MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Identifikace a funkční charakterizace miRNA s prognostickým významem u renálního karcinomu Diplomová práce
Robert Iliev
VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE: RNDr. ONDŘEJ SLABÝ Ph.D. 1
BRNO 2012
Bibliografický záznam Autor: Bc. Robert Iliev Přrírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Identifikace a funkční charakterizace miRNA s prognostickým významem u renálního karcinomu Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Vedoucí práce: RNDr. Ondřej Slabý Ph.D. Rok obhajoby: 2012 Klíčová slova: mikroRNA (miRNA), renální karcinom, diagnostika, prognóza, biomarker
2
Bibliographic entry Author: Bc. Robert Iliev Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of thesis: Identification and functional characterization of miRNA with prognostic significance in renal cell carcinoma Degree programme: Biology Field of study: Molecular biology and genetics Supervisor: RNDr. Ondřej Slabý Ph.D. Year of defence: 2012 Keywords: microRNA (miRNA), renal cell carcinoma, diagnostics, prognosis, biomarker
3
Chtěl bych tímto poděkovat vedoucímu své diplomové práce RNDr. Ondřeji Slabému, Ph.D za rady a odborné vedení, které mi věnoval při vypracovávání této práce. Moje poděkování také patří odborné konzultantce Mgr. Martině Rédové Ph.D za věnovaný čas, pomoc a užitečné postřehy potřebné při realizaci této práce. Nemalý dík patří také Bc. Andreji Beššemu za neocenitelnou pomoc při laboratorních experimentech.
Prohlášení: „Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Identifikace a funkční
charakterizace miRNA s prognostickým významem u renálního karcinomu vypracoval samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a s použitím uvedené literatury.“
V Brně dne 14. května 2012
Robert Iliev
4
Abstrakt V současné době představují maligní nádory ledvin 3 % všech malignit vyskytujících se u dospělé populace. Mezi zhoubnými nádory ledvin dosahuje renální karcinom
(RCC)
nejvyšší
letality.
Česká
republika
obsadila
počtem
nově
diagnostikovaných nádorů první místo v incidenci mezi všemi státy světa. Vzhledem k tomu je důležité objasnit molekulárně genetické mechanizmy hrající rozhodující roli ve vzniku a vývoji RCC. Podle nejnovějších studií jsou do vývoje RCC signifikantně zapojeny i mikroRNA (miRNA). Jsou to velmi stabilní krátké nekódující RNA, které mají schopnost post-transkripčně regulovat genovou expresi a podle bioinformatických analýz jsou schopny regulovat více než polovinu lidských genů. Tato práce se zabývá analýzou vybraných sérových a tkáňových miRNA u pacientů s renálním karcinomem. Práce se zaměřuje na identifikaci sérových i tkáňových miRNA a jejich spojitost s prognózou RCC. Cílem této práce je identifikovat miRNA které by měly potenciální prognostický význam a případné budoucí využití v diagnostice RCC.
Abstract At present, malignant kidney tumors represent 3% of all malignancies occurring in the adult population. Among the malignant tumors of the kidney, renal cell carcinoma (RCC) reaches the highest lethality. Czech Republic ranked by the number of newly diagnosed cancer incidence in the first place among all countries worldwide. Since it is important to clarify the molecular genetic mechanisms playing a crucial role in the emergence and development of RCC. According to recent studies, microRNAs are significantly involved in the development of RCC. MicroRNAs (miRNAs) are very stable short non-coding RNAs regulating gene expression post-transcriptionally. According to bioinformatic analysis, they are able to control more than half of human genes. This thesis deals with the analysis of selected serum and tissue miRNAs in patients with renal cell carcinoma. The work focuses on the identification of miRNAs in serum and tissue and their association with the prognosis of RCC. The aim of this work is to identify miRNAs that have the potential prognostic value and could be used in RCC diagnostics in the future.
5
OBSAH ÚVOD ........................................................................................................................................... 8 1. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................................ 10 1.1. Nádory ledvin ................................................................................................................... 10 1.2 Histopatologická klasifikace ............................................................................................. 10 1.3 Epidemiologie a etiologie ................................................................................................. 13 1.4 Klinický obraz ................................................................................................................... 14 1.5 Diagnostika ....................................................................................................................... 15 1.6 Staging a grading RCC ..................................................................................................... 15 1.8 Léčba ................................................................................................................................. 18 1.9 Molekulární patologie renálního karcinomu ..................................................................... 20 1.9.1 VHL ........................................................................................................................... 21 1.9.2 HIF ............................................................................................................................. 21 1.9.3 VEGF, PDGF ............................................................................................................. 22 1.9.4 MET ........................................................................................................................... 23 1.9.5 BHD ........................................................................................................................... 24 1.9.6 Dráha PI3K/AKT/mTOR ........................................................................................... 24 1.10 MikroRNA ...................................................................................................................... 26 1.10.1 Biogeneze ................................................................................................................. 26 1.11 Význam miRNA v kancerogenezi .................................................................................. 28 1.11.1 MiRNA a VHL/HIF angiogenní signální dráha ....................................................... 28 1.11.2 MiRNA a metabolizmus .......................................................................................... 29 1.11.4. MiRNA a apoptóza ................................................................................................. 31 1.11.5 MiRNA a buněčný cyklus ........................................................................................ 33 1.12 Využití miRNA v diagnostice ......................................................................................... 34 1.13 Využití miRNA v terapii ................................................................................................. 35 2. CÍLE PRÁCE .......................................................................................................................... 37 2.1 Dílčí cíle ............................................................................................................................ 37 2.1.1 Stanovení hladin vybraných miRNA v krevním séru ................................................ 37 2.1.2 Identifikace prognostických miRNA ......................................................................... 37 2.1.3 Funkční analýza miR-210, miR-143 in vitro ............................................................. 37 3. MATERIÁL A METODY ...................................................................................................... 38 3.1 Soubor pacientů použitých pro identifikaci sérových miRNA ......................................... 38 3.2 Soubor pacientů použitých pro identifikaci prognostických miRNA ............................... 39 3.3 Použité buněčné linie ........................................................................................................ 40 3.4 Izolace celkové RNA obohacené o miRNA frakci ze séra ............................................... 40
6
3.5 Izolace celkové RNA obohacené o frakci miRNA z FFPE tkání...................................... 42 3.6 Reverzní transkripce (RT) ................................................................................................. 44 3.7 qPCR ................................................................................................................................. 45 3.8 Kultivace buněčných linií ACHN a CAKI-2 .................................................................... 47 3.9 Stanovení růstové křivky................................................................................................... 48 3.10 Transfekce ....................................................................................................................... 49 3.11 Izolace RNA z transfekovaných buněk ........................................................................... 50 3.12 MTT test.......................................................................................................................... 51 3.13. Test na apoptózu ............................................................................................................ 52 3.14 Analýza buněčného cyklu ............................................................................................... 53 3.15 Scratch wound migrační test ........................................................................................... 54 3.16 Test buněčné invazivity pomocí systému xCELLigence ................................................ 55 4. VÝSLEDKY PRÁCE ............................................................................................................. 57 4.1 Výtěžky RNA izolované ze sér a FFPE tkání ................................................................... 57 4.2 Stanovení hladiny exprese vybraných sérových miRNA .................................................. 57 4.4 Stanovení účinků transfekce pre-miR-143 a anti-miR-210 a na buněčné linie ACHN a CAKI-2.................................................................................................................................... 67 4.4.1 Izolace RNA z transfekovaných buněk ...................................................................... 67 4.4.2 Transfekce .................................................................................................................. 67 4.4.3 Vliv transfekce anti-miR-210 a pre-mir-143 na viabilitu buněk CAKI-2 a ACHN ... 68 5. DISKUZE................................................................................................................................ 78 6. SOUHRN ................................................................................................................................ 82 6. SUMMARY ............................................................................................................................ 83 LITERATURA............................................................................................................................ 84 PŘÍLOHY ................................................................................................................................. 100
7
ÚVOD Zhoubné nádory ledvin představují v současnosti asi 3 % všech solidních nádorů vyskytujících se v dospělé polpulaci. Nejčastějším nádorem ledvin je pak renální karcinom. Tento nádor vzniká z buněk proximálních tubulů a představuje až 85 % zhoubných nádorů ledvin. Nádory ledvin rozdělujeme do několika histologických subtypů. Nejčastěji se vyskytující typ světlobuněčný renální karcinom (ccRCC). K hlavním histologickým podtypům RCC je řazen svělobuněčný renální karcinom (ccRCC), který představuje 75 % všech karcinomů ledviny. Každý rok je diagnostikováno kolem 30 000 nových pacientů s karcinomem ledviny v USA a 20 000 v Evropské unii. Muži jsou postiženi přibližně 1,5krát častěji než ženy. Nádor se nejčastěji objevuje ve věkové skupině 50-70 let. Většina karcinomů je sporadických, jenom asi 4 % je familiárních. U jedné třetiny nemocných je v době diagnózy zjištěna přítomnost metastáz a u více než poloviny nemocných s lokalizovaným nádorem onemocnění progreduje v dalším průběhu. Renální karcinom je urologickým onemocněním s nejvyšší letalitou. V České republice mortalita u RCC mírně přesahuje 40 %. Závažným problémem je jak vysoká incidence, tak také výrazná agresivita ledvinových karcinomů. RCC je charakteristický vysokou mírou chemorezistence a radiorezistence a v současnosti je proto zatím nejúčinnější chirurgická léčba. RCC je charakteristický časnou tvorbou metastáz. Při stanovení diagnózy bývají u 30-40 % pacientů přítomné metastazy. Pro malou účinnost klasické chemoterapie a značnou chemorezistenci renálního karcinomu se v současné době věnuje pozornost cílené léčbě. Výzkum klíčových signálních drah, které se podílejí na vzniku a vývoji RCC vedl k vývoji a používání monoklonálních protilátek a inhibitorů tyrozinkinázových receptorů. V průběhu vzniku RCC hrají klíčovou roli dva typy genů – onkogeny a nádorové supresory. Nejčastější mutací, která je spojována se vznikem světlobuněčné formy renálního karcinomu je mutace v genu VHL. Tento nádorový supresor je zapojen do regulace hypoxické signalizace interakcí s transkripčními faktory indukovanými hypoxií (HIF). Jedním z nejmodernějších přístupů v oblasti molekulární charakterizace solidních nádorů, včetně RCC, je v současné době analýza mikroRNA. MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA, které se významným způsobem podílejí na regulaci genové exprese. Podle bioinformatických analýz jsou schopny posttranskripčně regulovat až polovinu lidských genů. Hrají tak důležitou roli v mnoha buněčných dějích od regulace buněčné proliferace a diferenciace až po apoptózu. Geny 8
regulované pomocí miRNA jsou nejen součástí procesu onkogeneze,podílejí se také na nádorové invazivitě nebo chemorezistenci. Předkládaná diplomová práce se zaměřuje na identifikaci sérových i tkáňových miRNA a jejich spojitost s prognózou RCC. Cílem této práce je identifikovat miRNA, které by měly potenciální prognostický význam a případné budoucí využití v diagnostice RCC.
9
1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1. Nádory ledvin Zhoubné nádory ledvin představují přibližně 3 % solidních nádorů u dospělé populace (Richie et al. 2006). Nejčastějším maligním nádorem je renální karcinom (RCC). Tento nádor vzniká z buněk proximálních tubulů a představuje až 85 % zhoubných nádorů ledvin (Adam et al. 2002). K hlavním histologickým podtypům RCC je řazen svělobuněčný renální karcinom (ccRCC), který představuje 75 % všech karcinomů ledviny. Druhý nečastější podtyp je s 15 % papilární renální karcinom (pRCC). Třetí nejčastější je chromofóbní renální karcinom, který představuje jen 5 % karcinomů ledviny. Zvláštní skupinu nádorů tvoří uroteliální papilokarcinomy ledvinové pánvičky (7-8 % maligních nádorů ledvin). U dětí se vyskytuje nefroblastom označovaný jako Wilmsův tumor tvořící asi 5-6 % všech maligních nádorů ledvin. Benigní nádory jako adenom, onkocytom, angiomyolipom a další jsou řádově méně časté. Histologické formy nádorů ledvin jsou uvedeny v Tabulce 1. Tabulka 1 - Rozdělení nádorů ledvin podle histologické formy (Adam et al. 2002) Nádory ledvinového pouzdra
fibrom, leiomyom, lipom
Parenchymové nádory
adenom, adenokarcinom
Nádory ledvinové pánvičky
papilokarcinom neboli uroteliální karcinom
Vaskulární nádory
hemangiom
Nádory dětského věku
nefroblastom (Wilmsův tumor)
Metastázy jiných nádorů
1.2 Histopatologická klasifikace RCC vzniká z epiteliálních buněk renálních tubulů. Nádory ledvin se dělí do několika podtypů podle Heidelberské klasifikace. Pro rozlišení daných typů jsou v této klasifikaci používány výsledky z molekulárně genetických vyšetření. V roce 2004 přijala Světová zdravotnická organizace (WHO) aktualizovanou klasifikaci, která je uvedena v Tabulce 2 (Srinivasa et al. 2010).
10
Nejčastějším typem maligního nádoru ledviny je světlobuněčný karcinom (ccRCC), který se na celkovém množství nádorů ledvin podílí ze 70-75 % (Kawaciuk 2005). Pochází z buněk proximálních tubulů. Makroskopicky má na řezu barvu šedobílou, která může přecházet do různých odstínů žluté podle obsahu cholesterolu a lipidů v buňkách. RCC má ve většině případů zlatavou barvu, což je způsobeno vysokým obsahem lipidů a glykogenu. Nádory bohaté na granulární buňky jsou zbarvené do hněda, pravděpodobně vlivem cytochromálních enzymů v četných mitochondriích. Růst nádoru je převážně solidní nebo tubulární s chudým stromatem, ale s charakteristickým bohatě větveným cévním zásobením. Nádor tvoří velké polygonální buňky s malými kulatými uniformními jádry. Buňky obsahují velké množství glykogenu, triacylglycerolů a fosfolipidů, ale málo cytoplazmatických organel (Kawaciuk 2005). Druhý nejčastěji se vyskytující podtyp renálního karcinomu je papilární karcinom, který tvoří asi 10 % karcinomů ledviny (Adam et al. 2002). Vyrůstá z distálních tubulů ledvinného kortexu a na řezu se jeví jako světle šedý až zlatavě žlutý. Výsledné zabarvení obvykle závisí na množství pěnitých makrofágů v nádorovém stromatu. Makroskopicky bývá nádor dobře ohraničen se silnějším pseudopouzdrem, většinou lokalizovaný v kortexu pólu ledviny. Většina papilárních karcinomů je tvořena buňkami s bazofilní nebo eosinofilní cytoplazmou. Bazofilní varianty mají zřejmě lepší prognózu než eozinofilní (Kawaciuk 2005). Chromofóbní karcinom (chRCC) představuje jen 5 % karcinomů ledviny. Vyrůstá z kortikální části společných vývodů. Makroskopicky má šedou, béžovou, někdy až hnědou barvu. Pro chromofóbní karcinom je nejčastější solidní uspořádání. V nádorech většinou chybějí nekrózy a hemoragie. Buňky chRCC mají většinou objemnou a transparentní cytoplazmu s viditelnými mezibuněčnými hranicemi. Buňky bývají také často binukleární nebo multinukleární s typicky svraštělým jádrem a perinukleárním projasněním. ChRCC se nápadně často vyskytuje s Birtt-Hogg Dubé syndromem. Chromofóbní karcinom má většinou výrazně lepší prognózu než světlobuněčný karcinom (Kawaciuk 2005). Karcinom ze sběrných kanálků (ductus Bellini) představuje 0,5–2,6 % všech karcinomů ledviny. Tento typ karcinomu je však velmi agresivní a také často rychle metastazuje. Nádor má pravděpodobně původ v medulárních pyramidách ledvin a makroskopicky vypadá jako infiltrativně rostoucí, tuhý nebo šedobílý útvar. Obvykle neobsahuje nekrózy a hemoragie. Je složen z tubulárních nebo tubulopapilárních 11
struktur typicky ohraničených jednou vrstvou velkých kuboidálních buněk (Adam et al. 2002). Podtypem karcinomu ze sběrných kanálků je medulární karcinom. Vyskytuje se téměř jen u pacientů afroamerické populace, kteří trpí srpkovitou anemií. Typicky je diagnostikován u mladých jedinců s průměrným věkem v době diagnózy 22-24 let. Makroskopicky je to ne zcela ohraničený nádor s lobulární úpravou postihující větší část ledviny, především dřeň. Špatnou prognózu nemocných s medulárním karcinomem prozatím nezlepšila žádná chemoterapie nebo imunoterapie, která byla u tohoto nádoru použita (Kawaciuk 2005). Sarkomatoidní karcinom není samostatným histologickým subtypem, ale je výsledkem sarkomatoidní dediferenciace, která může vycházet téměř ze všech typů karcinomů. Představuje asi 1 % všech karcinomů ledviny a nejčastěji vzniká z chromofóbního a světlobuněčného karcinomu. Nádory tvořené sarkomatoidními buňkami jsou často málo pigmentované, šedé nebo žlutohnědé (Adam et al. 2002). Tabulka 2 - Rozdělení nádorů vznikajících z epiteliálních buněk renálních tubulů (Srinivasa et al. 2010, upraveno). benigní nádory
metanefrický adenom papilární renální adenom onkocytom
maligní nádory
světlobuněčný (konvenční) karcinom (ccRCC) papilární renální karcinom chromofóbní karcinom (chRCC) karcinom ze sběrných kanálků medulární karcinom neklasifikovatelný renální karcinom dědičné nádorové syndromy multilokulárně cystický RCC karcinom z mucinózních tubulárních a vřetenovitých buněk RCC asociovaný s neuroblastomem karcinom s Xp11.2 translokací
12
1.3 Epidemiologie a etiologie Karcinom ledviny tvoří přibližně 2-3 % všech solidních nádorů dospělé populace (Kawaciuk 2005). Každý rok je diagnostikováno kolem 30 000 nových pacientů s karcinomem ledviny v USA a 20 000 v Evropské unii. Muži jsou postiženi přibližně 1,5krát častěji než ženy. Nádor se nejčastěji objevuje ve věkové skupině 50-70 let. Většina karcinomů je sporadických, jenom asi 4 % je familiárních. U jedné třetiny nemocných je v době diagnózy zjištěna přítomnost metastáz a u více než poloviny nemocných s lokalizovaným nádorem onemocnění progreduje v dalším průběhu. Renální karcinom je urologickým onemocněním s nejvyšší letalitou. V České republice mortalita u RCC mírně přesahuje 40 % (www.svod.cz).
Díky rozšíření používání
počítačových diagnostických metod jako ultrazvuk a počítačová tomografie se v posledních 25 letech zvýšil záchyt renálního karcinomu o 23-70 % (Graf 1) (Kawaciuk 2005). Česká republika tak zaujímá v incidenci RCC první místo na světě (Graf 2).
Graf 1 - Incidence a mortalita RCC v ČR (převzato z www.svod.cz)
Výskyt RCC je totiž z velké části ovlivněn životním stylem. Jen kouření zvyšuje riziko vzniku RCC až o 20-30 %. Mezi rizikové faktory patří také obezita a hypertenze (Klener 2002). Další rizikový faktor je častá konzumace smaženého a uzeného masa. Silný protektivní účinek je připisován konzumaci ovoce, zejména citrusů (Kawaciuk 2005). Vyšší výskyt renálního karcinomu ve východní Evropě je dáván do souvislostí 13
s horším životním prostředím znečištěným polycyklickými aromatickými uhlovodíky, azbestem, olovem, kadmiem a organickými rozpouštědly (Adam et al. 2002).
Graf 2 - Srovnání incidence RCC v různých zemích světa (převzato z www.svod.cz)
1.4 Klinický obraz Karcinom ledviny může být zpočátku zcela asymptomatický nebo je jediným příznakem mikroskopická hematurie (Klener et al. 2002). Zjevná hematurie, hmatná rezistence a bolesti v bedrech jsou tři klasické symptomy, které však jsou pozorovány u méně než 10 % pacientů. Tyto příznaky jsou většinou spojeny se špatnou prognózou, nebo jsou projevem pokročilého stádia nádoru. Častá je také anemie, horečka a úbytek na váze. Mezi méně časté příznaky patří náhle vzniklá varikokéla nebo otoky dolních končetin. Mohou se také objevit i některé paraneoplastické syndromy, jako je hyperkalcémie či polyglobulie. Pestrá a necharakteristická symptomatologie v počátečním období růstu karcinomu komplikuje určení správné diagnózy a může zastírat pravý důvod obtíží. To je patrně jedna z příčin, proč je nádor diagnostikován až v pokročilejším stádiu (Kawaciuk 2005) .
14
1.5 Diagnostika Pro diagnostiku jsou klíčové zejména zobrazovací metody. Pomocí nich je možné určit vztah nádoru k okolním tkáním, rozlišit u nádoru část solidní a cystickou a detekovat i případnou sraženinu v dolní duté žíle. Zobrazovacími metodami je odhaleno 48 % nádorů. Nejčastěji je nádor ledviny diagnostikován při ultrasonografickém vyšetření, a to i v takových případech, kdy nebylo toto vyšetření indikováno z urologických důvodů (Adam et al. 2002). Za nejdůležitější vyšetřovací metodu se považuje počítačová tomografie (CT) s kontrastem. Její senzitivita je totiž až 95 % a umožňuje diagnostikovat nádory, jejichž průměr je menší než 3 cm (Kawaciuk 2005). Magnetická rezonance má oproti CT přednost v přesnějším posouzení vztahu nádoru k okolním strukturám a zejména ve vyšší senzitivitě k zobrazení rozšíření nádoru do renálních žil a do dolní duté žíly. Magnetická rezonance se také používá u nemocných, kterým nelze podat pro alergii nebo nedostatečnou funkci ledvin kontrastní látku před vyšetřením CT (Adam et al 2002). Radiologická vyšetření, při kterých se zobrazuje cévní řečiště pacientů, tedy angiografie a kavografie, se v současnosti používají méně často, protože všechny informace získané těmito metodami lze získat vyšetřením magnetickou rezonancí. K diagnostice malých nádorů se používá imunoscintigrafie, při které se aplikují monoklonální protilátky G-250 označené radionuklidem
131
I. Tyto protilátky se vážou
na antigeny exprimované na povrchu buněk RCC (Kawaciuk 2005).
1.6 Staging a grading RCC Stagingové systémy reflektují anatomické šíření onemocnění a staging nádoru je všeobecně uznáván jako nejdůležitější prognostický faktor u nádorů ledviny. V současnosti se nejvíce používají dva stagingové systémy - modifikovaná Robsonova klasifikace a TNM systém (Tabulka 2, 3) navržený Mezinárodní unií proti rakovině (UICC) při WHO v roce 1987 (Kawaciuk 2005).
15
Tabulka 2 – TNM klasifikace nádoru ledviny Primární nádor TX Primární nádor nemůže být posouzen T0
Primární nádor není přítomen
T1
Nádor ≤ 7 cm ve svém největším rozměru, omezený na ledvinu T1a Nádor ≤ 4 cm ve svém největším rozměru, omezený na ledvinu T1b Nádor ˃ 4 cm, ale ≤ 7 cm ve svém největším rozměru, omezený na ledvinu
T2
Nádor ˃ 7 cm ve svém největším rozměru, omezený na ledvinu
T3
Nádor se šíří do velkých žil nebo je přítomna invaze do nadledviny nebo do perinefrické tkáně, ale ne přes Gerotovu fascii (GF)
T3a Nádor s invazí do nadledviny nebo perinefrické tkáně, ale ne přes GF Nádor se zjevně šíří do žil ledviny, případně do jejich segmentárních větví nebo do T3b dolní duté žíly (VCI) pod úroveň bránice T3c Nádor se šíří do dolní duté žíly nad úroveň bránice nebo prorůstá do stěny VCI T4 Nádor prorůstá přes Gerotovu fascii Uzlinové metastázy Lateralita lymfatických uzlin (LU) nemá vliv na kategorii N. Je-li provedeno odstranění lymfatických uzlin, mělo by jich patalogické vyšetření zahrnovat nejméně osm . NX Regionální LU nemohou být posouzeny N0 Nejsou přítomny metastázy v regionální LU N1 Metastáza v jedné regionální LU N2 Metastázy ve více než jedné regionální LU Vzdálené metastázy MX Nemůže být posouzena přítomnost vzdálenách metastáz M0 Nejsou přítomny vzdálené metastázy M1 Vzdálené metastázy
Systém byl zpřesněn v roce 1992, když bylo přidáno rozdělení v každé kategorii podle průměru nádoru, vaskulárního šíření, postižení lymfatických uzlin a rozšíření metastáz. S těmito změnami se tento systém stal významným prognostickým indikátorem, který koreluje s přežitím a beznádorovým intervalem u všech kategorií. Robsonova klasifikace naproti tomu velikost nádoru nezohledňuje, což tuto klasifikaci znevýhodňuje (Tabulka 4). Systém TNM klade systematický důraz na místní a uzlinové šíření a na vzdálené metastázy. TNM klasifikace je předléčebnou klasifikací. Jejím morfologickým korelátem je pTNM klasifikace, kde platí obdobná kritéria jako v klasifikaci klinické.
16
Tabulka 3 - TNM klasifikace nádorů ledviny rozdělená do čtyř stádií Stádium I II III IV
T T1a-b T2 T1-2 T3a-C T4 T1-4 T1-4
N N0 N0 N1 N0-1 N0-1 N2 N0-2
M M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1
Tabulka 4 - Srovnání TNM a Robsonovy klasifikace TNM
Robsonova klasifikace
T1a-b
I
T2
I
T3a
II
T3b-c
IIIa
N1-2
IIIb
T3b-c N1-2
IIIc
T4
IVa
M1
IVb
Grading je cenný doplňující indikátor stagingu ohledně délky přežití. Poprvé byl použit v roce 1971 Skinerem (Tabulka 5) a později upraven Fuhrmanovou (Tabulka 6) do aktuálního čtyřstupňového schématu. V současnosti nejpoužívanější klasifikace je založena na rozměru, tvaru a obsahu jádra (Kawaciuk 2005). Obecný třístupňový grading založený na diferencovanosti nádoru pak nádory rozděluje na dobře diferencované (G1), středně diferencované (G2) a špatně diferencované (G3), přičemž poslední stupeň obecného gradingu zahrnuje v případě gradingu jaderného stupeň G3 a G4. Tabulka 5 - Grading podle Skinnera G1 G2 G3 G4
Jádra jsou neodlišitelná od normálních tubulárních buněk Jádra jsou často malá, mírně zvětšená a bez abnormálních jadérek Jádra jsou středně zvětšená, nepravidelná a různě tvarovaná, často s velkými jadérky, ale nejsou přítomny žádné bizarní formy Četná bizarní, obrovská jádra
17
Tabulka 6 - Grading podle Fuhrmanové G1 G2 G3 G4
Malá (10 μm), okrouhlá, uniformní jádra a nenápadná nebo nepřítomná jadérka Větší (15 μm) nepravidelná jádra a jadérka patrná až pod velkým zvětšením (400x) Větší (20 μm) výrazně nepravidelná jádra a zřetelně viditelná jadérka již při menším zvětšení (100x) Velká, bizarní, často jádra s četnými výběžky do cytoplazmy a objemným a hrudkovitým chromatinem
1.8 Léčba Jedinou efektivní metodou léčby primárního nádoru ledviny zůstává radikální nefrektomie, při které musí být odstraněn celý nádor s adekvátními operačními hranicemi. Radikální nefrektomie zahrnuje časné podvázání hilových cév a odstranění ledviny, včetně Gerotovy fascie (Obr. 1) a veškerého jejího obsahu, perirenálního tuku, nadledviny a odstranění lymfatických uzlin (Kawaciuk 2005). Obrázek 1 - Ledvina s Gerotovou fascií (http://medical-group.cityofhope.org, upraveno)
Ačkoliv je radikální nefrektomie stále považována za standardní léčbu pro lokalizovaný karcinom, je v současnosti již dobře ověřeno, že parciální resekce ledviny nebo dokonce prostá enukleace nádoru mohou být u pečlivě vybraných pacientů stejně efektivní (Kawaciuk 2005). Dosavadní zkušenosti potvrdily, že šetřící výkon může být proveden bezpečně, s nízkou morbiditou, zachováním dobré funkce ledviny, extrémně nízkou incidencí lokální recidivy a poměrně dlouhým beznádorovým intervalem. Jak radikální nefrektomie, tak záchovná operace mohou být provedeny laparoskopicky. 18
Radioterapie se u karcinomu ledviny nepoužívá, protože buňky karcinomu ledvin jsou značně radiorezistentní. Pokud bychom chtěli použít účinnou dávku záření, tedy 45-50 Gy, pak by došlo velkému nevratnému poškození ostatních orgánů. Radioterapie je indikována pouze jako paliativní léčba kostních nebo mozkových metastáz (Adam et al. 2002). Karcinom ledviny je obecně málo chemosenzitivní. Chemoterapie proto vyvolává jen málo léčebných odpovědí. Je to patrně zapříčiněno zvýšeným množstvím proteinu MDR-1, který odstraňuje chemoterapeutika z buňky. Největší účinnost byla pozorována při podání 5-fluorouracilu. Účinnost však nepřesahuje 15 % (Kawaciuk 2005). Pro malou účinnost klasické chemoterapie a značnou chemorezistenci renálního karcinomu se v současné době věnuje pozornost cílené léčbě. Jedná se především o používání monoklonálních protilátek a inhibitorů tyrozinkinázových receptorů (Obr. 2). Do první kategorie spadají protilátky panitumumab a bevacizumab (Klener et Klener 2010).
Obrázek 2 -
Schéma působení monoklonálních protilátek i kinázových inhibitorů
(převzato z Audenet et al. 2011)
19
Panitumumab je lidská monoklonální IgG2 protilátka s vysokou afinitou k receptoru pro epidermální růstový faktor. Váže se na extracelulární doménu receptoru. Inhibice příslušné signální kaskády vede k omezení proliferace, indukci apoptózy, ke snížení produkce IL-8 a vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF). Předpokladem účinnosti je přítomnost nemutovaného genu KRAS. KRAS je gen kódující proteiny, které se podílejí na regulaci proliferace, angiogeneze a metastazování (Holečková 2011). Bevacizumab je humanizovaná monoklonální protilátka proti VEGF. VEGF se za normálních
okolností
váže
na
receptor
VEGFR,
takže
neutralizací
VEGF
bevacizumabem je kompletně blokována novotvorba cév v nádorové tkáni (Klener et Klener 2010). Do
další
kategorie
patří
nízkomolekulární
tyrozin-kinázové
inhibitory
pazopanib, sunitinib, sorafenib, everolimus a temsirolimus. Pazopanib je inhibitor tyrozin-kinázových domén receptorů VEGFR, PDGFR a KIT a je určen především pro léčbu metastatického RCC. Jeho působení je antiangiogenní. Sunitinib je multikinázový inhibitor s inhibičním účinkem vůči PDGFR, KIT, RET, FLT3, VEGFR a CSF1R. Tato inhibice způsobuje omezení proliferace, buněčné invaze, angiogeneze a indukuje apoptózu (Vasquez et al. 2012). Sorafenib je multikinázový inhibitor. Nejenže snižuje proliferaci u nádorových buněk, ale inhibuje i proces angiogeneze blokováním VEGFR2 a VEGFR3 (Flaherty 2006). Temsirolimus je dihydroxyester sirolimu a patří mezi inhibitory mTOR. Snižuje aktivaci cyklin-dependentních kináz a fosforylaci Rb proteinu. Zastavuje tak buňky v G1 fázi. Inhibuje také translaci HIF1α, čímž omezuje aktivitu VEGF a působí tak jako inhibitor angiogeneze. Everolimus patří také mezi inhibitory mTOR. Na rozdíl od temsirolimu proniká hematoencafalickou bariérou a lze ho proto použít k léčbě mozkových metastáz (Klener et Klener 2010).
1.9 Molekulární patologie renálního karcinomu Do skupiny karcinomů ledviny se v současné době řadí více typů tohoto nádoru. Každý má přitom rozdílný klinický průběh, odpověď na terapii a každý je také způsoben mutacemi v jiných genech. Za vznik nejčastějšího typu RCC, tj. ccRCC je zodpovědný gen VHL. Mutace v tomto genu zapříčiňuje vznik jak dědičné, tak i sporadické formy ccRCC (Linehan et al. 2010). Gen MET je naproti tomu zodpovědný za dědičnou formu pRCC a určité procento sporadického pRCC. Na vzniku chRCC se podílí gen BHD, který zapříčiňuje jeho dědičnou formu. Mezi další geny podílející se na 20
vývoji RCC patří také VEGF a PDGF, účastnící se angiogeneze, která umožňuje další vývoj nádoru (Lee et al. 2005). Za změny ve fungování metabolizmu jsou pak zodpovědné geny FH a SDHB začleněné ve fungování Krebsova cyklu a gen ABCB1 zodpovídající za chemorezistenci RCC (Tomlinson et al. 2002, Kitada et Jamasaki 2007). Do klíčových regulačních procesů je také zapojená dráha PI3K/AKT/mTOR (Fingar et al. 2004). 1.9.1 VHL Gen von Hippel-Lindau (VHL) je nádorový supresor a mutace v tomto genu jsou zodpovědné za dědičnou i sporadickou formu ccRCC (Bukowski et al. 2009). VHL se nalézá na lokusu 3p25.3 (Hejna et al. 2000). Protein kódovaný tímto genem je součástí proteinového komplexu, který zahrnuje elongin B, elongin C, cullin-2 a má E3 ubiquitin ligázovou aktivitu. VHL tímto způsobem řídí polyubiquitinylaci transkripčního faktoru HIF-α. Takto označený HIF-α je pak degradován v proteazomu (Tanimoto et al. 2000). V buňkách, které postrádají funkční VHL nebo jsou vystaveny hypoxii, se HIF-α akumuluje a váže se na protein HIF-β (Maxwell et al. 1999). Tento heterodimer se váže na specifické sekvence na DNA a transkripčně aktivuje geny zapojené do adaptace na hypoxii. Nadprodukce takovýchto hypoxií indukovaných mRNA je jedním ze znaků nádorů, které neobsahují funkční pVHL. Nosiči jedné funkční a jedné mutované alely mají zvýšené riziko vzniku různých typů nádorů zahrnující hemangioblastomy, feochromocytomy a nádory ledvin (Kaelin 2002). U onemocnění syndromem von Hippel-Lindau dochází ke ztrátě zbývající funkční alely VHL, což zapříčiňuje vznik renálních cyst (Mandriota et al. 2002). U 40 až 80 % sporadických ccRCC byla zjištěna bialelická inaktivace VHL. U některých ccRCC je pak způsobena nepřítomnost VHL hypermetylací promotoru VHL (Kim et Kaelin 2004).
1.9.2 HIF Hypoxická signalizace je zprostředkována malou skupinou transkripčních faktorů, známých jako faktory indukované hypoxií (HIF). Tyto faktory regulují expresi více než dvou stovek genů začleněných do procesů angiogeneze, invazivity a regulace buněčného dělení. Cílové proteiny regulované HIF zahrnují VEGF, PDGF, EGFR, TGFα, HEF-1, GLUT1 a MUC1 mnoho dalších (Semenza 2010). HIF fungují jako heterodimery sestávající z α (HIF-1α nebo HIF-2α) a β podjednotky (HIF-1β). Zatímco 21
HIF-1β je v buněčném jádru přítomen stále, přítomnost HIF-1α je závislá na nedostatku kyslíku. Za hypoxie se HIF-1α translokuje do jádra, spojí se s HIF-1β a tak aktivují p300/CBP, který následně indukuje expresi cílových genů (Obr. 3). Promotory těchto genů totiž obsahují elementy odpovídající na hypoxii (HRE) (Semenza 2003). Ve zdravých buňkách je tato aktivace pouze dočasná. Při dostatku kyslíku je HIF-1α hydroxylován prolinovou a asparaginovou hydroxylázou (Kaelin 2005). Tyto hydroxylace umožní navázání na VHL, který HIF-1α ubiquitinuje. Na rozvoji RCC se ale pravděpodobně ve větší míře podílí HIF-2α než HIF-1α (Bertout et al. 2009).
Obrázek 3 - Regulace genové exprese pomocí HIF-1α (převzato z Araki et al. 2011)
1.9.3 VEGF, PDGF Pro růst a vývoj nádoru je klíčové dostatečné cévní zásobení a novotvorba cév. Stěžejní roli v angiogenezi má u RCC endoteliální růstový faktor. Gen pro vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) se nachází na lokusu 6p12 (Wei et al. 1996). 22
Proteiny VEGF patří svou strukturou do rodiny růstových faktorů, kam patří také PDGF a TGF-β. U člověka existuje pět různých izoforem VEGF (Lee et al. 2005). VEGF je silný mitogen působící na vaskulární endoteliální buňky (Ferra et al. 1989). Je to patrně jediný chemokin, který může přímo stimulovat proliferaci endoteliálních buněk podporovanou přes navázání a dimerizaci transmembránových buněčných receptorů. VEGF se váže především na receptory VEGFR1 a VEGFR2 (Poltorak et al. 1997). Tyto receptory jsou přítomné na endoteliálních buňkách a různé izoformy VEGF kompetují mezi sebou o navázání na tyto receptory. S nádory je většinou spojována izoforma VEGF145, která je dostatečným induktorem k formování nové vaskulatury. Nejen že stimuluje prodlužování stávajících cév, podporuje také jejich větvení, čímž vniká zcela nová cévní síť. Nádorová cévní síť je na rozdíl od normální vaskulatury neorganizovaná. Cévy se nepravidelně kroutí, jsou nadměrně větvené a bez souvislé bazální membrány (Baluk et al. 2005). Tok krve je díky nedokonalé vaskulatuře neuspořádaný a odlišný v různých částech nádoru. Kvůli nedokonalému endotelu a absenci pericytů se tyto cévy vyznačují zvýšenou propustností, což
vede
ke zvýšení intersticiálního tlaku v nádoru. Společně s VEGF se na angiogenezi významně podílí i růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF). Rodina proteinů PDGF sestává z růstových faktorů, přičemž každý z nich obsahuje jeden ze čtyř polypetidových řetězců PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C nebo PDGF-D (Lee et al. 2000). Tyto řetězce jsou kódovány čtyřmi různými geny nalézajícími se na chromozomech 7, 22, 4 a 11. Po dimerizaci PDGF a navázání na tyrozin-kinázové receptory PDGFR-α nebo PDGFR-β dochází k aktivaci signálních enzymů zahrnujících Src, PI3K a PLC-γ1 (Talquist et al. 2004). Zvýšená exprese PDGF byla prokázána v mnoha typech nádorů (Bukowski et al. 2008). Je prokázáno, že hraje důležitou roli v procesech, zahrnujících autokrinní stimulaci nádorových buněk a angiogenezi vedoucí k rozvoji nádoru.
1.9.4 MET Gen MET je protoonkogen a jeho mutantní alela se nachází u většiny dědičných pRCC. Leží na lokusu 7q31 a jeho produktem je povrchový tyrozin-kinázový receptor pro jaterní růstový faktor (HGF) (Verine et al. 2010). MET je exprimován v časné fázi vývoje a jeho exprese přetrvává i v dospělosti. Spolu se svým ligandem HGF je MET více exprimován při poranění ledvin, kdy funguje jako mechanismus pro tkáňovou opravu a regeneraci (Matsumoto et Nakamura, 23
2001). Po navázání ligandu MET aktivuje různé efektorové molekuly uvnitř buňky, např. Grb2, Gab1, PI3K, Shc a Src. Obzvlášť velký význam má Grb2, který je zapojen do regulace buněčného cyklu pomocí navázání na Ras/MAPK dráhu a do regulace buněčné migrace a invaze (Giubellino et al. 2009).
1.9.5 BHD Gen Birt-Hogg-Dubé (BHD) se nachází na lokusu 17p11.2 (Khoo et al. 2001). Mutace v tomto genu je příčinou syndromu Birt-Hogg-Dubé. Jedná se o autozomálně dominantní onemocnění charakteristické tvorbou fibrofolikulomů a plicních cyst, spontáním pneumothoraxem a nádory ledvin (Baba et al. 2006). Produkt tohoto genu, známý také jako folikulin, funguje jako nádorový supresor a u RCC je velmi často pozorována ztráta BHD lokusu (Khoo et al. 2001). U 15-30 % pacientů s Birt-HoggDubé syndromem se vyskytuje renální karcinom, zahrnující onkocytom, chRCC, pRCC a ccRCC (Woodward et al. 2008). Toto rozpětí histologických typů RCC, které se vyskytují u pacientů s BHD syndromem, je způsobeno rozdílným genetickým pozadím nebo dalšími změnami v genové expresi ostatních genů (Woodward et al. 2008).
1.9.6 Dráha PI3K/AKT/mTOR Signální dráha PI3K/Akt/mTOR reguluje buněčný růst, metabolismus, proliferaci a motilitu buněk. Mutace v genech, které jsou zapojeny do této dráhy, jako PI3K nebo PTEN, jsou často nalézány v mnoha typech nádorů. Dráha PI3K/Akt/mTOR hraje důležitou roli v odpovědi buňky na hypoxické podmínky (Sansal et Sellers, 2004). Těmto podmínkám jsou nádorové buňky vystaveny v důsledku nadměrné proliferace, která není doprovázena dostatečnou tvorbou nových cév. Deregulace dráhy PI3K/AKT/mTOR vede k rezistenci nádorových buněk vůči radioterapii a chemoterapii. V důsledku toho bylo mnoho úsilí věnováno vývoji látek inhibujících tuto dráhu. Účinnými inhibitory mTOR se v nedávné době ukázaly být deriváty rapamycinu everolimus a temsirolimus, které se používají při léčbě metastatického renálního karcinomu (Klener et Klener, 2010). mTOR je členem rodiny strukturně podobných kináz obsahujících strukturní domény FAT, FATC a HEAT, které zprostředkovávají protein-proteinové interakce. Tyto domény umožňují interagovat mTOR s ostatními proteiny, což z něj dělá jeden z klíčových proteinů v buněčné regulaci (Fingar et al. 2004). 24
mTOR funguje ve dvou multiproteinových komplexech (Obr. 4) - TOR komplex 1 (TORC1) a TOR komplex 2 (TORC2) (Inoki et Guan, 2006), který je zapojen do kontroly morfologie buňky a její adheze skrz regulaci proteinkinázy Cα a dále fosforyluje a aktivuje Akt (Sarabassov et al. 2005). TORC1 pomocí fosforylace proteinů p70 a proteinu vázajícího eukaryotický faktor 4E (4E-BP1) kontroluje translaci cyklinu D, c-Myc a dalších klíčových proteinů regulujících proliferaci a rovněž reguluje expresi a stabilitu HIF-1α (Fingar et al. 2004).
Obrázek 4 - Signální dráha mTOR (převzato z Inoki et Guan 2006) Mezi další geny, které se na patologii RCC také podílejí z menší části, patří FH, SDHB, ABCB1. Gen pro fumarát hydratázu (FH), která hraje klíčovou roli v Krebsově cyklu, se nachází na lokusu 1q42.1 (Tomlinson et al. 2002). Mutace v tomto genu je příčinou syndromu hereditární leiomyomatózy a renálního karcinomu (HLRCC). HLRCC je vrozené autozomálně dominantní onemocnění, při kterém dochází ke vzniku pRCC. Mutace v genu pro podjednotku B sukcinát dehydrogenázového komplexu (SDHB; lokus 1p36) (Verine et al. 2010), který rovněž hraje důležitou roli v Krebsově cyklu, může byt příčinou ccRCC, chRCC a onkocytomu (Ricketts et al. 2008). Podobně jako BHD syndrom je i mutace v SDHB spojena s různými histologickými podtypy nádorů ledvin (Henderson et al. 2009). Gen ABCB1 se nalézá na lokusu 7q21.12 (Kitada et 25
Jamasaki 2007). Jeho produkt MDR-1 je jednou z nejdůležitějších součástí mechanizmu buněčné multirezistence (Kawaciuk 2005). MDR-1 za pomoci ATP funguje jako pumpa, která odstraňuje z buněk xenobiotika (Kitada et Jamasaki, 2007).
1.10 MikroRNA MikroRNA (miRNA) jsou 18-22 nukleotidů dlouhé molekuly RNA, které mají schopnost sekvenčně specificky post-transkripčně regulovat genovou expresi (Timmons et al. 2003). Po navázání miRNA na 3´ nepřekládanou oblast (UTR) mRNA dochází u cílové mRNA buď k degradaci nebo translační represi. V lidském genomu se nachází kolem 1500 genů pro miRNA (miRBase, březen, 2012). Jedná se tedy o největší genovou rodinu v lidském genomu. Každá miRNA je schopna regulovat víc než stovku genů (Lim et al. 2005). Všechny lidské miRNA dohromady tak mohou regulovat až jednu polovinu genů (Kunei et al. 2011). Fakt, že jednotlivé miRNA mohou regulovat mnoho cílových mRNA, a že jedna mRNA může být regulována mnoha miRNA, znamená, že v buňkách existuje komplexní regulační síť interakcí mezi molekulami RNA. První miRNA lin-4 byla objevena v roce 1993 u hlístice Caenorhabditis elegans (Lee et al. 1993). Tato miRNA reguluje expresi proteinu LIN-14, který je zapojen do regulace postembryonálního vývoje. Jako další byla v roce 2000, také u C. elegans, objevena miRNA let-7 (Reinhart et al. 2000). let-7 negativně reguluje expresi genu lin41, který se, stejně jako LIN-14, účastní regulace exprese transkripčního faktoru LIN-29 podílejícím se na larválním vývoji (Slack et al. 2000). MiRNA byly před tímto objevem pokládány jen za produkty degradace delších molekul mRNA a o jejich roli v buněčné regulaci se neuvažovalo. Objasnění funkce těchto malých RNA molekul bylo proto tak přelomový objev, že za něj jeho autoři Andrew Z. Fire a Craig C. Mello v roce 2006 právem dostali Nobelovu cenu.
1.10.1 Biogeneze Primární miRNA (pri-miRNA) vzniká v jádře transkripcí genu pro miRNA prostřednictvím RNA-polymerázy II a III (Lee et al. 2004, Burchert et al. 2006). V primárním transkriptu může být přítomno několik pri-miRNA vedle sebe a podobně jako ostatní transkripty má na 5’ konci 7-methylguanosinovou čepičku (CAP) a poly-A konec na 3’ konci (Lee et al. 2004). Primární transkript má vlásenkovou strukturu a je 26
v jádře štěpen RNázou III zvanou Drosha za přítomnosti proteinu Pasha (DGCR8) vázajícího RNA (Denli et al. 2004). Účinnost tohoto štěpení zavisí na velikosti koncové smyčky, struktuře dvouřetězcových úseků a sekvenci kolem místa štěpení. Zkrácení koncové smyčky, porušení komplementarity dvouřetězcových úseků nebo změna v sekvencích sousedících s místem, kde Drosha pri-miRNA štěpí totiž vede k významnému poklesu účinnosti tohoto procesu nebo dokonce naprostému zamezení štěpení pri-miRNA. Tímto štěpením vznikají 70 až 60 nukleotidů dlouhé vlásenky, tzv. prekurzorové miRNA (pre-miRNA) s dvounukleotidovým přesahem na 3´ konci (Zeng et Cullen 2003). Pre-miRNA jsou z jádra exportovány do cytoplazmy Exportinem 5 (XPO5), který patří do třídy Ran-GTP dependentních transportních proteinů (Lund et al. 2004). XPO5 reaguje s pre-miRNA na relativně širokém povrchu pomocí slabých interakcí, čímž je zaručena schopnost transportovat různé pre-miRNA se strukturními rozdíly. Dodáním GTP je umožněno exportování do cytoplazmy, kde je pre-miRNA štěpena proteinovým komplexem Dicer ve spolupráci s proteinem TRBP (TAR RNA vázající protein) (Lee et al. 2011). Samotné štěpení probíhá po intramolekulární dimerizaci obou RNázových domén. Tyto domény pak štěpí fosfodiesterové vazby na dsRNA zároveň, avšak každá na jiném řetězci (Zhang et al. 2004). Vniká tak 21 nukleotidů dlouhý dvojřetězec miRNA:miRNA*. Vedoucí řetězec (tzv. „guide strand“) je pak začleněn do multienzymového komplexu známého jako „RNA-induced silencing complex“ (RISC). RISC se skládá z proteinu Ago2, miRNA, TRBP a Diceru. Ago2 patří do rodiny argonautových proteinů (Maister et al. 2004). Druhý řetězec (tzv. „passenger strand“) je odstraněn a degradován. Na výběru aktivního vlákna má vliv jeho stabilita na 5´ konci (Khvorova et al. 2003). Pro začlenění do RISCu je většinou vybráno vlákno s menší stabilitou na 5´ konci. Pro správné fungování komplexu RISC je zapotřebí přítomnost endonukleázového komplexu C3PO, který se podílí na odstranění neaktivního („passengerového“) řetězce (Ye et al. 2011). Po začlenění aktivního vlákna miRNA do RISCu může tento komplex inhibovat translaci dvojím způsobem. V závislosti na míře komplementarity miRNA a cílové mRNA dojde buď k rozštěpení cílové mRNA nebo k translační represi (Doench et Sharp 2004). Při translační represi sice nedochází k translaci, avšak úroveň cílové mRNA zůstává nezměněna. K degradaci mRNA nemusí ovšem docházet jen při dokonalé
komplementaritě.
Jedná
se
o 27
degradaci
nezávislou
na
dokonalé
komplementaritě, která se vyznačuje deadenylací na 3´ konci mRNA (Wu et al. 2006). Za určitých stresových podmínek ovšem může miRNA naopak aktivovat translaci, a to za pomoci koplexu Ago2-FXR1 (Vasudevan et al. 2007).
1.11 Význam miRNA v kancerogenezi Výsledky výzkumů zabývajících se nádorovou transformací ukázaly, že drtivá většina nádorových buněk se projevuje šesti základními změnami v buněčné fyziologii, které spoluurčují maligní růst nádorové tkáně. Jedná se o soběstačnost v produkci růstových signálů, necitlivost k protirůstovým signálům, poškozenou apoptózu, neomezený replikační potenciál, schopnost angiogeneze, invaze a tvorby metastáz (Hanahan et Weinberg, 2000). Každá z těchto změn ve fyziologii buňky představuje prolomení
buněčného
protinádorového
mechanizmu.
Tyto
charakteristiky
pravděpodobně sdílejí všechny typy nádorů. Poprvé byla role miRNA v kancerogenezi naznačena v roce 2004. Ve studii zabývající se mapováním genů pro miRNA bylo zjištěno, že se nacházejí na fragilních místech chromozomů, stejně tak v amplifikovaných lokusech nebo v oblastech s častou ztrátou heterozygozity (Calin et al. 2004a). V navazující studii byla tato teorie podpořena objevením rozdílných expresních vzorů mezi B-lymfocty pacientů postižených chronickou lymfocytární leukemií (CLL) a zdravými CD5+ B-lymfocyty (Calin et al. 2004b). Od té doby byla publikována celá řada studií dokazujících významnou roli miRNA v kancerogenezi. Ukázalo se, že zasahují do regulace angiogeneze, metastazování, proliferace i diferenciace buněk (Zhang et al. 2006).
1.11.1 MiRNA a VHL/HIF angiogenní signální dráha Stejně jako mnoho typů solidních nádorů jsou i nádory ledvin často charakterizovány hypoxickými podmínkami, které jsou zapříčiněny nerovnováhou mezi dodávaným a spotřebovávaným kyslíkem (Vaupel et al. 2007). Hypoxie a kompenzační angiogeneze jsou u RCC obzvláště důležité, v porovnání s ostatními nádory, pro svou specifickou asociaci s mutacemi genu VHL. Produkt tohoto genu společně s elonginem B, elonginem C a cullinem 2 (CUL2) tvoří ubiquitin-ligázový komplex, který zprostředkovává degradaci proteinů indukovaných hypoxií, mezi které patří i HIF-1α (Clifford et al. 1999). Při hypoxických podmínkách nebo inaktivaci VHL tak dochází ke zvýšené expresi HIF-1α. HIF-1α pak funguje jako transkripční faktor vázající se na 28
HRE v promotorech genů, které jsou při hypoxii aktivované. HIF-1α je tak spíše považován za onkogen, než za nádorový supresor. Některé studie však naznačují, že růst nádorů může být prostřednictvím HIF-1α i inhibován (Raval et al. 2005). O HIF-1α je známo, že reguluje mnoho genů zapojených do angiogeneze, glykolýzy a transportu glukózy např. VEGF, PGK a GLUT1. Nicméně indukuje také expresi proteinů umožňujících zastavení buněčného cyklu a buněčnou smrt jako jsou p21, p27 a NOXA (Kim et al. 2004). Ukázalo se, že mezi takto regulované geny patří i gen pro miR-210 (Huang et al. 2010). Ektopická exprese miR-210 v buněčných liniích odvozených z nádoru hltanu (FaDu) a slinivky (SU86.86) zpomalila u myší, kterým byly tyto buňky implantovány, růst nádoru a úroveň exprese miR-210 v těchto nádorech negativně korelovala s velikostí nádoru. Zvýšenou hladinou miR-210 se také vyznačují nádory se stupněm gradingu G3 a G4 a také nádory s metastázami v lymfatických uzlinách (Valera et al. 2011). V nádorech ovaria byla naopak pozorována častá delece lokusu, kde se gen pro miR-210 nalézá (Giannakakis et al. 2008). Mezi cílové geny miR-210 patří MNT, který je antagonistou MYC (Zhang et al. 2009). Exprese miR-210 také silně koreluje s expresí karbonické anhydrázy IX (CIAX) (Neal et al. 2010). U pacientů s delší celkovou dobou přežití byla v RCC prokázána nižší hladina miR-210.
1.11.2 MiRNA a metabolizmus Kromě klasických drah začleněných do kancerogeneze jsou v poslední době dávány do souvislosti s patofyziologií řady nádorových onemocnění i metabolické dráhy. U RCC jsou většinou deregulovány nejen dráhy mající vztah k metabolizmu kyslíku, ale i železa, fungování Krebsova cyklu a zpracování živin. Z těchto důvodů je možné se na RCC dívat i také jako na nemoc buněčného metabolizmu (Linehan et al. 2010). U RCC byla např. zjištěna snížená hladina guanin deaminázy GDA (Lichtenfels et al. 2009). Toto snížení koreluje se zvýšenými hladinami miR-106a a miR-185. Protože je tento gen zodpovědný za degradaci guaninu, je snížením jeho exprese umožněna nádorovým buňkám rychlejší proliferace, a to díky pomalejšímu odbourávání guaninu potřebného pro syntézu nové DNA. U RCC byla také pozorována zvýšená exprese glutaminázy, která je doprovázena poklesem exprese miR-141 (Craven et al. 2006). 29
MiR-210 inhibuje také expresi proteinu ISCU (iron sulfur scaffold protein). Je to mitochondriální protein potřebný pro tvorbu železno-sirných klastrů, které slouží jako kofaktory pro klíčové enzymy zapojené do Krebsova cyklu, elektron-transportního řetězce a metabolizmu železa. Snížená exprese ISCU při hypoxii je hlavní příčinou tvorby reaktivních kyslíkových radikálů (ROS). Potlačení exprese ISCU vede ke snížení jak aktivity mitochondriálního komplexu 1, tak i ke snížení aktivity akonitázy, což způsobí posun směrem ke glykolýze a tak zvýší přežití buněk. Pacienti s nádory s nízkou hladinou ISCU mají horší prognózu (Favaro et al. 2010). U RCC byla nedávno zjištěna také snížená hladina jodotyronin dejodinázy typu 1 (DIO1) (Pachucki et al. 2001). Jedná se o enzym zapojený do metabolizmu tyroidních hormonů, které hrají důležitou roli v růstu, vývoji, diferenciaci a regulaci buněčných metabolických drah. mRNA pro tento protein je cílovou molekulou miR-224, jejíž hladina byla u ccRCC zvýšená (Boguslavska et al. 2011).
1.11.3 Epiteliálně mezenchymální tranzice a invazivita K tomu, aby nádorové buňky získaly schopnost metastazovat, je zapotřebí, aby původně epiteliální buňky získaly vlastnosti buněk mezenchymálních. Pro proces epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) je charakteristická ztráta adhezivních molekul epiteliálních buněk jako je E-kadherin a integrin. Místo nich dochází k expresi vimentinu a fibronektinu, což je znak mezenchymálních buněk (Zeisber et Nelson 2009). Několika studiemi bylo prokázáno významné snížení exprese miR-141 a miR-200c u ccRCC v porovnání se zdravou renální tkání (Jung et al. 2009; Nakada et al. 2008). MiR-141 a miR-200c patří do do rodiny miR-200 a obě inhibují EMT represí ZEB1 a SIP1, což jsou represory E-kadherinu (Gregory et al. 2008). SIP1 může také kromě inhibice exprese E-kadherinu přímo aktivovat expresi vimentinu, což je jeden ze znaků metastatického ccRCC (Park et al. 2008). Schopnost migrace buněk je dávána také do souvislosti s poklesem exprese miR-200b, miR-200c, miR-429 a miR-204, které snižují expresi moesinu a ezrinu, které patrně podporují zvýšení migrace buněk RCC (Seliger et al. 2010). Zvýšená exprese cytoskeletálních proteinů moesin/ezrin/radixinové rodiny je často detekována ve studiích proteomu RCC (Craven et al. 2006).
30
Do regulace invazivity a migrace je také zapojena miR-205, která je u RCC snížená. Její cílovou mRNA je FAK (kináza fokálních adhezí) (Majid et al. 2011), což je nereceptorová tyrozinkináza asociovaná s integrinovou β podjednotkou. Je zapojena do utváření fokálních adhezí spojených s F-aktinovým kontraktilním aparátem, který je napojen na buněčnou membránu. Aktivuje migraci buněk díky interakci s extracelulární matrix (ECM) (Barliya et al. 2011). Aktivace FAK může být také způsobena mutací v PTEN nebo jeho inhibicí prostřednictvím miR-21. Mezi substráty, které jsou aktivovány pomocí FAK, patří i Ras a PI3K (Meng et al. 2007). Mezi další miRNA specificky exprimované v ccRCC patří miR-143. Tato miRNA inhibuje expresi myosinu 6 (MYO6) a proteinkinázy 7 aktivované mitogenem (MAPK7/ERK4) (Huang et al. 2009). Snížená exprese miR-143 byla naopak pozorována u nádorů prostaty a močového měchýře (Szczyrba et al. 2010; Li et al. 2011). U nádoru močového měchýře redukuje zvýšená exprese miR-143 růst a migraci nádorových buněk inhibicí exprese COX-2 (Song et al. 2011). V RCC je patrně miR143 zapojena do regulace buněčného cyklu, protože mezi její predikované cíle patří VHL a p53 (Fendler et al. 2011; Valera et al. 2011). K dalším miRNA podílejícím se na metastazování patří miR-584. Její hladina je u ccRCC snížená (Ueno et al. 2011). Mezi její cílové geny patří ROCK-1, který je aktivován pomocí RhoA. Ektopická exprese miR-584 v buněčných liniích odvozených z RCC (A-498, 769-P) způsobila pokles pohyblivosti a viability buněk (Ueno et al. 2011).
1.11.4. MiRNA a apoptóza Mezi procesy, na jejichž regulaci se miRNA podílejí, patří i apoptóza. K těmto miRNA patří např. miR-1826. U RCC buněk s inaktivovaným VHL reprimuje miR1826 expresi β-kateninu a MEK1. Po transfekci buněčných linií pomocí pre-miR-1826 se ukázalo, že také inhibuje proliferaci, invazi a buněčnou migraci. Navíc miR-1826 podporuje apoptózu a zastavuje buňky v G1 fázi buněčného cyklu (Hirata et al. 2012). V mnoha studiích byla u RCC také detekována snížená hladina miR-375, mezi jejíž cílové molekuly patří JAK2 kináza (Ding et al. 2010). Signální dráha, do které jsou zapojeny Janusovy kinázy, aktivuje transkripční faktory STAT, jejichž aktivita přispívá ke vzniku nádorů pomocí regulace aktivity řady růstových faktorů, apoptózy a angiogeneze. Stálá aktivace STAT1, STAT3 a STAT5 byla zjištěna nejen u RCC, ale i u dalších typů nádorů (Bromberg 2002). Snížená hladina miR-375 také ovlivňuje expresi 31
adeponektinového receptoru ADIPOR2, přičemž snížená exprese ADIPOR2 byla detekována u 40 % pacientů s RCC (Pinthus et al. 2008). Tyto receptory jsou zapojeny do regulace apoptózy a proliferace (Mistry et al. 2006). Na apoptózu má také vliv miR21. Její zvýšená hladina byla detekována ve většině RCC. Mezi její cílové molekuly, které mají vliv na apopotózu patří PTEN, Akt a PDCD4 (programmed cell death 4) (Catto et al. 2011). PDCD4 inhibuje translaci, moduluje aktivitu JUN kinázy a inhibuje expresi MAP4K1a zasahuje tak i do řízení invaze. Blokování apoptózy pomocí miR-21 se děje také prostřednictvím inhibice transkripce p53 (Saal et Harvey 2009). Kromě toho zasahuje miR-21 inihibicí SMAD7 do fungování signální dráhy TGF-β a ovlivňuje tak buněčnou diferenciaci. Zvýšená hladina miR-21 koreluje s nižší dobou přežití (Zaman et al. 2012). Po snížení exprese pomocí anti-mir-21 došlo v buněčných liniích Caki-1 a OS-RC-2 (RCC linie) ke zvýšení exprese TIMP3 a Fas ligandu (FASL), které jsou přímými cíli miR-21(Zhang et al. 2011). Také byla zaznamenána pozitivní korelace mezi hladinou miR-21 a velikostí nádoru (Neal et al. 2010). Míru apoptózy může ovlivňovat i miR-210. Bylo prokázáno, že po tansfekci buněčných linií zastavuje anti-miR-210 proliferaci a stimuluje apoptózu (Fasanaro et al. 2008). Na apoptózu má také vliv miR-509-3p (Zhai et al. 2012). Spolu s miR-508-3p jsou v RCC jejich hladiny významně nižší a obě potlačují migraci buněk. Do regulace apoptózy je zapojena také miR-185 (Liu et al. 2010). Zvýšené hladiny této miRNA byly nalezeny u mnoha typů nádorů včetně RCC. Mezi její cílové mRNA patří mimo jiné i PTEN, který reguluje aktivitu Akt skrz odbourávání PIP3 na PIP2. Akt je zapojen do inhibice např. FAS dependentní apoptózy, uvolnění cytochromu C nebo aktivace kaspázy 9. Další funkcí miR-185 je pak také inhibice KCNJ16, což je draselný kanál, který má důležitou úlohu v buněčném růstu (Felipe et al. 2006). PTEN je dále regulován pomocí miR-221 a miR-222 (Garofalo et al. 2009). Zvýšená hladina těchto miRNA částečně vysvětluje chemorezistenci RCC, protože dráha PI3K/Akt hraje v rezistenci důležitou roli (Garofalo et al. 2008). Kromě PTEN je další cílovou molekulou miR-221 a miR-222 i TIMP3, který je začleněn do aktivace kaspáz (Lee et al. 2008). K dalším miRNA zapojeným do regulace apoptózy patří také miR-155. Zvýšené hladiny této miRNA byly prokázány v mnoha typech nádorů (Wang et Lee 2010). Jejím cílovým genem je TP53INP1 (tumor protein 53-induced nuclear protein 1).
Je to
proapoptický protein indukovaný pomocí p53 (Tomasini et al. 2001). Zvýšená exprese TP53INP1 indukuje zástavu buněčného cyklu a apoptózu dokonce při absenci p53 (Tomasini et al. 2005) 32
1.11.5 MiRNA a buněčný cyklus V souvislosti s regulací buněčného cyklu byla identifikována miR-24, jejíž hladina je zvýšená ve všech typech RCC v porovnání se zdravou tkání. Ukázalo se, že miR-24 reprimuje v mnoha buněčných liniích inhibitor buněčného cyklu CDKN2A (p16) (Lal et al. 2008). Ztráta CDKN2A lokusu (9p21.3) je detekována u 35 až 40 % ccRCC, avšak nízká hladina p16 je patrná u více než 80 % ccRCC. Je proto možné, že ztráta p16 u RCC bez ztráty 9p je pravděpodobně zprostředkována zvýšenou expresí miR-24. Pacienti s nízkou hladinou p16 mají většinou horší prognózu (Ikuerowo et al. 2007) Zvýšená hladina miR-21 byla nalezena v různých typech nádorů, jako jsou nádory plic, kolorekta, ledvin, hlavy, krku a mnohé další (Zaman et al. 2012). Pro snížení hladiny této miRNA byla použita antisense miR-21. Jedná se o komplementární RNA k miR-21. Po aplikaci anisense miR-21 dochází k nárůstu exprese p21 a p38 MAP kináz a k poklesu exprese cyklinu E2 a cyklin-dependentní kinázy E2 (CDKE2). Tato snížená exprese cyklinu E2 a CDKE2 omezuje fosforylaci Rb, což zabraňuje přechodu z G1 do S fáze buněčného cyklu. Na inhibici proliferace se dále mohou podílet např. miR-508-3p a miR-509-3p (Zhai et al. 2012). Jejich cílové mRNA zatím ovšem nejsou známy. Mezi další miRNA ovlivňující proliferaci patří miR-205 (Majid et al. 2011). Cílem této miRNA jsou geny pro proteiny Src, Lyn a Yes. Po zvýšení exprese miR-205 a tudíž blokování Src onkogenní dráhy došlo v buněčné linii A498 k zastavení buněčného cyklu v G0/G1 fázi. Také bylo pozorováno snížení hladiny cyklinu D1 a cmyc. Pro miR-205 je další cílovou molekulou mRNA pro STAT1. STAT1 je transkripční faktor zvýšeně exprimovaný u RCC. Je to jeden z genů, který zodpovídá za rezistenci k chemoterapii a radioterapii (Zhu et al. 2012). Po snížení exprese STAT1 došlo u buněčné linie 786-O k redukci hladiny genů spojených s kontrolním bodem G1/M, a to p21, GADD45A a Rb. Došlo také ke zvýšení citlivosti na radioterapii a taxol (Zhu et al. 2012).
33
1.12 Využití miRNA v diagnostice Většina karcinomů ledvin zůstává velmi dlouhou dobu zcela bez symptomů. První příznaky jsou nevýrazné, variabailní a necharakteristické. Léčba se tak často oddaluje. V současnoti zatím neexistuje žádná diagnostická metoda, pomocí které by se dal RCC odhalit dřív, než se objeví první závažné příznaky jako je hematurie a bolest v bedrech (Kawaciuk 2005). Včasná diagnostika je přitom u onkologických onemocnění podmínkou úspěšné léčby. Jedna z důležitých oblastí diagnostiky onkologických pacientů je odlišit pacienty nemetastatické od pacientů s metastázami. V současné době se k tomuto rozlišení používá vyšetření regionálních uzlin odebraných při resekci nádoru. V případě odebrání malého počtu mízních uzlin však může dojít k podcenění hloubky invaze a pacient tak nedostane patřičnou adjuvantní terapii (Kawaciuk 2005). K rozlišení metastatických a nemetastatických pacientů by se proto mohlo používat miRNA profilování resekovaných nádorových tkání. Největší rozdíly v expresi mezi metastatickými a nemetastatickými ccRCC byly nalezeny u miR-451, miR-221, miR-30a, miR-10b a miR-29a (Heinzelmann et al. 2011). Navíc byla také identifikována skupina čtyř miRNA let-7a, let-7c, miR-26a a miR-30c, jejichž hladiny byly nízké u agresivních, primárně metastatických nádorů. U dvaceti miRNA byl také nalezen vztah mezi hladinou exprese a dobou přežití bez progrese. U dalších jedenácti miRNA byl nalezena korelace mezi hladinou exprese a nádorově specifickým přežitím. U metastazujících ccRCC byl také zjištěn vliv mir-106b na délku přežití bez relapsu a u pacientů s nižší hladinou miR-106b se vyskytovaly častěji metastázy. Pacienti s vyšší hladinou exprese pak vykazovali delší dobu přežití (Slabý et al. 2010). Kromě tkáňových miRNA se v poslední době výzkum zaměřuje i na tzv. cirkulující miRNA. Jedná se o miRNA nalézající se v plazmě či v séru. Výhoda těchto miRNA je v prvé řadě v jejich snadném získání z pacientovy krve. Používání sérových miRNA znamená z hlediska minimalizované invazivity při získání významný přinos a využití těchto miRNA by v tomto směru mohlo přinést značné zlepšení diagnostiky a to nejen u onkologických onemocnění (Filková et al. 2012). MiRNA mohou v diagnostice nalézt široké uplatnění z důvodu své vysoké stability, která je způsobena jejich malou délkou. Díky tomu jsou odolné vůči nukleázám. I v séru jsou hladiny miRNA stabilní a oproti mRNA nebo proteinům jsou velmi odolné vůči degradaci i při běžné teplotě velmi dlouhou dobu. Kromě jejich stability spočívá další výhoda i v tom, že na rozdíl od tkáňových miRNA, který mohou být analyzovány až po resekci nádoru, je možné 34
sérové miRNA analyzovat i při nepřítomnosti příznaků a tudíž preventivně. V současné době existuje již celá řada studií, které se zabývaly miRNA vyskytujícími se v krevní plazmě nebo séru u různých onkologických onemocnění (Cho 2011, Wang et al. 2012). Na výzkum sérových miRNA u pacientů s RCC se však soustředilo jen několik málo studií a tak výzkum v této konkrétní oblasti je zatím na začátku. Jedna z nich se zabývala hladinou miR-1233. Zvýšená hladina této miRNA byla zjištěna v séru pacientů s RCC (Wulfken et al. 2011). Pomocí analýzy hladin miR-1233 se podařilo rozlišit pacienty s RCC od zdravých kontrol se 77% senzitivitou a 37,6% specifitou. Další miRNA vhodnou pro odlišení pacientů s RCC a zdravých kontrol by mohla být miR-508-3p. Hladina této miRNA je v séru zdravých kontrol několikanásobně nižší než u jedinců s RCC (Zhai et al. 2012).
1.13 Využití miRNA v terapii MiRNA bude v budoucnu patrně možné použít i v terapii, a to po identifikaci klíčových miRNA a jejich cílových molekul, které jsou zapojeny do procesu kancerogeneze. Mohly by tak vzniknout nové možnosti v oblasti protinádorové terapie spadající do genové terapie. Ukazuje se totiž, že zvýšené hladiny miRNA lze snížit pomocí komplementárních anti-mir oligonukleotidů (AMO) (Qi et al. 2006). Úroveň specifické cílové miRNA lze pomocí AMO účinně snížit a zabránit tak nežádoucí interakci mezi miRNA a cílovou mRNA, která kauzálně přispívá k rozvoji určitého onemocnění. Při syntéze AMO se používá vždy určitý druh chemické modifikace, která brání rychlému odbourání AMO (Hutvagner et al. 2004). Většinou je jedná o 2´-Omethyl nebo 2´-methoxyethyl RNA oligonukleotidy. Zvláštním typem AMO jsou tzv. antagomiRNA (Davis et al. 2006). Každý nukleotid je zde modifikován O-methylovou skupinou na 2´ ribózovém uhlíku a koncové nukleotidy jsou navázány pomocí fosfothioátové vazby místo vazby fosfodiesterové (Krutzfeldt et al. 2005). Další možná modifikace je cholesterylová skupina na 3´ konci. Tato modifikace zvýšila stabilitu oligonukleotidů v séru a posílila vychytávání těchto molekul buňkami. Kromě AMO lze také použít LNA (Locked Nukleic Acid). V tomto případě je modifikována ribóza methylenovým můstkem mezi 2´-hydroxylovou skupinou a 4´-uhlíkem (Beránek et al. 2007). Tyto modifikace zvýšují biologickou i termodynamickou stabilitu. Aplikace miRNA do organizmu se v současnosti provádí většinou intravenózně. Imunitní odpověď, která by mohla po aplikaci volných miRNA nastat, se již podařilo obejít použitím nanočástic, na které se anti-miR před aplikací navážou. Při použití 35
tohoto způsobu nedochází k imunitní odpovědi (Su et al. 2010). Další možností je dopravit do buněk gen pro anti-miR pomocí virových částic (Xie et al. 2012). Funkčnost technologie pro vkládání genů pro miRNA byla už ověřena na myších modelech, avšak jen v jaterní tkáni. Nevýhodou je, že po vložení genů pro miRNA může v buňkách dojít k jejich inaktivaci. Další možnou cestou je aplikování miRNA perorálně. U miR-168a bylo totiž prokázáno, že je schopna se z trávicího traktu dostat do krevní plazmy (Zhang et al. 2011).
36
2. CÍLE PRÁCE Cílem předkládané diplomové práce bylo na základě zjištěné hladiny tří miRNA v krevním séru pacientů s RCC a sér od zdravých kontrol vyhodnotit jejich využití jako diagnostických biomarkerů. Dalším cílem bylo zmapování exprese vybraných miRNA v nádorové tkáni u pacientů s RCC a nalezení prognostických miRNA, které budou korelovat s přítomností či nepřítomností metastáz. Posledním cílem bylo ověřit vliv miR-210 a miR-143 na viabilitu, apoptózu, buněčný cyklus, migraci a invazivitu u buněčných linií ACHN a CAKI-2.
2.1 Dílčí cíle 2.1.1 Stanovení hladin vybraných miRNA v krevním séru 1) Izolovat celkovou RNA obohacenou o frakci miRNA ze sér pacientů s RCC a zdravých dárců. 2) Stanovit hladiny exprese miR-378, miR-150 a miR-451. 3) Statisticky vyhodnotit získané hodnoty exprese a ověřit jejich diagnostický potenciál. 2.1.2 Identifikace prognostických miRNA 1) Izolovat celkovou RNA obohacenou o frakci miRNA z nádorových tkání fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu (FFPE) od pacientů s RCC. 2) Stanovit hladiny exprese let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-30c, miR-106b, miR-126, miR-127-3p, miR-136*, mir-143, mir-145, mir-195, miR-409-3p, miR-451. 3) Statisticky vyhodnotit získané hodnoty exprese a využít je k rozlišení primárně metastatických, pozdně metastatických a nemetastatických RCC. 4) Korelovat hladiny exprese miRNA s dobou přežívání pacientů s RCC. 2.1.3 Funkční analýza miR-210, miR-143 in vitro 1) Optimalizovat transfekci buněčných linií ACHN a CAKI-2 pomocí pre-miR-143 a anti-miR-210. 2) Stanovit vliv transfekce na viabilitu, buněčný cyklus, apoptózu, invazivitu a migraci.
37
3. MATERIÁL A METODY 3.1 Soubor pacientů použitých pro identifikaci sérových miRNA Do studie bylo zařazeno 90 pacientů (56 mužů a 34 žen) s RCC a 35 zdravých kontrolních jedinců. Sérum bylo odebráno pacientům i zdravým kontrolám v letech 2010 až 2011. Medián věku pacientů v době odběru byl 66 let. V 73 případech byl diagnostikován ccRCC, v 8 případech pRCC a v 9 chRCC. Medián věku v kontrolní skupině byl 63 let. Všichni pacienti i zdraví dárci podepsali informovaný souhlas týkající se odběru bioptického materiálu a použití klinických a demografických údajů pro vědecké účely. Vzorky sér byly uchovávány při teplotě -80°C. Základní data o použitém souboru
pacientů a kontrolní skupině zdravých dárců jsou uvedena v Tabulce 8. Tabulka 8 - Klinické údaje o souboru pacientů a zdravých kontrolních jedinců
RCC Počet pacientů Věk medián rozmezí Pohlaví muži ženy Histologický typ RCC světlobuněčný papilární chromofóbní Klinické stádium T1 T2 T3 T4 Fuhrman grade G1 G2 G3 G4
ZK 90
35
66 36 – 85
63 51-70
56 34
26 9
73 8 9
0 0 0
50 14 23 3
0 0 0 0
20 39 23 8
0 0 0 0
16 6 18
0 0 0
Metastatické onemocnění vaskuární invaze lymfatické uzliny vzdálené metastázy
38
3.2 Soubor pacientů použitých pro identifikaci prognostických miRNA Do studie bylo zařazeno 46 pacientů (32 mužů a 14 žen) se světlobuněčným renálním karcinomem. Tito pacienti byli operováni v Masarykově onkologickém ústavu v letech 2004 až 2009. Medián věku pacientů v době odběru byl 62 let. U 18 pacientů ccRCC metastazoval a u 28 nemetastazoval. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas týkající se odběru bioptického materiálu a použití klinických a demografických údajů pro vědecké účely. Základní data o souboru pacientů jsou v Tabulkách 9 a 10. Vzorky tkání byly fixovány ve formalínu a uchovány v parafinu. Fixace i zalití do parafinu bylo provedeno pracovníkem z Oddělení onkologické a experimentální patologie Masarykova onkologického ústavu. Tabulka 9 - Klinické údaje o souboru pacientů Počet pacientů Věk medián rozmezí Pohlaví muži ženy Klinické stádium T1a T1b T2 T3a T3b
46 62 39 - 83 32 14 9 6 7 16 8
Grading dle Fuhrmanové G1 G2 G3 G4
5 16 19 6
39
Tabulka 10 - Klinické údaje o souboru pacientů Metastatické onemocnění Ano Ne
18 28
Celkové sledování (měsíce) Medián Rozmezí IR* Nemetastatické s relapsem (měsíce) Doba přežití bez relapsu Medián Mezikvartilové rozpětí Nemetastatické bez relapsu (měsíce) Doba přežití bez relapsu Medián Mezikvartilové rozpětí
38 12 – 56
10 10 5 – 23
18 54 43 – 65
3.3 Použité buněčné linie ACHN (ATCC® CRL-1611™) Jedná se o adherentní epiteliální buněčnou linii izolovanou roku 1979. Je derivovaná z metastázy adenokarcinomu ledviny. Její růst je inhibován lidským interferonem.
CAKI-2 (ATCC® HTB-47™) Jde o adherentní epiteliální linii odvozenou z primárního svělobuněčného renálního karcinomu. Jedná se o hypopentaploida až hypohexaploida s abnormálními dicentrickými a akrocentrickými fragmenty.
3.4 Izolace celkové RNA obohacené o miRNA frakci ze séra Použitý materiál:
miRNeasy mini kit (Qiagen, Maryland, USA)
MS2 RNA (0,8 µg/µl) (Roche, Švýcarsko)
Chloroform (Sigma Aldrich, Missouri, USA) 40
Etanol 99,8% (Lachner, ČR)
TRIzol® LS Reagent (Invitrogen, Kalifornie, USA)
RNase-free filtertips
RNase-free 1,5ml a 2ml mikrozkumavky (Non-Stick Rnase-free Microfuge Tubes 1,5 ml a 2ml – Ambion)
DEPC-Treated water (Ambion)
Použité přístroje:
Stolní centrifuga s chlazením, Centrifuga IEC CL30R (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA)
Minicentrifuga Eppendorf miniSpin (Hamburg, Německo)
Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, New York, USA)
NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Delaware, USA)
Postup: 1. Od začátku izolace až po krok 6 byly zpracovávané vzorky uchovávány na ledu. 2. Ze vzorku bylo odebráno 250 µl séra do 1,5ml mikrozkumavky. 3. Mikrozkumavka se vzorkem byla centrifugována v chlazené centrifuze při 1000 g 5 min při 4 °C kvůli usazení případných nečistot. 4. 200 µl séra bylo přepipetováno do nové 1,5ml mikrozkumavky. 5. Byl připraven master mix z 800 µl Trizolu a 1,25 µl MS2 RNA, který byl poté krátce zvortexován. 6. Ke vzorku séra bylo pipetováno 750 µl master mixu - roztok byl důkladně vortexován a následně inkubován 5 min při pokojové teplotě (RT). 7. Po inkubaci bylo k roztoku pipetováno 200 µl chloroformu a opět důkladně vortexován a následovala 2min inkubace při RT. 8. Roztok byl poté centrifugován v chlazené centrifuze při 12000 g 15 min při 4 °C. 9. Vrchní vodná fáze byla opatrně přepipetována do nové kalibrované 2ml mikrozkumavky. 10. Byl připipetován 1,5násobek objemu 99,8% etanolu. 11. Po přidání etanolu byl roztok promíchán pipetou. 12. 750 µl roztoku bylo přeneseno do kolonky (rneasy Mini Spin Column). 41
13. Kolonka byla centrifugována (Minicentrifuga Eppendorf minispin) 30 s při RT 14 000 RPM a poté byl odstraněn filtrát. 14. Postup byl opakován do přefiltrování veškerého objemu. 15. Kolonka byla poté promyta přidáním 700 µl roztoku RWT a centrifugována 1 min při 14 000 RPM a následně byl filtrát odstraněn. 16. Kolonka byla poté 3x promyta přidáním 500 µl roztoku RPE - po každém přidání byla kolonka centrifugována 1 min při 14 000 RPM a filtrát byl poté pokaždé odstraněn. 17. Kolonka byla přenesena do nové mikrozkumavky a centrifugována 2 min při 14 000 RPM. 18. Kolonka byla poté 1 min ponechána otevřená. 19. Kolonka byla přenesena do nové mikrozkumavky (Non-Stick Rnase-free Microfuge Tube). 20. Do středu kolonky bylo naneseno oparně 50 µl Dnase/Rnase-free water. 21. Kolonka byla inkubována 1 min a pak centrifugována 1 min při 14 000 RPM. 22. Výsledná koncentrace a čistota izolované RNA byla změřena na NanoDropu. 23. Vyizolovaná RNA byla skladována i teplotě -80 °C nebo ihned zpracována.
3.5 Izolace celkové RNA obohacené o frakci miRNA z FFPE tkání
Den 1. Deparafinace a trávení Vzorek: tkáň v parafinovém bločku Použitý materiál:
Skalpel
1,5ml mikrozkumavky typu Eppendorf (Hamburg, Německo)
Xylen (Lachema, Česká republika)
99,8% etanol (Lachema, Česká republika)
High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Švýcarsko)
Použité přístroje:
Minicentrifuga Eppendorf (Hamburg, Německo)
Termoblok (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA)
Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, New York, USA) 42
Postup: 1. Plátky nakrájené mikrotomem byly vloženy do mikrozkumavky. 2. Pomocí skalpelu byl vzorek rozřezán na co nejmenší kousky o velikosti přibližně 2 mm. 3. Ke vzorku bylo pipetováno 800 μl xylenu. 4. Směs byla 5 min promíchávána převracením. 5. Ke směsi bylo pipetováno 400 μl 99,8% etanolu. 6. Roztok byl protřepán na vortexu a centrifugován (2 min/max RPM/RT), poté byl odstraněn supernatant. 7. Ke vzorku byl připipetován 1 ml 99,8% etanolu. 8. Vzorek byl protřepán na vortexu a centrifugován (2min/max RPM/RT), poté byl odstraněn supernatant. 9. Vzorek byl sušen 10 min v otevřené mikrozkumavce na termobloku při 55 °C. 10. Po vysušení bylo ke vzorku napipetováno 100 μl Parafin Tissue Lysin Buffer, 16 μl 5% SDS, 40 μl proteinázy K. 11. Směs byla opatrně protřepána tak, aby kousky tkáně nezůstaly na stěně mikrozkumavky. 12. Směs byla ponechána v uzavřené mikrozkumavce v termobloku při 55 °C, aby se vzorek dostatečně natrávil (min. 3 hod, optimálně přes noc).
Den 2. Izolace RNA Použitý materiál:
2ml mikrozkumavky typu Eppendorf (Hamburg, Německo)
99,8% etanol (Lachema, Česká republika)
mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion INC, Austin, Texas)
Kyselý fenol:CHCl3, Cat. AM720 (Ambion INC, Austin, Texas)
DEPC-Treated water, Cat. AM9906 (Ambion INC, Austin, Texas)
Použité přístroje:
Minicentrifuga Eppendorf (Hamburg, Německo)
Termoblok (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA)
Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, New York, USA)
NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA) 43
Postup: 1. Ke vzorku bylo pipetováno 600 μl Lysin Binding Buffer a 100 μl microRNA Homogenate Additive. 2. Směs byla protřepána na vortexu a poté byla inkubována 10 min na ledu. 3. Ke směsi bylo pipetováno 600 μl směsi kyselého fenolu a chloroformu. 4. Směs byla vortexována 1 min a poté centrifugována (5 min/max RPM/RT). 5. Vodná
fáze
byla
opatrně
přepipetována
do
nové
2ml
kalibrované
mikrozkumavky. 6. Byl připipetován 1,25násobek objemu 99,8% etanolu. 7. Do kolonky v mikrozkumavce bylo napipetováno 700 μl získaného roztoku. 8. Kolonka v mikrozkumavce byla centrifugována (15 s/10000 RPM/RT), poté byl odstraněn filtrát. 9. Postup byl opakován, dokud nebyl přefiltován veškerý roztok. 10. Do kolonky bylo pipetováno 700 μl Wash Solution 1 a poté byla mikrozkumavka s kolonkou centrifugována (5-10 s/10000 RPM/RT) a vzápětí byl odstraněn filtrát. 11. Do kolonky bylo pipetováno 500 μl Wash Solution 2/3, mikrozkumavka s kolonkou byla opět centrifugována (5-10 s/10000 RPM/RT), a následně byl odstraněn filtrát. Toto promytí bylo ještě jednou zopakováno. 12. Následně byla mikrozkumavka s kolonkou centrifugována bez jakéhokoliv přidaného roztoku (1 min/10000 RPM/RT). 13. Kolonka byla vzápětí přesunuta do čisté spodní zkumavky. 14. Na kolonku bylo pipetováno 50 μl Elution Solution předehřátého na 95 °C. 15. Kolonka byla následně centrifugována (30 s/max RPM/RT). 16. Koncentrace a čistota izolované RNA byla změřena na Nanodropu. Výsledný filtrát obsahující vyizolovanou RNA obohacenou o mikroRNA byl uchováván při teplotě teplotě -80 °C.
3.6 Reverzní transkripce (RT) Použitý materiál:
TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Kalifornie, USA)
TaqMan® Small RNA Assay (Applied Biosystems, Kalifornie, USA) 44
DEPC-Treated water (Ambion, Kalifornie, USA)
MicroAmp® 8-tube stripy
Použité přístroje:
Termocyklér PTC-200 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, Kalifornie, USA)
Minicentrifuga Eppendorf miniSpin (Hamburg, Německo)
Postup: 1. Vzorky byly postupně rozmraženy. 2. Master mix (MM) byl připraven dle rozpisu (množství na jeden vzorek): 0,15 μl
1 reakce: 100mM dNTPs MultiScribe™ Reverse Transcriptase, 50 U/μL
1,00 μl
10x Reverse Transcription Buffer
1,50 μl
RNase Inhibitor, 20U/μl
0,19 μl
Nuclease-free water
4,16 μl
3. Roztok byl mírně promíchán a centrifugován 30 s při 14 000 RPM. 4. Poté byl umístěn na led. 5. Vzorek byl naředěn na koncentraci RNA 10 ng/5 μl. 6. Jednotlivé vzorky byly poté pipetovány do 0,2 ml stripů. 7. Do každého stripu bylo napipetováno 7 μl MM, 5 μl vzorku a 3 μl příslušného RT primeru. 8. Roztok byl jemně promíchán a strip centrifugován 10 s v centrifuze na stripy a po centrifugaci byl strip inkubován 5 min na ledu. 9. Strip byl vložen do termocykléru, který byl nastaven na tento program: Hold
30 min
16 °C
Hold
30 min
42 °C
Hold
5 min
85 °C
Hold
∞
4 °C
10. Objem reakce byl nastaven na 15 μl a spuštěna reverzní transkripce.
3.7 qPCR Použitý materiál: 45
TaqMan® Universal PCR Master Mix II, No Amp Erase®UNG (Applied Biosystems, Kalifornie, USA)
TaqMan® Small RNA Assay (Applied Biosystems, Kalifornie, USA)
DEPC-Treated water (Ambion, Kalifornie, USA)
1,5ml mikrozkumavky typu Eppendorf
Použité přístroje:
7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Kalifornie, USA)
Centrifuge 5430 (Eppendorf, Německo)
Postup: 1. Protože je miRNA sonda citlivá na světlo, probíhala příprava qPCR v temnici. Do mikrozkumavky byla napipetována následující směs (objemy potřebné na duplikát):
Voda
18,4 μl
Master mix
24,0 μl
miRNA sonda
2,4 μl
produkt RT
3,2 μl
2. Při použití negativní kontroly byla do mikrozkumavky místo RT produktu napipetována voda. 3. Roztok byl jemně promíchán a mikrozkumavky byly centrifugovány 5 s při 1000 RPM. 4.
Do nové 96-jamkové destičky bylo pipetováno 2x 20 μl od každého vzorku do příslušných jamek destičky (bez bublinek).
5. Destička byla zakryta fólií a poté 60 s centrifugována při 1000 RPM. 6. Následně byla vložena do přístroje 7500 Real-Time PCR systém. 7. Jamky v destičce byly pojmenovány a pak byly nastaveny tyto podmínky reakce:
Hold
2 min
50 °C
Hold
10 min
95 °C
15 s
95 °C
60 s
60 °C
46
Opakovat 40x
8. Objem reakce byl nastaven na 20 μl a bylo spuštěno měření. 9. Po proběhnutí reakce byly exportovány hodnoty Ct. Pokud je číslo cyklu, při kterém hodnota fluorescence překročí prahovou hodnotu, menší nebo rovno 29, jedná se o silnou pozitivní reakci, což značí velké množství cílové DNA ve vzorku. Ct 30-37 značí střední množství cílové DNA ve vzorku. Ct 38-40 znamená, že ve vzorku se nalézá minimální množství cílové DNA.
3.8 Kultivace buněčných linií ACHN a CAKI-2 Buněčné linie ACHN a CAKI-2 byly kultivovány na 10cm plastových Petriho miskách v Dulbeccovu modifikovaném eagle mediu (DMEM) s přídavkem 5% fetálního bvinního séra (FBS), 1% neesenciálních aminokyselin, 2mM L-glutaminu, 4,5 g·l-1 D-glukózy, 110 mg·l-1 pyruvátu sodného, 100 μg·ml-1 streptomycinu a 100 U·ml-1 penicilinu při teplotě 37 °C v atmosféře s 5% CO2. Buňky byly pasážovány každý druhý až třetí den dle následujícího postupu: Použitý materiál:
buněčné linie ACHN, CAKI-2
plastové misky
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS), D8537 (Sigma-Aldrich Inc., Missouri, USA )
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 1×, Cat. 41966 (Invitrogen, Kalifornie, USA)
0,25% Trypsin-EDTA 1×, Cat. 25200 (Invitrogen, Kalifornie, USA)
Použité přístroje:
Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH, Německo)
Postup: 1. Misky byly zkontrolovány pod mikroskopem a pokud byla konfluence 80-90 %, mohly být buňky pasážovány. 2. Médium bylo odsáto a byly přidány 2 ml 0,25% roztoku Trypsin-EDTA.
47
3. Po dvouminutové inkubaci byly buňky resuspendovány a bylo k nim přidáno 8 ml média. Z této směsi byly odebrány 2 ml a přeneseny na novou misku s 8 ml čerstvého předehřátého DMEM. 4. Buňky byly poté inkubovány při 37 °C v atmosféře 5% CO2.
3.9 Stanovení růstové křivky Pro provedení experimentu je důležité zjistit, v jakém časovém intervalu od nasazení buněk dosahuje každá buněčná linie maximální rychlosti růstu. Rychlost proliferace byla zjištěna počítáním buněk obarvených trypanovou modří v Bürkerově komůrce. Byl sledován počet buněk na 5cm miskách každých 24 hod v průběhu 5 dnů. Experiment byl proveden v triplikátě a ve třech nezávislých opakováních. Použitý materiál:
buněčné linie ACHN, CAKI-2
plastové misky
0,25% Trypsin-EDTA 1×, Cat. 25200 (Invitrogen, Kalifornie, USA)
Trypan Blue Stain 0,4%, Cat. 15250 (Invitrogen, Kalifornie, USA)
Použité přístroje:
Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH, Hamburg, Německo)
Postup: 1. Pro každou linii bylo připraveno patnáct 5cm misek s 5 ml kompletního DMEM. 2. Do každé misky bylo nasazeno 106 buněk ACHN nebo CAKI-2. 3. Buňky byly inkubovány 5 dnů při 37 °C v atmosféře 5% CO2. 4. Každý den byly analyzovány vždy 3 misky od každé linie. 5. Z každé bylo odsáto medium a přidán 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA. 6. Po trypsinyzaci byly k roztoku přidány 2 ml DMEM. Ze vzniklé suspenze bylo pipetováno 50 μl na podložní sklíčko. K této suspenzi bylo poté pipetováno μl 0,4% roztoku tropanové modři a směs byla opatrně promíchána pipetou.
48
50
7. Ze směsi bylo přeneseno 10 μl do vyčištěné a správně sestavené Bürkerovy komůrky. Po přepočítání byly vytvořeny růstové křivky a zvoleny optimální časové intervaly a koncentrace buněk pro jednotlivé experimenty.
3.10 Transfekce Pro transfekci bylo využito transfekčního činidla LipofectamineTM RNAiMAX od firmy Invitrogen. Toto transfekční činidlo je široce používáno k transfekci DNA či RNA u řady buněčných linií. Buněčné linie byly použity k experimentu 48 hod od pasážování. Na buněčných liniích ACHN a CAKI-2 byl zjišťován vliv transfekce antimiR-143 a anti-miR-210 v následujících experimentech: a) Ovlivnění hladiny příslušné miRNA v buňkách (testováno pomocí qRT-PCR). b) Vliv transfekované anti-miRNA na viabilitu (MTT test), na apoptózu (barvení Annexinem V), buněčný cyklus (barvení propidiem jodidu), migraci (Scratch wound test) a invazivitu (xCELLligence test). Použitý materiál:
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 1×, Cat. 41966 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, -20 °C)
0,25% Trypsin-EDTA 1×, Cat. 25200 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA -20 °C)
OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium 1×, Cat. 31985 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 4 °C)
mirVana TM miRNA Isolation Kit (Ambion INC, Austin, Texas, 4 °C)
Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules / anti-miRTM miRNA Inhibitor Molecules (Ambion INC, Austin, Texas, -20 °C)
LipofectamineTM RNAiMAX Reagent, Cat. 13778-150 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 4 °C)
Postup: 1. 24 hod před transfekcí byly buňky nasazeny na 24jamkové desky (105 buněk / 500 μl DMEM média bez Atb) nebo na 96jamkové desky v případě MTT testu (104 buněk / 100 μl DMEM média bez Atb). 49
2. Bylo smícháno příslušné množství anti-miRNA s Opti-MEM® I médiem (50 μl pro 24jamkový formát, 25 μl pro 96jamkový formát). 3. Příslušné množství LipofectamineTM RNAiMAX bylo smícháno s daným objemem Opti-MEM® I média (50 μl pro 24jamkový formát, 25 μl pro 96jamkový formát) a inkubováno 5 min při RT. 4. Roztok z obou zkumavek byl smíchán a inkubován 20 min při RT. 5. Poté byl přidán komplex RNA s transfekčním činidlem do každé jamky s buňkami (100 μl pro 24jamkový formát, 50 μl pro 96jamkový formát). 6. Roztok byl jemně promíchán a inkubován 24-48 hod při 37 °C v atmosféře 5% CO2.
3.11 Izolace RNA z transfekovaných buněk Použitý materiál:
mirVana TM miRNA Isolation Kit (Ambion INC, Austin, Texas)
1,5ml mikrozkumavky, Eppendorf (Hamburg, Německo)
Kyselý fenol:CHCl3, Cat AM720 (Ambion INC, Austin, Texas)
Použité přístroje:
Minicentrifuga Eppendorf miniSpin ( Německo)
NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Delaware, USA)
Postup: 1. Buňky byly resuspendovány v 1 ml PBS a přeneseny do 1,5ml mikrozkumavky, poté byly centrifugovány při maximálních otáčkách a pak byl odstraněn supernatant. 2. K peletu bylo pipetováno 400 µl Lysis/Binding Solution. 3. Směs byla zvortexována a centrifugována 2 min při maximálních otáčkach. 4. Supernatant byl odsán do nové 1,5ml mikrozkumavky. 5. K supernatantu byla přidána 1/10 jeho objemu roztoku Homogenate additive. 6. Směs byla 10 min inkubována na ledu. 7. Byl přidán stejný objem kyselého-Fenolu:Chloroformu. 8. Směs byla 30-60 s vortexována. 9. Směs byla centrifugována 5 min při maximálních otáčkách. 50
10. Vodná fáze byla odebrána do nové mikrozkumavky. 11. Byl přidán 1,25 násobek objemu 99,8% etanolu a promícháno pipetou. 12. 700 µl směsi byla napipetováno do kolonky umístěné do mikrozkumavky. 13. Kolonka byla centrifugována 20 s (10 000 RPM). 14. Postup se opakoval do přefiltrování veškerého roztoku. 15. Kolonka byla promývána 700 µl Wash Solution 1 a poté centrifugována 5-10 s (10 000 x g). 16. Do kolonky bylo napipetováno 500 µl Wash Solution 2/3 a následně byla kolonka centrifugována 5-10 s (10 000 x g) – tento krok byl 1x opakován. 17. Kolonka se zkumavkou byla centrifugována 1 min. 18. Na kolonku bylo pipetováno 100 µl Elution Solution předehřátého na 95 °C. Kolonka byla centrifugována 20-30 s (10 000 x g). 19. Koncentrace a čitota izolované RNA byla změřena Nanodropu ND-1000. 20. Získaný roztok byl uchován při -80 °C.
3.12 MTT test MTT test se používá k určení životaschopnosti buněčných linií po transfekci nebo aplikaci chemoterapeutika. Metoda je založena na přeměně žlutého rozpustného 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromidu (MTT) na nerozpustný formazán (modrofialové krystaly). Reakce probíhá pouze v živých buňkách a to na membráně mitochondrií. Použitý materiál:
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay (MTT, Sigma Aldrich, Missouri, USA).
DMSO (Sigma Aldrich, Missouri, USA)
Použité přístroje:
Elisa Multi-Detection Microplate Reader (BIO-TEK, USA)
Postup: 1. Transfekované buňky byly pěstovány v 96jamkové destičce při hustotě 1000 buněk na jamku. 51
2. Médium bylo z jamek odstraněno vždy ve 24h intervalech po transfekci a místo něho bylo přidáno 20 µl 5 mg/ml MTT roztoku (MTT rozpuštené v PBS). 3. Buňky byly poté inkubovány 3 h při 37 °C a 5% CO2. 4. Po 3hod inkubaci byl roztok odstraněn a do jamek bylo pipetováno 200 µl DMSO. 5. Destička byla 10 min protřepávána. 6. Absorbance byla změřena na přístroji ELISA reader při vlnové délce 570 nm a 650 nm (pozadí). 7. Experiment byl uskutečněn ve třech nezávislých opakováních v triplikátech.
3.13. Test na apoptózu Většina eukaryotických buněk nese v plazmatické membráně záporně nabitý fosfatidylserin. Vyskytuje se téměř výhradně na vnitřní straně plazmatické membrány. Když se fosfatidylserin objeví i na vnější straně plazmatické membrány, značí to probíhající apoptózu.
Annexin
V
je
36kDa
protein
vázající
fosfatidylserin
za přítomnosti iontů vápníku. Pro analýzu byly buňky sklizeny 48 hod po transfekci z 6cm Petriho misky a pelet byl resuspendován ve 4 ml PBS. Z toho 1 ml suspenze byl použit na barvení Annexinem V a 3 ml na analýzu buněčného cyklu. Sklizeny byly i neovlivněné buňky, které byly použity jako negativní kontrola. Použitý materiál:
Annexin V-FITC Kit (Cat. No.130-092-052)
Použité přístroje:
FACS Canto II, BD Biosciences
Centrifuga Thermo IEC CL10
Postup: 1. Buňky byly promyty v 1 ml 1× Annexin V vázajícího pufru a centrifugovány 10 min při 1500 RPM. Poté byl odstraněn veškerý supernatant. 2. Opakován promývací krok 1. 52
3. Pelet byl resuspendován ve 100 µl 1 x Annexin V vázajícího pufru. 4. Bylo přidáno 10 µl Annexin V FITC. 5. Suspenze byla dobře promíchána a inkubována 15 min ve tmě při RT. 6. Buňky byly promyty v 1 ml 1× Annexin V vázajícím pufru a centrifugovány při 1500 RPM 10 min. Všechen supernatant byl odstraněn. 7. Pelet byl resuspendován v 500 µl 1× Annexin V vázajícím pufru. 8. Fluorescence byla změřena na průtokovém cytometru FACS Canto II. 9. K suspenzi bylo přidáno 5 µl roztoku propidium jodidu a měření bylo opakováno.
3.14 Analýza buněčného cyklu Propidium jodid (PI) je fluorescenční interkalační činidlo, které se zabudovává do struktury dvoušroubovice DNA a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření (> 560 nm). Během S fáze buněčného cyklu dochází k replikaci DNA, a tedy k postupnému zvyšování jejího obsahu v buňce až na dvojnásobek. Z analýzy fluorescenčního signálu PI je poté možné určit obsah DNA v buňkách, a tím i fázi buněčného cyklu, ve které se buňky nacházejí. Použitý materiál:
PI, Sigma, No: P4170-25MG
RNAsa
70% ethanol
Použité přístroje:
FACS Canto II, BD Biosciences
Centrifuga Thermo IEC CL10
Postup: 1. Buněčná suspenze byla centrifugována 5 min při 1500 RPM. 2. Poté byla promyta pomocí PBS a centrifugována 5 min při 1500 RPM. 3. Pelet byl fixován v 1 ml 70% vychlazeného ethanolu a inkubován 30 min na ledu. 4. Suspenze byla centrifugována 5 min při 1500 RPM. 5. Pelet byl opět promyt pomocí PBS a centrifugován 5 min při 1500 RPM. 53
6. Sediment byl resuspendován v 250 µl PBS. 7. K suspenzi bylo pipetováno 50 µl roztoku RNázy o konc. 0,1 mg/ml. Suspenze byla inkubována 10 min při 37°C 8. K výsledné směsi bylo přidáno 10 µl PI (zásobní roztok 1 mg/ml). Suspenze byla inkubována 10 min při RT a dalších 20 min na ledu. 9. Poté bya suspenze analyzována na průtokovém cytometru FACS Canto II a v programu FlowJo.
3.15 Scratch wound migrační test Tento test umožňuje sledovat efekt různých látek na migraci buněk. Metoda je velice jednoduchá a levná a může být modifikována dle potřeby. Princip této metody spočívá v narušení monovrstvy buněk sterilní špičkou a následném sledování migrace okolních buněk do takto vytvořené mezery. Migrační test byl proveden pouze s buněčnou linií ACHN, protože tato linie pochází z metastatického renálního adenokarcinomu. Použitý materiál:
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS), D8537 (Sigma-Aldrich Inc., Missouri, USA)
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 1×, Cat. 41966 (Invitrogen, Kalifornie, USA) – bez Atb
0,25% Trypsin-EDTA 1×, Cat. 25200 (Invitrogen, Kalifornie, USA)
Methanol Cat. 32213 (Sigma-Aldrich Inc., Missouri, USA)
Použité přístroje:
Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH, Německo)
Fotoaparát OLYMPUS SP-350 (OLYMPUS Europa GMBH, Německo)
Sterilní testovací destičky 24-jamkové (ploché dno) Cat. 92006 (Techno Plastic Products AG, Švýcarsko)
Postup: 1. Na základě růstové křivky pro buněčnou linii ACHN bylo určeno, že se do každé jamky vyseje 100 000 buněk. 54
2. Na 24-jamkovou desku bylo ze spodní části nakresleno 5 teček na každou jamku v místech, kde se později bude fotit. 3. Misky byly popsány. 4. První den experimentu byly nasazeny buňky do 6-jamkových desek. 5. Buňky byly inkubovány 24 h při 37 °C v 5% CO2. 6. Druhý den experimentu proběhla transfekce (viz výše). 7. Buňky byly opět inkubovány 24 h při 37 °C v 5% CO2. 8. Třetí den experimentu byly buňky zkontrolovány pod mikroskopem. 9. Byla udělána rýha sterilní žlutou špičkou. 10. Opatrně bylo odsáto médium a pomalu přidány 2 ml předehřátého sterilního PBS. 11. PBS bylo odsáto a přidáno 2,5 ml nového předehřátého média. 12. Jamky byly vyfoceny na 5 označených místech rýhy (zvětšení 10×). 13. Buňky byly inkubovány při 37 °C v 5% CO2. 14. Zarůstání rýhy bylo v intervalu 6 h průběžně sledováno pod mikroskopem. 15. Ve chvíli, kdy byly rýha téměř zarostlá (asi po 24 h) bylo odsáto médium a buňky byly propláchnuty 2 ml předehřátého PBS. 16. PBS bylo odsáto a pomalu byl přikapán 95% vychlazený metanol na pokrytí dna misky. 17. Každá jamka byla vyfocena na 5 označených místech (zvětšení 10×) 18. Fotografie byly vyhodnoceny pomocí softwaru TScratch.
3.16 Test buněčné invazivity pomocí systému xCELLigence Buňky jsou v tomto testu vysety na 16jamkové E-destičky, na jejichž dna jsou z druhé strany naneseny zlaté mikroelektrody. Buňky s invazivním charakterem migrují skrz póry ve dnech jamek na tyto elektrody a impedance (elektrický odpor) měřená na zlatých elektrodách tak vzroste. Invazivita byla sledována u buněk ACHN a CAKI-2 po tranfekci anti-miR-210. Míra impedance je vyjádřena v bezrozměrných jednotkách tzv. “buněčného indexu”. Jedná se o neinvazivní sledování invazivity (obecně chování buněk) v reálném čase. Impedance byla měřena v časovém intervalu 24 h, 36 h a 48 h. Postup: 1. 24 hod po transfekci byly buňky trypsinizovány a vysety na 16jamkové CIMdestičky (CIM-Plate 16, Roche) potažené (0.5 mg/ml) matrigelem (BD Bioscience). 55
2. Buňky v DMEM mediu s 1% FBS byly vysety v koncentraci 104 buněk na jamku do horní komory. 3. DMEM doplněné o 10% FBS bylo použito jako chemoatraktant. 4. Analýza buněk v reálném čase byla provedena pomocí programu xCELLigence (Roche). 5. Experiment byl proveden ve čtyřech nezávislých opakováních v duplikátech
56
4. VÝSLEDKY PRÁCE 4.1 Výtěžky RNA izolované ze sér a FFPE tkání RNA jsem izoloval celkem z 90 sér získaných od pacientů s ccRCC a 35 sér získaných od zdravých jedinců a ze 46 FFPE tkání ccRCC. Koncentrace RNA izolované ze séra se pohybovaly mezi 9,47 a 36,81 ng/μl (viz PŘÍLOHY). U RNA izolované z FFPE byly koncentrace vyšší. Pohybovaly se mezi 27,31 a 1167,02 ng/μl. Čistota získané RNA byla zjišťována poměrem absorbance při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Čistota se pohybovala mezi 0,85 a 2,57 s mediánem 1,87.
4.2 Stanovení hladiny exprese vybraných sérových miRNA Po izolaci RNA jsem přisoupil k samotnému stanovení hladin exprese miR-150 , miR-378 a miR-451. Pro určení hladin miRNA jsem použil metodu RT-PCR. Rozdíl v relativní expresi miR-150 mezi skupinami nedosáhl statistické signifikance (P = 0,222) a byla tedy z dalších analýz vyloučena (Graf 3). Expresní hladina miR-378 v séru pacientů s RCC byla signifikantně zvýšená oproti hladině v séru zdravých nenádorových kontrol (P = 0,0003) (Graf 4). Hladina miR-451 byla naopak v séru pacientů s RCC signifikantně snížená v porovnání s hladinou v séru zdravých dárců (P ˂ 0,0001) (Graf 5). Hodnoty exprese jsem normalizoval pomocí hladin referenčního genu miR-16. Ke zpracování dat jsem použil program MedCalc 12.
Normalizovaná exprese miR-150
Graf 3 – Srovnání exprese miR-150 u zdravých kontrol a pacientů s RCC
RCC
ZK
57
Normalizovaná exprese miR-378
Graf 4 – Srovnání exprese miR-378 u zdravých kontrol a pacientů s RCC
ZK
RCC
Normalizovaná exprese miR-451
Graf 5 – Srovnání exprese miR-451 u zdravých kontrol a pacientů s RCC
ZK
RCC
Pro zjištění senzitivity a specificity, s jakou se dle získaných hodnot exprese dají odlišit obě skupiny od sebe, jsem vytvořil ROC křivky. Při odlišení obou skupin pomocí miR-378 bylo dosaženo senzitivity 70 % a specificity 60 %. Při použití miR451 byla senzitivita 81 % a specificita 77 %. Po zkombinování obou miRNA došlo ke
58
zvýšení obou hodnot a bylo tak dosaženo 81% senzitivity a 83% specificity (Grafy 6 až 8). Analýza ROC (Receiver Operating Characteristics) křivek potvrdila, že expresní hladiny sérových miR-378 a miR-451 mohou být vhodnými biomarkery pro odlišení séra pacientů s RCC od séra zdravých nenádorových kontrol – plocha pod křivkou, AUC (Area Under Curve) byla 0,71 (95% konfidenční interval /CI/ 0,62 – 0,79), a 0,77 (95% CI 0,69 – 0,84) (Graf 6). Při použití hraniční hodnoty 0,02 pro relativní expresi miR-378 (normalizovanou vůči miR-16) jsem detekoval senzitivitu 70 % a specificitu 60 %. Na hraniční hodnotě 2,0 pro relativní expresi miR-451 (normalizovanou vůči miR-16) bylo dosaženo senzitivity 81 % a specificity 77 % (Graf 7). Multivariační logistická regresní analýza prokázala, že jak miR-378, tak miR-451 jsou potenciálně vhodnými biomarkery pro odlišení mezi séry pacientů s RCC a zdravých kontrol charakterizovanou AUC na hladině 0,86 na hodnoty senzitivity 81 % a specificity 83 % (Graf 8).
Graf 6 – ROC křivka pro miR-378
Senzitivita
AUC – 0,71 (95% CI 0,62 – 0,79), senzitivita 70 %, specificita 60 %
Specificita
59
Graf 7 – ROC křivka pro miR-451
Senzitivita
AUC – 0,77 (95% CI 0,69 – 0,84), senzitivita 81 %, specificita 77 %
Specificita
Graf 8 – ROC křivka pro kombinaci miR-378 a miR-451
Senzitivita
AUC – 0,86 (95% CI 0,78 – 0,91), senzitivita 81 %, specificita 83%
Specificita
60
4.3 Stanovení hladiny exprese vybraných miRNA ve FFPE tkáních ccRCC Pomocí qRT-PCR jsem stanovil hladinu let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-30c, miR-106b, miR-126, miR-127-3p, miR-136*, mir-143, mir-145, mir-195, miR-409-3p, miR-451 vzorků ccRCC. Tyto miRNA byly vybrány na základě expresního profilování založeného na principu qRT-PCR, představujícího vhodnou strategii pro identifikaci miRNA asociovaných s RCC provedeného v naší laboratoři. V rámci této fáze bylo mými kolegy identifikováno 64 miRNA odlišně exprimovaných v rámci jednotlivých skupin RCC pacientů, přičemž 20 miRNA vykazovalo zvýšenou expresi a 44 miRNA naopak sníženou expresi. Cílem bylo srovnání exprese uvedených miRNA mezi jednotlivými prognostickými skupinami pacientů s RCC. Jednalo se o 18 pacientů s metastatickým onemocněním (skupina 1), 10 pacientů, u nichž došlo k relapsu po nefrektomii (medián RFS = 10 měsíců; skupina 2) a 18 pacientů bez relapsu onemocnění (medián RFS = 54 měsíců; skupina 3). Exprese vybraných miRNA jsem poté normalizoval dle exprese RNU44.
Ke zpracování dat jsem použil program
MedCalc 12. Srovnání exprese jednotlivých miRNA je zobrazené v Grafech 9 až 21. Statisticky významné rozdíly mezi porovnávanými skupinami jsem zaznamenal u sedmi miRNA. Exprese let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-126, miR-143, miR-145 a miR-195 byla snížená v primárních nádorech, u kterých došlo k relapsu. Navíc bylo patrné, že nejnižší hladiny těchto miRNA byly u primárně metastatických tumorů. U ostatních miRNA jsem pozoroval stejný trend, avšak rozdíly mezi skupinami nebyly statisticky významné.
Graf 10 - Exprese miR-10b, P = 0,0004
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 9 - Exprese let-7c, P = 0,0023
61
Z grafů 9 a 10 je patrný významný rozdíl v expresi let-7c a mir-10b mezi skupinou pacientů s metastatickým onemocněním (skupina 1), skupinou pacientů, u nichž došlo k relapsu po nefrektomii (medián RFS = 10 měsíců; skupina 2) a skupinou pacientů bez relapsu onemocnění (medián RFS = 54 měsíců; skupina 3)
Graf 12 - Exprese miR-30c, P = 0,0020
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 11 - Exprese miR-26a, P = 0,0001
V grafech 11, 12 a 14 je patrný rozdíl v expresi u miR-26a, miR-30c a miR-126 mezi zkoumanými skupinami. U miR-106b (Graf 13) jsem nezjistil statisticky významné rozdíly mezi analyzovanými skupinami, P nebylo menší nebo rovno 0,01.
Graf 14 - Exprese miR-126, P = 0,0003
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 13 - Exprese miR-106b, P = 0,0342
62
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 15 - Exprese miR-127-3p , P = 0,0416 Graf 16 - Exprese miR-136*, P = 0,0342
U miR-127-3p a
miR-136* (Graf 15, 16) jsem nepozoroval významný
statistický rozdíl mezi analyzovanými skupinami pacientů. Naproti tomu rozdíly v expresi miR-143 a miR-145 (Graf 17,18) byly statisticky významné.
Graf 18 - Exprese miR-145, P = 0,0186
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 17 - Exprese miR-143, P = 0,0064
63
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 19 - Exprese miR-195a, P = 0,0013 Graf 20 - Exprese miR-409-3p, P = 0,0252
Významné rozdíly v hladinách exprese jsem zjistil také u miR-195a a miR-451 (Graf 19, 21). U miR-409-3p jsem rozdíl v expresi nepotvrdil (Graf 20).
Normalizovaná exprese vůči RNU44
Graf 21 – Exprese miR-451, P = 0,0073
Po analýze rozptylu jsem vyhodnotil pomocí log rank testu doby přežití bez relapsu (RFS) v závislosti na úrovni hladiny jednotlivých miRNA. Rozdíly v RFS byly významné pouze u čtyř miRNA, a to u miR-26a (P = 0,088), miR-126 (P = 0,015), miR127-3p (P = 0,014) a miR-145 (P = 0,05) (Tabulka 11; Grafy 22 až 25). Nižší doba přežití pacientů korelovala s nižší hladinou analyzovaných miRNA. Nejvýznamnější rozdíly v době přežití pacientů jsem zaznamenal u miR-127-3p a miR-145. 64
Tabulka. 11 – Statisticky zpracované relativní hodnoty exprese sledovaných miRNA
Primárně metastatické nádory (1)
Nemetastatické Nemetastatické nádory nádory s relapsem (2) bez relapsu (3)
P
Statisticky významné asociace s RFS
min
max
medián
min
max
medián
min
max
medián
let-7c
0,05
2,65
0,48
0,2
5,18
1,44
0,11
3,9
2,22
0,0023
-
mir-10b
0,12
1,75
0,92
0,2
7,68
1,72
0,24
7,59
7,34
0,0004
-
miR-26a
0,68
9,86
2,09
0,82
7,35
9,36
10,37
7,94
2,69
0,0001
0,088
miR-30c
1,37
9,19
3,08
1,27
5,82
18,69
11,35
7,81
28,54
0,002
-
miR-106b
0,17
3,31
1,37
0,19
6,16
1,79
0,29
8,3
2,75
0,0342
-
miR-126 miR-1273p miR-136*
2,55 13,92
7,41
2,09 31,23
13,54
16,41
52,14
24,29 0,0003
0,015
0,01
0,33
0,04
0,01
0,17
0,04
0
9,78
0,13
0,0416
0,014
0
0,03
0,01
0
0,02
0,01
0
1,04
0,01
0,0342
-
miR-143
1,23
9,85
14,37
0,54
4,69
25,39
1,46
94,54
139,22 0,0064
-
miR-145
0,66
7,63
9,88
0,84
9,92
19,24
0,79
9,71
25,44
0,0186
0,05
miR-195a miR-4093p miR-451
0,19
7,57
1,35
0,15
9,41
4,31
0,28
9,96
4,64
0,0013
-
0,01
0,33
0,03
0,01
0,15
0,04
0,01
8,06
0,09
0,0252
-
0,23
9,56
17,78
0,24
9,4
21,13
0,72
98,24
30,52
0,0073
-
Graf 22, 23 – Přežívání pacientů s diagnostikovaným RCC bez relapsu dle expresních hladin miR-26a, miR-126
65
Graf 24, 25 - Přežívání pacientů s diagnostikovaným RCC bez relapsu dle expresních hladin miR-127-3p a miR-145
66
4.4 Stanovení účinků transfekce pre-miR-143 a anti-miR-210 a na buněčné linie ACHN a CAKI-2 4.4.1 Izolace RNA z transfekovaných buněk Z tranfekovaných buněčných linií ACHN a CAKI-2 se mi podařilo izolovat RNA v dostatečné koncentraci a čistotě. 4.4.2 Transfekce Tranzientní transfekce buněk ACHN a CAKI-2 pomocí pre-miR-143 a anti-miR210 byla v obou případech úspěšná, jak dokazují výsledky kontrolní qPCR. U ACHN i CAKI-2 stoupla po transfekci pre-miR-143 hladina miR-143 o několik řádů. Hladina miR-210 po transfekci u obou linií klesla o 90-95 %. Obě buněčné linie jsem transfekoval pre-miR-143 a pre-miR negativní kontrolou pomocí LipofectamineTM RNAiMAX. Hladiny miR-143 jsem opět detekoval pomocí TaqMan RT-PCR 24 hod po transfekci. Expresi miR-143 jsem stejně jako u miR-210 normalizoval pomocí RNU48. U liniíA CHN i CAKI-2 jsem zjistil zvýšení hladiny miR-143 o tři řády – ACHN (n = 3, P < 0.001), CAKI-2 (n = 3, P < 0.001) (Graf 26). Buňky obou linií renálního karcinomu jsem transfekoval 50nM anti-miR miRNA-210 inhibitorem a anti-miR negativní kontrolou pomocí LipofectamineTM RNAiMAX. Hladinu exprese jsem detekoval pomocí TaqMan RT-PCR 24 hod po transfekci a expresi jsem miR-210 normalizoval vůči RNU48. V případě obou buněčných linií jsem zaznamenal po transfekci anti-miR-210 snížení exprese - v případě buněk ACHN na 9,1 % ± 3,7 % (n = 3, P < 0.001) a v případě buněk CAKI-2 na 4,6 % ± 0,1 % (n = 3, P < 0.001) (Graf 27).
67
Graf 26 – Zvýšení hladiny miR-143 po transfekci ACHN a CAKI-2 pomocí
Množství miR-210 po transfekci v tisících %
pre-miR-143 v porovnání s negativní kontrolou
2000
1500
Mock
1000
pre-miR-143 500
0 ACHN
CAKI-2
Graf 27– Snížení hladiny miR-210 po transfekci ACHN a CAKI-2 pomocí anti- miR210 v porovnání s negativní kontrolou 120
Normalizovaná exprese miR-210 po transfekci [%]
100 80 Mock
60
anti-miR-210 40 20 0 ACHN
CAKI-2
4.4.3 Vliv transfekce anti-miR-210 a pre-mir-143 na viabilitu buněk CAKI-2 a ACHN Test na viabilitu (MTT) byl proveden 48 hod po transfekci pre-miR-143, resp. anti-miR-210. V případě tranzientní transfekce pre-miR-143 jsme nezaznamenali žádný 68
vliv takto ovlivněných buněk na jejich viabilitu v porovnání s negativní kontrolou (Graf 28). Pokles buněčné viability po transfekci anti-miR-210 byl naopak patrný u obou buněčných linií (Graf 29). V případě transfekovaných buněk ACHN se jednalo o pokles o 24 % ± 3,3 % (n = 3, P < 0,0005) a v případě buněk CAKI-2 pak o pokles o 28 % ± 5,4 % (n = 3, P = 0,001). Graf 28 – Viabilita ACHN a CAKI-2 48 hod po transfekci pomocí pre-miR-143 a mock 120 100 80
[%]
Mock
60
pre-miR-143 40 20 0 ACHN
CAKI - 2
Graf 29 – Viabilita ACHN a CAKI po 48 hod od transfekce anti-miR-210 a mock
120 100 80
[%]
Mock
60
anti-miR-210 40 20 0 ACHN
CAKI-2
69
4.4.4 Test na apoptózu Při flow-cytometrické detekci apoptózy pomocí komerčního kitu Annexin V FITC jsem nezaznamenal žádné významné změny v míře apoptózy ani u jedné z buněčných linií (ACHN a CAKI-2) transfekovaných pre-miR-143 (Graf 30). Pouze u line CAKI-2 jsem po transfekci anti-miR-210 (Graf 31) pozoroval snížené množství apoptických buněk ve srovnání s negativní kontrolou, avšak při hraniční statistické významnosti. Poměr apoptických buněk byl u populace ACHN po transfekci pre-miR143 4,3 % ± 2,1 % (P = 0,787, n = 3) a u CAKI-2 3,2 % ± 0,6 % (P = 0,409, n = 3). Po transfekci anti-miR-210 byl poměr apoptických buněk v populace ACHN 4,0 % ± 0,9 % (P = 0,958, n = 3) a u CAKI-2 4,2 % ± 0,9 % (P = 0,029, n =3).
Graf 30 – Množství apoptických buněk u linií ACHN a CAKI-2 po transfekci pre-miR-143 120,0 100,0 80,0 60,0
Ostatní buňky Apoptické buňky
40,0 20,0 0,0 Mock
pre-miR-143 ACHN
Mock
pre-miR-143 CAKI-2
70
Graf 31 – Množství apoptických buněk u linií ACHN a CAKI po transfekci anti-miR-210 120 100 80 60
Ostatní buňky Apoptické buňky
40 20 0 Mock
anti-miR-210 ACHN
Mock
anti-miR-210 CAKI-2
4.4.5 Analýza buněčného cyklu Buňky ACHN a CAKI-2 jsem 48 hod po transfekci obarvil propidium jodidem a flow-cytometricky jsem analyzoval buněčný cyklus. U linií ACHN a CAKI-2 transfekovaných pre-miR-143 jsem nezaznamenal žádný statisticky významný rozdíl v proporčním zastoupení buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu oproti negativní kontrole (Graf 32, 33). U buněk linie ACHN transfekovaných anti-miR-210 jsem nezaznamenal žádné změny buněčného cyklu. U buněk CAKI-2 s umlčenou miR-210 jsem zjistil signifikantně zvýšené množství buněk akumulovaných ve fázi G2 buněčného cyklu a naopak snížený počet buněk ve fázi S buněčného cyklu (P = 0,001, n = 3) (Graf 35).
71
Graf 32 – Procentuální zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu u ACHN po transfekci pre-miR-143 s negativní kontrolou
Graf 33 – Procentuální zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu u CAKI-2 po transfekci pre-miR-143 s negativní kontrolou
72
Graf 34 – Procentuální zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu u ACHN po transfekci anti-miR-210
Graf 35 – Procentuální zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu u CAKI-2 po transfekci anti-miR-210
73
4.4.6 Scratch wound migrační test Buňky obou buněčných linií byly transfekovány pre-miR-143 a anti-miR-210 a 48 hod po transfekci jsem na nich provedl tzv. “scratch-wound” migrační test. Po transfekci buněčných linií ACHN a CAKI-2 (Graf 36) pomocí pre-miR-143 jsem nepozoroval žádný rozdíl v migraci ani u ACHN (P = 0,57) stejně tak u CAKI-2 (P = 0,75). U anti-miR-210 transfekovaných ACHN buněk byl patrný pokles migračního potenciálu o 5 % (P = 0,04, n = 3) (Graf 39). U buněk linie CAKI-2 jsem nepozoroval žádný vliv umlčení miR-210 na migrační potenciál buněk (Graf 37). Graf 36 – Procentuální vyjádření migrace u linií ACHN a CAKI-2 po transfekci premiR-143 100 80 60
ACHN Mock ACHN pre-miR-143
40
CAKI-2 Mock 20
CAKI-2 pre-miR-143
0 Mock
pre-miR-143 ACHN
Mock
pre-miR-143 CAKI-2
Graf 37 – Procentuální vyjádření migrace u linií ACHN a CAKI-2 po transfekci anti-miR-210 100 80 60
ACHN Mock ACHN anti-miR-210
40
CAKI-2 Mock CAKI-2 anti-miR-210
20 0 Mock
anti-miR-210 ACHN
Mock
anti-miR-210 CAKI-2
74
4.4.7 Test buněčné invazivity pomocí systému xCELLigence V případě buněk ACHN transfekovaných anti-miR-210 byl patrný pokles invazivity ve všech časových intervalech: 12 h – pokles o 20 % (P = 0,01, n = 4), 36 h = pokles o 21 % (P = 0,002, n = 4), 48 h – pokles o 23 % (P = 0,015, n = 4) (Graf 38, 39). V případě buněk CAKI-2 transfekovaných 50nM anti-miR-210 jsem pozoroval opačný trend, ovšem výsledky nebyly statisticky signifikantní. Změny invazivních vlastností buněk CAKI-2 s umlčenou miR-210 byly opět sledovány ve třech časových intervalech: 12 h – nárůst o 9 % (P = 0,585, n = 4), 36 h – nárůst o 4 % (P = 0,746, n = 4), 48 h – nárůst o 7 % (P = 0,514, n = 4) (Graf 40, 41).
Graf 38 – Zobrazení buněčného indexu u linie ACHN po transfekci anti-miR-210 3,5
anti-miR-210
Mock
3
Buněčný index
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-0,5 -10
0
10
20
30
75
40
50
60
Graf 39 – Zobrazení buněčného indexu u linie ACHN po transfekci anti-miR-210 modrá –transfekce anti-miR negativní kontrolou, tzv. mock fialová – transfekce anti-miR-210 3 2,5
Buněčnýl index
2 1,5 1 0,5 0 12 h
36 h Čas
48 h
Graf 40 – Zobrazení buněčného indexu u linie CAKI-2 po transfekci anti-miR-210 modrá – transfekce anti-miR-210; fialová – transfekce anti-miR negativní kontrolou, tzv. mock
4,5 4 3,5 3
Buněčný index
2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 -1 -10
0
10
20
30
Čas
76
40
50
60
Graf 41 – Zobrazení buněčného indexu u linie CAKI-2 po transfekci anti-miR-210 modrá – transfekce anti-miR-210; fialová – transfekce anti-miR negativní kontrolou, tzv. mock 4 3,5 3
Buněčný index
2,5 2
1,5 1 0,5 0 12 h 12
36 h 36 Čas
77
48 h 48
5. DISKUZE Prvním cílem této práce bylo ověřit rozdílné hodnoty exprese vybraných sérových miRNA, které byly identifikované v dřívější studii v naší laboratoři a potvrdit jejich výpovědní hodnotu při odlišení pacientů s RCC a zdravých jedinců. Vybrané miRNA jsem tedy testoval na širším souboru pacientů a kontrolní skupině zdravých jedinců. Cirkulující miRNA jsou vzhledem ke svým výjimečným vlastnostem považovány za potenciální neinvazivní biomarkery. Na základě dřívějšího výzkumu naší laboratoře, při kterém byly analyzovány hladiny exprese 667 vybraných miRNA v séru pacientů s RCC v porovnání s kontrolní skupinou, byly pro další analýzu vybrány miR-155, miR-378 a miR-451. Jako endogenní kontrolu pro normalizaci jsem použil miR-16, kvůli její stabilní expresi v séru (Lawrie et al. 2008). Z těchto tří miRNA se mi podařilo ptvrdit odlišnou expresi u miR-378 a miR-451. Cirkulující miR-378 byla v séru pacientů s RCC zvýšená, je totiž zapojena do regulace nádorových supresorů SUFU a TUSC2 (Lee et al. 2007). Dále miR-451, jejíž hladiny v séru pacientů byly snížené, je lokalizována na chromozomu 17 (Yi et al. 2010) a je pravděpodobně začleněna do regulace dráhy PI3K/AKT (Tian et al. 2012). Analytické parametry miR-378 (senzitivita 70 %, specificita 60 %) a miR-451 (senzitivita 81 %, specificita 77 %) prokázaly potenciál těchto miRNA odlišit sérum pacientů s RCC od séra zdravých nenádorových kontrol. Navíc po kombinaci těchto dvou miRNA se senzitivita zvýšila na 81 % a specificita na 83 %. Mezi sérové miRNA, které byly zkoumány s cílem odlišit s jejich pomocí pacienty s RCC od nenádorových kontrol patří i miR-1233 (Wulfken et al. 2011). Při použití jen této miRNA bylo již dosaženo 77,4% senzitivity a 37,6% specificity. Při kombinaci této miRNA spolu s miR-378 a miR-451 by se pravděpodobně hodnota senzitivity i specificity ještě zvýšily. Jako další sérové miRNA vhodné pro ověření možného použití by mohly následovat miR-760, mir-381, miR-1513p, miR-629 a mnohé další (Rédová et al. 2012). MiR-378 a miR-451 by měly být dále prověřeny na větším souboru pacientů a kontrol, protože v nedávné studii nebyly u miR-378 zjištěny pozorované rozdíly v expresi mezi pacienty s RCC a kontrolní skupinou (Hauser et al. 2012). Tato sérová miRNA byla také studována jako možný marker karcinomu žaludku (Liu et al. 2012). Jen pomocí miR-378 se podařilo odlišit pacienty s karcinomem žaludku od kontrolní skupiny s 87,5% senzitivitou a 70,7% specificitou (AUC = 0,861). Naproti tomu tkáňová miR-378 je u např. kolorektálního
78
karcinomu snížená (Faltejsková et al. 2012). Snížená hladina by mohla být vysvětlena jiným kontextem, do kterého je miR-378 v rámci patogeneze RCC zapojena. Dalším cílem bylo analyzovat miRNA z tkání RCC fixovaných ve formalínu a uchovaných v parafínu (FFPE). Na základě expresního profilování založeného na principu qRT-PCR bylo v předchozí studii v naší laboratoři identifikováno 64 miRNA odlišně exprimovaných v rámci jednotlivých skupin pacientů s RCC (P ˂ 0,05). Dvacet miRNA vykazovalo zvýšenou expresi a 44 miRNA naopak sníženou expresi. Na základě těchto výsledků byly pro ověření vybrány let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-30c, miR-106b, miR-126, miR-127-3p, miR-136*, mir-143, mir-145, mir-195, miR-409-3p, miR-451. Do studie bylo zařazeno 46 pacientů (32 mužů a 14 žen) s ccRCC. Medián věku pacientů byl 62 let. Cílem bylo srovnání exprese uvedených miRNA mezi jednotlivými prognostickými skupinami pacientů s RCC. Jednalo se o 18 pacientů s metastatickým onemocněním (skupina 1), 10 pacientů, u nichž došlo k relapsu po nefrektomii (medián RFS = 10 měsíců; skupina 2) a 18 pacientů bez relapsu onemocnění (medián RFS = 54 měsíců; skupina 3). Zjistil jsem, že exprese miR-10b, miR-26a, miR-126, miR-143, miR-145 a miR195 byla snížená v primárních nádorech, u kterých došlo k relapsu. Ještě nižší hladiny však byly u primárně metastatických tumorů. Skutečná role zkoumaných miRNA se ještě bude muset ověřit funkčními studiemi. V případě miR-409-3p, miR-127-3p a miR136* jsem nepotvrdil rozdíly v expresi patrné v dřívější studii. Tyto výsledky však bude nutné ověřit na větším souboru pacientů. Následně jsem přistoupil k analýze hladin miRNA a jejich vztahu k době přežívání pacientů bez relapsu. Za tímto účelem jsme pomocí ROC analýzy definovali hraniční (cut-off) hodnoty pro jednotlivé miRNA charakterizující relaps. Pomocí Kaplan-Meierovy analýzy a log-rank testu jsem prokázal významnou korelaci mezi miR-127-3p (P = 0,014), miR-145 (P = 0,05) a miR-126 (P = 0,015) a přežíváním bez relapsu. Také jsem zjistil trend snížené exprese miR-26a u RCC pacientů, u nichž došlo k relapsu onemocnění (P < 0,1). Jednotlivé miRNA validované v této fázi projektu byly již studovány u řady jiných malignit. Zvýšená hladina miR-10b je totiž dle nedávné studie zapojena do posílení migrace a invazivity u hepatocelulárního karcinomu (Li et al. 2012). Opačné působení této miRNA u RCC by mohlo být vysvětleno jiným kontextem, do kterého je miR-10b v rámci patogeneze RCC zapojena (Nakata et al. 2011). Zvýšená exprese miR26a podporuje růst cholangiokarcinomu, naproti tomu v plicních karcinomech je její 79
hladina snížená (Dang et al. 2012). Její uměle zvýšená exprese může iniciovat apoptózu u nádorových buněk prostřednictvím cílení MTDH a EZH2 (Zhang et al. 2011). Nádorově supresorové miR-143 a miR-145 jsou zahrnuty v procesu epiteliálněmesenchymální tranzice (Peng et al. 2011). Snížené hladiny těchto miRNA byly také nalezeny v kostních metastázách karcinomu močového měchýře (Noguchi et al. 2011). MiR-195 je zapojena do regulace BCL2 a její ektopická exprese vede k významnéhu snížení hladiny tohoto proteinu (Singh et Saini 2012). K dalším cílům této miRNA patří CDK4 (Lin et al. 2012). Ektopickou expresí miR-195 v buněčné linii T24 odvozené od nádoru močového měchýře došlo k zástavě buněčného cyklu v G1 fázi. Z výsledků této práce vyplývá, že represe nádorově supresorových miRNA by mohla být významným mechanismem při získávání metastatického potenciálu nádorových buněk v patogenezi RCC. Jejich úmělé navýšení by pak mohlo rozvoj nádoru omezit. Identifikované miRNA by mohly být také používány pro predikci časného relapsu po nefrektomii v klinické praxi a tím by mohly přispět k individualizaci terapie pacientů s RCC. V rámci řešení třetího cíle předkládané diplomové práce jsem na buněčných liniích renálního karcinomu ACHN (metastatický renální adenokarcinom) a CAKI-2 (primární renální karcinom) po transfekci příslušnými pre-/anti-miRNA sledoval buněčnou viabilitu (MTT test), detekoval jsem apoptózu (flow-cytometricky pomocí Annexin V-FITC kitu), sledoval jsem případné změny v buněčném cyklu (flowcytometricky), migrační potenciál ovlivněných buněk („scratch-wound“ migrační test) a buněčnou invazivitu (pomocí systému xCELLigence, který je založen na měření impedance transfekovaných buněk). Účinnost transfekce byla kontrolována pomocí qRT-PCR. U obou linií proběhla tranfekce pomocí obou miRNA úspěšně. U pre-miR-143 došlo ke statisticky signifikantnímu zvýšení hladiny exprese miR-143. Po transfekci anti-miR-210 došlo k úspěšnému snížení hladiny miR-210 na 9,1 % u ACHN a 4,6 % u CAKI-2. Pomocí MTT testu jsem prokázal, že snížení životaschopnosti nastalo u obou buněčných linií pouze po transfekci anti-miR-210. Zvýšená hladina miR-210 znamená většinou špatnou prognózu a to jak u RCC, tak u karcinomu prsu nebo u hepatocelulárního karcinomu (Valera et al. 2011, Toyama et al. 2012, Ying et al. 2011). Hladina miR-210 v plasmě pak koreluje se senzitivitou k trastuzumabu u pacientů karcinomem prsu (Jung et al. 2012). V rámci sledování změn míry apoptózy u obou buněčných linií transfekovaných buď pre-miR-143 nebo anti-miR-210 jsem nedetekoval 80
žádné statisticky významné změny v procentuálním zastoupení apoptotických buněk. Po transfekci anti-miR-210 u buněčné linie CAKI-2 však došlo ke kumulaci buněk ve fázi G2 buněčného cyklu. U linie ACHN nebyl pozorován žádný rozdíl, stejně tak po transfekci pre-miR-143 u obou linií. Migrační test prokázal vliv miR-210 na migraci u buněčné linie CAKI-2. Naopak vliv miR-143 na migraci jsem nepozoroval ani u jedné z linií. Invazivita buněčných linií ACHN a CAKI-2 byla sledována pomocí systému xCELLingence založeném na měření impedance v jamce. Ta byla sledována ve třech časových intervalech - po 12 hod, po 36 hod a po 48 hod, přičemž byly testovány pouze účinky transfekce anti-miR-210. Po 24 hod byl zaznamenán pokles invazivity o 20 % oproti negativní kontrole (P = 0,01), po 36 h pokles o 21 % (P = 0,002) a po 48 h pokles o 23 % (P = 0,015). U linie CAKI-2 byl pozorován opačný trend, avšak nebyl statisticky významný. Po 24 h došlo nárůst o 9 % (P = 0,585), po 36 h nárůst o 4 % (P = 0,746) a po 48 h nárůst o 7 % (P = 0,514). Z těchto výsledků je patrné, že miR-210 pravděpodobně hraje důležitou roli v regulaci různých buněčných regulačních drah, které jsou zapojeny do vývoje a podpory růstu RCC. Vliv transfekce na invazivitu pomocí pre-miR-143 jsem neprováděl, protože její vliv na invazivitu už je částečně prokázán (Peng et al. 2011) Další významné účinky na obě linie se mi pomocí pre-miR143 nepodařilo prokázat.
81
6. SOUHRN V současné době představují maligní nádory ledvin 3 % všech malignit vyskytujících se u dospělé populace. Renální karcinom (RCC) dosahuje mezi zhoubnými nádory ledvin nejvyšší letality. Česká republika dosáhla počtem nově diagnostikovaných nádorů první příčky v incidenci tohoto onemocnění mezi všemi státy světa. Vzhledem k tomu je důležité zlepšit diagnostiku tohoto onemocnění a lépe objasnit molekulárně genetické mechanismy hrající rozhodující roli ve vzniku a vývoji RCC. V první části této práce jsem pracoval se souborem sér 90 pacientů (56 mužů a 34 žen) s RCC a 35 zdravých kontrolních jedinců. Sérum bylo odebráno pacientům i zdravým kontrolám v letech 2010 až 2011..Medián věku pacientů v době odběru byl 66 let. U tohoto souboru 125 jedinců byly analyzovány hladiny sérových miR-150, miR378 a miR-451. U posledních dvou jmenovaných se podařilo prokázat rozdílné hladiny v séru pacientů a zdravých jedinců. Za použití miR-378 a miR-451 se podařilo odlišit pacienty s RCC a kontrolní jedince s 81% senzitivitou a 83% specificitou. Ve druhé části práce byly analyzovány tkáňové miRNA let-7c, miR-10b, miR26a, miR-30c, miR-106b, miR-126, miR-127-3p, miR-136*, mir-143, mir-145, mir-195, miR-409-3p a miR-451. MiRNA byly izolovány z FFPE tkáně RCC. Do studie bylo zařazeno 46 pacientů (32 mužů a 14 žen) s RCC. Medián věku pacientů byl 62 let. U 18 pacientů byl RCC metastatický u 28 nemetastatický. Pacienti byli rozděleni do tří prognostických
skupin.
V první
byli
primárně
metastatické
RCC,
v druhé
nemetastatické RCC s relapsem a ve třetí nemetastatické RCC bez relapsu. Statisticky významné rozdíly (P˂0,01) mezi skupinami byly zjištěny u let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-30c, miR-143, miR-195a a miR-451. Asociace s RFS byla nejvýraznější u miR26a, miR-126, miR-127-3p a miR-195a. V poslední části této práce byl zkoumán vliv transfekce pre-miR-143 a anti-miR210 na buněčné line ACHN a CAKI-2 odvozené z RCC. Po úspěšně provedené transfekci byl prokázán vliv na buněčné linie pouze pomocí miR-210. Výsledky experimentů prokázaly její vliv na buněčný cyklus, migraci a invazivitu.
82
6. SUMMARY At present malignant kidney tumors represent 3% of all malignancies occurring in the adult population. Renal cell carcinoma (RCC) reachs the highest lethality in all kidey malignancies. Czech Republic has reached of the number of newly diagnosed cancers in the first rungs in the incidence of the disease among all countries of the world. Given the importance of improving the diagnosis of disease and to better clarify the molecular genetic mechanisms playing a crucial role in the emergence and development of RCC. In the first part of this thesis, I worked with a set of sera from 90 patients (56 men and 34 women) with RCC and 35 healthy control subjects. Serum was collected from patients and healthy controls from 2010 until 2011. The median of patients age at the time of collection was 66 years. With this set of 125 individuals were analyzed serous miR-150, miR-378 and miR-451. With two last named we were able to demonstrate different levels in the serum of patients and healthy controls. Combination of miR-378 and miR-451 was able to distinguish patients with RCC and control group with 81% sensitivity and 83% specificity. In the second part of the thesis we were analyzed miRNA let-7c, miR-10b, miR26a, miR-30c, miR-106b, miR-126, miR-127-3p, miR-136*, mir-143, mir-145, mir-195, miR-409-3p and miR-451. MiRNAs were isolated from FFPE RCC tissues.. The study included 46 patients (32 males and 14 females) with RCC. The median of patients age was 62 years. 18 patients had metastatic RCC and 28 had nonmetastatic RCC. Patients were divided into three prognostic groups. The first was primarily metastatic RCC, in the second nonmetastatick RCC with relapsed and in the third nonmetastatické RCC without relapse. Statistically significant differences (P ˂ 0.01) between groups were found in let-7c, miR-10b, miR-26a, miR-30c, miR-143, miR-195a and miR-451st Association with RFS was most pronounced for miR-26a, miR-126, miR-127-3p and miR-195a. In the last part of this work we studied the influence of transfection with premiR-143 and anti-miR-210 on cell lines ACHN and CAKI-2 derived from the RCC. After successful transfection was shown to influence the cell lines using only miR-210. The experimental results have shown its effect on cell cycle, migration and invasiveness.
83
LITERATURA Adam Z, Vorlíček J. 2002. Speciální onkologie, první vydání. Masarykova univerzita, Brno Araki, K., A. H. Ellebedy, and R. Ahmed. 2011. TOR in the immune system. Curr Opin Cell Biol 23:707-715. Audenet, F., D. R. Yates, G. Cancel-Tassin, O. Cussenot, and M. Rouprêt. 2011. Genetic pathways involved in carcinogenesis of clear cell renal cell carcinoma: genomics towards personalized medicine. BJU Int.
Baba, M., S. B. Hong, N. Sharma, M. B. Warren, M. L. Nickerson, A. Iwamatsu, D. Esposito, W. K. Gillette, R. F. Hopkins, J. L. Hartley, M. Furihata, S. Oishi, W. Zhen, T. R. Burke, W. M. Linehan, L. S. Schmidt, and B. Zbar. 2006. Folliculin encoded by the BHD gene interacts with a binding protein, FNIP1, and AMPK, and is involved in AMPK and mTOR signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 103:15552-15557.
Baluk, P., H. Hashizume, and D. M. McDonald. 2005. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr Opin Genet Dev 15:102-111.
Barliya, T., M. Mandel, T. Livnat, D. Weinberger, and G. Lavie. 2011. Degradation of HIF-1alpha under hypoxia combined with induction of Hsp90 polyubiquitination in cancer cells by hypericin: a unique cancer therapy. PLoS One 6:e22849.
Bertout, J. A., A. J. Majmundar, J. D. Gordan, J. C. Lam, D. Ditsworth, B. Keith, E. J. Brown, K. L. Nathanson, and M. C. Simon. 2009. HIF2alpha inhibition promotes p53 pathway activity, tumor cell death, and radiation responses. Proc Natl Acad Sci U S A 106:14391-14396.
Bromberg, J. 2002. Stat proteins and oncogenesis. J Clin Invest 109:1139-1142.
Bukowski M R, Figlin A R, Motzer. 2009 Renal cell carcinoma, Molecular Targets and clinical aplications, second edition. Humana press, New York, USA
Calin, G. A., C. G. Liu, C. Sevignani, M. Ferracin, N. Felli, C. D. Dumitru, M. 84
Shimizu, A. Cimmino, S. Zupo, M. Dono, M. L. Dell'Aquila, H. Alder, L. Rassenti, T. J. Kipps, F. Bullrich, M. Negrini, and C. M. Croce. 2004a. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A 101:11755-11760.
Calin, G. A., C. Sevignani, C. D. Dumitru, T. Hyslop, E. Noch, S. Yendamuri, M. Shimizu, S. Rattan, F. Bullrich, M. Negrini, and C. M. Croce. 2004b. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101:2999-3004.
Catto, J. W., A. Alcaraz, A. S. Bjartell, R. De Vere White, C. P. Evans, S. Fussel, F. C. Hamdy, O. Kallioniemi, L. Mengual, T. Schlomm, and T. Visakorpi. 2011. MicroRNA in prostate, bladder, and kidney cancer: a systematic review. Eur Urol 59:671-681.
Cho IC, Chung J. Current status of targeted therapy for advanced renal cell carcinoma.Korean J Urol. 2012 Apr;53(4):217-28. Epub 2012 Apr 18 Cho, W. C. 2011. Circulating MicroRNAs as Minimally Invasive Biomarkers for Cancer Theragnosis and Prognosis. Front Genet 2:7.
Craven, R. A., A. J. Stanley, S. Hanrahan, J. Dods, R. Unwin, N. Totty, P. Harnden, I. Eardley, P. J. Selby, and R. E. Banks. 2006. Proteomic analysis of primary cell lines identifies protein changes present in renal cell carcinoma. Proteomics 6:2853-2864.
Dang X, Ma A, Yang L, Hu H, Zhu B, Shang D, Chen T, Luo Y. 2012. MicroRNA26a regulates tumorigenic properties of EZH2 in human lung carcinoma cells. Cancer Genet.;205(3):113-23.
Davis, S., B. Lollo, S. Freier, and C. Esau. 2006. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res 34:2294-2304.
Denli, A. M., B. B. Tops, R. H. Plasterk, R. F. Ketting, and G. J. Hannon. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432:23185
235.
Ding, L., Y. Xu, W. Zhang, Y. Deng, M. Si, Y. Du, H. Yao, X. Liu, Y. Ke, J. Si, and T. Zhou. 2010. MiR-375 frequently downregulated in gastric cancer inhibits cell proliferation by targeting JAK2. Cell Res 20:784-793.
Doench, J. G., and P. A. Sharp. 2004. Specificity of microRNA target selection in translational repression. Genes Dev 18:504-511.
Faltejskova P, Svoboda M, Srutova K, Mlcochova J, Besse A, Nekvindova J, Radova L, Fabian P, Slaba K, Kiss I, Vyzula R, Slaby O. 2012. Identification and functional screening of microRNAs highly deregulated in colorectal cancer. J Cell Mol Med.
Fasanaro, P., Y. D'Alessandra, V. Di Stefano, R. Melchionna, S. Romani, G. Pompilio, M. C. Capogrossi, and F. Martelli. 2008. MicroRNA-210 modulates endothelial cell response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosine kinase ligand Ephrin-A3. J Biol Chem 283:15878-15883.
Favaro, E., A. Ramachandran, R. McCormick, H. Gee, C. Blancher, M. Crosby, C. Devlin, C. Blick, F. Buffa, J. L. Li, B. Vojnovic, R. Pires das Neves, P. Glazer, F. Iborra, M. Ivan, J. Ragoussis, and A. L. Harris. 2010. MicroRNA-210 regulates mitochondrial free radical response to hypoxia and krebs cycle in cancer cells by targeting iron sulfur cluster protein ISCU. PLoS One 5:e10345. Felipe, A., R. Vicente, N. Villalonga, M. Roura-Ferrer, R. Martínez-Mármol, L. Solé, J. C. Ferreres, and E. Condom. 2006. Potassium channels: new targets in cancer therapy. Cancer Detect Prev 30:375-385.
Fendler, A., C. Stephan, G. M. Yousef, and K. Jung. 2011. MicroRNAs as regulators of signal transduction in urological tumors. Clin Chem 57:954-968. Filková, M., A. Jüngel, R. E. Gay, and S. Gay. 2012. MicroRNAs in Rheumatoid Arthritis: Potential Role in Diagnosis and Therapy. BioDrugs 26:131-141. 86
Fingar, D. C., and J. Blenis. 2004. Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression. Oncogene 23:3151-3171.
Flaherty KT. 2006 Chemotherapy and targeted therapy combinations in advanced melanoma. Clin Cancer Res. Apr 1;12(7 Pt 2):2366s-2370s. Garofalo, M., G. Di Leva, G. Romano, G. Nuovo, S. S. Suh, A. Ngankeu, C. Taccioli, F. Pichiorri, H. Alder, P. Secchiero, P. Gasparini, A. Gonelli, S. Costinean, M. Acunzo, G. Condorelli, and C. M. Croce. 2009. miR-221&222 regulate TRAIL resistance and enhance tumorigenicity through PTEN and TIMP3 downregulation. Cancer Cell 16:498-509.
Garofalo, M., C. Quintavalle, C. Zanca, A. De Rienzo, G. Romano, M. Acunzo, L. Puca, M. Incoronato, C. M. Croce, and G. Condorelli. 2008. Akt regulates druginduced cell death through Bcl-w downregulation. PLoS One 3:e4070.
Giannakakis, A., R. Sandaltzopoulos, J. Greshock, S. Liang, J. Huang, K. Hasegawa, C. Li, A. O'Brien-Jenkins, D. Katsaros, B. L. Weber, C. Simon, G. Coukos, and L. Zhang. 2008. miR-210 links hypoxia with cell cycle regulation and is deleted in human epithelial ovarian cancer. Cancer Biol Ther 7:255-264.
Giubellino, A., W. M. Linehan, and D. P. Bottaro. 2009. Targeting the Met signaling pathway in renal cancer. Expert Rev Anticancer Ther 9:785-793.
Gregory, P. A., A. G. Bert, E. L. Paterson, S. C. Barry, A. Tsykin, G. Farshid, M. A. Vadas, Y. Khew-Goodall, and G. J. Goodall. 2008. The miR-200 family and miR205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1. Nat Cell Biol 10:593-601.
Hanahan, D., and R. A. Weinberg. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100:57-70. Heinzelmann, J., B. Henning, J. Sanjmyatav, N. Posorski, T. Steiner, H. Wunderlich, M. R. Gajda, and K. Junker. 2011. Specific miRNA signatures are 87
associated with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma. World J Urol 29:367-373.
Hauser S, Wulfken LM, Holdenrieder S, Moritz R, Ohlmann CH, Jung V, Becker F, Herrmann E, Walgenbach-Brünagel G, von Ruecker A, Müller SC, Ellinger J. 2012. Analysis of serum microRNAs (miR-26a-2*, miR-191, miR-337-3p and miR378) as potential biomarkers in renal cell carcinoma. Cancer Epidemiol..
Hejna JA, Timmers CD, Reifsteck C, Bruun DA, Lucas LW, Jakobs PM, TothFejel S, Unsworth N, Clemens SL, Garcia DK, Naylor SL, Thayer MJ, Olson SB, Grompe M, Moses RE. 2000. Localization of the Fanconi Anemia Complementation Group D Gene to a 200-kb Region on Chromosome 3p25.3 Am. J. Hum. Genet. 66:1540–1551.
Hirata, H., Y. Hinoda, K. Ueno, K. Nakajima, N. Ishii, and R. Dahiya. 2012. MicroRNA-1826 directly targets beta-catenin (CTNNB1) and MEK1 (MAP2K1) in VHL-inactivated renal cancer. Carcinogenesis 33:501-508. Holečková P. 2011Souhrn novinek cílené biologické léčby renálního karcinomu. Urol. praxi,; 12(2): 100–104
Huang, X., Q. T. Le, and A. J. Giaccia. 2010. MiR-210--micromanager of the hypoxia pathway. Trends Mol Med 16:230-237. Hutvágner, G., M. J. Simard, C. C. Mello, and P. D. Zamore. 2004. Sequencespecific inhibition of small RNA function. PLoS Biol 2:E98.
Ikuerowo, S. O., M. A. Kuczyk, R. von Wasielewski, O. B. Shittu, U. Jonas, S. Machtens, and J. Serth. 2007. p16INK4a expression and clinicopathologic parameters in renal cell carcinoma. Eur Urol 51:732-737; discussion 738.
Inoki K, Guan KL 2006Complexity of the TOR signaling network.Trends Cell Biol. Apr;16(4):206-12. 88
Jung EJ, Santarpia L, Kim J, Esteva FJ, Moretti E, Buzdar AU, Di Leo A, Le XF, Bast RC Jr, Park ST, Pusztai L, Calin GA. Plasma microRNA 210 levels correlate with sensitivity to trastuzumab and tumor presence in breast cancer patients. Cancer.;118(10):2603-14.
Kaelin, W. G. 2002. Molecular basis of the VHL hereditary cancer syndrome. Nat Rev Cancer 2:673-682.
Kaelin, W. G. 2005. The von Hippel-Lindau protein, HIF hydroxylation, and oxygen sensing. Biochem Biophys Res Commun 338:627-638. Kawaciuk I. 2005. Prognóza karcinomu ledviny, první vydání. Galén, Praha Khoo, S. K., M. Bradley, F. K. Wong, M. A. Hedblad, M. Nordenskjöld, and B. T. Teh. 2001. Birt-Hogg-Dubé syndrome: mapping of a novel hereditary neoplasia gene to chromosome 17p12-q11.2. Oncogene 20:5239-5242.
Khvorova, A., A. Reynolds, and S. D. Jayasena. 2003. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115:209-216.
Kim, W. Y., and W. G. Kaelin. 2004. Role of VHL gene mutation in human cancer. J Clin Oncol 22:4991-5004.
Kitada, K., and T. Yamasaki. 2007. The MDR1/ABCB1 regional amplification in large inverted repeats with asymmetric sequences and microhomologies at the junction sites. Cancer Genet Cytogenet 178:120-127. Klener P, Abrahámová J, Fait V, Mališ J, Matějovský Z, Petruželka L, Žaloudík J. 2002. Klinická onkologie, první vydání. Galén, Praha Klener P, Klener P. 2009. Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii, první vydání. Grada,, Brno Krützfeldt, J., N. Rajewsky, R. Braich, K. G. Rajeev, T. Tuschl, M. Manoharan, and M. Stoffel. 2005. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 89
438:685-689.
Lal, A., H. H. Kim, K. Abdelmohsen, Y. Kuwano, R. Pullmann, S. Srikantan, R. Subrahmanyam, J. L. Martindale, X. Yang, F. Ahmed, F. Navarro, D. Dykxhoorn, J. Lieberman, and M. Gorospe. 2008. p16(INK4a) translation suppressed by miR-24. PLoS One 3:e1864.
Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulford K, Banham AH, Pezzella F, Boultwood J, Wainscoat JS, Hatton CS, Harris AL. 2008 Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol.;141(5):672-5 Lee DY, Deng Z, Wang CH Yang BB. 2007. MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targeting SuFu and Fus-1 expression. Proc Natl Acad Sci U S A.;104(51):20350-5. Lee, J. T., B. D. Lehmann, D. M. Terrian, W. H. Chappell, F. Stivala, M. Libra, A. M. Martelli, L. S. Steelman, and J. A. McCubrey. 2008. Targeting prostate cancer based on signal transduction and cell cycle pathways. Cell Cycle 7:1745-1762.
Lee, M. J., J. Y. Kim, K. Suk, and J. H. Park. 2004. Identification of the hypoxiainducible factor 1 alpha-responsive HGTD-P gene as a mediator in the mitochondrial apoptotic pathway. Mol Cell Biol 24:3918-3927.
Lee, Y. C. 2005. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Curr Opin Investig Drugs 6:1124-1130.
Lee, Y. M., Y. J. Park, S. J. Lee, Y. Ku, S. B. Han, P. R. Klokkevold, and C. P. Chung. 2000. The bone regenerative effect of platelet-derived growth factor-BB delivered with a chitosan/tricalcium phosphate sponge carrier. J Periodontol 71:418424.
Li QJ, Zhou L, Yang F, Wang GX, Zheng H, Wang DS, He Y, Dou KF. 2012. MicroRNA-10b promotes migration and invasion through CADM1 in human hepatocellular carcinoma cells. Tumour Biol. 90
Lin Y, Wu J, Chen H, Mao Y, Liu Y, Mao Q, Yang K, Zheng X, Xie L. 2012. Cyclin-dependent kinase 4 is a novel target in micoRNA-195-mediated cell cycle arrest in bladder cancer cells. FEBS Lett.;586(4):442-7
Linehan, W. M., P. A. Pinto, G. Bratslavsky, E. Pfaffenroth, M. Merino, C. D. Vocke, J. R. Toro, D. Bottaro, L. Neckers, L. S. Schmidt, and R. Srinivasan. 2009. Hereditary kidney cancer: unique opportunity for disease-based therapy. Cancer 115:2252-2261.
Linehan, W. M., R. Srinivasan, and L. S. Schmidt. 2010. The genetic basis of kidney cancer: a metabolic disease. Nat Rev Urol 7:277-285.
Liu, H., A. R. Brannon, A. R. Reddy, G. Alexe, M. W. Seiler, A. Arreola, J. H. Oza, M. Yao, D. Juan, L. S. Liou, S. Ganesan, A. J. Levine, W. K. Rathmell, and G. V. Bhanot. 2010. Identifying mRNA targets of microRNA dysregulated in cancer: with application to clear cell Renal Cell Carcinoma. BMC Syst Biol 4:51.
Liu H, Zhu L, Liu B, Yang L, Meng X, Zhang W, Ma Y, Xiao H. 2012 Genomewide microRNA profiles identify miR-378 as a serum biomarker for early detection of gastric cancer. Cancer Lett. 28;316(2):196-203. Lund, E., S. Güttinger, A. Calado, J. E. Dahlberg, and U. Kutay. 2004. Nuclear export of microRNA precursors. Science 303:95-98.
Majid, S., S. Saini, A. A. Dar, H. Hirata, V. Shahryari, Y. Tanaka, S. Yamamura, K. Ueno, M. S. Zaman, K. Singh, I. Chang, G. Deng, and R. Dahiya. 2011a. MicroRNA-205 inhibits Src-mediated oncogenic pathways in renal cancer. Cancer Res 71:2611-2621.
Mandriota, S. J., K. J. Turner, D. R. Davies, P. G. Murray, N. V. Morgan, H. M. Sowter, C. C. Wykoff, E. R. Maher, A. L. Harris, P. J. Ratcliffe, and P. H. Maxwell. 2002. HIF activation identifies early lesions in VHL kidneys: evidence for site-specific tumor suppressor function in the nephron. Cancer Cell 1:459-468. 91
Matsumoto, K., and T. Nakamura. 2001. Hepatocyte growth factor: renotropic role and potential therapeutics for renal diseases. Kidney Int 59:2023-2038.
Maxwell, P. H., M. S. Wiesener, G. W. Chang, S. C. Clifford, E. C. Vaux, M. E. Cockman, C. C. Wykoff, C. W. Pugh, E. R. Maher, and P. J. Ratcliffe. 1999. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399:271-275.
Meng, Q., C. Xia, J. Fang, Y. Rojanasakul, and B. H. Jiang. 2006. Role of PI3K and AKT specific isoforms in ovarian cancer cell migration, invasion and proliferation through the p70S6K1 pathway. Cell Signal 18:2262-2271.
Mistry, T., J. E. Digby, J. Chen, K. M. Desai, and H. S. Randeva. 2006. The regulation of adiponectin receptors in human prostate cancer cell lines. Biochem Biophys Res Commun 348:832-838.
Nakada, C., K. Matsuura, Y. Tsukamoto, M. Tanigawa, T. Yoshimoto, T. Narimatsu, L. T. Nguyen, N. Hijiya, T. Uchida, F. Sato, H. Mimata, M. Seto, and M. Moriyama. 2008. Genome-wide microRNA expression profiling in renal cell carcinoma: significant down-regulation of miR-141 and miR-200c. J Pathol 216:418427.
Nakata K, Ohuchida K, Mizumoto K, Kayashima T, Ikenaga N, Sakai H, Lin C, Fujita H, Otsuka T, Aishima S, Nagai E, Oda Y, Tanaka M. 2011. MicroRNA-10b is overexpressed in pancreatic cancer, promotes its invasiveness, and correlates with a poor prognosis. Surgery;150(5):916-22.
Neal, C. S., M. Z. Michael, L. H. Rawlings, M. B. Van der Hoek, and J. M. Gleadle. 2010a. The VHL-dependent regulation of microRNAs in renal cancer. BMC Med 8:64.
Noguchi S, Mori T, Hoshino Y, Maruo K, Yamada N, Kitade Y, Naoe T, Akao Y. 2011. MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human bladder cancer T24 cells. Cancer Lett. ;307(2):211-20 92
Pachucki, J., M. Ambroziak, Z. Tanski, J. Luczak, J. Nauman, and A. Nauman. 2001. Type I 5'-iodothyronine deiodinase activity and mRNA are remarkably reduced in renal clear cell carcinoma. J Endocrinol Invest 24:253-261.
Peng X, Guo W, Liu T, Wang X, Tu X, Xiong D, Chen S, Lai Y, Du H, Chen G, Liu G, Tang Y, Huang S, Zou X. 2011. Identification of miRs-143 and -145 that is associated with bone metastasis of prostate cancer and involved in the regulation of EMT. PLoS One. 6(5):e20341
Park, S. B., K. S. Cho, J. H. Lee, Y. K. Jeong, S. H. Choi, B. S. Kang, and J. K. Kim. 2008. Unusual manifestations of renal cell carcinoma. Acta Radiol 49:839-847. Pinthus, J. H., N. Kleinmann, B. Tisdale, S. Chatterjee, J. P. Lu, A. Gillis, T. Hamlet, G. Singh, F. Farrokhyar, and A. Kapoor. 2008. Lower plasma adiponectin levels are associated with larger tumor size and metastasis in clear-cell carcinoma of the kidney. Eur Urol 54:866-873.
Poltorak, Z., T. Cohen, R. Sivan, Y. Kandelis, G. Spira, I. Vlodavsky, E. Keshet, and G. Neufeld. 1997a. VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 272:7151-7158.
Prasad, S. R. ;Humphrey, P. A. ;Catena, J. R. ;Narra, V. R. ;Srigley, J. R. ;Cortez, A. D. ;Dalrymple, N. C. ;Chintapalli, K. N. 2006. Common and uncommon histologic subtypes of renal cell carcinoma: imaging spectrum with pathologic correlation. J Indian Med Assoc 107: 10, 725-727
Qi, L., X. Li, S. Zhang, and D. An. 2006. Genetic regulation by non-coding RNAs. Sci China C Life Sci 49:201-217.
Richie JP, Jonasch E, Kantoff PW: Renal Cell Carcinoma. In Holland-Frei Cancer Medicine 7th edition. Edited by: Kufe WD, Bast RC, Hait WN, et al. Hamilton (Canada), BC Decker; 2006:1401-1410.
93
Redova M, Poprach A, Nekvindova J, Iliev R, Radova L, Lakomy R, Svoboda M, Vyzula R, Slaby O. 2012. Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma. J Transl Med. 22;10:55.
Saal, S., and S. J. Harvey. 2009. MicroRNAs and the kidney: coming of age. Curr Opin Nephrol Hypertens 18:317-323.
Sansal, I., and W. R. Sellers. 2004. The biology and clinical relevance of the PTEN tumor suppressor pathway. J Clin Oncol 22:2954-2963.
Seliger, B., S. Jasinski, S. P. Dressler, F. M. Marincola, C. V. Recktenwald, E. Wang, and R. Lichtenfels. 2011. Linkage of microRNA and proteome-based profiling data sets: a perspective for the priorization of candidate biomarkers in renal cell carcinoma? J Proteome Res 10:191-199.
Semenza, G. L. 2003. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 3:721-732.
Semenza, G. L. 2010. Oxygen homeostasis. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 2:336361.
Singh R, Saini N. 2012. Downregulation of BCL2 by miRNAs augments drug-induced apoptosis - a combined computational and experimental approach. J Cell Sci.;125(Pt 6):1568-78
Slaby, O., J. Jancovicova, R. Lakomy, M. Svoboda, A. Poprach, P. Fabian, L. Kren, J. Michalek, and R. Vyzula. 2010. Expression of miRNA-106b in conventional renal cell carcinoma is a potential marker for prediction of early metastasis after nephrectomy. J Exp Clin Cancer Res 29:90.
Song, T., X. Zhang, C. Wang, Y. Wu, J. Dong, J. Gao, W. Cai, and B. Hong. 2011. Expression of miR-143 reduces growth and migration of human bladder carcinoma cells by targeting cyclooxygenase-2. Asian Pac J Cancer Prev 12:929-933.
Su, R. W., W. Lei, J. L. Liu, Z. R. Zhang, B. Jia, X. H. Feng, G. Ren, S. J. Hu, and 94
Z. M. Yang. 2010. The integrative analysis of microRNA and mRNA expression in mouse uterus under delayed implantation and activation. PLoS One 5:e15513. Szczyrba, J., E. Löprich, S. Wach, V. Jung, G. Unteregger, S. Barth, R. Grobholz, W. Wieland, R. Stöhr, A. Hartmann, B. Wullich, and F. Grässer. 2010. The microRNA profile of prostate carcinoma obtained by deep sequencing. Mol Cancer Res 8:529-538.
Tanimoto, K., Y. Makino, T. Pereira, and L. Poellinger. 2000. Mechanism of regulation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. EMBO J 19:4298-4309.
Tian Y, Nan Y, Han L, Zhang A, Wang G, Jia Z, Hao J, Pu P, Zhong Y, Kang C. 2012. MicroRNA miR-451 downregulates the PI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma. Int J Oncol.;40(4):1105-12.
Timmons, L., H. Tabara, C. C. Mello, and A. Z. Fire. 2003. Inducible systemic RNA silencing in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell 14:2972-2983.
Tomasini, R., M. Seux, J. Nowak, C. Bontemps, A. Carrier, J. C. Dagorn, M. J. Pébusque, J. L. Iovanna, and N. J. Dusetti. 2005. TP53INP1 is a novel p73 target gene that induces cell cycle arrest and cell death by modulating p73 transcriptional activity. Oncogene 24:8093-8104.
Tomlinson, I. P., N. A. Alam, A. J. Rowan, E. Barclay, E. E. Jaeger, D. Kelsell, I. Leigh, P. Gorman, H. Lamlum, S. Rahman, R. R. Roylance, S. Olpin, S. Bevan, K. Barker, N. Hearle, R. S. Houlston, M. Kiuru, R. Lehtonen, A. Karhu, S. Vilkki, P. Laiho, C. Eklund, O. Vierimaa, K. Aittomäki, M. Hietala, P. Sistonen, A. Paetau, R. Salovaara, R. Herva, V. Launonen, L. A. Aaltonen, and M. L. Consortium. 2002. Germline mutations in FH predispose to dominantly inherited uterine fibroids, skin leiomyomata and papillary renal cell cancer. Nat Genet 30:406-410.
Toyama T, Kondo N, Endo Y, Sugiura H, Yoshimoto N, Iwasa M, Takahashi S, Fujii Y, Yamashita H. 2012. High expression of microRNA-210 is an independent 95
factor indicating a poor prognosis in Japanese triple-negative breast cancer patients. Jpn J Clin Oncol. 42(4):256-63.
Ueno, K., H. Hirata, V. Shahryari, Y. Chen, M. S. Zaman, K. Singh, Z. L. Tabatabai, Y. Hinoda, and R. Dahiya. 2011. Tumour suppressor microRNA-584 directly targets oncogene Rock-1 and decreases invasion ability in human clear cell renal cell carcinoma. Br J Cancer 104:308-315.
Valera, V. A., B. A. Walter, W. M. Linehan, and M. J. Merino. 2011. Regulatory Effects of microRNA-92 (miR-92) on VHL Gene Expression and the Hypoxic Activation of miR-210 in Clear Cell Renal Cell Carcinoma. J Cancer 2:515-526.
Vasudevan, S., Y. Tong, and J. A. Steitz. 2007. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science 318:1931-1934.
Vaupel, P., and A. Mayer. 2007. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome. Cancer Metastasis Rev 26:225-239.
Verine, J., A. Pluvinage, G. Bousquet, J. Lehmann-Che, C. de Bazelaire, N. Soufir, and P. Mongiat-Artus. 2010a. Hereditary renal cancer syndromes: an update of a systematic review. Eur Urol 58:701-710.
Wang, H., G. Tan, L. Dong, L. Cheng, K. Li, Z. Wang, and H. Luo. 2012. Circulating MiR-125b as a Marker Predicting Chemoresistance in Breast Cancer. PLoS One 7:e34210.
Wei, M. H., N. C. Popescu, M. I. Lerman, M. J. Merrill, and D. B. Zimonjic. 1996. Localization of the human vascular endothelial growth factor gene, VEGF, at chromosome 6p12. Hum Genet 97:794-797.
Woodward, E. R., C. Ricketts, P. Killick, S. Gad, M. R. Morris, F. Kavalier, S. V. Hodgson, S. Giraud, B. Bressac-de Paillerets, C. Chapman, B. Escudier, F. Latif, S. Richard, and E. R. Maher. 2008. Familial non-VHL clear cell (conventional) renal cell carcinoma: clinical features, segregation analysis, and mutation analysis of FLCN. 96
Clin Cancer Res 14:5925-5930.
Wulfken, L. M., R. Moritz, C. Ohlmann, S. Holdenrieder, V. Jung, F. Becker, E. Herrmann, G. Walgenbach-Brünagel, A. von Ruecker, S. C. Müller, and J. Ellinger. 2011. MicroRNAs in renal cell carcinoma: diagnostic implications of serum miR-1233 levels. PLoS One 6:e25787.
Xie, J., S. L. Ameres, R. Friedline, J. H. Hung, Y. Zhang, Q. Xie, L. Zhong, Q. Su, R. He, M. Li, H. Li, X. Mu, H. Zhang, J. A. Broderick, J. K. Kim, Z. Weng, T. R. Flotte, P. D. Zamore, and G. Gao. 2012. Long-term, efficient inhibition of microRNA function in mice using rAAV vectors. Nat Methods 9:403-409.
Ye, X., N. Huang, Y. Liu, Z. Paroo, C. Huerta, P. Li, S. Chen, Q. Liu, and H. Zhang. 2011. Structure of C3PO and mechanism of human RISC activation. Nat Struct Mol Biol 18:650-657.
Yi Z, Fu Y, Zhao S, Zhang X, Ma C. 2010. Differential expression of miRNA patterns in renal cell carcinoma and nontumorous tissues. J Cancer Res Clin Oncol. 2010 Jun;136(6):855-62.
Ying Q, Liang L, Guo W, Zha R, Tian Q, Huang S, Yao J, Ding J, Bao M, Ge C, Yao M, Li J, He X. 2011. Hypoxia-inducible microRNA-210 augments the metastatic potential of tumor cells by targeting vacuole membrane protein 1 in hepatocellular carcinoma. Hepatology.;54(6):2064-75.
Zaman, M. S., V. Shahryari, G. Deng, S. Thamminana, S. Saini, S. Majid, I. Chang, H. Hirata, K. Ueno, S. Yamamura, K. Singh, Y. Tanaka, Z. L. Tabatabai, and R. Dahiya. 2012b. Up-regulation of microRNA-21 correlates with lower kidney cancer survival. PLoS One 7:e31060.
Zeng, Y., and B. R. Cullen. 2003. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA 9:112-123.
Zhai, Q., L. Zhou, C. Zhao, J. Wan, Z. Yu, X. Guo, J. Qin, J. Chen, and R. Lu. 97
2012. Identification of miR-508-3p and miR-509-3p that are associated with cell invasion and migration and involved in the apoptosis of renal cell carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 419:621-626.
Zhang, A., Y. Liu, Y. Shen, Y. Xu, and X. Li. 2011. miR-21 modulates cell apoptosis by targeting multiple genes in renal cell carcinoma. Urology 78:474.e413-479.
Zhang B, Liu XX, He JR, Zhou CX, Guo M, He M, Li MF, Chen GQ, Zhao Q. 2011. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer. Carcinogenesis. ;32(1):2-9.
Zhang, L., D. Hou, X. Chen, D. Li, L. Zhu, Y. Zhang, J. Li, Z. Bian, X. Liang, X. Cai, Y. Yin, C. Wang, T. Zhang, D. Zhu, D. Zhang, J. Xu, Q. Chen, Y. Ba, J. Liu, Q. Wang, J. Chen, J. Wang, M. Wang, Q. Zhang, J. Zhang, K. Zen, and C. Y. Zhang. 2012. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Res 22:107-126.
Zhang, Z., H. Sun, H. Dai, R. M. Walsh, M. Imakura, J. Schelter, J. Burchard, X. Dai, A. N. Chang, R. L. Diaz, J. R. Marszalek, S. R. Bartz, M. Carleton, M. A. Cleary, P. S. Linsley, and C. Grandori. 2009. MicroRNA miR-210 modulates cellular response to hypoxia through the MYC antagonist MNT. Cell Cycle 8:2756-2768.
Zhu, H., Z. Wang, Q. Xu, Y. Zhang, Y. Zhai, J. Bai, M. Liu, Z. Hui, and N. Xu. 2012. Inhibition of STAT1 sensitizes renal cell carcinoma cells to radiotherapy and chemotherapy. Cancer Biol Ther 13. Q. Wang, J. Chen, J. Wang, M. Wang, Q. Zhang, J. Zhang, K. Zen, and C. Y. Zhang. 2012. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Res 22:107-126.
Zhang, Z., H. Sun, H. Dai, R. M. Walsh, M. Imakura, J. Schelter, J. Burchard, X. Dai, A. N. Chang, R. L. Diaz, J. R. Marszalek, S. R. Bartz, M. Carleton, M. A. Cleary, P. S. Linsley, and C. Grandori. 2009. MicroRNA miR-210 modulates cellular response to hypoxia through the MYC antagonist MNT. Cell Cycle 8:2756-2768. 98
Zhu, H., Z. Wang, Q. Xu, Y. Zhang, Y. Zhai, J. Bai, M. Liu, Z. Hui, and N. Xu. 2012. Inhibition of STAT1 sensitizes renal cell carcinoma cells to radiotherapy and chemotherapy. Cancer Biol Ther 13.
99
PŘÍLOHY Tabulka koncentrací a čistot izolované RNA číslo vzorku 1955/04 6 5759/08 4 5263/05 6449/05 2875/06 5148/06 5174/06 4801/07 2941/08 2902/06 5578/07 6242/07 2599/07 6112/04 5108/05 5647/05 5905/05 282/06 3234/06 4580/08 26/09 1796/08 3165/04 1392/06 3582/05 6133/05 2329/06 2117/08 1293/08 3106/06 7305/07 2901/04 1031/07 2811/05 4505/07 1847/04 4321/06 4701/08 2812/07 1566/06
koncentrace 260/280 RNA [ng/ml ] 240,29 113,02 186,82 27,31 302,34 333,14 87,40 428,49 250,74 88,63 228,70 72,60 166,43 203,97 151,12 139,58 769,89 264,07 297,99 154,37 246,05 159,76 151,74 174,52 507,06 176,14 174,89 134,90 829,33 150,31 266,82 175,49 219,50 104,84 126,18 162,73 222,27 105,12 249,48 1167,02
2 1,88 1,96 1,79 1,65 1,92 1,89 1,92 1,96 1,99 2,03 1,92 1,96 1,94 1,96 1,95 2 2,01 1,93 1,9 2,01 2,03 2,01 1,92 1,93 1,94 2,08 1,89 1,95 1,92 2,03 2 1,99 1,98 1,89 2 1,94 1,85 1,97 1,99
číslo vzorku 08/40 08/410 08s/283 06s/311 05s/583 06s/195 08s/365 06/130 06/135 06/161 06/218 06/203 06/208 06/249 06/269 06/36 06/39 06/419 06/451 06/519 06/536 06/596 06/604 06/75 06/80 07/114 07/146 07/15 07/219 07/241 07/246 07/274 07/297 07/315 07/393 07/488 07/499 07/500 07/550 08/161
100
koncentrace 260/280 RNA [ng/ml ] 17,48 17,10 16,04 19,69 21,31 20,07 9,47 13,54 15,59 13,00 17,73 14,22 17,26 14,32 14,24 13,73 13,79 11,64 14,13 15,10 16,89 15,37 13,61 15,46 14,77 17,15 17,79 15,42 9,88 16,83 15,02 23,42 14,40 14,93 11,08 18,35 19,15 34,72 16,83 19,35
1,58 1,19 1,76 1,61 1,64 1,77 1,6 2,23 1,92 2,23 1,9 2,01 2,16 1,89 2,1 1,81 1,83 1,76 1,78 2,13 1,8 1,87 1,67 2,03 1,81 1,97 1,68 2,06 2 1,81 1,82 1,72 1,83 1,87 1,29 1,86 1,69 1,66 1,76 1,81
5183/07 05s/714 1460/05 2076/04 5988/04 6146/04 1295/05 05s/537 06s/32 06s/370 08s/417 08s/249 07s/360 07s/437 06s/460 05s/692 06/127 06/225 06/308 06/439 06/455 06/459 06/589 06/80 07/178 07/219 07/357 07/382 07/487 07/559 07/583 07/89 08/124 08/139 08/17 08/216 08/226 08/289 08/315 08/32 08/323 08/351 08/363 08/393
161,66 19,91 289,80 135,16 49,22 253,23 293,48 15,98 18,08 18,20 24,09 17,85 11,01 11,39 15,91 20,16 16,48 18,06 12,77 12,32 11,56 16,89 15,18 14,77 16,81 12,21 17,89 16,12 20,98 16,01 21,08 13,38 18,39 16,22 21,88 12,30 14,19 16,84 16,59 14,14 18,81 29,82 16,85 18,71
2 1,68 2,03 1,96 1,86 2,04 1,98 1,84 1,85 1,52 2,01 1,45 1,43 1,41 1,57 1,87 1,79 1,91 2,57 2,43 2,13 1,95 1,75 1,81 1,7 1,79 1,86 1,78 1,87 2,05 1,6 2,04 1,91 1,73 1,75 2,03 1,92 1,1 1,77 1,72 1,43 0,9 1,56 1,32
08/184 08/209 08/359 08/363 08/412 08/418 08/515 08/546 08/90 05/738 06/127 09/42 08/476 08/517 08/526 08/74 09/34 S-BM S-PP S-KJ S-CHO S-JF S-MP S-CJ S-AP S-ŠF S-DK S-PA S-VJ 37 35 10 37 37 10 37 24 10 37 36 10 37 39 10 37 29 10 37 33 10 37 34 10 37 25 10 37 26 10 37 27 10 37 30 10 37 38 10 37 40 10 37 41 10
101
16,58 21,48 36,81 16,85 18,14 30,31 20,28 24,89 16,62 15,40 16,48 17,53 14,55 26,71 19,79 30,34 26,59 21,28 27,80 21,04 20,39 6,94 30,56 18,95 23,16 22,51 20,83 20,92 17,78 10,61 15,97 18,78 22,28 22,04 15,68 24,04 22,25 19,82 18,62 22,85 21,12 21,50 21,10 20,74
1,64 1,67 1,58 1,56 1,34 0,85 1,45 1,13 1,95 2,23 1,79 1,53 1,76 1,26 1,22 1,6 1,25 1,53 1,3 1,58 1,65 1,44 1,57 1,5 0,87 1,39 1,33 1,55 1,49 1,28 1,53 1,45 1,63 1,53 1,29 1,49 1,62 1,63 1,28 1,72 1,68 1,44 1,56 1,41
