v databázi NCBI.

ID v databázi (NCBI)

AGR34023.1 ABD76396.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

79

Podobnost v aminokyselinové sekvenci s IgM vyjádřená v% 69% 70%

Tab. 12: Porovnání aminokyselinové sekvence imunoglobulinu IgD C. carpio (BAM74145.1) s imunoglobuliny kaprovitých ryb v databázi NCBI.

ID v databázi (NCBI)

AGR34025.1 ADK66818.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

Podobnost v aminokyselinové sekvenci s IgD vyjádřená v% 67% 67%

Na základě podobnosti viz. Tab. 9 – 12 je pravděpodobné, ţe celá sekvence imunoglobulinů C. carpio bude velmi podobná se sekvencemi imunoglobulinů M. amblycephala a C. idella. Předpokládáme, ţe imunoglobulin M má velikost přibliţně 1700 bp a imunoglobulin D 3000 bp.

80

6.2.1 PCR Amplifikace IgM/IgD C.carpio se zdařila. Velikost (IgM 1029 bp a IgD 422 bp) odpovídal očekávaným hodnotám. Byla zjištěna optimální teplota pro nasedání primerů

(„annealing temperature― – IgM: Ta - 60 °C, IgD: Ta - 60 °C).

Obr. 35: DNA elektroforéza s amplikony imunoglobulinů. 1% agarózový gel obarvený SYBR Green I). M: marker, 1: DNA IgD izolované z krve, 2: DNA IgM izolované z krve, 3: DNA IgD izolované ze sleziny, 4: DNA IgM izolované ze sleziny

81

6.2.2 Purifikace plazmidové DNA Koncentrace vzorků DNA izolovaných z gelu byly změřeny přístrojem NanoDrop

ND-8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies). Krev IgM (ng/μl) 54,14

Slezina IgD (ng/μl) 49,31

IgM (ng/μl) 44,00

IgD (ng/μl) 15,70

6.2.3 Analýza kolonií (transformantů) a rozbití buněk Z pořízené fotografie lze odvodit, ţe velikost získaných amplikonů se v případě IgM pohybovala okolo 1000 bp a u IgD přibliţně 500 bp, coţ odpovídá původním PCR produktům. Se vzorky v rámečku bylo pracováno dále při izolaci plazmidu.

Obr. 36: Výsledek kontrolní PCR na 1% agarózovém gelu. M: marker, IgM z krevního séra (č. klonů 1-8), IgD z krevního séra (č. klonů 1-8), IgM ze sleziny (č. klonů 1-8), IgD ze sleziny (č. klonů 1-8)

82

6.2.4 Izolace plazmidu Vyizolované plazmidy s DNA inzerty genů IgM/IgD byly změřeny přístrojem

NanoDrop ND - 8000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies). Krev IgM (ng/μl) 34,28 24,99 37,34 25,39 17,83

Slezina IgD (ng/μl) 49,81 63,21 54,63 12,35 87,11

IgM (ng/μl) 57,55 164,2 22,93 242,2 29,0

IgD (ng/μl) 15,06 17,65 37,45 20,62 60,86

6.2.5 Sekvenace Z výsledných sekvencí byla vytvořena konsenzuální (konzervovaná) sekvence pomocí programu Geneious. Vyuţitím dostupného online nástroje BLAST na internetových stránkách byla výsledná sekvence srovnána se sekvencemi z databáze.

Tab. 13: Získané sekvence imunoglobulinů IgM/IgD (C. carpio). Barevně jsou označeny forward a reverse primery.

IgM (1029 bp)

IgD (422 bp)

ATGGTCACTGTCTCGTCAGTTCAACCATCTGCACCAAAGTCAATCTTCGGCATGTCTCAGTGTACTT CTGATTCTGATGGGTTCCTCACCATCGGCTGCTTGGCAAGAGGTTTCTCACCTGCGGACTCGCTTAC ATTCAAATGGAAGGATTCTGATAAAAAAGAGTTGAGTGGTTTTGTGCAGTATCCGGCATTTGGACG GGATGGAGACTATAGCAAAATCAGCCATCTGCGCGTGAGGAAAAGTGATTGGGATGCTAAAAAAC CTTACAAATGCGAAGCTTCAAATTCTGAAGGCAGTAAAGAAACTACTCTTGTTCCATCACCCCCAC CGCCAGATCAGCATGCAGATGTGTACTTAACAGTACCTACAAAAATGGAGTTAGACAATGGAACA GCAACCTTCATGTGTTTAGCCCAGCGGTTTTCACCTAAAACATATGAGTTTAATTGGTATCAGGATG GTAAGGAGGTGACAGATGCAATAGACAAATATGACAAAAGTGAGAAGAAAGGCTCAGTAACCGA ATATAGTGCCACRAGCATTTTGCAAATCAGTGCCGACAAATGGAATCACCCAAACAACAAAATTAA GTGTGAGTTCGTGCACAAGACGGGAAAGAAAGTTATTGTGGCAGAATATGCAGTTCCTATTCAAGA TTGCACCAATATTGCTGTTGATATAGTGCCTCCCTCCCTTGAAGACATGCTGAAAAATAGACAAGG AGTGCTGAAGTGCAAAGCTTCAGCAGACAATTCAGGTTTCACCAAAATAAAAATAGAAGCGAATA ATAATATCATCGCTGAGGCAGCAATAACTGAAAACAAAAAAGTTGTGGAACTTGACGCCCCGATTG GCTATGAAGAATGGAGCAATGGAACCGAATTTACATGCACCGTTGAACACAAAGAGCTAGCAGAG CCCAAGGCAACTAAGTTCATCAGAGAAAATGGTAAAGAACCCAAGAGACCCTCTGTTTATATATTA GCACCCCCAGAGCACAAAGAGGGTGACAAGATGACCCTGACG ATGGAAGATGGACGTATGAAAGCATACAGTGAGATACTGGTGCCACAGCAAGAGTGGAATCAAGG GATCACTTACACCTGTCAGATAAATAACGGACACGATGGGAAAACTGCTGAGAAACGCACCAGTA TTTGCACAGTGATTGCGCCATCCAGTCAGCGGGCAGAGGTCTACCTAGTGGGTCCATCCCTCAGTA GTGTGAGATCTGAGACCTCTGTGAGTTTGACATGTTTGGTTGTTGGTCAGAGTGTCAAGTTGTTCTC CATTCAGTGGAAAGAGAATGGTATCGTTCACAATCCAAATGGCCATGAACAAGAGCCTAGAGATC ATAACAATGGGACTCAAAGCAAAGAAAGCATTTTGAAGGTTTCAGTTAGAGACTGGAATGCATAT GCTGTCTTTGCCTGTGAGGTTAAGCATCT

83

Tab. 14: Porovnání získané sekvence IgM/IgD se sekvencemi z databáze Vzorek

ID v databázi (NCBI)

IgM IgD

AB004108.1 AB774152.1

Podobnost se sekvencí z databáze 99% 99%

6.2.6 5´/3´RACE-PCR (rychlá amplifikace konců cDNA) Dle srovnání s celými sekvencemi dalších kaprovitých ryb bylo zjištěno, ţe ani u jednoho genu nemáme 5´ ani 3´ konec. Předpokládáme, ţe na 5´ konci genu IgM chybí 400 bp a na 3´ konci 350 bp, na 5´ konci genu IgD 1 500 bp a na 3´ konci 1 000 bp. 5´/3´ konce sekvencí imunoglobulinů byly hledány v transkriptomu a v genomu C. carpio, ale neznámou oblast v genu se nám nepodařilo najít, proto byla zvolena metoda RACE-PCR. Na konsenzuální sekvenci byly navrţeny primery pro provedení 5´/3´ RACE-PCR. Optimální teplota pro nasedání primerů (IgM SP: Ta – 57 °C, IgM SP1: Ta – 55 °C, IgM SP2: Ta - 56 °C, IgM SP3: Ta - 56 °C, IgD SP: Ta - 59 °C, IgD SP1: Ta - 57°C, IgD SP2: Ta - 57 °C, IgD SP3: Ta - 56 °C). Tab. 15: Získaná sekvence IgM/IgD (C. carpio). Barevně označené primery pouţité na 5´/3´ RACE PCR (zeleně – reverse primery na 5´ RACE, červeně – forward primery na 3´RACE).

IgM (1029 bp)

IgD (422 bp)

ATGGTCACTGTCTCGTCAGTTCAACCATCTGCACCAAAGTCAATCTTCGGCATGTCTCAGTGTACTTCTG ATTCTGATGGGTTCCTCACCATCGGCTGCTTGGCAAGAGGTTTCTCACCTGCGGACTCGCTTACATTCAA ATGGAAGGATTCTGATAAAAAAGAGTTGAGTGGTTTTGTGCAGTATCCGGCATTTGGACGGGATGGAG ACTATAGCAAAATCAGCCATCTGCGCGTGAGGAAAAGTGATTGGGATGCTAAAAAACCTTACAAATGC GAAGCTTCAAATTCTGAAGGCAGTAAAGAAACTACTCTTGTTCCATCACCCCCACCGCCAGATCAGCAT GCAGATGTGTACTTAACAGTACCTACAAAAATGGAGTTAGACAATGGAACAGCAACCTTCATGTGTTT AGCCCAGCGGTTTTCACCTAAAACATATGAGTTTAATTGGTATCAGGATGGTAAGGAGGTGACAGATG CAATAGACAAATATGACAAAAGTGAGAAGAAAGGCTCAGTAACCGAATATAGTGCCACRAGCATTTTG CAAATCAGTGCCGACAAATGGAATCACCCAAACAACAAAATTAAGTGTGAGTTCGTGCACAAGACGGG AAAGAAAGTTATTGTGGCAGAATATGCAGTTCCTATTCAAGATTGCACCAATATTGCTGTTGATATAGT GCCTCCCTCCCTTGAAGACATGCTGAAAAATAGACAAGGAGTGCTGAAGTGCAAAGCTTCAGCAGACA ATTCAGGTTTCACCAAAATAAAAATAGAAGCGAATAATAATATCATCGCTGAGGCAGCAATAACTGAA AACAAAAAAGTTGTGGAACTTGACGCCCCGATTGGCTATGAAGAATGGAGCAATGGAACCGAATTTAC ATGCACCGTTGAACACAAAGAGCTAGCAGAGCCCAAGGCAACTAAGTTCATCAGAGAAAATGGTAAA GAACCCAAGAGACCCTCTGTTTATATATTAGCACCCCCAGAGCACAAAGAGGGTGACAAGATGACCCT GACG ATGGAAGATGGACGTATGAAAGCATACAGTGAGATACTGGTGCCACAGCAAGAGTGGAATCAAGGGA TCACTTACACCTGTCAGATAAATAACGGACACGATGGGAAAACTGCTGAGAAACGCACCAGTATTTGC ACAGTGATTGCGCCATCCAGTCAGCGGGCAGAGGTCTACCTAGTGGGTCCATCCCTCAGTAGTGTGAG ATCTGAGACCTCTGTGAGTTTGACATGTTTGGTTGTTGGTCAGAGTGTCAAGTTGTTCTCCATTCAGTGG AAAGAGAATGGTATCGTTCACAATCCAAATGGCCATGAACAAGAGCCTAGAGATCATAACAATGGGAC TCAAAGCAAAGAAAGCATTTTGAAGGTTTCAGTTAGAGACTGGAATGCATATGCTGTCTTTGCCTGTGA GGTTAAGCATCT

84

6.2.6.1 5´RACE-PCR Amplifikace 5´ konců DNA probíhala stejně jako amplifikace částečných genů imunoglobulinů.

Z výsledných

sekvencí

byla

opět

vytvořena

konsenzuální

(konzervovaná) sekvence. 5´ konec IgD se nepodařilo získat, délka řetězce neodpovídala předpokládané velikosti. Obr. 37: 5´RACE-PCR, zobrazení 5´ konců imunoglobulinů pomocí agarózové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR Green I). M: marker, 1: 5´ konec cDNA IgM, 2: 5´ konec cDNA IgD

Tab. 16: Získaná sekvence 5´ konce imunoglobulinu M (C. carpio). IgM (372bp) dosekvenovaný 5´konec

ATGTTACTGTATGGACTCCTGGTGATTATTTCATCTGTCAGTGGTCAGTCTTTGACCT CCTCAGATTCTGTGGTGAAAAAGCCTGGAGAATCAGTGACTCTGTCCTGCACTGGG TCTGGATTCTTAGTAGGCACCTCTTACATGCACTGGATCTATCAGAAACCAGGGAA AGGACTGGAGTGGATTGGACGTATTGACCCTGGCTCTGGCACTCTTTTTGCTCAGTC TCTACAGGGCCAGTTCTCCATCACAAAAGACACAAATAAAAACATGCTGTATTTAG AGGTGAAAAGCCTGGGGACTGAAGACACAGCTGTTTATTACTGTGCACGGCAATAC RACCATGCTTTTGACTACTGGGGGAAAGGAACC

85

6.2.6.2 3´RACE-PCR Amplifikace 3´ konců DNA a tvorba konsenzuální sekvence probíhala opět stejným způsobem. 3´ konec IgD se nepodařilo opět získat.

Obr. 38: 3´RACE-PCR, zobrazení DNA 3´ konců imunoglobulinů pomocí agarózové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR Green I). M: marker, 1: 3 konec cDNA IgM, 2: 3 konec cDNA IgD

Tab. 17: Získaná sekvence 3´ konce imunoglobulinu M (C. carpio). IgM (300 bp) Dosekvenovaný 3´ konec

TGTTATGTGAAGGACTTCTACCCCAAAGAGGTGTTTGTGTCTTGGCTTGCTGATGAT GAACCTGTGACTTCTAAATACAGCACTAGCCTGCCAATTCAGAAAGATCAAACCTT CTCAGTCTACAGTCAGCTAACAGTTAATGATTCCAAGTGGACGAATGGTACAGTGT TCAGTTGTGTCGTGTATCACGAAGCCATTGATGAAAAAATGCGCGTACTGACAAGA TCTATTACTGATAATATTGAAAAGGCAGGAGTAATTAATTTAAGTATGAATACCCCT GCATTTTGCAAGCCCTAG

86

6.2.7 Kompletní sekvence IgM Po sloţení 5´/3´ konců na částečnou sekvenci imunoglobulinu M jsme dostali výslednou sekvenci celého genu s počtem 1 701 bp (Tab.18). Její podobnost s dalšími druhy kaprovitých ryb je uvedena v (Tab. 21-22).

Tab. 18: Výsledná nukleotidová sekvence imunoglobulinu M.

IgM (1 701 bp)

ATGTTACTGTATGGACTCCTGGTGATTATTTCATCTGTCAGTGGTCAGTCTTTGACCT CCTCAGATTCTGTGGTGAAAAAGCCTGGAGAATCAGTGACTCTGTCCTGCACTGGG TCTGGATTCTTAGTAGGCACCTCTTACATGCACTGGATCTATCAGAAACCAGGGAA AGGACTGGAGTGGATTGGACGTATTGACCCTGGCTCTGGCACTCTTTTTGCTCAGTC TCTACAGGGCCAGTTCTCCATCACAAAAGACACAAATAAAAACATGCTGTATTTAG AGGTGAAAAGCCTGGGGACTGAAGACACAGCTGTTTATTACTGTGCACGGCAATAC RACCATGCTTTTGACTACTGGGGGAAAGGAACCATGGTCACTGTCTCGTCAGTTCAA CCATCTGCACCAAAGTCAATCTTCGGCATGTCTCAGTGTACTTCTGATTCTGATGGG TTCCTCACCATCGGCTGCTTGGCAAGAGGTTTCTCACCTGCGGACTCGCTTACATTC AAATGGAAGGATTCTGATAAAAAAGAGTTGAGTGGTTTTGTGCAGTATCCGGCATT TGGACGGGATGGAGACTATAGCAAAATCAGCCATCTGCGCGTGAGGAAAAGTGATT GGGATGCTAAAAAACCTTACAAATGCGAAGCTTCAAATTCTGAAGGCAGTAAAGAA ACTACTCTTGTTCCATCACCCCCACCGCCAGATCAGCATGCAGATGTGTACTTAACA GTACCTACAAAAATGGAGTTAGACAATGGAACAGCAACCTTCATGTGTTTAGCCCA GCGGTTTTCACCTAAAACATATGAGTTTAATTGGTATCAGGATGGTAAGGAGGTGA CAGATGCAATAGACAAATATGACAAAAGTGAGAAGAAAGGCTCAGTAACCGAATA TAGTGCCACRAGCATTTTGCAAATCAGTGCCGACAAATGGAATCACCCAAACAACA AAATTAAGTGTGAGTTCGTGCACAAGACGGGAAAGAAAGTTATTGTGGCAGAATAT GCAGTTCCTATTCAAGATTGCACCAATATTGCTGTTGATATAGTGCCTCCCTCCCTT GAAGACATGCTGAAAAATAGACAAGGAGTGCTGAAGTGCAAAGCTTCAGCAGACA ATTCAGGTTTCACCAAAATAAAAATAGAAGCGAATAATAATATCATCGCTGAGGCA GCAATAACTGAAAACAAAAAAGTTGTGGAACTTGACGCCCCGATTGGCTATGAAGA ATGGAGCAATGGAACCGAATTTACATGCACCGTTGAACACAAAGAGCTAGCAGAG CCCAAGGCAACTAAGTTCATCAGAGAAAATGGTAAAGAACCCAAGAGACCCTCTGT TTATATATTAGCACCCCCAGAGCACAAAGAGGGTGACAAGATGACCCTGACGTGTT ATGTGAAGGACTTCTACCCCAAAGAGGTGTTTGTGTCTTGGCTTGCTGATGATGAAC CTGTGACTTCTAAATACAGCACTAGCCTGCCAATTCAGAAAGATCAAACCTTCTCAG TCTACAGTCAGCTAACAGTTAATGATTCCAAGTGGACGAATGGTACAGTGTTCAGTT GTGTCGTGTATCACGAAGCCATTGATGAAAAAATGCGCGTACTGACAAGATCTATT ACTGATAATATTGAAAAGGCAGGAGTAATTAATTTAAGTATGAATACCCCTGCATT TTGCAAGCCCTAG

Tab. 19: Výsledná aminokyselinová sekvence imunoglobulinu M.

IgM (567 aminokyselin)

MLLYGLLVIISSVSGQSLTSSDSVVKKPGESVTLSCTGSGFLVGTSYMHWIYQKPG KGLEWIGRIDPGSGTLFAQSLQGQFSITKDTNKNMLYLEVKSLGTEDTAVYYCAR QYXHAFDYWGKGTMVTVSSVQPSAPKSIFGMSQCTSDSDGFLTIGCLARGFSPAD SLTFKWKDSDKKELSGFVQYPAFGRDGDYSKISHLRVRKSDWDAKKPYKCEASN SEGSKETTLVPSPPPPDQHADVYLTVPTKMELDNGTATFMCLAQRFSPKTYEFNW YQDGKEVTDAIDKYDKSEKKGSVTEYSAXSILQISADKWNHPNNKIKCEFVHKTG KKVIVAEYAVPIQDCTNIAVDIVPPSLEDMLKNRQGVLKCKASADNSGFTKIKIEA NNNIIAEAAITENKKVVELDAPIGYEEWSNGTEFTCTVEHKELAEPKATKFIRENG KEPKRPSVYILAPPEHKEGDKMTLTCYVKDFYPKEVFVSWLADDEPVTSKYSTSL PIQKDQTFSVYSQLTVNDSKWTNGTVFSCVVYHEAIDEKMRVLTRSITDNIEKAG VINLSMNTPAFCKP-

87

Nakonec byl pomocí internetových nástrojů z portálu ExPASy (www.expasy.org) odhadnut předpokládaný izoelektrický bod a molekulová hmotnost imunoglobulinu M (Tab. 19), kterou jsme předpokládali dle Veselý et al. (2006) okolo 70 kDa.

Tab. 20: Teoretická hmotnost a pI proteinu. Protein IgM

Teoretická molekulová hmotnost 62,9 kDa

Izoelektrický bod 6,21

Tab. 21: Porovnání nukleotidové konsenzuální sekvence kaprovitých ryb se sekvencí IgM C. carpio v databázi NCBI. ID v databázi (NCBI) KC894945.1 DQ417927.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

imunoglobulinů u

Podobnost v nukleotidové sekvenci s IgM vyjádřená v% 85% 82%

Tab. 22: Porovnání aminokyselinové konsenzuální sekvence imunoglobulinu IgM C. carpio s imunoglobuliny kaprovitých ryb v databázi NCBI.

ID v databázi (NCBI)

AGR34023.1 ABD76396.1

Druh ryby Megalobrama amblycephala Ctenopharyngodon idella

88

Podobnost v aminokyselinové sekvenci s IgM vyjádřená v% 64% 65%

7 Diskuze Prvním cílem této diplomové práce byla charakterizace imunitní odpovědi C. carpio proti ektoparazitovi E. nipponicum pomocí základních immuno-biochemických metod. Pro tyto účely byly vyuţity ES produkty a homogenát získaný z dospělých červů E. nipponicum přirozeně infikovaných kaprů. Ke sledování hladiny leukocytů byl proveden krevní roztěr obarven roztokem Giemsy-Romanowskeho (1:9 barviva Giemsa-Romanowski a dH2O). U všech krevních rozměrů bylo vypočteno procentuální zastoupení – lymfocytů, granulocytů a monocytů. Pro stanovení celkové koncentrace imunoglobulinů se osvědčila starší, ale jednoduchá precipitační metoda. Během tohoto výzkumu byla metodou sráţení síranem zinečnatým měřena celková koncentrace protilátek v krvi kapra. Výsledné hodnoty neposkytly ţádné informace o specifické imunitě proti parazitům, pouze o aktuálním imunologickém stavu ryb, který můţe být ovlivněn spoustou faktorů jako teplota vody nebo znečištění okolního prostředí (Magnadóttir 2006). Např. nízká teplota vody působí imunosupresivně (Le Morvan, Troutaud and Deschaux 1998). Avtalion (1969) píše, ţe ryby v prostředí s teplotou niţší neţ 14 °C zastavují produkci protilátek. Získaná data byla velmi variabilní, proto byly všechny hodnoty vyhodnoceny také statisticky, aby byla zvýšena výpovědní hodnota. Naměřené koncentrace protilátek byly porovnány s procentuálním zastoupením leukocytů na krevním roztěru, z kterých se nejvíce podílejí na imunitní odpovědi granulocyty a monocyty. Obecně zmnoţení granulocytů úzce souvisí s reakcí krvetvorby ryb na různé patogeny a s protiinfekční obranou. Kromě toho funkcí monocytů je fagocytóza a vyvolání zánětlivé odpovědi k eliminaci cizorodých mikroorganismů (Klontz 1994, Svobodová et al. 2012). Byl vypočten poměrový koeficient mezi koncentrací imunoglobulinů a procentuálním zastoupením leukocytů. Niţší hodnoty koeficientu vyjadřují vyšší imunitní odpověď spojenou se zvýšenou hladinou imunoglobulinů i leukocytů, naopak hodnoty vysoké určují výraznou rozdílnost mezi těmito parametry. Z vypočítaných poměrových koeficientů se ukázalo, ţe hladina imunoglobulinů a počet buněk se mění nezávisle, tedy zvýšená hodnota imunoglobulinů v séru ryb vůbec nesouvisí s počtem granulocytů a monocytů.

Ke zjištění imunitní odpovědi kapra jsme vyuţili metodu ELISA a Western blot. Obě metody byly prováděny s komerčně dostupnými sekundárními protilátkami proti kapřímu IgM značenými křenovou peroxidázou od firmy Aquatic Diagnostics, která jako 89

jedna z mála tyto protilátky nabízí. Jako primární protilátky byly vyuţity pozitivní i negativní kapří séra. Po optimalizaci metody ELISA, kdy byla zvýšena teplota inkubace protilátek ředěných v PBS-T + 1% BSA na 37 °C, jsme dosáhli zajímavých výsledků (Kořínková et al. 2008). Krevní séra pocházející z infikovaných kaprů dosahovaly vyšší absorbance neţ séra od neinfikovaných ryb, coţ odpovídá pracím Buchmann (1999), Vladimirov (1971), Scott and Anderson (1984), i kdyţ tito autoři experimentovali s jinými druhy monogenei. Hodnoty získané s antigeny o různé koncentraci nebyly rozdílné u homogenátu E. nipponicum a ani u jeho ES produktů s pozitivními séry. Naproti tomu mezi pozitivními a negativními séry s tímto různým mnoţstvím antigenů byly rozdíly zaznamenány. Při ředění primární protilátky v různých poměrech (1:100, 1:50, 1:10, 1:5) u stejného séra výrazné rozdíly zaznamenány nebyly, ale mezi pozitivními a negativními séry byl rozdíl zřetelný. S vyuţitím metody Western blot byl homogenát a ES produkty separovány pomocí polyakrylamidové elektroforézy (SDS-PAGE). Poté byl gel přeblotován na membránu a následovala fáze inkubace, kdy se membrána nastříhala a nechala inkubovat v přítomnosti specifických protilátek. Buchmann (1993) touto metodou potvrdil imunitní odpověď Anguilla anguilla proti Pseudogyrodactylus bini. V našich experimentech se ukázalo, ţe proteinové prouţky, které jsme očekávali ve velikosti těţkého řetězce IgM okolo 70 kDa se neobjevily. Pouze u jednoho pozitivního vzorku v reakci s homogenátem E. nipponicum byl zaznamenán pruh o velikosti cca 20 kDa, který se shoduje s prací Buchamann (1993),

který zaznamenal

18

odlišných antigenů

produkovaných

Pseudogyrodactylus bini v rozmezí 20 – 94 kDa. V druhé části mé diplomové práce jsme se pokusili o přípravu rekombinantních forem kapřích IgM/IgD, které by byly následně pouţity pro generování polyklonálních

protilátek. Řídili jsme se postupem z prací Feng et al. (2009), Hordvik et al. (2002), Pilstrom and Bengtén (1996). V databázi NCBI byly nalezeny sekvence těchto imunoglobulinů, na které byly navrţeny primery. Produkty PCR o poţadované velikosti byly ligovány do vektoru pJET1.2/blunt a vzniklé konstrukty byly následně transdukovány do kompetentních bakteriálních buněk E. coli kmene XL-1 Blue. Tyto geny byly amplifikovány pomocí PCR a osekvenovány na šesnáctikapilárním přístroji 3130xI Genetic Analyzer 2010. Výsledné sekvence byly zpracovány na konsenzuální sekvenci v programu Geneious. Podobnost s původní sekvencí z databáze u obou genů činila 99%, to mohlo být způsobeno chybou při sekvenování nebo přirozeným 90

polymorfizmem C. carpio. Po srovnání sekvencí s dalšími kaprovitými druhy jsme zjistili, ţe naše geny imunoglobulinů jsou pouze částečné a chybí 5´ i 3´ konec nukleotidových sekvencí, proto jsme vyuţili k dosekvenování obou konců metodu RACE-PCR, které vyuţil i Nakao et al. (1998) a Feng et al. (2009). Podstatou 5´RACE-PCR je přepis z mRNA do cDNA pomocí genově specifického reverzního primeru SP1. Pomocí genově specifického primeru SP2 a oligo dN primeru s adaptorem je provedena první PCR a druhá PCR se provádí s primerem komplementárním k adaptoru a genově specifického primeru SP3. Amplifikované DNA byly následně transformována v E. Coli a izolovaný plazmid byl sekvenován. Podařilo se získat 5´ konec sekvence pouze u imunoglobulinu M, zpracování bylo provedeno stejně jako u částečných genů a výsledná sekvence dosahovala délky 372 bp. 3´-RACE vyuţívá přirozeného poly(A)-konce na mRNA. Nejprve se syntetizuje cDNA reverzní transkripcí z mRNA s primerem, který má na konci umístěn adaptor. Při následné PCR amplifikaci byl pouţit genově specifický forward primer a primer komplementární k adaptoru. DNA byla zpracována opět stejným způsobem, ale sekvenaci se podařilo získat pouze u IgM s délkou 300 bp. Příčinou neschopnosti získat neznámé 5´/3´ konce IgD mohlo být přetrvávající nasedání primerů na sekvenci jiného genu. Předpokládaná délka IgM po srovnání se sekvencemi kaprovitých ryb, kde podobnost genů přesahovala 80% byla 1700 bp. Tato délka není pravděpodobně správná neboť 1700 není číslo dělitelné třemi a na základě takové sekvence nemůţe být syntetizován odpovídající protein. Na druhou stranu námi získaná sekvence o délce 1701 bp, která přeloţením poskytuje smysluplný otevřený čtecí rámec (567 aminokyselin) se jeví jako smysluplná. Molekulová hmotnost našeho osekvenovaného imunoglobulinu M je 62,9 kDa. Je zde zajímavý rozdíl v této velikosti s publikovanými daty Veselý et. al (2006), který uvádí velikost těţkého řetězce 70kDa a lehkého řetězce 25 kDa. Publikace můţe být zatíţena chybou nebo v mém měření nastala chyba sekvenace. Prezentované výsledky v této práci popisují imunitní odpověď C. carpio proti ektoparazitární nákaze E. nipponicum pomocí imunochemických metod a charakteristiku protilátek s vyuţitím metod molekulárních.

91

8 Závěr Tato práce se zabývá charakterizací protilátkové odpovědi C.carpio proti antigenům z extraktů E. nipponicum s vyuţitím biochemických

a imunodetekčních

metod. Druhá část byla zaměřena na přípravu sekundární protilátky anti-Carp IgM/IgD. Pro přehlednost jsou výsledky shrnuty do následujících bodů:



Byly spočítány hodnoty leukocytů na krevních roztěrech, kdy některé ryby vykazovaly zvýšenou imunitní odpověď, která mohla být způsobena parazitární infekcí nebo také nespecifickými vlivy jako je teplota, či stresové faktory způsobené výlovem a uchováním kaprů v nádrţi.



Vyuţitím metody sráţení síranem zinečnatým byla stanovena celková hladina imunoglobulinů v pozitivních i negativních sérech kapra. Na základě výsledků nelze jednoznačně potvrdit imunitní odpověď proti E. nipponicum.



Antigenní vlastnosti ES produktů a homogenátu E. nipponicum nebyly potvrzeny metodou Western blot, naopak metoda ELISA vykazovala zvýšenou absorbanci u infikovaných kaprů.



Částečná sekvence IgM i IgD získaná z databází byla porovnána s dalšími imunoglobuliny kaprovitých ryb, kdy bylo zjištěno, ţe nejvyšší podobnost mají s M. amblycephala a C. idella z čeledi kaprovitých. DNA byla amplifikována metodou PCR.



Pomocí metody 5´/3´ RACE PCR se podařilo osekvenovat neznámé části IgM C. carpio. U IgD byla tato snaha neúspěšná.

92

9 Použitá literatura Ainsworth, A. J. (1992) Fish granulocytes: morphology, distribution, and function. Annual Review of Fish Diseases, 2, 123-148. Alvarez-Pellitero, P. (2008) Fish immunity and parasite infections: from innate immunity to immunoprophylactic prospects. Veterinary immunology and immunopathology, 126, 171-198. Amin, A. & L. Mortensen (1992) Blood and Lymph. AB AMIN, L. MORTENSEN und TT POPPE: Histology Atlas. Verlag Akvapatologisk Laboratorium AS, Bodo-Norway, 84-93. Aydogdu, A. & F. N. Altunel (2002) Helminth parasites (Plathelminthes) of common carp (Cyprinus carpio L.) in Iznik Lake. B Eur Assoc Fish Pat, 22, 343-348. Bagge, A. & E. Valtonen (1999) Development of monogenean communities on the gills of roach fry (Rutilus rutilus). Parasitology, 118, 479-487. Bartůňková, J. & V. Hořejší. 2009. Základy imunologie. Praha, Triton. Billard, R. 1999. The Carp: Biology and Culture. Springer. Bowden, T. J. (2008) Modulation of the immune system of fish by their environment. Fish & Shellfish Immunology, 25, 373-383. Buchmann, K. (1999) Immune mechanisms in fish skin against monogeneans-a model. Folia Parasitologica, 46, 1-8. Buchmann, K. & J. Bresciani (2006) Monogenea (Phylum Platyhelminthes). Fish diseases and disorders, 1, 297-344. Campbell, T. W. & C. K. Ellis. 2013. Avian and exotic animal hematology and cytology. John Wiley & Sons. Clem, L. & P. Small (1967) Phylogeny of immunoglobulin structure and function I. Immunoglobulins of the lemon shark. The Journal of experimental medicine, 125, 893920. Crowther, J. R. 2000. The ELISA guidebook. Springer. Danilova, N., J. Bussmann, K. Jekosch & L. A. Steiner (2005) The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology, 6, 295-302. Du Pasquier, L. & J. Schwager. 1989. Evolutions of the immune system. In Progress in Immunology, 1246-1255. Springer.

93

Du Plessis, S. (1948) A gyrodactyloid parasite from the ureters of largemouth bass at the Jonkershoek Inland Fish Hatchery, South Africa. Transactions of the American Fisheries Society, 75, 105-109. Dupouy-Camet, J. & K. D. Murrell. 2007. FAO/WHO/OIE guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. Food & Agriculture Org. Dvořáková, H., M. Kašný, L. Jedličková, K. Skipalová, J. Ilgová, E. Dzika, B. Koubková, M. Gelnar & L. Mikeš (2013) Bioactive molecules of the blood-feeding monogenean Eudiplozoon nipponicum. Dzik, J. M. (2006) Molecules released by helminth parasites involved in host colonization. Acta Biochimica Polonica, 53, 33-64. Ebert, D. & E. A. Herre (1996) The evolution of parasitic diseases. Parasitology today, 12, 96-101. Ergens, R. (1988) Four species of the genus Annulotrema Paperna and Thurston, 1969 (Monogenea: Ancyrocephalinae) from Egyptian freshwater fish. Folia Parasitol, 35, 209215. Ferenčík, M. 2005. Imunitní systém: informace pro každého. Grada Publishing as. Fichtelius, K., J. Finstad & R. Good. 1968. Bursa equivalents of bursaless vertebrates. In Laboratory Investigation, 339-&. Fischer, S. A. & W. E. Kelso (1990) Parasite fauna development in juvenile bluegills and largemouth bass. Transactions of the American Fisheries Society, 119, 877-884. Flajšhans, M. & G. Hulata (2006) Common carp-Cyprinus carpio. Genimpact final scientific report. Available from URL: http://genimpact. imr. no/__data/page/7650/common_carp. pdf. Gregory, R. (1990) Parasites and host geographic range as illustrated by waterfowl. Functional Ecology, 645-654. Halton, D. W., A. G. Maule, G. R. Mair & C. Shaw (1998) Monogenean neuromusculature: some structural and functional correlates. International journal for parasitology, 28, 1609-1623. Hansen, J. D., E. D. Landis & R. B. Phillips (2005) Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: Implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 6919-6924. Hart, S., A. Wrathmell, J. Harris & T. Grayson (1988) Gut immunology in fish: a review. Developmental & Comparative Immunology, 12, 453-480. 94

Hine, P. (1992) The granulocytes of fish. Fish & Shellfish Immunology, 2, 79-98. Hirazawa, N., N. Umeda, A. Hatanaka & A. Kuroda (2006) Characterization of serine proteases in the monogenean Neobenedenia girellae. Aquaculture, 255, 188-195. Hirono, I., B.-H. Nam, J. Enomoto, K. Uchino & T. Aoki (2003) Cloning and characterisation of a cDNA encoding Japanese flounder Paralichthys olivaceus IgD. Fish & shellfish immunology, 15, 63-70. Hitzfeld, B. 2005. Fish Immune Immunotoxicology, 242-245. Springer.

System.

In

Encyclopedic

Reference

of

Hoar, W. S., D. J. Randall, G. Iwama & T. Nakanishi. 1997. The fish immune system: organism, pathogen, and environment. Academic Press. Hodová, I., I. Matejusova & M. Gelnar (2010) The surface topography of Eudiplozoon nipponicum (Monogenea) developmental stages parasitizing carp (Cyprinus carpio L.). Central European Journal of Biology, 5, 702-709. Hrubec, T. & S. Smith (2000) Hematology of fish. Schalm's veterinary hematology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 1120-1125. Jansen, P. & T. Bakke (1991) Temperature-dependent reproduction and survival of Gyrodactylus salaris Malmberg, 1957 (Platyhelminthes: Monogenea) on Atlantic salmon (Salmo salar L.). Parasitology, 102, 105-112. Kaattari, S. & J. Piganelli. 1996. The specific immune system: Humoral defense, Iwama G., Nakanishi T., The Fish Immune System: Organism, Pathogen, and Environment, 1996, 207-254. Academic Press, San Diego. Kachamakova, N. M., I. Irnazarow, H. K. Parmentier, H. F. Savelkoul, A. Pilarczyk & G. F. Wiegertjes (2006) Genetic differences in natural antibody levels in common carp (Cyprinus carpio L.). Fish & shellfish immunology, 21, 404-413. Kearn, G. (1994) Evolutionary expansion of the Monogenea. International journal for parasitology, 24, 1227-1271. Kindt, T. J., R. A. Goldsby, B. A. Osborne & J. Kuby. 2007. Kuby immunology. Macmillan. Klontz, G. (1994) Fish hematology. Techniques in fish immunology, 3, 121-131. Kořínková, K., K. Kovařčík, Z. Pavlíčková, M. Svoboda & B. Koudela (2008) Serological detection of Trichinella spiralis in swine by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) using an excretory–secretory (E/S) antigen. Parasitology research, 102, 1317-1320. Krejsek, J. & O. Kopecký. 2004. Klinická imunologie. NUCLEUS HK.

95

Lamková, K., A. Šimková, M. Palíková, P. Jurajda & A. Lojek (2007) Seasonal changes of immunocompetence and parasitism in chub (Leuciscus cephalus), a freshwater cyprinid fish. Parasitology Research, 101, 775-789. Le Morvan, C., D. Troutaud & P. Deschaux (1998) Differential effects of temperature on specific and nonspecific immune defences in fish. The Journal of experimental biology, 201, 165-168. Lefebvre, F., B. Mounaix, G. Poizat & A. Crivelli (2004) Impacts of the swimbladder nematode Anguillicola crassus on Anguilla anguilla: variations in liver and spleen masses. Journal of Fish Biology, 64, 435-447. Lipský, Z. 1998. Krajinná ekologie pro studenty geografických oborů. Karolinum. Lucas, A. M. & C. Jamroz (1961) Atlas of avian hematology. Atlas of Avian Hematology. Luskova, V. (1998) Factors affecting hematological indices in free-living fish populations. Acta Veterinaria Brno, 67, 249-None. MacArthur, R. H. 1967. The theory of island biogeography. Princeton University Press. Magnadóttir, B. (2006) Innate immunity of fish (overview). Fish & shellfish immunology, 20, 137-151. Mix, E., R. Goertsches & U. K. Zett (2006) Immunoglobulins—basic considerations. Journal of neurology, 253, v9-v17. Paperna, I. (1963) Enterogyrus cichlidarum n. gen. n. sp., a monogenetic trematode parasitic in the intestine of a fish. Bulletin of the Research Council of Israel B, 11, 183187. Pecka, M., M. Bláha, I. Fátorová, J. Kratochvíl, P. Měřička, E. Pešková, P. Sadílek, M. Váchová & D. V. F. Vokurková (2010) Praktická hematologie. Laboratorní metody. Český Těšín: Infiniti art. Pilstrom, L. & E. Bengtén (1996) Immunoglobulin in fish—genes, expression and structure. Fish & Shellfish Immunology, 6, 243-262. Press, C. M. & Ø. Evensen (1999) The morphology of the immune system in teleost fishes. Fish & Shellfish Immunology, 9, 309-318. Ranzani-Paiva, M., E. Rodrigues, M. Veiga, A. Eiras & B. Campos (2003) Differential leucokocyte counts in''dourado'', Salminus maxillosus Valenciennes, 1840, from the Mogi-Guaçu River, Pirassununga, SP. Brazilian Journal of Biology, 63, 517-525. Rao, Y.-z. & T.-b. Yang (2007) cDNA cloning, mRNA expression and recombinant expression of a cathepsin L-like cysteine protease from Neobenedenia melleni (Monogenea: Capsalidae). Aquaculture, 269, 41-53.

96

Roberts, L., J. Janovy, G. Schmidt & S. Larry. 2009. Roberts’ Foundations of Parasitology. McGraw-Hill. Roberts, R. J. 2012. Fish pathology. John Wiley & Sons. Rohlenová, K., S. Morand, P. Hyršl, S. Tolarová, M. Flajšhans & A. Šimková (2011) Are fish immune systems really affected by parasites? An immunoecological study of common carp (Cyprinus carpio). Parasit Vectors, 4, 120. Saha, N., T. Usami & Y. Suzuki (2002) Seasonal changes in the immune activities of common carp (Cyprinus carpio). Fish Physiology and Biochemistry, 26, 379-387. Savan, R., A. Aman, K. Sato, R. Yamaguchi & M. Sakai (2005) Discovery of a new class of immunoglobulin heavy chain from fugu. European journal of immunology, 35, 33203331. Secombes, C. & L. Chappell (1996) Fish immune responses to experimental and natural infection with helminth parasites. Annual Review of Fish Diseases, 6, 167-177. Secombes, C. J. (1997) The nonspecific immune system: cellular defenses. The fish immune system: organism, pathogen, and environment, 15, 63. Svobodová, Z., J. Paláčková & D. Pravda. 1986. Jednotné metody hematologického vyšetřování ryb. Výzkum. ústav rybářský a hydrobiologický. Šimková, A., T. Lafond, M. Ondračková, P. Jurajda, E. Ottová & S. Morand (2008) Parasitism, life history traits and immune defence in cyprinid fish from Central Europe. BMC Evolutionary Biology, 8, 29. Šimková, A., O. Verneau, M. Gelnar & S. Morand (2006) Specificity and specialization of congeneric monogeneans parasitizing cyprinid fish. Evolution, 60, 1023-1037. Takeuchi, T., S. Satoh & V. Kiron (2002) Common carp, Cyprinus carpio. Nutrient Requirements and Feeding of Finfish for Aquaculture, 245-261. Tavares-Dias, M., E. G. Affonso, S. R. Oliveira, J. L. Marcon & M. I. Egami (2008) Comparative study on hematological parameters of farmed matrinxã, Brycon amazonicus Spix and Agassiz, 1829 (Characidae: Bryconinae) with others Bryconinae species. Acta amazônica, 38, 799-805. Tavares-Dias, M., A. M. d. C. Monteiro, E. G. Affonso & K. D. S. Amaral (2011) Weight-length relationship, condition factor and blood parameters of farmed Cichla temensis Humboldt, 1821 (Cichlidae) in central Amazon. Neotropical Ichthyology, 9, 113-119. Toman, M. 2000. Veterinární imunologie. Grada. Tort, L., J. Balasch & S. Mackenzie (2003) Fish immune system. A crossroads between innate and adaptive responses. Inmunología, 22, 277-286. 97

Tripathi, N. K., K. S. Latimer & V. V. Burnley (2004) Hematologic reference intervals for koi (Cyprinus carpio), including blood cell morphology, cytochemistry, and ultrastructure. Veterinary Clinical Pathology, 33, 74-83. Turner, R. J., M. J. Manning, J. P. Métraux & D. A. Millar. 1994. Immunology: a comparative approach. John Wiley & Sons Ltd. Valigurová, A., I. Hodová, R. Sonnek, B. Koubková & M. Gelnar (2011) Eudiplozoon nipponicum in focus: monogenean exhibiting a highly specialized adaptation for ectoparasitic lifestyle. Parasitology research, 108, 383-394. Vandeputte, M. (2003) Selective breeding of quantitative traits in the common carp (Cyprinus carpio): a review. Aquatic Living Resources, 16, 399-407. Verity, C., A. Loukas, D. McManus & P. Brindley (2001) Schistosoma japonicum cathepsin D aspartic protease cleaves human IgG and other serum components. Parasitology, 122, 415-421. Vesely, T., S. Reschova, D. Pokorova, J. Hulova & Z. Nevorankova (2006) Production of monoclonal antibodies against immunoglobulin heavy chain in common carp (Cyprinus carpio L.). VETERINARNI MEDICINA-PRAHA-, 51, 296. Volf, P. & P. Horák. 2007. Paraziti a jejich biologie. Triton. Whittington, I. D. (2005) Monogenea Monopisthocotylea (ectoparasitic flukes). Whyte, S. K. (2007) The innate immune response of finfish–a review of current knowledge. Fish & shellfish immunology, 23, 1127-1151. Williams, A. E. (2011) Immunity to Parasites. Immunology: Mucosal and Body Surface Defences, 278-301. Zapata, A. G., A. Chibá & A. Varas (1997) 1 Cells and Tissues of the Immune System of Fish. Fish physiology, 15, 1-62. Zurawski, T., G. Mair, A. Maule, M. Gelnar & D. Halton (2003) Microscopical evaluation of neural connectivity between paired stages of Eudiplozoon nipponicum (Monogenea: Diplozoidae). Journal of Parasitology, 89, 198-200.

10 Internetové zdroje URL 1 http://www.rybarstvi.eu/ URL 2 http://news.thomasnet.com/fullstory/Membrane-Sandwiches-make-westernblotting-easier-13151

98

99