Identifikasi Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) Pada Oosit Sapi Yang Dimaturasi Secara In Vitro Dengan Metode Elektroforesis

Jurnal Ilmu Peternakan, Desember 2008, hal. 64 – 71 ISSN 1907 – 2821

Vol. 3 No.2

Identifikasi Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) Pada Oosit Sapi Yang Dimaturasi Secara In Vitro Dengan Metode Elektroforesis (Identification of Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) from Bovine Oocytes in Vitro Maturation with Elektroforesis Method) Widjiati, Epy. M. L. 1), Zaenal. Mustakim2), Lianny Nangoi3) Fakultas Kedokteran Hewan Unair Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya 60115 Email : [email protected]

ABSTRACT The aim of this research was to identification of protein Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) isolated from oocytes dominant follicles in in vitro maturation. Bovine ovary obtained from a slaughterhouse was aspired in its ovary dominant follicles. The oocytes were matured in Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) then culture for 22 hours at 38,5 ºC in incubator CO2. Twenty two hours after being culture, the GDF-9 protein identification were examined using Sodium Dodecyl Sulphonate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE). Several protein fractions were obtained from the result of research. Based on calculation of regression equation resulting from protein marker to determine the molecular weight of GDF-9 protein. Eight protein fractions were determined, they are : 177 kDa, 137 kDa, 100 kDa, 73 kDa, 51 kDa, 41 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 20 kDa. Protein appearing in the protein band the molecular weight of 51 kDa was identified as GDF-9 protein playing role in maturation process. Key word : GDF-9, oocyte, maturation, SDS PAGE

PENDAHULUAN Dalam rangka meningkatkan produktivitas ternak, banyak teknik yang dikembangkan. Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas ternak tersebut adalah dengan In Vitro Fertilitation (IVF). Namun kendala yang dialami saat ini adalah tingkat keberhasilan IVF masih belum mampu memproduksi embrio in vitro dengan kualitas optimum. Masalah tersebut perlu dikaji secara molekuler reproduksi, mengingat pada proses maturasi oosit banyak protein diduga berperan dan sampai saat ini sintesis dan fungsi protein tersebut secara molekuler masih belum banyak diketahui (Pawshe et al., 1996). Selain hormon ternyata diketahui ada peran growth factor selama proses

maturasi oosit. Oleh karena itu, selama proses maturasi banyak protein yang berperan dalam proses pematangan oosit seperti; Insulin-like Growth Factor (IGF), IGF-Binding Protein (IGFBP), Epidermal Growth Factor (EGF), Transforming Growth Factor Alfa (TGFα), Transforming Growth Factor Beta (TGFβ), Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9). Sampai saat ini sintesis dan fungsi protein tesebut secara molekuler masih belum banyak diketahui (Widjiati dan Rimayanti, 2002). Growth Factor merupakan faktor lokal berperan dalam peningkatan proliferasi dan diferensiasi sel granulosa, sehingga menyebabkan terjadinya ekspansi kumulus, peran sesungguhnya dari faktor lokal oosit ini belum banyak dikaji secara mendalam. Oleh karena itu,

Vol. 3, 2008

penting untuk mengetahui peran sitokin ini dalam proses folikulogenesis dan maturasi oosit (Widjiati, 2007). Growth factor mempunyai pengaruh penting dalam meningkatkan sekresi protein pada cairan folikel, hal ini disebabkan karena growth factor berperan dalam meningkatkan transpor asam amino melintasi membran sel serta meningkatkan pengikatan asam-asam amino sehingga membentuk protein (Frandson, 1992). Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) merupakan salah satu growth factor yang mempengaruhi berbagai fungsi sel ovari termasuk sintesis DNA pada membrane sel granulosa dan proses penurunan cAMP sehingga proses meiosis dapat belangsung (Vitt et al., 2002). Growth Differentiation Factor-9 juga berfungsi sebagai regulator pada pertumbuhan dan diferensiasi pada jaringan embrional maupun jaringan dewasa. Growth Differentiation Factor-9 disintesis oleh sel somatik ovum yang secara langsung berefek pada pertumbuhan dan fungsi oosit. Keberadaan dan peran GDF-9 pada oosit sangat dibutuhkan pada proses maturasi dan folikulogenesis ovarium. Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) adalah suatu glikoprotein yang termasuk dalam Subfamili dari (TGF-β) yang disekresi oleh oosit dengan berat molekul 51kDa. Seperti ligan-ligan family Transforming Growth Factor-β (TGF-β) lainnya, ligan GDF-9 diketahui berhubungan dengan serine kinase. Growth Differentiation Factor-9 mempunyai kemampuan untuk merangsang proliferasi sel granulosa dan menghambat diferensinya. Growth Differentiation Factor-9 berperan dalam proses pematangan sel telur yang merupakan ligan spesifik reseptor TGF-β. Sekresi GDF-9 akan memacu sekresi TGF-β sehingga akan menghalangi tranfer cAMP dari

IDENTIFIKASI GROWTH DIFFERENTIATION 65

granulosa ke oosit akibatnya cAMP dalam oosit turun dan proses maturasi dapat berjalan. Kekurangan GDF-9 akan mengganggu proses pematangan sel telur. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui profil GDF9 yang selama proses maturasi, karena sangat mempengaruhi kualitas oosit sebagai bank oosit untuk sumber produksi embrio yang dihasilkan secara in vitro.

MATERI DAN METODE Penelitian ini dilakukan kurang lebih selama tiga bulan mulai bulan JuliSeptember 2007 di laboratorium In Vitro Fertilitation (IVF) Fakultas Kedokteran Hewan Unair dan laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya. Bahan penelitian Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah ovarium sapi yang di peroleh dari Rumah Potong Hewan. Media kimia yang diperlukan antara lain : Tissue Culture Media 199 (TCM-199), NaCl fisiologis dan Diionized Water (DW), Gentamisin Sulfat, Glutamin, Follicle Stimulating Hormone (FSH), Luteinizing Hormone (LH), Mineral Oil, Bovine Serum Albumin (BSA), Phosphat Buffer Salin (PBS). Alat penelitian Alat yang digunakan untuk penelitian ini antara lain adalah : gunting, pinset, spuite disposible 5 cc, jarum ukuran 18 G, cawan petri disposible, erlemeyer, pipet pasteur, pipet ependorf, tabung ependrof, alat centrifuge, freezer, incubator CO2, gelas ukur, mikroskop

66 WIDJIATI DKK

Jurnal Ilmu Peternakan

inverted, refrigerator, elektro buffer.

elektroforesis,

Tahapan Penelitian Koleksi Oosit Ovarium sapi yang diperoleh dari Rumah Potong Hewan (RPH). Oosit diambil secara aspirasi dengan menggunakan jarum ukuran 18 G yang dihubungkan dengan spuit 5 ml berisi 1 ml TCM. Pengambilan sampel oosit berdasarkan diameter permukaan, yaitu folikel dominan dengan ukuran 6-8 mm. Maturasi Oosit Untuk proses maturasi oosit dipergunakan Tissue Culture Medium 199 (TCM 199). Sepuluh sampai dua puluh oosit berdasarkan ukurannya dikultur dalam 100 ul medium tetes dan ditutup dengan mineral oil. Pematangan oosit dilakukan pada suhu 38,5ºC didalam inkubator CO2 5% selama 22 jam (Pawshe et al., 1996). Isolasi Protein dimaturasi

Oosit

yang

telah

Isolasi protein yang dilakukan adalah sebagai berikut : sampel oosit yang telah dikoleksi diambil sebanyak 200µL ditambah larutan Phospate Buffer Saline Tween (PBST) yang mengandung 0.05 M Phenyl Metil Sulfonil Flouride (PMSF) sampai lima kali volume sampel. Sampel oosit yang telah diencerkan kemudian dilakukan sonifikasi selama 10 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit untuk memisahkan antara endapan dan supernatan. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1, kemudian dimasukkan ke dalam refrigerator selama 12 jam. Selanjutnya disentrifugasi 6000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit untuk memisahkan endapan dan supernatan. Endapan yang diperoleh dimasukkan ke

dalam freezer selama lima menit. Endapan yang dihasilkan tersebut kemudian ditambah Tris Cl 50µL dan disimpan di freezer sebelum digunakan sebagai bahan isolat Fraksi Protein Oosit. Preperasi Protein Growth Differention Factor 9 dengan SDS PAGE Elektroforesis adalah gerakan partikel (koloid) yang bermuatan listrik melalui suatu gel karena pengaruh medan listrik (Aulanni‟am, 2004). Elektroforesis ini dapat digunakan untuk menentukan titik isoelektrik dan berat molekul dari protein. Sampel protein yang berasal dari oosit ditambah dengan larutan buffer kemudian disimpan pada suhu - 10ºC. Selanjutnya menyiapkan separating gel pada alat SDS-PAGE yaitu memasukan larutan gel ke dalam alat pembentuk gel menggunakan pipet. Tambahkan butanol kurang lebih 1ml dan biarkan selama 30 menit dan keluarkan comb. Sampel protein 10-20 µL dimasukan ke dalam lubang cetakan pada stacking gel. Selanjutnya plate yang telah berisi sampel dimasukan ke alat biorab dan anoda dihubungkan pada reservoir bawah dan katoda dihubungkan pada reservoir atas. Power supply dihubungkan dengan arus listrik 30 mA. Tahap pewarnaan yang dipakai adalah larutan staining diletakkan dalam cawan petri dan ditunggu dalam lima menit sambil digoyangkan sampai terlihat warna. Tahap pencucian menggunakan larutan destaining yang membutuhkan waktu lebih lama yaitu sampai jel terlihat jernih. Kemudian hasil elektroforesis difoto atau discan.

Vol. 3, 2008

IDENTIFIKASI GROWTH DIFFERENTIATION 67

HASIL PENELITIAN Hasil identifikasi protein GDF-9 dari oosit sapi yang telah dimaturasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE,

S

sehingga didapatkan hasil yang dinyatakan dalam satuan berat molekul yaitu kDa. Hasil SDS-PAGE ditampilkan dengan pewarnaan commasie blue R-250.

S

M

M

S 170 130 95

170 130 95 72

72

55 43

55

34

26

43

26

34

17

A

17

B

Gambar 1. Hasil analisis protein dengan metode SDS-PAGE. Keterangan : A : sebelum pemurnian protein. B : setelah pemurnian protein. S : sampel berasal dari oosit sapi yang dikoleksi dari dominan folikel. M : marker.

Menurut Aulanni‟am (2004), penentuan molekul relatif dilakukan dengan bantuan protein standar (marker). Untuk menentukan molekul relatif protein dilakukan dengan menghitung

nilai Retardation Factor (Rf) masing-masing pita dengan rumus :

Jarak pergerakan protein dari tempat awal Rf = Jarak peergerakan warna dari tempat awal

dari

68 WIDJIATI DKK

Jurnal Ilmu Peternakan

Tabel 1. Penghitungan persamaan regresi protein marker. No 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A 15,9 mm 22,3 mm 31 mm 40,5 mm 52 mm 66 mm 83 mm 98 mm 118 mm

B 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm 118 mm

Rf 0,134 0,188 0,263 0,343 0,441 0,559 0,703 0,8305 1

Marker Mr marker (log Y Da) 5,2304 5,1139 4,9777 4.8573 4,7404 4,6335 4,5315 4,4150 4,2304

Mr marker (kDa) 170 130 95 72 55 43 34 26 17

Tabel 2. Perhitungan standarisasi protein marker. No

A B Rf 1 15,9 mm 118 mm 0,134 2 22,3 mm 118 mm 0,188 3 31 mm 118 mm 0,263 4 40,5 mm 118 mm 0,343 5 52 mm 118 mm 0,441 6 66 mm 118 mm 0,559 7 83 mm 118 mm 0,703 8 98 mm 118 mm 0,831 9 118 mm 118 mm 1 Keterangan : A : jarak pergerakan protein dari tempat awal B : jarak pergerakan warna dari tempat awal

Marker Mr marker (log Y Da) 5.228 5.118 4.977 4.852 4.743 4.635 4.524 4.419 4.228

Penghitungan molekul relatif dari pita-pita protein (Gambar 1) yang terdapat pada gel dilakukan dengan jalan membandingkan antara molekul relatif dari marker dengan Rf. Selanjutnya dibuat kurva standar dengan nilai logaritma molekul relatif sebagai sumbu y. Molekul relatif GDF-9 dari oosit yang dimaturasi secara in vitro ditentukan

Mr marker (kDa) 169,0 129,5 94,8 71,9 55,3 43,2 33,5 26,2 16,9

berdasarkan persamaan regresi yang dihasilkan dari analisis Statistical Program for Social Science 13 (SPSS 13) dari marker protein adalahY=5.6023.228X2+3.728X2-874X3 artinya garis yang dibentuk akan melewati titik-titik dari Rf dan log marker, sedang Y adalah nilai logaritma masa molekul relatif.

Vol. 3, 2008

IDENTIFIKASI GROWTH DIFFERENTIATION 69

Tabel 3. Perhitungan Massa Molekul Relatif (Mr). Oosit yang Dimaturasi Secara In Vitro A B Rf Mr sampel (log Y Da) 1 17 mm 118 mm 0,127 5.248 2 21 mm 118 mm 0,178 5.135 3 32 mm 118 mm 0,271 4.963 4 40 mm 118 mm 0,339 4.863 5 56 mm 118 mm 0,475 4.709 6 69 mm 118 mm 0,585 4.614 7 75 mm 118 mm 0,636 4.575 8 97 mm 118 mm 0,822 4.427 9 111 mm 118 mm 0,941 4.304 Keterangan : A : jarak pergerakan protein dari tempat awal B : jarak pergerakan warna dari tempat awal No

Berdasarkan penghitungan persamaan regresi dari marker protein untuk menentukan massa molekul relatif protein didapatkan 9 fraksi protein yaitu : 177kDa, 137kDa, 100kDa, 73kDa, 51kDa, 41kDa, 38kDa, 27kDa, 20kDa. Hasil yang di dapat dari penghitungan massa molekul relatif sampel, maka pita protein dengan berat molekul 51kDa sebagai protein GDF-9 yang berasal dari oosit yang telah dimaturasi secara in vitro. PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah dilakukan identifikasi protein GDF-9 menggunakan metode elektroforesis dengan Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) yang merupakan standar metode pengujian terhadap molekul relatif protein, struktur sub unit dan kemurnian protein. Teknik ini digunakan karena sederhana, murah, dan sampel yang digunakan relatif sedikit (Rantam, 2003). Metode SDS-PAGE dilakukan dengan menentukan perbedaan letak pita pada gel yang dibandingkan dengan marker protein yang berkisar antara 17170kDa. Marker yang digunakan adalah marker medium karena molekul relatif berkisar antara 0-200kDA

Mr sampel (kDa) 177 137 100 73 51 41 38 27 20

Preparasi sampel diambil dari oosit yang dimaturasi secara in vitro dengan metode SDS-PAGE 12%. Perhitungan berat molekul dari pita-pita protein pada gel poliakrilamid dengan jalan membandingkan molekul relatif dari marker. Hasil didapatkan beberapa pita protein yaitu protein dengan molekul relatif 177kDa, 137kDa, 100kDa, 73kDa, 51kDa, 41kDa, 38kDa, 27kDa, 20kDa. Pada proses maturasi banyak protein yang berperan hal ini dapat terlihat pada band hasil SDS-PAGE. Dari beberapa protein diatas, protein dengan molekul relatif 51kDa diidentifikasi sebagai protein GDF-9 yang berperan pada proses maturasi secara in vitro karena protein tersebut berasal dari oosit dan dengan bantuan persamaan regresi dapat ditentukan molekul relatifnya. Oosit yang dikoleksi dari folikel sangat kecil menunjukan tingkat keberhasilan maturasi dan fertilisasi yang rendah diakibatkan oleh faktor intrinsik oosit (Yang dan Roy., 2001). Growth Differentation Factor-9 mempengaruhi berbagai sel ovari termasuk sintesis DNA pada membran sel granulosa (Jayawardana et al., 2006). Growth Differentation Factor-9 mereduksi cAMP yang distimulasi FSH pada proses steroidogenesis sehingga proses meiosis

70 WIDJIATI DKK

dapat berlangsung. Growth Differentation Factor-9 memungkinkan terjadinya ekspansi kumulus komplek dan peningkatan reseptor LH dalam sel granulosa dan memproduksi asam hialuronat yang dapat diindikasi pada oosit yang telah matang (Vitt et al., 2000). Kerja biologis dari GDF-9 diperantai oleh reseptor tipe I dan II TGF β bersama dengan kerja serine kinase yang diikuti dengan faktor phosphorylasi intrasel (Mazerbourgh et al., 2003). Efek GDF-9 tergantung pada konsentrasi dan dosis 100-300 ng/ml adalah dosis maksimal yang dibutuhkan (Oja et al., 2003). Pada tikus betina sangat membutuhkan GDF-9 yang berperan pada perkembangan folikel primer sampai pada saat ovulasi oosit (Elvin et al., 2000). Efek GDF-9 pada sel target dimediasi melalui beberapa pathway paralel dan berlawanan dengan pathway yang mengaktifasi gonadotropin pada tahapan folikulogenesis. Sekresi dari GDF-9 berperan dalam proses pengaturan, pertumbuhan dan deferensiasi sel pada ovarium mamalia (Oja et al., 2003). Protein yang telah diidentifikasi melalui SDS-PAGE belum tentu mengandung protein yang diinginkan, oleh karena itu perlu uji spesifik untuk mengetahui secara spesifik protein yang dikehendaki. Salah satu uji spesifik yang digunakan adalah dengan uji Western blotting (Aulanni‟am, 2004).

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terdapat 9 fraksi protein GDF-9 yang diisolasi dari oosit sapi yang telah dimaturasi secara in vitro. Berdasarkan persamaan regresi linear dari marker

Jurnal Ilmu Peternakan

protein maka dapat diketahui molekul relatif protein GDF-9 adalah 51 kDa. Saran Untuk membuktikan bahwa band protein 51 kDa adalah GDF-9 perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan western blotting.

DAFTAR PUSTAKA Aulanni‟am. 2004. Prinsip dan Teknik Analisis Biomolekul. Edisi I. Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya Press. Malang. 47-75. Elvin, J. A., Yan and M. M. Matzuk 2000. Oocyte-expressed TGF-β superfamily members in female fertility. J. Mol Cell Endoc. 159:1-5. Frandson, R.D. 1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Edisi ke empat terjemahan B. Srigondo dan K. Prasno. Gajah Mada University Press, Yogyakarta: 683. Jayawardhana, B. C., S. Takashi, N. Hiromi, K. Etsushi, T. Masafumi and M. Akio. 2006. Hormonal regulation of expression growth differentiation factor-9 (GDF-9) reseptor typeI and type II genes in vitro the bovine ovarian follicle. J. Repro. 131(3):545. Mazerbourg, S., C. Klein, A. J. Hsueh, N. KaivoOja, O. Ritvos, D. G. Motterhead and O. Korchynski. 2003. Growth differtiation factor-9 signaling is mediated by type I receptor, activin receptor-like kinase 5. J. Mol Endoc 18 : 653-665. Oja. N. K., B. Jonas, K. Meerit, K. Janne, V. Ursula, C. Mark, V. Kaisa, P. K. Janne, M. O. Vesa, H. Masayu, M. Aristidis, P. G. Nigel, T. D. Peter, J. W. H. Aaron and R. Olli. 2003. Growth differentiation factor-9 smad2 activation and inhibin b production in cultured human granulose luteal-cells. J. Clin Endoc and Metab 88 : 755-762. Pawshe, C. H., A. Palanisamy, M. Taniju, S. K. Jain and S. M. Totey. 1996. Comparison of Carious Maturation Treatments on In Vitro Maturation. J. Theriog. 46:971-982. Rantam, F. A. 2003. Metode Immunologi. Cetakan pertama. Airlangga University Presss. Surabaya.

Vol. 3, 2008

IDENTIFIKASI GROWTH DIFFERENTIATION 71

Stephanie, A. P., J. Carolina, Jorgez, and M. M. Matzuk. 2004. Growth differentiation factor 9 regulates expression of the bone morphogenetic protein antagonist gremlin. J. Biol. Chem. 31:32281-32286.

Widjiati dan Rimayanti. 2002. Seleksi diameter folikel terhadap morfologi embrio kambing tahap satu sel dan angka fertilisasi in vitro. Lembaga Penilitian Universitas Airlangga, Surabaya.

Vitt UA, S. Mazerbourg, C. Klein and A. J. W. Hsueh. 2002. Bone morphogenetic protein receptor for growth differentiation factor-9. Biology of Reproduction. 67:473-480.

Yang P. And S. K. Roy. 2001. Epidermal growth factor modulates transforming growth factor receptor mesenger RNA and protein levels in hamster prenatal follicles in vitro. J. Biol. Reprod. 65: 847-854.

Widjiati. 2007. Induksi maturasi oosit secara in vitro oleh TGF β asal oosit kumulus kompleks. [Disertasi]. Universitas Brawijaya. Malang.