1
ISOLASI DA IDETIFIKASI GEETIK MOOKARIO JAMUR TIRAM (Pleurotus sp.)
FEMI APRILIA ZAELAI
DEPARTEME BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DA ILMU PEGETAHUA ALAM ISTITUT PERTAIA BOGOR BOGOR 2010
2
ABSTRAK FEMI APRILIA ZAELANI. Isolasi dan Identifikasi Genetik Monokarion Jamur Tiram (Pleurotus sp.) Dibimbing oleh MUHAMMAD JUSUF dan SRI LISTIYOWATI. Salah satu cara memperoleh isolat unggul dalam program pemuliaan adalah membuat persilangan untuk meningkatkan variasi genetik turunannya. Langkah awal persilangan adalah koleksi monokarion. Monokarion adalah hifa primer haploid yang berasal dari basidiospora tunggal. Penelitian ini bertujuan menyediakan monokarion jamur tiram (Pluerotus sp.) yang telah teridentifikasi tipe kawinnya, dan mengkarakterisasi genotipe monokarion yang diperoleh dengan teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Penelitian ini menggunakan basidiokarp dari satu galur Pleurotus sp.. Metode penelitian terdiri atas: isolasi monokarion, menentukan tipe kawin monokarion, uji segregasi, dan analisis keragaman genotipe melalui AFLP. Monokarion yang berhasil diisolasi berjumlah 30 yang terbagi ke dalam empat tipe kawin, yaitu P1O1, P2O2, P1O2, dan P2O1. Kedua gen penentu tipe kawin mengikuti kaidah segregasi dan berpadu bebas pada pembentukan basidiospora. Hasil analisis gerombol dari data AFLP mengelompokkan monokarion menjadi dua kelompok utama yang dapat digunakan sebagai dasar pemilihan parental yang memiliki perbedaan genetik yang tinggi. Kata kunci : Pleurotus, monokarion, tipe kawin, AFLP .
ABSTRACT FEMI APRILIA ZAELANI. Isolation and Genetic Identification Monokaryon of Oyster Mushroom (Pleurotus sp.). Supervised by MUHAMAD JUSUF and SRI LISTIYOWATI One way to obtain high quality isolates in breeding programe is hybridization to increase genetic variation of offspring. The first step for hybridization was monokaryons collection. Monokaryon is haploid primer hyphae resulted of single basidiospore germinated. The research aim to provide Pleurotus sp. monokarions which their mating type has been identified, also conduct monokaryon genotype characteritation through Amplified Fragment Length Polymorphism technique (AFLP). This research used basidocarp of one strain of Pleurotus sp. Methods in this research were consisted of: monokaryon isolation, mating type test, segregation test, and genotype variation analysis which consist of DNA isolation, and AFLP. This research successfully got 30 monokaryons which were distributed into four mating types, those are P1O1, P2O2, P1O2, dan P2O1. Two mating type genes present segregation and random assortment theory. Result of AFLP data clustering analysis showed monokaryons had two main group which could be used as considering to choose parentals with far genetic difference. Keyword: Pleurotus, monokaryon, mating type, AFLP.
3
ISOLASI DA IDETIFIKASI GEETIK MOOKARIO JAMUR TIRAM (Pleurotus sp.)
FEMI APRILIA ZAELAI G34052762
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEME BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DA ILMU PEGETAHUA ALAM ISTITUT PERTAIA BOGOR BOGOR 2010
4
Judul Skripsi Nama NIM
: Isolasi dan Identifikasi Genetik Monokarion Jamur Tiram (Pleurotus sp.) : Femi Aprilia Zaelani : G34052762
Menyetujui :
Pembimbing I,
Dr. Ir. Muhammad Jusuf NIP : 19500710 197603 1 003
Pembimbing II,
Dra. Sri Listiyowati, M.Si NIP : 19640714 199002 2 001
Mengetahui : Ketua Departemen,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si NIP: 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA Puji dan syukur tidak henti-hentinya penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul skripsi ini adalah Isolasi dan Identifikasi Genetik Monokarion Jamur Tiram (Pleurotus sp.). Penelitian dilakukan mulai bulan Januari sampai dengan bulan Desember 2009 di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Muhamad Jusuf dan Ibu Dra. Sri Listiyowati M.Si selaku pembimbing skripsi yang telah memberikan bimbingan, perhatian dan kepercayaan kepada saya untuk melakukan penelitian ini. Penulis juga ucapkan terima kepada Mbak Pepi, Bapak Yanto, Ibu Ratna, Bapak Muzuni, Bapak Ulung, Kak Zahroh, Kak Rizki, Luria Marlina Limbong, Goto Giok, Puspiari dan Sri Maria Ulfha atas bantuannya selama penelitian. Tidak lupa saya ucapkan terima kasih kepada teman-teman di Departemen Biologi khususnya Vina Vidiawati, Adi Sasono, Darojatul Ulya, Marwiyati, Ikka Erniasari, Ika Rezza atas persahabatan dan warna yang telah kalian berikan ke dalam hidup saya. Last but not least, saya ucapkan terima kasih kepada keluarga besarku, khususnya Mamah, Bapak, kedua adikku Danil dan Esa, bi Eneng dan sepupuku Herma Amalia, bersyukur bisa berada di tengah-tengah kalian. Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2010
Femi Aprilia Zaelani
6
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 24 April 1987 dari ayah Muhammad Asep Zaelani S.Pd dan ibu Nuryati. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 3 Sukabumi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih mayor Biologi di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2008/2009 – 2009/2010, Biologi Cendawan pada tahun ajaran 2008/2009, Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 2008/2009, dan Genetika Dasar pada tahun ajaran 2009/2010. Selain itu penulis aktif sebagai anggota OWA (Observasi Wahana Alam) yang merupakan himpunan organisasi pecinta alam Departemen Biologi. Selama mengikuti perkuliahan, penulis melakukan studi lapangan pada tahun 2007 dengan judul Elliptical Fourier Analysis Apertura pada Gastropoda Bercangkang di Wana Wisata Cangkuang, Sukabumi, Jawa Barat. Penulis juga melakukan praktik lapangan pada tahun 2008 dengan judul Pemeriksaan Ultrastruktur Menggunakan Transmission Electron Microscope (TEM) dan Pewarnaan Imunohistokimia di Laboratorium TEM dan Histologi Lembaga Biologi Molekul Eijkman, Jakarta.
7
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL
................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN
............................................................................................................. viii ........................................................................................................ viii
PENDAHULUAN ................................................................................................................ Latar Belakang .............................................................................................................. Tujuan ............................................................................................................................ Waktu dan Tempat ..........................................................................................................
1 1 2 2
BAHAN DAN METODE ......................................................................................................... Bahan ................................................................................................................................ Metode .............................................................................................................................. Isolasi monokarion ..................................................................................................... Penentuan Tipe Kawin ............................................................................................... Uji Segregasi .............................................................................................................. Analisis Keragaman Genotipe .................................................................................... Isolasi DNA ......................................................................................................... Kultur Isolat ................................................................................................... Isolasi DNA ................................................................................................... Pengukuran Kualitas dan Kuantitas DNA ...................................................... Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) ........................................... Restriksi DNA Genomik dan Ligase Adaptor (R/L)……………………… .. Preamplifikasi…………………………………………………………….. ... Amplifikasi Selektif………………………………………………………. ... Visualisasi Fragmen Hasil Amplifikasi.......................................................... Analisis DATA ....................................................................................................
2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4
HASIL ....................................................................................................................................... Isolasi Monokarion ............................................................................................................ Penentuan Tipe Kawin ....................................................................................................... Uji Segregasi ...................................................................................................................... Keragaman Genetik Berdasarkan AFLP ............................................................................
5 5 5 6 6
PEMBAHASAN ........................................................................................................................ Isolasi Monokarion ............................................................................................................ Penentuan Tipe Kawin ....................................................................................................... Keragaman Genetik Berdasarkan AFLP ............................................................................
9 9 9 9
SIMPULAN ............................................................................................................................. 10 SARAN ................................................................................................................................... 10 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................. 10 LAMPIRAN ............................................................................................................................. 12
8
DAFTAR TABEL Halaman 1 Empat monokarion dengan empat tipe kawin berbeda yang teridentifikasi di awal penelitian … ......................................................................................................................... 2
5
Uji tipe kawin monokarion dengan empat isolat monokarion penguji tipe kawin: BBR3 BBR11, BBR13, dan BBR14……………………………………………………………….
5
3 Uji Khi kuadrat………………………………………………………………………………
6
4 Jumlah lokus positif untuk berbagai kombinasi Primer Mse I dan Pst I……………………
8
5 Rata-rata dan ragam lokus positif monokarion dan dikarion pada kombinasi primer P11-700-M51, P11-700-M53, P11-700-M55……………………………………………….
8
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 Kotak-kotak berukuran 0.75 x 0.75 cm pada dasar cawan Ø 5 cm berisi medium water agar 4%……………………………………………………………………………….
2
2 Basidiospora tunggal yang berkecambah, kultur dikarion 20 hari, kultur monokarion 20 hari………………………………………………………………………………………… 5 3 Sambungan apit (SA), zona kosong seperti garis pembatas pada pertemuan dua monokarion tidak serasi, zona kosong tidak terbentuk pada pertemuan dua monokarion serasi ………………………………………………………………………………………..
6
4 Visualisasi AFLP dengan 3 jenis kombinasi primer pada 8 isolat monokarion, dan 6 isolat dikarion hasil hibridisasi, serta 1 isolat dikarion basidiokarp……………………….. 5
7
Pengelompokan monokarion berdasarkan analisis gerombol menggunakan MINITAB 14 pada gabungan kombinasi primer P11-700-M51, P11-700-M53, dan P11-700-M55………
8
DAFTAR LAMPIRA Halaman 1. Luaran scoring data AFLP dengan primer P11-700-M51 menggunakan piranti lunak SAGA ................................................................................................................................ 13 2. Luaran scoring data AFLP dengan primer P11-700-M53 menggunakan piranti lunak SAGA .................. ………………………………………………………………………………………………………… 15 3. Luaran scoring data AFLP dengan primer P11-700- M55 menggunakan piranti lunak SAGA ................................................................................................................................ 17
1
PEDAHULUA Latar Belakang Pleurotus sp. adalah organisme heterotrof yang memanfaatkan bahan organik di sekitarnya sebagai bahan nutrisi, yaitu dengan cara mengekskresikan enzim ekstraselular untuk mengubah senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana. Menurut Landecker (1996), klasifikasi Pleurotus sp. termasuk ke dalam dunia Fungi, filum Basdiomycota, kelas Basidiomycetes, ordo Agaricales, famili Tricholomataceae, dan genus Pleurotus. Pleurotus sp. telah dibudidayakan secara industri pada berbagai substrat yang merupakan limbah organik (seperti jerami, limbah kapas, serbuk gergaji), serta menempati posisi kedua di dunia untuk jamur yang paling banyak dibudidayakan setelah Agaricus bisporus (Royse 1996). Selain peran penting sebagai jamur pangan, Pleurotus sp. juga mempunyai aplikasi lain seperti bahan kosmetik (Nawamura et al. 2009) dan farmasi (Vasudewa et al. 2007). Produksi yang baik pada budidaya jamur dapat dicapai apabila keadaan medium (kepadatan dan kandungan air) dan kandungan nutrisi yang terdapat di dalamnya sesuai untuk pertumbuhan dan perkembangan jamur. Selain itu jenis isolat dan faktor lingkungan seperti suhu, pH, kelembapan, cahaya, aerasi juga turut berperan. Produksi jamur tiram yang masih rendah erat kaitannya dengan kesesuaian faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan jamur tiram dalam usaha budidaya. Di Indonesia sampai saat ini belum diperoleh informasi keberadaan program pemuliaan jamur tiram untuk memperoleh bibit unggul melalui persilangan. Oleh karena itu sangat penting dimulai usaha pemuliaan, yang diawali dengan koleksi monokarion. Fase hidup Pleurotus sp. terdiri dari fase monokarion (haploid) dikarion (di-haploid), dan diploid (Eugenio dan Anderson 1968). Dua hifa monokarion yang serasi mampu berfusi dan menghasilkan dikarion. Dikarion adalah miselium dengan tiap selnya mempunyai dua nukleus yang tetap independen (bebas) selama perkembangan vegetatif, dan akan menjadi tubuh buah apabila berada pada kondisi lingkungan yang sesuai. Karyogami terjadi pada sel basidia yang menghasilkan sel diploid, kemudian diikuti pembelahan meiosis menghasilkan empat basidiospora uninukleat. Rekombinasi genetik dapat terjadi ketika meosis
berlangsung. Basidiospora dapat berkecambah ketika menemukan kondisi lingkungan yang sesuai untuk membentuk hifa monokarion. Dikarion Pleurotus sp. memiliki sambungan apit, sedangkan monokarionnya tidak memiliki struktur tersebut. Sambungan apit adalah struktur khusus yang memungkinkan dua nukleus terdistribusi pada sel-sel hasil pembelahan mitosis ketika fase pertumbuhan dan perberkembangan (Larraya et al. 2001). Pleurotus sp. merupakan cendawan heterotalus bifaktor. Heterotalus artinya monokarion hanya dapat kawin dengan monokarion lain yang berasal dari basidiospora yang berbeda, sedangkan bifaktor artinya keserasian antara dua monokarion berbeda dikendalikan secara genetik oleh dua faktor. Kedua faktor tersebut sering disebut lokus A dan lokus B. Setiap lokus memiliki banyak jenis alel atau multialel. Jenis alel dapat disimbolkan dengan angka yang ditempatkan setelah simbol huruf untuk lokus, seperti A1B1 dan A2B2. Lokus A dan B, serta jenis alel yang menyertainya disebut dengan tipe kawin. Keserasian atau perkawinan antara dua monokarion berbeda dapat terjadi apabila tipe kawin di antara keduanya berbeda, yaitu alel-alel pada kedua lokus diantara kedua monokarion harus berbeda. Menurut Larraya et al. (2000) kontrol sistem kawin bifaktor seperti ini menyulitkan pemuliaan yang berorientasi melalui persilangan. Walaupun demikian, persilangan saat ini masih merupakan cara yang tepat untuk memperoleh bibit unggul karena praktis dan terjangkau dari segi ekonomi. Persilangan juga mampu meningkatkan variasi genetik yang berperan dalam mempertahankan kelangsungan hidup spesies, karena variasi genetik mampu meningkatkan kemampuan adaptasi yang lebih tinggi terhadap perubahan lingkungan (Landacker 1996). Pengetahuan tentang variasi genetik sangat penting bagi program pemuliaan karena memberikan dasar untuk pengembangan selanjutnya. Variasi genetik dapat digunakan sebagai bahan seleksi genotipe yang dikehendaki. Keragaman genetik yang dihasilkan dari data sidik DNA (DNA Fingerprinting) dapat digunakan dalam pengelompokan, sehingga informasi yang diperoleh dapat digunakan untuk mengidentifikasi tetua yang paling sesuai untuk disilangkan. Amplified Fragment Lenght Polimorphism (AFLP) merupakan penanda molekular
2
(molecular marker) yang dapat digunakan untuk mendeteksi keragaman genetik pada tingkat DNA. Penanda molekular menurut Stansfield (1986) digunakan untuk "penanda lokus''. AFLP mampu mendeteksi polimorfisme dalam jumlah besar (Mueller &Wolfenbarg 1999), sehingga AFLP menjadi penanda yang paling efisien untuk mengidentifikasi genotipe individu. Teknologi AFLP telah digunakan dalam studi keragaman intraspesies jarak pagar (Pancadewi 2008), studi struktur genetik populasi cendawan Magnaporthe grisea (Tredway et al. 2005) dan keragaman genetik Pleurotus spp. (Jusuf 2010).
Tujuan Penelitian ini bertujuan menyediakan monokarion jamur tiram (Pluerotus sp.) yang telah teridentifikasi tipe kawinnya, serta mengkarakterisasi genotipe monokarion yang diperoleh dengan teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
antibiotik) dengan volume berisi ± 5 ml water agar. Cawan petri yang digunakan berdiameter 5 cm. Bagian dasar luar cawan telah digambar kotak-kotak berukuran ± (0.75 x 0.75) cm (Gambar 1). Medium agar-agar yang telah berisi basidiospora diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam. Pemeriksaan menggunakan mikroskop dengan perbesaran (4x10) – (10x10) dimulai setelah inkubasi 24 jam. Setiap kotak yang mengandung basidiospora tunggal yang berkecambah ditandai di bagian dasar cawan untuk dipindahkan ke cawan berisi medium Agar Sukrosa Kentang (ASK) yang mengandung antibiotik [komposisi per liter medium: 20 g agar-agar, air rebusan 200 g kentang, 20 g gula putih, dan] dan diinkubasi hingga tumbuh menjadi miselium.
Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2009 hingga Desember 2009 di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati & Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor (PPSHB IPB).
BAHA DA METODE BAHA Tubuh buah jamur tiram ditumbuhkan di Laboratorium PPSHB IPB. Isolat jamur tiram tersebut berasal dari petani di Madiun dan diberi kode isolat BBR. METODE Isolasi Monokarion. Isolasi basidiospora yang digunakan merupakan kombinasi dari dua metode isolasi yang dilakukan oleh Wang dan Wen (1996) dan Choi et al. (1999). Stipe dipotong sedekat mungkin dengan pileus. Kemudian pileus diletakkan pada cawan petri steril dengan lamella menghadap ke bagian dasar cawan untuk menghasilkan jejak basidiospora. Selama inkubasi pembentukan jejak basidiospora, cawan berisi pileus disimpan di dalam lemari es untuk mencegah perkecambahan basidiospora. Isolasi basidiospora dilakukan dengan teknik pengenceran basidiospora hingga diperoleh kerapatan 5-8 basidiospora/µl. Suspensi basidiospora sebanyak 1µl diteteskan diatas permukaan medium water agar 4% (4 g agar Bacto dalam 100 ml aquades dan 250 mg
Gambar 1 Kotak-kotak berukuran 0.75 x 0.75 cm pada dasar cawan Ø 5 cm berisi medium water agar 4%
Penentuan Tipe Kawin. Tipe kawin monokarion yang dihasilkan dari penelitian ini disimbolkan dengan P dan O, pemberian nama berbeda dengan Larraya et al. (2001) yang berupa A dan B. Hal ini dilakukan karena isolat BBR yang digunakan belum diidentifikasi jenis spesiesnya. Jika ingin mengetahui tipe kawin berdasarkan lokus A dan B, maka disilangkan dengan tester yang sudah ditemukan lebih awal, yaitu tester A1B1, A2B2, A1B2, dan A2B1 oleh Larraya et al. (2001). Penentuan tipe kawin dilakukan dengan memasangkan dua miselium monokarion dengan jarak 1 cm pada satu cawan ASK. Cawan diinkubasi pada suhu ruang hingga zona pertemuan kedua monokarion terbentuk. Zona pertemuan kemudian diperiksa untuk mengetahui keberadaan sambungan apit. Pemeriksaan dilakukan dengan pengambilan sedikit hifa pada zona pertemuan secara aseptik dan diamati menggunakan mikroskop perbesaran (10x40). Jika terdapat sambungan
3
apit pada hasil pemeriksaan, maka kedua monokarion tersebut serasi (compatible), namun jika pada hasil pemeriksaan tidak ditemukan sambungan apit, maka kedua monokarion tersebut tidak serasi. Empat jenis monokarion dengan tipe kawin berbeda yang ditemukan di awal penelitian, diberi kode P1O1, P2O2, P1O2, dan P2O1. Keempat monokarion yang tipe kawinnya telah teridentifikasi di awal penelitian, disilangkan dengan monokarion lain yang tipe kawinnya belum teridentifikasi. Uji Segregasi. Uji segregasi digunakan untuk mengetahui kesesuian pemisahan dan perpaduan bebas alel-alel penentu tipe kawin antara pengamatan dan teori menurut Mendel. Uji segregasi dilakukan dengan menghitung nilai khi kuadrat, kemudian membandingkannya dengan khi-tabel. Berikut rumus untuk menghitung khi kuadrat:
Khi − kuadrat ߯ ଶ = ୀଵ
ሺܱ݅ − ܰ݅ܧሻଶ ܰ݅ܧ
2
χ db ά (db = 3, ά= 0.05) = 7.815 (khi- tabel) χ2 = khi kuadrat hasil perhitungan i = jenis tipe kawin k = jumlah jenis tipe kawin, k=4 Oi = jumlah basidiospora dengan tipe kawin i Ei = frekuensi harapan tipe kawin i N = Jumlah total basidiospora
Analisis Keragaman Genotipe Isolasi DA - Perbanyakan miselium. Medium sukrosa kentang cair steril sebanyak 50 ml pada erlenmeyer (air rebusan 200 g kentang, 20 g gula putih, 500 mg antibiotik kloramfenikol, dan ditambah aquades hingga volume 1000 ml) masing-masing diinokulasi dengan miselium monokarion dan dikarion (satu erlenmeyer untuk 1 jenis isolat), lalu diinkubasi pada mesin penggoyang pada suhu ruang selama 2 minggu. - Isolasi DA. Ektraksi DNA menggunakan metode Sambrook et al. (1989) dengan bufer ekstraksi menurut Raeder dan Broda (1985). Hasil perbanyakan miselium pada medium cair dipanen dan divakum untuk menghilangkan medium cair yang terperangkap di dalam gumpalan miselium. miselium digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair. Serbuk miselium disuspensikan dengan 3 ml buffer ekstrak [Tris-HCl 200 mM pH 8.5, Ethylene Diamine Tetra Acetic (EDTA) 25 mM, NaCl 250 mM, Sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.5%] di dalam tabung berukuran 15 ml. Suspensi diinkubasi selama 30 menit di dalam penangas air bersuhu 65°C, kemudian disimpan di dalam
es selama ± 5 menit. Hasil dimurnikan dengan penambahan larutan kloroform dan isoamil alkohol (CIAA) pada perbandingan 24:1 sebanyak 1x volume ekstrak. Campuran larutan digoyang secara perlahan dengan cara dibolak-balik. Selanjutnya campuran larutan disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Supernatan diambil dan dicampur dengan 1x volume larutan PCI (Fenol: kloroform: isoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1), kemudian dibolak-balik secara perlahan. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Supernatan diambil dan dicampur dengan 0.1x volume NaOAC 2M pH 5.2 dan alkohol absolut sebanyak 2x volume. Larutan tersebut diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4°C. Larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Supernatan dibuang, selanjutnya pada pelet yang diperoleh ditambahkan 1 ml alkohol 70% (v/v), dan disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang, pelet dikeringkan dengan vakum hingga kering. Pelet disuspensikan dengan 50 µl ddH2O, kemudian dipindahkan ke dalam tabung baru berukuran 1.5 ml. Selanjutnya pada suspensi ditambahkan dengan 0.1x volume RNAse (10mg/ml), diinkubasi pada suhu 37°C selama semalam. Larutan DNA yang diperoleh disimpan sebagai stok pada suhu -20°C. - Pengukuran Kualitas dan Kuantitas DA. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Elektroforesis digunakan untuk melihat keutuhan dari DNA genom yang diisolasi.
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP): - Restriksi DA Genom dan Ligase Adaptor (R/L). Volume pereaksi untuk 1x reaksi restriksi dan ligasi adaptor adalah 20 µl, dengan komposisi sebagai berikut: 2.5 µl buffer RL 10x (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, Mgasetat 5 mM, K-asetat 250 mM 0.125 µl enzim restriksi Pst I (20 unit µl), 0.25 µl enzim restriksi MseI I (10 unit/µl), 0.5 µl Pst I adaptor (5 pMol/µl), 0.5 µl Mse I adaptor (50 pMol/µl), 0.5 µl ATP 10 mM, 0.16 µl T4 ligase (3 unit/µl) dan 15.465 µl ddH2O. Untuk memudahkan pembuatan bahan reaksi tersebut, maka setiap bahan diambil untuk 16x reaksi. Volume DNA genom yang akan dipergunakan dalam reaksi restriksi dan ligasi adaptor adalah 5 µl (250-500 ng/µl),
4
sehingga total volume campuran 25 µl. Campuran diinkubasi semalam pada suhu 37°C. Susunan nukleotida adaptor yang digunakan adalah sebagai berikut: Adaptor Pst I: 5’CTCGTAGACTGCGTACA3’ 3’CATCTGACGCATGTACCT5’ Adaptor Mse I 5’GACGATGAGTCCTGAG3’ 3’TACTCAAGGACTCAT5’ - Preamplifikasi. Sebanyak 5 µl hasil R/L dicampur dengan 0.6 µl primer P00 (Pst I) 30 ng/µl [5’GACTGCGTACATGCAG3’], 0.6 µl primer M02 (Mse I) 30 ng/µl [5’GATGAGTCCTGAGTAAC3’], 0.4 µl dNTP 10 mM, 2µl PCR buffer 10x, 0.08 µl super Tag 5 unit/µl dan 11.32 µl ddH2O, sehingga total volume campuran menjadi 20 µl. Semua campuran tersebut di preamplifikasi menggunakan alat PCR PTC100TM JM. PCR dilakukan sebanyak 24 siklus pada 94°C selama 30 detik (denaturasi), 56°C selama 60 detik (penempelan primer), 72°C selama 60 detik (ekstensi). Hasil dari proses ini disebut dilute pre-amp atau template sekunder. Untuk mengetahui hasil proses preamplifikasi dilakukan elektroforesis. Preamplifikasi yang baik akan menghasilkan fragmen DNA smear (apusan). - Amplifikasi Selektif. Amplifikasi selektif menggunakan tiga kombinasi primer berlabel, yaitu: M51 (Mse I) dengan sekuen: 5’GATGAGTCCTGAGTAAACCA3’ M53 (Mse I) dengan sekuen : 5’GATGAGTCCTGAGTAAACCG3’ M55 (Mse I) dengan sekuen : 5’GATGAGTCCTGAGTAAACGA3’ Primer Mse I dikombinasikan dengan primer P11 (Pst I) dengan sekuen: 5’GACTGAGTACATGCAGAA3’ Primer P11 diberi label IRD 700. Produk preamplifikasi diencerkan 10x untuk digunakan sebagai template dalam amplifikasi selektif. Sebanyak 10 µl dilute pre-amp dicampur dengan 0.6 µl primer M51/ M53/ M55 (50 ng/µl), 1µl primer P11 berlabel IRD 700 (1 pmol/µl), 0.4 µl dNTP 10 mM, 2 µl super buffer 10x, 5.92 µl ddH2O, 0.08 µl Tag NA polymerase (5 unit/µl), sehingga volume campuran total 20 µl. Campuran bahan-bahan tersebut diamplifikasi dengan program PCR LI-COR. PCR LI-COR diawali dengan 13 siklus dengan kondisi: siklus kesatu proses denaturasi pada suhu pada 95°C selama 30 detik, proses penempelan primer pada suhu 65°C selama 30 detik, proses ekstensi 72°C
selama 60 detik. Siklus kedua sampai ketiga belas, suhu denaturasi dan ekstensi tetap, namun suhu penempelan primer mengalami penurunan 0.7°C tiap siklus. Proses dilanjutkan dengan 24 siklus pada 94°C selama 30 detik (denaturasi), 56°C selama 30 detik (penempelan primer) dan 72°C selama 60 detik (ekstensi). - Visualisasi Fragmen Hasil Amplifikasi. Elektroforesis hasil amplifikasi selektif, menggunakan LI-COR DNA Analyzer. Gel yang digunakan untuk elektroforesis dibuat dengan mencampur 20 ml KB plus 6.5% gel matrix, 15 µl TEMED dan 150 µl ammonium persulfat (APS) 10% (b/v). Campuran tersebut dimasukkan pada plat kaca dan didiamkan selama kurang lebih 1 jam hingga gel terpolimerasi atau membeku. Plat kaca berisi gel dimasukkan ke wadah elektroforesis, kemudian pada bagian atas ditambah bufer TBE 1x dengan komposisi TBE 10x yaitu Tris-HCl 1M pH 8.3, asam boraks 0.83 M, EDTA 10 mM. Pre-elektroforesis dilakukan selama 20 menit dengan daya 20 Watt untuk menaikan suhu hingga 50°C. Produk amplifikasi selektif 20 µl dicampur dengan loading bufer yang mengandung formamid 2x [formamid 98% (b/v), EDTA 10 mM, bromofenol biru 0.025% (b/v), silen sianol 0.025% (b/v)] dengan volume yang sama yaitu 20 µl, sehingga total campuran menjadi 40 µl. Total campuran divortex dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 94°C pada hotblock denaturasi, lalu didinginkan di dalam es selama kurang lebih 1 jam. Pembuatan marker dilakukan dengan mencampur 1 µl DNA ladder 100 pb, 19 µl H2O, dan 20 µl loading bufer formamid 2x. Sebanyak 1.5 µl marker dan masing-masing campuran sampel dengan loading bufer dimasukkan pada sumur gel. Selanjutnya dilakukan elektroforesis selama kurang lebih tiga jam dengan daya 40 watt dan tegangan 1500 volt. Hasil elektroforesis akan langsung divisualisasikan melalui layar komputer yang dihubungkan dengan mesin LI-COR 4300 D/A Analyzer. - Analisis Data. LI-COR 4300 analyzer akan menghasilkan file gambar hasil elektroforesis gel, fragmen-fragmen kemudian dideteksi dengan piranti lunak SAGA Automated AFLP (Anonymous 2004) dan diberi nilai + (plus) untuk kehadiran fragmen, dan – (minus) untuk ketidak-hadiran fragmen. Dengan menggunakan Microsoft Word nilai + dan – ditransformasi menjadi nilai 1 dan 0. Data ini kemudian diolah dengan prosedur
5
analisis gerombol menggunakan piranti lunak MI/ITAB 14.
HASIL Isolasi Monokarion Basidiospora tunggal (Gambar 3 a, b, c) yang berhasil diperoleh berjumlah sekitar 100 basidiospora. Hanya tiga puluh basidiospora yang berhasil tumbuh menjadi monokarion dan diberi kode BBR1- BBR30, sedangkan tujuh puluh lainnya gagal menjadi monokarion. Kegagalan dapat disebabkan beberapa kasus, yaitu: basidiospora tidak berkembang menjadi miselium (tidak viabel), kultur basidiospora tunggal terkontaminasi, kultur miselium tidak dapat disubkulturkan kembali, dan keadaan miselium berupa dikarion. Berdasaran hasil pengamatan awal menunjukan isolat dikarion (Gambar 2d) tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan isolat monokarion (Gambar 2e). e spora
spora
a
hifa 25 µm
spora
hifa
hifa
b
25 µm
c
25 µm
d e Gambar 2 Basidiospora tunggal yang berkecambah (a, b, c), kultur dikarion 20 hari (d), kultur monokarion 20 hari (e).
Penentuan Tipe Kawin Empat monokarion dengan empat tipe kawin berbeda yang teridentifikasi di awal penelitian adalah isolat BBR4, BBR11, BBR13, dan BBR14. Isolat BBR4 hanya serasi dengan isolat BBR11, sedangkan isolat BBR13 hanya serasi dengan isolat BBR14. Jika BBR4 memiliki genotipe tipe kawin P1O1, maka BBR11 memiliki genotipe tipe kawin P2O2, jika BBR13 memiliki genotipe tipe kawin P1O2, maka BBR14 memiliki tipe kawin P2O1 (Tabel 1). Tipe kawin isolat monokarion BBR lain berhasil diidentifikasi melalui pemasangan dengan keempat isolat monokarion penguji tipe kawin yang telah teridentifikasi di awal penelitian. Setiap isolat
monokarion hanya serasi dengan satu isolat monokarion penguji tipe kawin (Tabel 2). Tabel 1 Empat monokarion dengan empat tipe kawin berbeda yang teridentifikasi di awal penelitian BBR4 BBR11 BBR13 BBR14 (P1O1) (P2O2) (P2O1) (P1O2)
BBR4 (P1O1)
-
+
-
-
BBR11(P2O2)
+
-
-
-
BBR13(P1O2)
-
-
-
+
BBR14 (P2O1)
-
-
+
-
Ket : (+) = membentuk sambungan apit, (-) = tidak membentuk sambungan apit Tabel 2 Uji tipe kawin monokarion dengan empat isolat monokarion penguji tipe kawin: BBR4, BBR11, BBR13, BBR14 isolat
tipe
Monokarion BBR1
BBR4 (P1O1)
BBR11 BBR13 (P2O2) (P1O2)
BBR14 (P2O1)
-
-
-
+
P1O2
BBR2
-
-
+
-
P2O1
BBR3
+
-
-
-
P2O2
BBR5
-
-
+
-
P2O1
BBR6
-
+
-
-
P1O1
BBR7
-
+
-
-
P1O1
BBR8
-
-
-
+
P1O2
BBR9
-
-
+
-
P2O1
BBR10
-
-
+
-
P2O1
BBR12
-
+
-
-
P1O1
BBR15
+
-
-
-
P2O2
BBR16
-
-
+
-
P2O1
BBR17
-
-
-
+
P1O2
BBR18
-
+
-
-
P1O1
BBR19
-
+
-
-
P1O1
BBR20
-
+
-
-
P1O1
BBR21
+
-
-
-
P2O2
BBR22
-
+
-
-
P1O1
BBR23
-
+
-
-
P1O1
BBR24
-
-
+
-
P2O1
BBR25
-
+
-
-
P1O1
BBR26
-
-
-
+
P1O2
BBR27
-
-
+
-
P2O1
BBR28
+
-
-
-
P2O2
BBR29
-
-
+
-
P2O1
BBR30
+
-
-
-
P2O2
kawin
Ket : (+) = membentuk sambungan apit, (-) = tidak membentuk sambungan apit
Pasangan monokarion serasi memiliki struktur khas berupa sambungan apit berdasarkan pengamatan mikroskopis (Gambar 3a, 3b). Secara makroskopis, pada
6
pasangan monokarion tidak serasi akan terbentuk zona kosong seperti garis pembatas pada pertemuan keduanya (Gambar 3c), sedangkan pada pasangan monokarion serasi tidak terdapat zona kosong (Gambar 3d).
a
b
c
d
Gambar 3 Sambungan apit (a, b), zona kosong seperti garis pembatas pada pertemuan dua monokarion tidak serasi (c), zona kosong tidak terbentuk pada pertemuan dua monokarion serasi (d).
Uji segregasi Keseluruhan isolat monokarion yang diperoleh menunjukan 10 isolat memiliki tipe kawin P1O1, 6 isolat memiliki tipe kawin P2O2, 5 isolat memiliki tipe kawin P1O2, dan 9 isolat memiliki tipe kawin P2O1. Jumlah isolat dari setiap tipe kawin kemudian dijadikan sebagai nilai pengamatan pada uji khi kuadrat (Tabel 3). Nilai khi kuadrat perhitungan lebih kecil dari nilai khi kuadrat tabel, menunjukan sebaran pengamatan tidak berbeda nyata dari sebaran harapan. Tabel 3 Uji khi kuadrat Pengamatan Hipotesis Tipe kawin (Oi) (Ei)
Harapan (Nx Ei)
Khi Kuadrat (χ 2)
P1O1
10
¼
7.5
0.83
P2O2
6
¼
7.5
0.3
P1O2
5
¼
7.5
0.83
7.5 30
0.3 2.26
P2O1 9 ¼ Total 30 1 χ 2 db ά (db = 3, ά= 0.05) = 7.815; χ 2 hitung 2.26 ≤ χ2 db ά
AFLP Isolat yang digunakan untuk analisis keragaman genotipe dengan AFLP berjumlah 8 jenis monokarion (BBR3, BBR4, BBR7, BBR 8, BBR9, BBR11, BBR13, BBR14 dan BBR6), 6 jenis dikarion hasil hibridisasi monokarionnya (BBR13-14, BBR9-13, BBR8-14, BBR4-11, BBR7-11, BBR3-4), serta 1 jenis dikarion induk (i) penghasil
monokarionnya. AFLP menggunakan 3 kombinasi primer mampu mengamplifikasi fragmen restriksi dengan baik (Gambar 4). Pemberian nilai (scoring) menggunakan piranti lunak SAGA Automated AFLP, dibatasi hanya pada ukuran 39 pb – 283 pb walaupun fragmen positif nampak pada ukuran ≤ 39 bp dan ≥ 300 pb. Fragmen dengan ukuran dibawah 39 pb sangat rapat sehingga tampak menyatu, sedangkan diatas 300 pb fragmen terlihat samar-samar dan hanya terdapat beberapa fragmen. Pasangan primer M51 dengan P11-700 menghasilkan 71 lokus untuk keseluruhan isolat. Total fragmen DNA yang dihasilkan monokarion dan dikarion adalah 584 fragmen dengan kisaran 28-53 fragmen untuk setiap isolat. Jumlah lokus yang menampakan monomorf sebanyak 12 lokus (Lampiran 1). Pasangan primer M53 dengan P11-700 menghasilkan 92 lokus untuk keseluruhan isolat. Total fragmen DNA yang dihasilkan setiap isolat monokarion dan dikarion adalah 744 fragmen dengan kisaran 19-73 fragmen untuk setiap isolat. Jumlah lokus yang menampakan monomorf sebanyak 5 lokus (Lampiran 2). Pasangan primer M55 dengan P11-700 menghasilkan 114 lokus untuk keseluruhan isolat. Total fragmen DNA yang dihasilkan setiap isolat monokarion dan dikarion adalah 831 fragmen dengan kisaran 16-98 fragmen untuk setiap isolat. Jumlah lokus yang menampakan monomorf sebanyak 4 lokus (Lampiran 3). AFLP dengan menggunakan tiga kombinasi primer yang berbeda mendeteksi 277 lokus dengan total fragmen yang dianalisis adalah 2159 fragmen. Kombinasi primer yang paling banyak menghasilkan lokus adalah M55 dan P11-700 (Tabel 4). Hasil pengelompokan berdasarkan jumlah nukleus dalam sel penyusun hifa menunjukan bahwa nilai rata-rata fragmen positif monokarion lebih kecil dari rata-rata fragmen positif dikarion untuk semua jenis kombinasi primer. Ragam (deviasi) dari nilai rata-rata fragmen positif tersebut, baik pada monokarion maupun dikarion cukup besar (Tabel 5). Nilai rata-rata diperoleh berdasarkan jumlah fragmen positif dari setiap primer dibagi dengan total lokus pada primer yang sama. Analisis gerombol berdasarkan data AFLP pada tiga kombinasi primer (P11-700-M51, P11-700-M53, dan P11-700-M55) menunjukan koefisien kemiripan antar isolat monokarion sebesar 0.64-0.79 atau terdapat keragaman 22.13- 35-65%.
7
Gambar 4 Visualisasi AFLP dengan 3 jenis kombinasi primer pada 8 jenis monokarion (3, 4, 7, 8, 9, 11, 13, 14) dan enam jenis dikarion hasil hibridisasi (14-13, 9-13, 8-14, 4-11, 7-11, 3-4) serta satu dikarion basidiokarp (i). M adalah penanda urutan standar 50bp-700bp.
8
Pada koefesien kemiripan 0.64 dibentuk dua kelompok utama. Kelompok satu terdiri atas isolat BBR7, BBR8, BBR13, dan BBR14. Kelompok dua terdiri atas isolat BBR3, BBR4, BBR11, dan BBR9 (Gambar 5). Tabel 4 Jumlah lokus positif untuk berbagai kombinasi primer Mse I dan Pst I. Isolat (BBR)
Tabel 5 Rata-rata dan ragam lokus positif monokarion dan dikarion pada kombinasi primer P11-700-M51, P11700-M53, dan P11-700-M55. P11-700-M51 Mono37,12±7,03 karion Dikarion 42,66±7,91
P11-700-M53
P11-700-M55
49,37±11,71
53,87±24,82
52,66±18,25
66,83±27,54
Jumlah lokus positif berdasarkan kombinasi primer Mse dan Pst P11-700-M51
P11-700-M53
P11-700-M55
71 lokus
92 lokus
114 lokus
3
35
40
60
4
33
59
25
7
47
64
67
8
36
60
77
9
28
30
39
11
31
52
30
13
47
49
95
14
40
41
38
13-14
35
50
40
19-13
43
55
62
8-14
45
62
82
4-11
32
19
30
7-11
48
57
89
3-4
53
73
98
induk
31
31
6
Σtotal
584
744
831
ukuran lokus
40-275 pb
40pb -281 pb
39pb-283pb
. Gambar 5
Pengelompokan monokarion berdasarkan analisis gerombol menggunakan MINITAB 14 pada gabungan kombinasi primer P11-700-M51, P11-700-M53, dan P11-700-M55.
9
PEMBAHASA Isolasi Monokarion Isolat Pleurotus sp. yang digunakan pada penelitian ini berasal dari Madiun dengan kode BBR. Pemilihan ini didasarkan pada viabilitas basidiopsora yang cukup tinggi dibandingkan dengan isolat-isolat lain yang telah dicoba sebelumnya seperti BNK, AMD, dan USX. Berdasarkan penelitian Puspiari (2010) mengenai sifat pertumbuhan dan perkembangan Pleurotus spp., diketahui BBR merupakan isolat yang memiliki bobot basah terbesar dibandingkan tujuh isolat lain yang digunakan. Di Indonesia, sejauh ini belum ada laporan mengenai usaha pemuliaan melalui persilangan. Keberhasilan persilangan tergantung pada metode isolasi spora yang dilakukan. Pemilihan metode isolasi spora yang tepat mampu memisah-misahkan spora tunggal dan membiakannya menjadi monokarion. Ada dua metode isolasi spora yang telah dicoba pada penelitian ini, yaitu metode gores Bonman et al. (1986), serta metode pengenceran spora gabungan dari Choi et al. (1999) dan Wang & Wen (1997). Metode gores tidak dapat mengisolasi spora tunggal Pleurotus sp. karena ukuran sporanya cukup kecil bila dibandingkan dengan spora Pyricularia grisea yang telah berhasil diisolasi menggunakan metode ini. Sebagai pembanding, spora P. grisea ukurannya berkisar 22.6-36.7 x 8.9-9.4 µm (Listiyowati & Widyastuti 2008), sedangkan P. ostreatus ukurannya berkisar 8.3-10.7 x 3.1 -3.6 µm (Lechner et al. 2004). Metode pengenceran merupakan metode isolasi spora yang tepat untuk Pleurotus sp. karena metode ini tidak tergantung pada ukuran spora. Basidiospora yang berhasil diisolasi pada penelitian ini mengalami kegagalan pertumbuhan menjadi monokarion sebesar 70%. Faktor penyebab terbesar dari kegagalan adalah spora yang tidak viabel. Menurut Larraya et al. (2000) dengan P. ostreatus sebagai objek penelitiannya, basidiospora yang tidak viabel disebabkan oleh polimorfisme panjang kromosom (PPK). Polimorfisme panjang kromosom terjadi karena jumlah ruas DNA yang homolog, sehingga menyebabkan penyusunan ulang kromosom akibat delesi, duplikasi, inversi dan translokasi. Salah satu akibat dari PPK adalah perbedaan jumlah ruas berulang pada kromosom homolog, khususnya rDNA yang merupakan gen terbanyak penyusun ruas berulang. Berdasarkan percobaan yang
dilakukan pada Kluyveromyces lactis (Maleszka & Clark-Walker 1990) dan Saccharomyces cerevisae (Rustchenko & Sherman 1994), galur yang memiliki jumlah salinan rDNA lebih banyak yang akan tumbuh lebih cepat. Berdasarkan kecepatan tumbuh, Monokarion pada penelitian ini tumbuh lebih lambat dibandingkan dengan dikarion. Hal tersebut disebabkan dikarion yang kedua nukleusnya berbeda secara genetik (heterokarion) saling berkomplementasi dalam mengekspresikan gen-gennya, sehingga dikarion tumbuh lebih cepat (Landacker 1996). Penentuan Tipe Kawin Isolasi monokarion berhasil dilakukan karena monokarion-monokarion hanya serasi tepat dengan satu isolat monokarion penguji tipe kawin, atau tidak ditemukan monokarion yang serasi dengan dua isolat monokarion penguji tipe kawin. Menurut Larraya et al. (2001), monokarion yang serasi dengan dua tester bukan berarti gagal dalam mengisolasi monokarion P. ostreatus, tetapi karena lokus B terbagi ke dalam dua sublokus, yaitu matBα dan matBβ. Hasil ini diperoleh dari penggunaan marka molekular RAPD L31300 dan L61800 pada monokarion-monokarion hasil meosis. Pada penelitian ini tidak ditemukan monokarion yang serasi dengan dua tipe kawin, mungkin dapat disebabkan oleh beberapa hal, (i) tidak ada sublokus pada lokus O yang pararel dengan lokus B pada P. ostreatus, (ii) jumlah monokarion yang diperoleh dalam penelitian ini relatif sedikit, (iii) atau dapat juga disebabkan oleh frekuensi rekombinasi yang rendah. Frekuensi rekombinasi yang terjadi adalah berkisar 0.615.8% untuk galur yang berbeda (Larraya et al. 2000), sehingga untuk mendapatkan alel tipe nonparental dibutuhkan jumlah monokarion yang banyak. Nilai khi kuadrat hasil perhitungan untuk uji seregasi lokus P dan O lebih kecil dari khi kuadrat tabel. Hal ini menunjukan bahwa lokus O dan lokus P pada Pleurotus sp. terletak pada kromosom yang berbeda, sama halnya seperti lokus A dan B pada Pleurotus ostreatus. Karena terletak pada kromosom yang berbeda, maka kejadian basidiosporogenesis akan menghasilkan empat tipe kawin yang berbeda. Keragaman Genetik Berdasarkan AFLP Desain primer yang baik merupakan faktor yang sangat menentukan dalam keberhasilan amplifikasi PCR (Vos et al. 1995). Jumlah total fragmen DNA dari 15 isolat dengan tiga
10
macam primer diperoleh 2159 fragmen. Fragmen-fragmen tersebut berupa 277 lokus yang berhasil diamplifikasi. Jumlah lokus yang diamplifikasi oleh setiap primer berbedabeda. Nilai rata-rata fragmen positif pada isolat dikarion lebih besar daripada isolat monokarion, karena sel dikarion memiliki dua nukleus. Nilai ragam yang besar untuk nilai rata-rata lokus positif monokarion menunjukan bahwa lokus yang berhasil diamplifikasi tidak menyebar secara merata pada setiap isolat monokarion. Berdasakan hasil penentuan tipe kawin dan analisis gerombol, monokarion BBR3 serasi dengan isolat BBR4 dan BBR7. Sedangkan isolat monokarion BBR13 serasi dengan BBR14 dan juga BBR9. Namun berdasarkan hasil AFLP, BBR3 lebih baik disilangkan dengan BBR7 daripada dengan BBR4, karena BBR3 dan BBR4 berasal dari kelompok yang sama. Demikian halnya isolat BBR13 lebih baik disilangkan dengan BBR9, karena BBR13 dan BBR14 berada pada kelompok yang sama. Hal tersebut diharapkan dapat meningkatkan variasi genetik pada keturunannya. Untuk menghasilkan basidiospora hasil meiosis dengan variasi genetik yang tinggi, maka harus menggabungkan dua parental monokarion yang jauh berbeda secara genetik. Variasi genetik yang tinggi diharapkan dapat menyeleksi galur unggul, seperti memiliki masa pertumbuhan dan perkembangan yang cepat, serta memiliki nilai efisiensi biologis yang tinggi. Pada meiosis, gen-gen pada kromosom akan bersegregasi dan berpadu bebas yang menyebabkan genotipe monokarionmonokarion dapat berbeda satu sama lain. Perbedaan ini akan semakin besar jika terjadi rekombinasi melalui pindah silang pada saat meiosis.
SIMPULA Monokarion yang berhasil diisolasi berjumlah 30 yang terbagi ke dalam 4 jenis tipe kawin, yaitu P1O1, P2O2, P1O2, dan P2O1. Data uji tipe kawin menunjukan gen-gen penentu tipe kawin bersegregasi dan berpadu bebas berdasarkan uji khi kuadrat. AFLP dapat digunakan untuk menentukan identitas dari setiap monokarion karena mampu mengamplifikasi banyak lokus dalam sekali reaksi PCR. Hasil analisis gerombol data AFLP dapat digunakan untuk dasar pemilihan parental yang memiliki perbedaan yang tinggi secara genetik.
SARA Pada penelitian selanjutnya diharapkan melakukan pengukuran ciri-ciri kuantitatif dari monokarion sehingga pengelompokan berdasarkan AFLP dapat dihubungkan dengan ekspresi fenotipenya.
DAFTAR PUSTAKA Anonymous. 2004. SAGA Automated AFLP Analysis Software. User Guide. LI-COR Biosciences Inc. Bonman JM, Vergel de Dios TI, Khin MM. 1986. Physiologic specialization of Pyricularia oryzae in the Philiphines. Plant Dis 70: 767-769. Choi YW, Hyde KD, Ho WH. 1999. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity 3: 29-38. Eugenio CP, Anderson NA. 1968. The genetics and cultivation of Pleurotus ostreatus. Mycologia 60: 627-634. Jusuf M. 2010. Amplified Fragment Lenght Polymorphism Diversity of Cultivated White Oyster Mushroom Pleurotus ostreatus. HAYATI J Biosci 17: 21-26. Landecker EM. 1996. Fundamental of The Fungi. (4th ed) New Jersey: Prentice- Hall. Larraya LM, Ramírez L, Pissabarro AG . 2000. Molecular tools for breeding Internatl Microbiol basidiomycetes. 3:147–152. Larraya et al. 2001. Relationship between monokaryotic growth rate and mating type in edible basidiomycete Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol 67: 3617-3625. Lechner B, Wright JE, Alberto E. 2004. The genus Pleurotus in Argentina. Mycologia 96: 845-858. Listiyowati S, Widyastuti U. 2008. Hubungan Kemampuan Pergantian Inang dengan Plastisitas Genetik pada Cendawan Blas Padi (Pyricularia grisea). Laporan Penelitian Strategis Berdasarkan Program Penelitian IPB: Genetic Resources and Engineering and Breeding. Bogor: LPPM IPB. Maleszka R, Clark-Walker GD. 1990. Magnification of the rDNA cluster in Kluyveromyces lactis. Mol Gen Genet 223:342-344. Mueller UG, Wolfenbarger LR. 1999. AFLP genotyping and fingerprinting. TREE 14: 389-394.
11
Nawamura et al, penemu; Shiseido Company. 10 Sep 2009. Skin whitening method using Pleurotus nebrodensis. US 2009/0226388 A1. Pancadewi K. 2008. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) [tesis]. Bogor. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Puspiari. 2010. Pengelompokan Beberapa Isolat Jamur Tiram Putih (Pleurotus spp.) Berdasarkan Sifat Pertumbuhan dan Perkembangan [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Raeder U, Broda P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Let in Appl Microbiol 1: 17-20. Royse DJ. 1996. Speciality mushrooms. In: Janick J (ed). Progress in new crops. Arlington. ASHS Pr. Rustchenko EP, Sherman F. 1994. Physical constitution of ribosomal genes in common strain Saccharomyces cerevisae. Yeast 176:3231-3241.
Sambrook J, Fritish EP, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual (2nd ed). New York: Cold Harbour Laboratory Pr. Stansfield WD. 1986. Theory and Problems of Genetics. New York: McGraw-Hill Book Company. Tredway LP, Stevenson KL, and Burpee LL. 2005. Genetic structure of Magnaporthe grisea populations associated with St. Augustinegrass and tall fescue in Georgia. Phytopathol 95:463-471. Vasudewa NS, Abeytunga DTU, Ratnasooriya WD. 2007. Antinociceptive Activity of Pleurotus ostreatus, an Edible Mushroom, in Rats. Pharm biol 45: 533540. Vos et al. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. /ucl Acids Res 23: 4407-4414. Wang CH, Wen HK. 1996. A simple method for obtaining single-spore isolates of fungi. Bot Bull Acad Sin 38: 41-44.
12
LAMPIRA
13
Luaran Scoring Data AFLP Dengan Primer P11-700-M51 Menggunakan Piranti Lunak SAGA data type f2 backcross 15 71 0 symbols +=A H=H -=# Complete Scoring Characters: + = Present, H = Heterozygote, - = Not Present, ? = UnKnown, - = Fail # Sample names bbr3 bbr4 bbr7 bbr8 bbr9 bbr11 bbr13 bbr14 bbr13-14 bbr9-13 bbr814 bbr4-11 bbr7-11 bbr3-4 bbr-induk
*p11-700-M51-0275 *p11-700-M51-0273 *p11-700-M51-0271 *p11-700-M51-0243 *p11-700-M51-0240 *p11-700-M51-0238 *p11-700-M51-0236 *p11-700-M51-0233 *p11-700-M51-0229 *p11-700-M51-0226 *p11-700-M51-0224 *p11-700-M51-0222 *p11-700-M51-0221 *p11-700-M51-0219 *p11-700-M51-0217 *p11-700-M51-0215 *p11-700-M51-0212 *p11-700-M51-0210 *p11-700-M51-0205 *p11-700-M51-0201 *p11-700-M51-0198 *p11-700-M51-0192 *p11-700-M51-0188 *p11-700-M51-0187 *p11-700-M51-0183 *p11-700-M51-0165 *p11-700-M51-0164 *p11-700-M51-0162 *p11-700-M51-0146 *p11-700-M51-0139 *p11-700-M51-0135 *p11-700-M51-0134 *p11-700-M51-0127 *p11-700-M51-0123 *p11-700-M51-0122 *p11-700-M51-0118 *p11-700-M51-0113 *p11-700-M51-0109 *p11-700-M51-0106 *p11-700-M51-0104 *p11-700-M51-0102 *p11-700-M51-0100 *p11-700-M51-0098 *p11-700-M51-0096 *p11-700-M51-0093
--++--+++-+-+++++++++++++++++ -+++---++--+--+++++++++++++++ ------++-++-+++ +++++++++++++++ --++--++--+-++-+++--+++++++++ +++++++++++++++ --++--+--++-++--+---++--------+----+--+-++---------+----+-+++---------+-++---+--------++--+-+++-++-++--++++-++++------+---+-++++++++++++++-++ +++++++-+++++++ +++++++-+++++++++++++++++++++ +++++++++++++++ +++++++++++++++ +++++++++++++++ +++-++++++-+--+ -+++--+---+-+++ -----++---+++++ --------++-++++-----++++++++--+---++-++-++--+----+-++-++--++--++-++-+++------------+--+---+---+--+--+-------+-+++ --++--+++++-+++-++--++-++-++++++++++++++--++++-+++++-++--------+----+-++++-++-+++-++------------+++------+------+------+------+
14
*p11-700-M51-0091 *p11-700-M51-0089 *p11-700-M51-0087 *p11-700-M51-0086 *p11-700-M51-0081 *p11-700-M51-0078 *p11-700-M51-0077 *p11-700-M51-0075 *p11-700-M51-0072 *p11-700-M51-0070 *p11-700-M51-0068 *p11-700-M51-0066 *p11-700-M51-0064 *p11-700-M51-0062 *p11-700-M51-0059 *p11-700-M51-0057 *p11-700-M51-0055 *p11-700-M51-0053 *p11-700-M51-0051 *p11-700-M51-0050 *p11-700-M51-0048 *p11-700-M51-0046 *p11-700-M51-0045 *p11-700-M51-0043 *p11-700-M51-0041 *p11-700-M51-0040
++++--+---+-+++ -+++++-++++++++ ++++++++++++--+ +++++++++++++++ ------+-----++--+----++++-++--+----+--+-+-++---++-++----+---+++--+--++----+-+-----+++ --++-++--++--++--+++--++-+-++ ----+------+--+ +-+---++--+-++-+--+-------+++ ----+---------+ +++++++++++++++ +++++++++++++++ ----+---------+ --+++-+--++-+++++++++++++++-++---++-++-+-++ ++---+-+-----++ -+---+---+-+-+-+------++-+-++++--++-++++++-
15
Luaran Scoring Data AFLP Dengan Primer P11-700-M53 Menggunakan Piranti Lunak SAGA data type f2 backcross 15 92 0 symbols +=A H=H -=# Complete Scoring Characters: + = Present, H = Heterozygote, - = Not Present, ? = UnKnown, - = Fail # Sample names # bbr6 bbr7 bbr11 bbr12 bbr13 bbr15 bbr17 bbr18 bbr17-18 bbr13-17 bbr12-18 bbr7-15 bbr11-15 bbr6-7 bbr-induk *p11-700-M53-0281 *p11-700-M53-0270 *p11-700-M53-0268 *p11-700-M53-0265 *p11-700-M53-0263 *p11-700-M53-0258 *p11-700-M53-0255 *p11-700-M53-0252 *p11-700-M53-0237 *p11-700-M53-0231 *p11-700-M53-0229 *p11-700-M53-0227 *p11-700-M53-0222 *p11-700-M53-0218 *p11-700-M53-0214 *p11-700-M53-0210 *p11-700-M53-0207 *p11-700-M53-0205 *p11-700-M53-0200 *p11-700-M53-0192 *p11-700-M53-0190 *p11-700-M53-0188 *p11-700-M53-0186 *p11-700-M53-0185 *p11-700-M53-0181 *p11-700-M53-0179 *p11-700-M53-0174 *p11-700-M53-0171 *p11-700-M53-0167 *p11-700-M53-0165 *p11-700-M53-0158 *p11-700-M53-0156 *p11-700-M53-0155 *p11-700-M53-0151 *p11-700-M53-0150 *p11-700-M53-0148 *p11-700-M53-0143 *p11-700-M53-0141 *p11-700-M53-0138 *p11-700-M53-0137 *p11-700-M53-0135 *p11-700-M53-0132 *p11-700-M53-0129 *p11-700-M53-0128 *p11-700-M53-0126
+++++++++++++++ ----+++--++++++ --+++++--+++++-++++-+++++-+++ --++--++--+-+++---+++++-+++++ --+++++-+++++++ --+++++--++++++ -+++--++--+-++-+++-+--+++-++-+++-+--++---+++---+--++-----+++-+++++++-++++++++++++++++ -++++-+--++-++-+++--+--++-++--+++-++-++-+++-++--++--+-++++++-+++-++-++-+++--+--++-++-+++-++++++-+++-++--+--++-++-+++--+++++-++-+++-++++++-++--++--++-+++++-+++-+++-++-+++++++++++++++++ ++++-++++++++++-++--+++-+-+++++++-------++++++-+-+++----+-+---++--+-++++++++-+++----++++-++++++-+++-++-++++-+-++++++--+++++-++++++-++-+++-++-+----+-----+++ ++------------++-----+--+--+--+++-+++++-+++ +--+--+---+-++---+----+------+-+----+++--+---+-----++-++-
16
*p11-700-M53-0124 *p11-700-M53-0123 *p11-700-M53-0120 *p11-700-M53-0119 *p11-700-M53-0115 *p11-700-M53-0114 *p11-700-M53-0113 *p11-700-M53-0111 *p11-700-M53-0105 *p11-700-M53-0104 *p11-700-M53-0103 *p11-700-M53-0102 *p11-700-M53-0100 *p11-700-M53-0099 *p11-700-M53-0097 *p11-700-M53-0095 *p11-700-M53-0092 *p11-700-M53-0090 *p11-700-M53-0088 *p11-700-M53-0087 *p11-700-M53-0085 *p11-700-M53-0084 *p11-700-M53-0083 *p11-700-M53-0082 *p11-700-M53-0081 *p11-700-M53-0078 *p11-700-M53-0075 *p11-700-M53-0072 *p11-700-M53-0071 *p11-700-M53-0069 *p11-700-M53-0068 *p11-700-M53-0064 *p11-700-M53-0062 *p11-700-M53-0060 *p11-700-M53-0058 *p11-700-M53-0056 *p11-700-M53-0054 *p11-700-M53-0052 *p11-700-M53-0051 *p11-700-M53-0050 *p11-700-M53-0049 *p11-700-M53-0046 *p11-700-M53-0045 *p11-700-M53-0043 *p11-700-M53-0042 *p11-700-M53-0041 *p11-700-M53-0040
--------------+ --------------+ -------------++ -----+-------++ -+--+------+-++ -++-+++---++++++++++++++++-+-+++++-++++-+++ ++-++---+++--++ ++++-+--+++--++ -++++++++++--+-++++++-+-++++++++-++-+++--++ -+++--+-+-+--++--+-+--++----+ +-+-----+++-+++++++++++++++++ --++-++++++-+++ -+++-+--++----+ -+++-+--++---------+--++--++-+-+-+--++----++---+-+-+----+ ------------++-+--------------++----+++-+++----+-++-----++++-++++-+-+++ -------+--+---+ +++++++++++++++ --+++---++--------------+-++-++-----+-+-++--+++++--++-+++++++--+------+++++++++++++++ -++-+++---+-+++ --+-+-----+-+++ +++-+--+--+-+++++--+--++---+-++--++++++-++++---+-------++ ++---+--------++++-+--++-+-+-+---+---------++--++---+-+++++--+-+----++-
17
Luaran Scoring Data AFLP Dengan Primer P11-700-M55 Menggunakan Piranti Lunak SAGA data type f2 backcross 15 114 0 symbols +=A H=H -=# Complete Scoring Characters: + = Present, H = Heterozygote, - = Not Present, ? = UnKnown, - = Fail # Sample names # bbr6 bbr7 bbr11 bbr12 bbr13 bbr15 bbr17 bbr18 bbr17-18 bbr13-17 bbr12-18 bbr7-15 bbr11-15 bbr6-7 bbr-induk *p11-700-M55-0283 *p11-700-M55-0281 *p11-700-M55-0277 *p11-700-M55-0267 *p11-700-M55-0264 *p11-700-M55-0262 *p11-700-M55-0250 *p11-700-M55-0247 *p11-700-M55-0241 *p11-700-M55-0240 *p11-700-M55-0237 *p11-700-M55-0235 *p11-700-M55-0233 *p11-700-M55-0228 *p11-700-M55-0224 *p11-700-M55-0223 *p11-700-M55-0221 *p11-700-M55-0218 *p11-700-M55-0216 *p11-700-M55-0213 *p11-700-M55-0211 *p11-700-M55-0209 *p11-700-M55-0207 *p11-700-M55-0205 *p11-700-M55-0203 *p11-700-M55-0201 *p11-700-M55-0197 *p11-700-M55-0195 *p11-700-M55-0192 *p11-700-M55-0189 *p11-700-M55-0185 *p11-700-M55-0184 *p11-700-M55-0182 *p11-700-M55-0179 *p11-700-M55-0175 *p11-700-M55-0173 *p11-700-M55-0171 *p11-700-M55-0170 *p11-700-M55-0168 *p11-700-M55-0167 *p11-700-M55-0165 *p11-700-M55-0163 *p11-700-M55-0162 *p11-700-M55-0160 *p11-700-M55-0158
+++++++++++++++-++--++--+-+++++++++-+++++++-++--+---+--+------+-----++++-++-+-------+---++--++-+-+---++-+-+++--+------++----+++-+++++-+++-++--+++-+--++-++++++++++++++++++-+-----+++++--++--++-++-++----------+-+++-++--++++++--++++--+-++++++------+-----++------+--++-++----+-+--++-++--++--+-----++----+-----------++++++++++++--++--++--+-++++++++--++++------------+-++---++-+--+---+------+-----++-++++-+-++-+++++++++++++++++--+++-+++++-++--++++--+++-++--++--++--+-+++-++--+++++-++---------+-+++----+-+---+-++++-+-++++++++++----+-++-----+++++++-++-+---++----+---+-+--++--++-++-++--+---+++++-++--+-------+-++--++--++-++-++-----++-+--+---
18
*p11-700-M55-0157 *p11-700-M55-0155 *p11-700-M55-0152 *p11-700-M55-0151 *p11-700-M55-0149 *p11-700-M55-0147 *p11-700-M55-0145 *p11-700-M55-0143 *p11-700-M55-0141 *p11-700-M55-0140 *p11-700-M55-0138 *p11-700-M55-0136 *p11-700-M55-0134 *p11-700-M55-0133 *p11-700-M55-0130 *p11-700-M55-0128 *p11-700-M55-0127 *p11-700-M55-0125 *p11-700-M55-0124 *p11-700-M55-0123 *p11-700-M55-0120 *p11-700-M55-0118 *p11-700-M55-0116 *p11-700-M55-0114 *p11-700-M55-0113 *p11-700-M55-0111 *p11-700-M55-0109 *p11-700-M55-0105 *p11-700-M55-0104 *p11-700-M55-0102 *p11-700-M55-0100 *p11-700-M55-0097 *p11-700-M55-0096 *p11-700-M55-0094 *p11-700-M55-0093 *p11-700-M55-0092 *p11-700-M55-0090 *p11-700-M55-0088 *p11-700-M55-0087 *p11-700-M55-0086 *p11-700-M55-0084 *p11-700-M55-0083 *p11-700-M55-0081 *p11-700-M55-0079 *p11-700-M55-0077 *p11-700-M55-0076 *p11-700-M55-0074 *p11-700-M55-0073 *p11-700-M55-0071 *p11-700-M55-0070 *p11-700-M55-0068 *p11-700-M55-0067 *p11-700-M55-0065 *p11-700-M55-0064 *p11-700-M55-0063 *p11-700-M55-0062 *p11-700-M55-0060 *p11-700-M55-0059 *p11-700-M55-0056
++++--+--++-+++--+--+---+-+++-++--+--++--+------+---+-+++----++---+-++-----+----+-+++--+--+------+------+--+-----------+-++-+++-++--++-++-++--++-----++-+++-----+---+-++------+-----+++--+--+-------+-++--+++++++++++++-++++++++--++--++-++-++--++--+---+-++--++--+---+-++----+-----------++--+--++-+++-----+---+-++------+---+-++---+---+------+-++--+--++-+++-----+---+-+++-++--+---+-+++-----+---+-+++--+--+-----++--+++++-+++++++--+--+---+-++++++-+--++-+-+------+-----++---+-+--++----+-++-++-+++++++-++-++-+++-+++-++--+-+++-++--+++-+---+-++---+--+-----+++-+---------+++--+--+++++-++++-+--+++-+-+++-----++-++-+++-++--+--++-++---+--+--++-++++++++++++++--++++++++++++--------+---+-+++-+++-++-++-++--++--+--++-+++--+------------+++-+---+-+++--+--+------++ -++---+---+-+++ --+---+--++-+++-+++-+---+-+++++++++++++++++ --++--++-++-+++++++++++++++++
19
*p11-700-M55-0054 *p11-700-M55-0051 *p11-700-M55-0048 *p11-700-M55-0047 *p11-700-M55-0045 *p11-700-M55-0044 *p11-700-M55-0043 *p11-700-M55-0042 *p11-700-M55-0040 *p11-700-M55-0039
+++++++++++++++ +++-+++++++++++ +-+++-+-----+++-+++-+++++-+++++++++-+++++++-++++++--+-++--+++++---+-++++++-+++++-+--+-+-+-+-+++++++-+++-+-----++-
