STT]DI AKTWTTAS ENZIM PROTEASE EKSTRASELITLER STRNPTOKOKUS
GRUP
B
(Streptococcus agolactiae) PADA SUBSTRAT MUSIN
OIeh : Achmad Slantet Atru dan Mulnmmad Amrullah Pogalat)
ABSTRACT Group B Steptococci (GBS) produce exhacellular enzymes which are know to be involved in virulence mechanism. One of the en2.ymes is protease which has an ability to degradate Rrucin. Mucin has an important role to defend mucosal membrane from invasion of bacteria- The purpose of this research was to analysis protease characteristics of GBS on the mucin substrat as a model for studying dre role of GBS proteases in pathogenesis of GBS infections. The optimum pH for the enzym was 7 and the enryme had maximal activity at37a C. The protease activity was inhibited by EDTA (2 ;M and 5 mM) anA ptr4Sf (2 rnM and 5 mM). The protease ac.tivity was enhanced by addition of MgCl2, QCl2, and FqCl3 (2 mM and 5 mM).
Key words : protease, SGB, mucin, enzym characterization, purification.
PENDAHT]LUAIY Streptokokus Grup B (SGB) atau Streptococcus agalrctiae telah diketahui sebagai patogen penting pada manusia dan hewan, yang dapat menyebabkan infeksi invasif neonatal pada komplikasi obstetri seperti keguguran melahirkan, ketuban pecah sebelum waktu (KPSW), berat lahir bayi rendah (BLBR), partus lama Qtrolong Iabow\ serta penyakit neonatal septicemia (Baby blue), dan meningitis (trreradangan otak) pada bayi. (Edwards and Baker, 1995 dalam Putranto, 2004). Patogenitas bakteri ini disebabkan oleh faktor virulensi yang dimilikinya berupa pncduk ekstrase luler seperti hialuronidase, hipurikase, nuclcas€, C5a-ase, hemolisin dan faktor CAMP. Faktor virulensi non struktural(metabolit) ini umumnya berperan dalam proses invasi rlan perusakan jaringan inang (Takahashi e/ rrl.,
1999; Pritchard and
Lin, lgg3. Dalam
menginfeksi sel inang bakteri ini mula-nrula
melakukan perlekatan (adhesi) kemudian berkolonisasi dan melakukan invasi pada
jaringan mukosa inang dengan c:lra mensekresikan enzim protease untuk mendegradasi musin yang terdapat pada permukaan sel inang dengan hancurnya lapisan musin akan memudahkan baLleri
mencapai dan menginfeksi sel inang. Sekresi
ini yang telah diidentifikasi dari SGB adalah C5a-ase, yakni protease pendegradasi komplemen C5q namun sekresi proteas€ SGB pada jaringan mukosa belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi protease SCB pada substral musin secara in vito untuk mengetalrui mekanisme infeksi SGB pada jaringan enzim protease saat
mukosa.
METODE PNNELITIAIV
Penglitian ini dilaksanakan di Laborakriurn Mikrobiologi dan Biokinria dan l,ahrratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PAU-IPB s€rta l,aboratorium Terpadu FKH-IPB pada bulan Januari sampli tlcngur Bulan Mei20M. llahan Penelitian adalah Isolnt Bakteri SCB SR 21, SR 30, SV 14 dan SV 24, Medin Todd Hewifi Broth (THB), agur. kasein (susu skiim I Vo), Musin, larutan Buffer'l'ris HCL . Bovine Serum Albumin (BSA), TCA, Na2CO3, Folin, tirosin. Alat penelitian terdiri dari : Inkubator, Water Bath, Shaker, Hot plate, spektrofotometer, sentrifirge,Cawan Pteridish, Autoclave,
tl kantong dialisis, coulomb kromatografi, dan pH meter Skrening Isolat SGB penghasil protease
Isolat Bakteri SGB SR 21, SR 30, SV 14 dan SV 24 yang dkoleksi dari penderita komplikasi obstetri di Rumatr Sakit
Marinir Cilandak Jakarta
selatan,
ditumbuhkan pada media Tod Hewitt Rroth
(TI{B) agar yang telah
disuplementasi
dengan substrat kasein (susu skim l%) dan diinkubasi pada suhu 370C selama semalam. Isolat bakferi yang mbmperlihatkan adanya
zona bening menunjukkan bakteri tersebut menghasilkan enzim protease.
Produksi enzim Protcase Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada 50 ml mcdia Tod He-witt Broth (TFIB), diinkubasi pada suhu 37'C selama kurang lebih 5 jarn (O[)6,2eu, = 0,0800, sekitar I x 108 sel ml-l) selanjutnya diinokulasikan kembali kedalam 100 ml media serupa yang mengandung0,2Yo musin) diinkubasi semalam pada suhu ruang. Enzim dipisahkan dari sel menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm, 30 menit pada 40C. Supernatan yang mengandung enzim diuji aktivitasnya dengan metode Bergmeyer et al (1984) dan ditentukan kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976).
Pengukuran Konsentrasi Protein dan Aktivitas Protease.
Konsentrasi
protein
Campuran
5 ml pereaksi Bradfoed.
ini dihomogenkan dan diinkubasi
5 menit pada suhu 3/C kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada
l, 595 nm (Bradford I976.dalam Baihaqi
(2004). Persamaan garis regresi ditentukan dari nilai absorbansi dan konsentrasi protein dari standar BSA dengan konsentrasi sebagai absis dan absorbansi sebagai ordinat. Konsentrasi protein ditentukan dari kurva standar yang terbentuk
protease
et al
(1984) yang dimodifrkasi dongan subshat musin. 0,25 ml musin l%
dimasukkan dalam tabung reaksi yang bcrisi 0,25 ml buffer Tris HCI 0,2 M pF{ 7 dan 0.05 ml ekstrak kasar enzim, diinkubasi l0 mcnit pada Untuk menghentikan n uksi ditambahkan TCA 0,1 M 0,5 ml diinkubasi l0 menit pada suhu Aan disentrifugasi selama l0 menit pada kecepatan 4000 rpm. Terakhir ditambahkan NazCOr 1,25 ml dan Folin 0,25 ml diinkubasi lagi pada sulru 370C selama 20 menit selanjutnya diukur dcngan
lfC.
l/C
spcktrofotometer pada panjang gchrrnbang 57lt nnr. Satu unit aktivitas enzim protcase
Parameter yang diamati drlam penelitian ini meliputi : (a) konsentrasi Protein dari Protease bakteri SGB: (b) aktivitas Protease pada berbagai suhu Inkubasi; (c) aktivitas protease pada berbagai
pH; dan (d) aktivias
Protese
pada
penambahan beberapa logam
ini
Data yang diperoleh dalam penelitian
diolah dengan menggunakan bantuan grafiU kurva dan diagram selanjutnya dianalisis s@ara deskriptif kualitntif
diukur
menggunakan standar protein Bovine Senrm Albumin (BSA) dengan konsenhasi 0,1-1,0 mg/ml. l00pl. Tiap konsentasi BSA dan sampel protease ditempatkan pada tabung
reaksi, ditambah
Pengukuran aktivitas
dilakukan dengan metode metode Bergmeyer
HASIL DAN PEMBAHASAI\
Ilasil Selelsi SGB Penghasil Protease. Dari beberapa isolat SGB yang ditumbuhkan (SR 22, SR 30, SV 14 dan SV
24)
pada media seleksi diperoleh s€mua
isolat SGB memperlihatkan zona bening yang menunjukkan adanya aktivitas enzim protease. Kemudian dipilih isolat SGB dengan aktivitas tertinggi (SGB SR 30), ditumbuhkan pada media THB untuk produksi protease, selanjufirya diukur aktivitas proteasenya pada berbagai lama
waktu intubasi pada suhu dilakukan karakterisasi enzim.
AGRIPLUS,YoIUme 17 Nomor 02Mei 2MZ ISSN08&4-0129
3fC
dan
52
Produksi Enzim Protease Ekstraseluler.
rc Gambar
L
5101520 lA/aktu lnkrrbarl Aktivitas Enzim
0,677 IU/mg (Gambar 2 & penambahan beberapa logam,
-E
5 i? .$
B
Protease Sfeptokokus Grup Inkubasi pada media THB
Isolat bakteri SGB SR 30 di atas diperoleh aktivitas maksimum sebesar 0,27 IU/mg pada waktu inkubasi jam ke-15. (Gambar 1). Aktivitas maksimum Protease Streptokokus Grup B SR 30 dicapai pada pH 7 dengan aktivjtas sebesar 0,57 IU/mg dan pada suhu 370C dengan aktivitas r"b"*t
t-
(larr ke-)
3).
dapat meningkatkan aktivitas enzim dengan aktivitas yang berbeda-beda namun logam CaCl2 memberikan aktivitas enzim yang
lebih tinggi, yakni 0,101 IU/mg konsentrasi 1 mM dan 0,125 IU/mg
ini
bebanding lurus dengan konsentrasi logam yang ditambal*an" sebagaimana terlihat pada garnbar 2 di bawatr ini. o.8
0.6
t,.
\'.. I
o'5
\
o.+
0..
r
^ .
saicgl _ _____
E
3
9.7
E
?o,
o-u
o.s
Eo, 0.r
0.1
0
'r_---
5
E7
-T_
a-a
SClO
/r.
,',/\. ,/\ ,/\ a.\ ''-n3037
2.
Nilai Aktivias Enzim Musin l7o.
\
405060
Suhu {0 C}
pH
Gambar
ffi
/\i. ,/\ /\ /t
o.s
E o.r
L
pada pada
konsentrasi 5 mM. Kenaikan aktivitas enzim
Pada
semuanya
dengan Berbagai waktu
Protease SGB Terhadap Be6agoi pH dan Sqhu Menggunakan Substrur
Pada gambar 2
di atas terlihat bahwa aktivitas enzim protease SGB pada substrat musin cukup bervariasi yang disesuaikan dengan perubahan pH. Pengukuran aktivitas dilakukan pada kisaran pH yang cukup bcsar,
yaitu dari pH 4,0 sampai pH l0.(Untuk pH 4,0 - 6,0 menggunakan buffer universal 0,02 M dan untuk pH 6,0 - 10,0 menggunakarr
AGftIPLAS, Yoluae 77 lVomot
buffer
'liis HCI 0,2 M)
dengan aktivitlr
maksinrum. pada pH 7. pH rendah atau pl I tinggi tlnprit menyebabkan denanrasi protlilr enzirn yang akan menurunkan rrktivitrur enzirn, namun ada suatu pH tertenlu yung menyebabkan kecepatan reaksi paling tfurggi dan memberikan aktivitas maksimum bagi kerja enzim, yaitu pH optimum enzim. pada
0Z
Mci ZN?,
ISSN OSWTAS
53
kondisi
ini
gugus pemberi atau penerima proton yang penting .pada situs aktif enzim
berada dalam tingkat ionisasi
besar, yaitu dari suhu l00C sampni 600C
yang
diinginkan (Suhartono, 1989). Aktivias enzim ini tidak terlalu jauh berbeda dengan enzim protease pendegradasi musin pada
dengan aktivitas maksimum padf sdru 370C. Pada suhu rendah reaksi berlangsung lurnbat sedangkan pada suhu tinggi lebih cepat
8
namun kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya denaturasi akan mengurangi kecepatan r€aksi, oleh karena ada dua pengaruh berlawanan maka akan terjadi titik
(Budiarti dan Suhartono, 1999). Protease S.agalactiae SR 30 juga memiliki kisaran suhu aktif yang cukup
optimum, yaitu suhu yang pahng tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim tertentu (Po€djiadi, I 994)
bakteri EPEC (Entero Patogenic E coli) yang
memiliki aktivitas maksimum pada pH
g
--(r;fzr
o.14 o.12
O,O98 O.lOi
o.1
o.08
$ g
o.o8
t
o.o2 o
o.o4
o.o9
il[ il
o.o3
n
Igclz(t)
lGntrol
C.Gl2(2) c*N2(.)
o.o38
T
lr2crt
Konaentragl (mll)
(2,
I
h2crt
Gambar 3. Nilai Aktivitas Enzim Protease SGB dengan Penambaban Beberapa logam pada Substrat Musin
l%
Penambahan beberapa logam bervalensi dua semuanya mampu meningkatkan nilai aktivitas enzim dengan altivitas yang berbeda-beda, hal ini menuqiukkan enzim protease SGB membutuhkan logam tersebut sebagai kofaklor yang berperan dalam reaksi katalisis.dan kestabilan enzim. Dari hasil uji aktivitas enzim dengan penambatran logam
diatas nampak bahwa pemberian logam CaCl2 memberikan nilai aktivitas tertinggi yakni 0,101 IU/mg pada konsentrasi 2 mM dan 0,125 U/mg pada konsentrasi 5 mM, dimana kenaikan aktivitas nya berbanding lurus dengan konsentrasi logam. Kenaikan aktivitas enzim ini disebabkan enzim protease ini memerlukan sejumlah logam penting untuk menstabilkan konformasi aktifrrya atau untuk menginduksi formasi situs aktif enzim (Devlin,1982).
KESIMPTILAI\ Protease SGB memiliki aktivitas optimum pada pH 7 dengan nilai aktivitas spesifik sebesar 0,57 IU/mg dan suhu inkubasi 3/C dengan aktivitasb,6TT NJlmg. Aktivitas protease SGB dapat ditingkatkan dengan pemberian logam (MgCl2,CaCl2 and FezClr.
DAFTAR PUSTAKA Baihaqi,A.' 2004. ldentihkasi Bokt€ri- llnkteri Penghasil Protease di Kopuluuan seribu.Thesis.
I
Pll. Bogor.
Bergmeyer f{V, Grassl M, Walter HF. 1984. Methods of Enzymatic Analysis. Vcrlag Chemie. Weinhcim. Volumc IV: 4.i-49.
AGRIPLUS, Volume 17 Nomot 02 Mei 2(Nt7, ISSN 05514129
54
Bradford
MM.
A rapid and sensitive for the quantitation of
1976.
methode
microgram quantities of protein utilising thr principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72:248 -254.
Budiarti
S,
MT.
Suhartono 1999. peranan Protease pada bakteri patogen. Makalah dipresentasikan
Padang,3
Devlin
-4
pada PIT
PERMI.
Agustus 1999.
TM. 1982. Textbook
of
a Hyaluronidase. Infect. lmmun. 6l: 3234-3239.
W.S. 2004. Karakterisasi Enzim Hyaluronidase pada bakteri Streptococcus agalaAiae (Streptococcus Grup B).Thesis IPB. Bogor.
Putanto,
Smith AC, and D.K. Podolsky. 1986. Colonic mucin glycoproteins in health and disease.
Clin. Gastroenterol. 15 : 815-837. Biochemistry
with Clinical Correlations. John Wiley and Sons. Canada.
A. 1994. Dasardasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia press.
Poedjadi
Jakarta.
Takahashi
SY,
Aoyagi
.EE.
Addersort
G.Okuwaki, and J.F.Bohnsack.
1999.
Capsular Sialic Acid Limits C5a Production on Tlpe III Group B Stnepococci. Infect. Immun. 67: lg661870.
Pritchard DG, Lin B. 1993. Gmup B Stepococcal Neuraminidase is Actually
AGRIPLAS,Yoluae IZ Nomot 02Mei Zrt7, ISSNAei44Izg
