Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni

Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni

Centrum pro kardiovaskulární výzkum Laboratoř imunologické diagnostiky IKEM Praha ve spolupráci s firmou Beckman Coulter, Praha

Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

1

Akumulace tukové tkáně

Dyslipoproteinémie FFA uvolňování (postprandiálně– VLDL1 – small dense LDL)

Leptin, adiponektin Interleukin 6, MCP-1, TNFα, VCAM, ICAM Zvýšená infiltrace imunitních buněk, zejména makrofágů a změna jejich fenotypu „metabolic inflammation“ Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

2

Imunologické komplikace obezity dané chronickým zánětem tukové tkáni ale i  lipogenezí v primárních i sekundárních lymfatických orgánech – thymus, kostní dřeň či lymfatické uzliny 


3

Anatomické rozložení tukové tkáně Podkožní tuková tkáň

- břicho, trup, končetiny

Nitrobřišní tuková tkáň

- viscerální (mesenterická and omentalní) - retroperitoneální (perirenální a perigonadální)

Další lokalizace

- Perivaskulární / epikardiální -intramuskulární, intermuskulární - ………


4

Komplikace obezity Pulmonary disease

abnormal function obstructive sleep apnea hypoventilation syndrome

Nonalcoholic fatty liver disease steatosis steatohepatitis cirrhosis

Gall bladder disease

Gynecologic abnormalities abnormal menses infertility polycystic ovarian syndrome

Osteoarthritis Skin Gout

Idiopathic intracranial hypertension

Stroke Cataracts Coronary heart disease Diabetes Dyslipidemia Hypertension Severe pancreatitis Cancer

breast, uterus, cervix colon, esophagus, pancreas kidney, prostate

Phlebitis

venous stasis 5

Příklady látek, uvolňovaných tukovou tkání


6

Příklady receptorů, exprimovaných v tukové tkáni


7

Typy buněk v bílé tukové tkáni

- adipocyty 30-60%

- preadipocyty, fibroblasty a kmenové buňky - matrix kolagenových vláken - cévy (myocyty/endotheliální buňky) - imunitní buňky (monocyty/makrofágy, lymfocyty) - a další …..

Lymfocyty

Makrofágy

Monocyty

Endotheliální buňky

Preadipocyty Adipocyty


8

Adipocytokiny – zdroj Adipocyty 

SVF

MCP-1, macrophage migration inhibitory factor, IL-6, leptin, adiponektin,…



IL1β, IL-8, IL-10, TNF-α, resistin, VEGR ….


9

Molecular mechanism underlying adipose tissue inflammation.

Suganami T , Ogawa Y J Leukoc Biol 2010;88:33-39

©2010 by Society for Leukocyte Biology


10

DAMP signály při excesivní obezitě

J. Clin. Invest. 2006;116:33-35 J. Intern. Med. 2007;262:422-430


11

…. je ale makrofág v tukové tkáni skutečně statickou buňkou…? Netrin -1 - protein, který byl dosud sledován zejména vzhledem k jeho roli ve vývoji nervového systému a při regulaci růstu nádorů. * zřejmě reguluje migraci buněk v širším kontextu 2014 -Netrin-1 promotes adipose tissue macrophage retention and insulin resistance in obesity. Ramkhelawon B et al., Nat Med. 2014 Apr;20(4):377-84

* Exprimován pouze v tukové tkáni obézních myší * Exprese v makrofázích je aktivována saturovanými mastnými kyselinami (palmitát) a přes receptor Unc5B blokuje migraci makrofágů, tj. efflux z tkání.


12

Experiment  Detekce

rozdílů v zastoupení jednotlivých subtypů makrofágů v subkutánní, perirenální a perivaskulární (podél a. renalis) tukové tkáni u pacientů s pokročilou aterosklerózou vs. zdravým jedincům  Zjištění korelace mezi rizikovými faktory aterosklerózy a zastoupením jednotlivých subpopulací makrofágů Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

13

Subjekty pacienti

indikovaní k rekonstrukční operaci tepen pánve a dolních končetin – tj. pacienti s pokročilou aterosklerózou Kde ale vzít vzorky nitrobřišní tukové tkáně od zdravých jedinců? kontrolní soubor zdravých jedinců – program transplantace ledvin od živých dárců 


14

Dárci ledvin jsou ochotni účastnit se studie • jsou velmi dobře vyšetřeni • budou sledováni po celý život (sběr dat i po delší době) •


15

Metody Analýza subpopulací pomocí průtokové cytometrie 2. Určení genové exprese cytokinů a adipokinů 3. Zjištění zastoupení jednotlivých typů mastných kyselin v tukové tkáni – tj. dieta 4. Odběry séra – zaměření na rozvoj inzulinové rezistence, cytokiny v séru 1.

16

WHITE ADIPOSE TISSUE

ADIPOSE TISSUE ADIPOSE – TISSUE MATRIX. FIBERS

FILTER 250 μm MESH

COLLAGENASE DIGESTION CENTRIFUGE FILTRATE FILTER 50 μm MESH ADIPOCYTES

STROMAL VASCULAR CELLS (MONOCYTES/MACROPHAGES/PREADIPOCYTES, ENDOTHELIAL CELLS)

Flow cytometry FILTER 50 μm MESH


17

Postup - pokračování Ochlazení vzorku, filtrace (150 µm)  Opakované promytí, cetrifugace 1200m rpm  Označení monoklonálními protilátkami s navázanými fluorochromy (CD 14 (PC7) (Beckman Coulter), CD16 (ECD) (Beckman Coulter), CD 36 (FITC) (Beckman Coulter), a CD 163 (PE) (Biolegenda) a kalprotectin (PC7)(Acris antibodies)), následně analyzována metodou průtokové cytometrie. 

Izotypové kontroly - IgG1 FITC, PE, ECD Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

18

CD 16 Výskyt-2 formy  první je exprimovaná na NK buňkách, monocytech, makrofách a některých T lymfocytech. Jedná se o transmembránovou formu. Molekulová hmotnost50-65kDa (FcγRIII-A)  druhá je exprimovaná na neutrofilech a je glykosilphosphatidylinositolem kotvená forma. Molekulová hmotnost-48kDa (FcγRIII-B). Spoluzodpovídá za jejich aktivaci a expresi adhesivních molekul. Znak aktivních, proinflamačních monocytů/makrofágů Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

19

CD 36    



Scavenger receptor Funkce - fagocytoza apoptotických neutrofilů a modifikovaných nízko densitních lipoproteinů Norma 90-100% Molekulová hmotnost -78-88 kDa Výskyt na buňkách - monocyty, makrofágy, krevní destičky, endoteliální buňky


20

CD 163

scavenger receptor pro hemoglobin-haptoglobinový komplex







 

Funkce - monocyty/makrofágy protizánětlivého charakteru - odstraňování hemoglobin-haptoglobinového komplexu Výskyt na buňkách-makrofágy, Kupferovy buňky jater, monocyty, část dendritických buněk, část progenitorových buněk Exprese na povrchu buněk je indukovaná glukokortikoidy (nezávisle na IL10) a IL10 asociované s ateroprotektivní aktivitou, klíčová role v pooperačním hojení Vazba hemoglobin-haptoglobinového komplexu na CD163 vede k zvýšené syntéze IL10 Exprese znaku CD163 roste při diferenciaci monocytu 21 na makrofág Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

Kalprotektin (calprotectin) MRP8/14 protein, calgranulin,

L1 protein, 27E10 antigen





cytosolový protein, který se uvolňuje z leukocytů po jejich aktivaci nebo lýze.Jedná se o kalcium a zinek vazebný protein s antimikrobiální aktivitou o molekulové hmotnosti 36,5 kDa. Skládá se ze dvou těžkých řetězců a jednoho lehkého řetězce. Tvoří jej především monocyty a neutrofily membránová forma kalprotektinu je pouze na nezralých makrofázích a je ukazatelem influxu do místa zánětu.


22

Životnost buněk – renální tuková tkáň

První výsledky…. CD14+CD16+

CD14+

* CD14+CD16+CD36+++CD163*** Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

24

Korelace s BMI

25

Prezentované výsledky a postupy jsou výsledkem pracovní skupiny pod vedením

Rudolfa Poledneho Anna Králová Alena Sekerková Jiří Froněk Jana Ždychová Ilja Stříž

Pavel Kružík Děkuji Evě Fáberové a Adéle Sajdlové za velmi významnou pomoc s realizací experimentu. Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

26

Na druhou stranu……. …….fat, fit and healthy fenomen …….  Obézní

jedinci, kteří ale vykazují normální, metabolické parametry – lipoproteinové parametry, glykémie, IR  Nemají zvýšený krevní tlak  Jsou v dobré fyzické kondici Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

27

…možné vysvětlení….


28


29

Děkuji za pozornost a přeji Vám dobrou chuť!

[email protected]


30

Izotypové kontroly

Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni

Recommend Documents