Humán szubmandibuláris nyálmirigy-eredetű primer sejtek és immortalizált sejtvonal differenciálódásának in vitro vizsgálata Doktori tézisek
Szlávik Vanda Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Varga Gábor egyetemi tanár, az MTA doktora
Hivatalos bírálók: Dr. Kovács Attila kandidátus, egyetemi docens Dr. Darvas Zsuzsa kandidátus, egyetemi docens Szigorlati bizottság: Elnök: Dr. Falus András, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Tagok: Dr. Tóth Sára, kandidátus, egyetemi docens Dr. Réz Gábor, kandidátus, egyetemi docens
Budapest 2008
Bevezetés A
nyálelválasztásnak
mennyisége
és
minősége
lényeges
a
szájhigiénia
és
a
gyomornyálkahártya épségének szempontjából. A nyáltermelés csökkenése, illetve elvesztése mind az egészségre, mind az életminőségre rendkívül rossz hatással van. A nyálmirigy hypofunkciónak több oka lehet: a szájszárazságot, vagy xerostomiát leggyakrabban az egyik autoimmun kórkép, a Sjögren-szindróma, illetve a terápiás besugárzás váltja ki. A kórfolyamatokban elsősorban a nyál-termelésért felelős acinussejtek károsodnak lényegesen. A nyálmirigy funkcionális szövetének helyreállítása a patológiás folyamatok gyógyítását követő fontos lépés lehet, mely javítja a szájüreg egészségét és az életminőséget. Pluripotens progenitorsejtek implantációja megoldást jelenthet a károsodott acinussejtek pótlására. Egyre több bizonyíték van arra, hogy a szubmandibuláris nyálmirigy interkaláris duktuszaiban széles fejlődési potenciálú, multiopotens progenitorsejtek találhatók. A nyálmirigyek organogenezisében a proliferáció, az apoptózis és a cytodifferenciálódás együttesen jelenlévő, összehangolt folyamatok, amelyeket térben és időben differenciálisan expresszálódó és ható faktorok irányítanak. A részleteiben csak rágcsálóknál ismert morfogenezis összes stádiumára intenzív epitéliális proliferáció jellemző, apoptózis csak a lumenképződésnél jelentkezik. A nyálmirigyekkel kapcsolatos in vitro differenciációs vizsgálatok egyik széleskörben alkalmazott modellje a HSG (Human Salivary Gland) sejtvonal, mely egy irradiált szubmandibuláris nyálmirigy interkaláris duktuszaiból származik. In vitro kísérletes rendszerekben a HSG sejtek differenciálódnak bazális membrán-extraktum, Matrigel®, vagy laminin hatására. A folyamatot kísérő morfológiai átalakulás és a differenciált sejtalakokra jellemző szekretoros fehérjék expressziós változásai is nyomonkövethetők. A tenyésztés körülményeitől függően a HSG sejtek különböző morfológiai változásokat mutatnak: tiszta laminin aljzaton a sejtek diszkrét acinusokat formálnak, bazális membrán felületen nagy, duktális lumenű retikuláris hálózatot, acinotubuláris struktúrákat és acinusokat is képeznek. Úgy tűnik, hogy a funkcionális differenciálódást jelző markerfehérjék expressziója nincs egyértelmű korrelációban a morfológiai változásokkal, pl. a laminin felületén morfológiailag acinussá alakult HSG sejtek a duktusz-sejtekre jellemző cisztatint termelik. A bazális membrán-extraktumok felületén kifejezettebb az amiláz-expresszió növekedése függetlenül a kialakult struktúrák morfológiájától. 2
A HSG sejtek differenciálódását vizsgáló kísérletekből a legtöbb ismeretünk az első 72 óra morfológiai és génexpressziós változásairól vannak. Keveset tudunk arról, hogy meddig életképesek a kialakult, morfológiailag megváltozott struktúrák. Az embrionális élet organogenetikus folyamataiban teljesen differenciálatlan egyforma sejtekből strukturálisan és funkcionálisan érett szerv jön létre, melynek élettani működése a differenciálódott sejtalakok eltérő funkcióján alapszik. A HSG sejtvonal, mint modellrendszer alkalmazásával továbbra is kérdés maradt, hogy a beindult morfológiai és funkcionális változások elérnek–e egy terminálisan differenciálódottnak tekinthető állapotot. A HSG sejtek immortálisak, differenciálatlan populációik folyamatos sejtosztódásra képesek. Bár többen beszámoltak az acináris differenciálódás következtében mérséklődő proliferációról, arról kevés ismeretünk van, hogy az előrehaladó folyamatban vajon megmarad-e a sejtvonal halhatatlansága. Az HSG sejtvonal differenciálódása, bár modellértékű, terápiás jelentősége azonban kevés a sejtvonal immortális sajátságai miatt. A károsodott nyálmirigyszövet regenerálásának egyik felmerülő lehetősége a kívülről bejuttatott szövetpótlás. Ez az igény indokolja a valódi nyálmirigyszövetekből nyert sejtek in vitro differenciációs sajátságainak tanulmányozását. Eddig kevés próbálkozás történt nem neoplasztikus eredetű humán szubmandibuláris nyálmirigy-sejtkultúra létrehozására. A Tran és munkatársai által létrehozott huSMG primer tenyészet, műtétileg eltávolított egészséges (nem daganatos, nem gyulladt és nem irradiált) emberi szubmandibuláris nyálmirigyből származik és hosszútávon fenntartható in vitro körülmények között. A huSMG sejtkultúra szövettani karakterüket tekintve duktális sejtekből áll, melyek epitéliális markerfehérjéket expresszálnak. Megfigyeléseink szerint a huSMG sejtek passzálhatósága nagyon kis hatásfokú és differenciációs kísérletekre kevéssé alkalmas. Érdemesnek tűnt kidolgozni egy olyan izolálási és tenyésztési eljárást, mely a huSMG sejtekhez hasonlóan egészséges humán nyálmirigyből indul ki, azonban passzálható és differenciáltatható sejteket eredményez. Ehhez célszerűnek láttuk -szemben a huSMG egyneműségével – egy heterogén összetételű primer tenyészet létrehozását: ez a PTHSG (Primary Total Human Salivary Gland).
Célkitűzések Munkánkban a HSG sejtvonal differenciálódását hosszútávon követtük nyomon; a sejtek sorsát az elköteleződéstől a terminális állapotig vizsgáltuk. Tanulmányoztuk a primer eredetű humán nyálmirigysejtek túlélését és differenciálódását plasztikon és bazális membrán extraktumok környezetében. Kísérleteinket az alábbi szempontok szerint terveztük: 3
1. A HSG sejtvonal morfológiailag legreprodukálhatóbb acinus-struktúrájának kialakítása Matrigel® környezetében 2. A kialakult HSG acinusok proliferációjának, túlélésének és apoptózisának vizsgálata 3. A differenciálódás időbeli és szerkezeti végpontjának meghatározása 4. A differenciációs folyamat reverzibilitásának tanulmányozása 5. A főbb jelátviteli utak aktiválásának, illetve gátlásának differenciálódásra gyakorolt hatásának vizsgálata
6. In vitro differenciációs modell kidolgozása humán szubmandibuláris nyálmirigyszövetből (PTHSG sejtkultúra) 7. Az alap- és a differerenciáltatott PTHSG tenyészet proliferációs sajátságainak vizsgálata 8. A morfológiai differenciálódás dinamikájának nyomonkövetése 9. A
differenciáltatott
humán
nyálmirigysejtek
fehérje-
és
génexpressziójának
tanulmányozása
Anyagok és módszerek •
A kísérletekhez használt sejttenyészetek (PTHSG, HSG) létrehozása és fenntartása
•
HSG és PTHSG sejtek differenciáltatása extracelluláris mátrix komponenseket tartalmazó közegben (Matrigel®, Basal Membrane Extract)
•
Proliferációs aktivitás mérése (3H-timidin-inkorporáció, MTT- és XTT redukció)
•
Apoptózis-detektálás (annexin V-flow (áramlási) cytometria és kaszpáz-3 aktivitásmérés)
•
RNS izolálás, cDNS készítés, real time (valós idejű) PCR
•
Immunhisztokémiai festések (fluoreszcens, konfokális, fénymikroszkópos)
•
Videómikroszkópia
•
Sejtek jelátviteli útjainak farmakológiai gátlása
•
Statisztikai elemzés
4
Eredmények I. A HSG sejtek vizsgálatainak eredményei A HSG sejtek morfológiai változásai és sorsa plasztikon és Matrigel®-ben A humán szubmandibuláris nyálmirigy eredetű HSG (Human Salivary Gland) sejtek plasztik aljzaton epitéliális monolayert alkotnak és folyamatosan proliferálnak. Növekedési faktorcsökkentett Matrigel®-be helyezve a HSG sejtek 24 órán belül gömbszerű struktúrákat formálnak, a sejtek felszínén mikrovillusok jelennek meg. A szférikus struktúrák a tenyésztés 4. napjára 10-12 granulált sejtből állnak, acinus-szerű morfológiát mutatnak, a sejthalmazokban lumen képződik. A Matrigel®-ben kialakult acinusokat konfokális mikroszkóppal vizsgálva amiláz-expressziót tapasztaltunk. A tenyésztés 5. napján az acináris struktúrák szétesnek, a sejtek összezsugorodnak. A propidium-jodiddal jelölt sejtmagok konfokális mikroszkópos felvételei fragmentált kromatin-állományt mutatnak, szemben az azonos ideig plasztikon tenyésztett HSG sejtek homogén magállományával. A 3 napig Matrigel®-ben növesztett HSG sejteket az acináris struktúrák épségének megőrzésére ügyelve izoláltuk a Matrigel®-ből, majd az acinusokat friss Matrigel®-be keverve új tenyészeteket hoztunk létre. A friss Matrigel®-ben az acinusok 2-3 nap múltán szintén szétestek, hasonlóan az átültetés nélkül 5-6 napig Matrigel®-ben tenyésztett testvérkultúrákhoz. Amennyiben nemcsak a Matrigel®-t emésztettük el az acinusok környezetéből, hanem magukat az acinusokat is sejtjeikre izoláltuk, majd az így nyert egyedi sejtekből álló szuszpenziót plasztik aljzatra szélesztettük, a HSG sejtek eltérően viselkedtek attól függően, hogy előzőleg mennyi időt töltöttek Matrigel®-ben. A megelőzően 3 napig Matrigel®-ben nevelt sejtek egysejt-rétegben (monolayerben) letapadtak a plasztik aljzatra, újra differenciálatlan, epitéliális morfológiát mutattak, míg a 6 napos acinusokból származó HSG sejtek nem proliferáltak tovább, a tenyésztőfolyadékban lebegő, elpusztult sejteket találtunk. A HSG sejtek proliferációs dinamikája plasztikon és Matrigel®-ben A plasztikon és Matrigel®-ben nevelt sejtkultúrák proliferációs dinamikáját XTTéletképességi teszttel követtük. A plasztik-kultúrák növekedési görbéje az immortális sejtvonalakra jellemző lefutást mutatta; a sejtszám gyorsan növekedve eléri a konfluens (egybefüggő) tenyészetekre jellemző értéket, majd a növekedés a kontakt-gátlás következtében mérséklődik, ezt követően pedig kissé visszaesik. A Matrigel®-ben tenyésztett HSG kultúrák proliferációs dinamikája ettől nagyon különböző. A tenyésztés első három 5
napján a sejtszám-növekedés hasonló mértékű, bár mérsékeltebb, mint a plasztikon nevelt testvértenyészeteké, tehát a sejtek proliferációs fázisban vannak. A 4. napon a növekedés észrevehetően lelassul, majd a sejtszám erőteljesen visszaesik az 5. illetve a 6. napra. Megfigyeléseink a fentebb tárgyalt morfológiai változásokkal egybevetve valószínűsítik, hogy a HSG sejtek a Matrigel®-ben előbb proliferálnak és differenciálódnak, majd ezt gyors sejthalál követi. A tríciált timidin inkorporációs mérések eredményei azt mutatják, hogy a plasztikon és Matrigel®-ben nevelt HSG sejtek DNS szintézise az első sejtciklusban (20 órán belül) nem különbözik, viszont jelentősen kisebb mértékű az izotóppal jelölt timidin beépítése a Matrigel®-es kultúráknak a tenyésztés 26. órájában, 2., illetve 3. napján. Vizsgáltuk a Matrigel®-ből egyedi sejtekre izolált és plasztik aljzatra visszaültetett HSG acinusok
proliferációs
aktivitását
is.
Azonos
sejtszámmal
kiültetett
plasztik
testvértenyészeteket létrehozva differenciálatlan HSG sejtekből (kontroll) és a 3 napos HSG acinusokból nyert egyedi sejtszuszpenzióból, azt tapasztaltuk, hogy az előzőleg Matrigel®ben nevelt sejtek DNS-szintézise 98,4±4,3 %-a volt a kontrollnak. A 6 napig Matrigel®-ben növesztett HSG acinusokból származó egyedi HSG sejteknek nem volt mérhető DNSszintézise plasztikra való kiültetés után. Apoptózis detektálása a Matrigel®-ben tenyésztett HSG sejtkultúrákban Annexin- V-FITC flow cytometria Az apoptotikus sejtek membránján a foszfatidil-szerin externalizálódik, így a hozzá specifikusan kötődő fluoreszcensen jelölt annexint mérni tudjuk flow cytometria segítségével. A plasztikon nevelt HSG sejtkultúrák annexin kötődése nagyon alacsony volt a kultúra 5. és 6. napján is. A Matrigel®-es tenyészetekben az Annexin-V-FITC-pozitív sejtek aránya a tenyésztés idejével párhuzamosan nőtt. Ezekben a tenyészetekben az annexin pozitív sejtek között a magas fluoreszcencia-intenzitású populációt alkotó sejtek száma szintén jelentősen emelkedett a Matrigel®-ben töltött napokkal. Survivin mRNS- és fehérje-szint változásának vizsgálata Az antiapoptotikus fehérjék családjába tartozó survivin mRNS expresszió-változását kvantitatív RT-PCR-rel követtük nyomon. A 3 napos Matrigel®-ben differenciáltatott HSG tenyészetek survivin-mRNS szintje hasonlóan alakult az azonos korú plasztik-kultúrákéhoz. A Matrigel®-ben töltött 5 nap után a sejtek survivin-szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, 6
mint az 5 napig plasztikon nevelt HSG sejteké. A fluoreszcens immunlokalizációs vizsgálataink szerint a differenciálatlan, plasztikon növesztett HSG sejtekben a survivin fehérje a sejtmagokban és a citoplazmában egyaránt megtalálható, ezért a zölddel jelölt survivin és a magok piros propidium-jodid festése együtt narancssárgán jelenik meg. A Matrigel®-ben differenciáltatott 4 napos HSG acinusokban a survivin fehérjét már csak a citoplazmában lehetetett detektálni, míg a 6 napos széteső acinusok survivin-negatívak voltak Kaszpáz-3 aktivitás mérés A programozott sejthalál egyik effektor enzime a kaszpáz-3. A Matrigel®-ben differenciáltatott HSG-tenyészetekben mért kaszpáz-3 enzimaktivitás a survivin-szint változással fordított arányban alakult. Az azonos korú plasztik-kultúrákkal összevetve (100±49 %) az 1 és 2 napos Matrigel®-es tenyészetek kaszpáz-3 aktivitása nem változott jelentősen (rendre 79±5 % és 175±72 %); a 3 napig Matrigel®-ben tartott kultúráké viszont szignifikánsan nőtt (446±11 %, p<0,01, n=3-3), ami kaszpáz-3 függő apoptózisra utal. Szignalizációs útvonalak farmakológiai gátlása a plasztikon és Matrigel®-ben tenyésztett HSG sejtekben A főbb jelátviteli útvonalak blokkolásával a HSG sejteken a Matrigel® által kiváltott proliferációs és apoptotikus hatásokat próbáltuk befolyásolni. A különböző inhibitorokat 3 ill. 5 napig alkalmaztuk Matrigel®-es és plasztik -HSG tenyészeteken. A sejtek morfológiai változásait fénymikroszkóppal, a proliferációs aktivitásuk alakulását XTT-assay-vel követtük. Az egyes inhibitorok hatása a kezelési idő függvényében nem változott, 3 vagy 5 napig alkalmazva a gátlószereket, azok hasonlóan befolyásolták a HSG sejtek életműködéseit. A PKC enzimek és NFκB gátlása jelentős csökkenést idézett elő mind a plasztikon, mind pedig a Matrigel®-ben
nevelt HSG sejtek proliferációjában a kezeletlen kontroll-
tenyészetekével összevetve. Az NFκB által kiváltott növekedés-gátlás sokkal hangsúlyosabb volt a Matrigel®-es kultúrákon, mint az azonos módon kezelt plasztik-tenyészeteken (interakció: p<0,001). PI3K–gátlás esetén a sejtszám-növekedés szignifikánsan visszaesett plasztikon, míg Matrigel®-ben nem változott. Az MMP-inhibtor jelenléte a plasztikon tenyésztett HSG sejtek osztódását nem befolyásolta, a Matrigel®-es kultúrákban viszont sejtszám-növekedést idézett elő. A tyrosin-kináz gátlószer alkalmazásakor a plasztikkultúrákban mérsékelten csökkent a proliferáció, míg a Matrigel®-ben nevelt sejtek száma jelentősen nőtt, csillapítva a Matrigel® fentebb említett proliferáció-gátló hatását.
7
II. A PTHSG sejtek vizsgálatának eredményei PTHSG (Primary Total Human Salivary Gland) tenyészet készítése A PTHSG tenyészetek létrehozásához szájsebészeti műtéteken kiemelt egészséges (nem gyulladt, nem daganatos és nem besugarazott) humán szubmandibuláris nyálmirigy-szövetet használtunk. A szövetminták a mechanikus aprítása és az enzimatikus emésztés után több centrifugálás következett, majd tenyészedényekbe helyeztük a sejtszuszpenziót, mely a kiültetés pillanatában főleg tápfolyadékban lebegő sejtaggregátumokból állt. Primer tenyészetekben (0. passzázsú, a továbbiakban: p0) az egyedi sejtek kitapadása után azok klonális elszaporodását figyeltük meg, terjeszkedő, kiterült epitéliális mezőket eredményezve. A sejtkultúra 4. napján a PTHSG sejtek diszkrét, összefüggő foltokat alkottak, melyben a sejtek macskakő-szerű, epitéliális karaktert mutattak, környezetükben gyakran elnyúlt, fibroblaszt-jellegű sejteket találtunk. A tenyésztés 7. napjára a PTHSG primer kultúrák kb. 70 %-os konfluenciát értek el; a tenyészetek elsősorban egy-sejtrétegűek voltak, elszórtan 3dimenziós sejthalmazok képződtek az epitéliális mezők felületén. A PTHSG sejtek 1. passzázsából származó kultúrák hasonló külső jegyeket mutattak mint a primer tenyészetek (p0), azonban 3-dimenziós sejthalmazokat már nem találtunk. A 2. és 3. passzázsú PTHSG kultúrákban a fibroblaszt-jellegű sejtek aránya megnőtt az epitéliális sejtekéhez képest. A PTHSG primer-és további szubkultúráinál is kb. 30 nap tenyésztési idő után a tenyészetek elöregedését figyeltük meg, a sejtek elvesztették a kapcsolatot egymással és a letapadási felszínnel. PTHSG sejtek differenciálódása bazális membrán extraktumok (BME) felületén A növekedési-faktor-csökkentett BME felületén az 1. passzázsból származó (továbbiakban p1) PTHSG sejtek gömbölyded, acino-tubuláris struktúrákat alkottak a kiültetést követő 24 órán belül. Videómikroszkópos kísérleteink megmutatták, hogy a sejtek a szélesztést követően sebesen migrálnak a BME aljzaton, gyorsan kis aggregátumokat formálnak, melyek acino-tubuláris alakzatokká fejlődnek. A következő napokban a PTHSG sejtek további mozgását lehetett megfigyelni. A sejtaggregátumok, függetlenül az alkalmazott BME koncentrációjától, hasonló struktúrát mutattak. A paraffinos metszeteken hematoxilin-eozin festéssel lumennel rendelkező duktális hálózatokat és acináris struktúrákat láthattunk.
8
A PTHSG sejtek proliferációja plasztikon és BME-aljzaton Öt különböző páciensből származó szövetmintán végrehajtott független kísérletek szerint a BME felületén 3 napos tenyésztés után a sejtek proliferációja jelentősen visszaesett a plasztikon nevelt testvérkultúrákéhoz képest. Egy másik kísérleti felállásban közvetlen sejtszámlálással hasonlítottuk össze a PTHSG sejtek 1. és 3. passzázsából származó plasztik-tenyészeteinek sejtosztódási aktivitását. Az 1. passzázsból származó PTHSG sejtek száma a tenyésztés 3. napjára 126±12 %-kal nőtt, ehhez hasonló eredményt adtak a 3. passzázsból származó sejtek, ahol a sejtszám-növekedés 112±13 % volt. A PTHSG sejtek génexpressziója plasztikon és BME-aljzaton Összehasonlítottuk 5 beteg szubmandibuláris nyálmirigy-szövetének, illetve az azokból készített PTHSG tenyészetek 1. passzázsú, plasztikon nevelt sejtjeinek amiláz mRNS expresszióját. A plasztikon tenyésztett PTHSG sejtek közül 4 minta amiláz expressziója jelentős mértékben csökkent az eredeti nyálmirigyekből mért expressziós szinthez képest, egy esetben viszont nem tapasztaltunk szignifikáns változást. A plasztikon nevelt PTHSG sejtek 1. passzázsú tenyészeteinek amiláz mRNS expressziója változatos képet mutatott, 2 nagyságrend eltérés volt a különböző betegekből származó mintákban. További kísérleteinkben vizsgáltuk, hogy befolyásolja-e a BME felületén való tenyésztés az amiláz-, illetve egyéb nyálmirigyhez-kötődő gének (claudin1, claudin3, kallikrein, és a mezenchimális eredetű sejtekre jellemző vimentin) kifejeződését; és van-e ebben szerepe a felhasznált BME fehérje- koncentrációjának. Ehhez 1. passzázsú plasztikon, illetve BMEfelületen tenyésztett PTHSG kultúrákat használtunk, melyek 13 különböző betegből származó nyálmirigyből készültek. A statisztikai elemzést ANOVA módszerrel végeztük. Nem találtunk összefüggést a BME fehérje-koncentráció (9,1-17,1mg/ml) és a génexpressziós változások között (P=0,9935), ugyanakkor bizonyos mintákban erőteljes amiláz mRNS expressziós-szintnövekedést tapasztaltunk a BME-kezelés hatására. A többi gén expressziója széles határok közt változott a plasztikon és a BME felületen növesztett tenyészetekben. Ahhoz, hogy az egyes gének BME-kezelés hatására bekövetkező tendenciózus változásait elemezhessük, a különböző koncentrációjú BME típusokból és a különböző páciensekből nyert adatokat összevontuk, és az összes vizsgált génre megállapítottuk az expressziós-szint átlagos változását. Az amiláz expresszió szignifikánsan növekedett a BME felületen tenyésztett PTHSG sejtekben a plasztikon nevelt kultúrákéhoz képest, ugyanakkor nem 9
tapasztaltunk szignifikáns változást a többi vizsgált gén esetén (claudin1, claudin3, kallikrein és vimentin). A minták felében (azaz 6 különböző betegből előállított PTHSG sejtkultúránál) a BME kezelés hatására bekövetkező amiláz expresszió növekedésének nagyságrendje 1,5-nél kisebb volt, míg a többi 6 mintánál ez az érték 2,5-nél nagyobb. Ha ezt a két mintacsoportot elkülönítve vizsgáltuk a többi gén kifejeződésének mértékét, azt tapasztaltuk, hogy ahol az amiláz-szint fokozottabban növekedett, ott a claudin3-szint is megnőtt, a többi gén expressziós szintje viszont nem változott. Az amiláz-növekedésben kisebb értéket képviselő mintákban a claudin1 expressziós szintje lecsökkent, a többi gén kifejeződése változatlan maradt.
A primer (p0) PTHSG kultúrákban elszórva őssejt-niche-ekre (őssejt fészek) emlékeztető sejthalmazok alakultak ki, melyekben a többi sejttől eltérően jellegzetesen kicsi és denz sejtmagú sejtek némelyike CD34, illetve C-kit immunreaktivitást mutatott. A PTHSG primer tenyészeteit (p0) alkotó epitéliális sejteken erős amiláz–immunreaktivitást észleltünk, ugyanakkor egyazon kultúrában amiláz-negatív sejtcsoportokat is találtunk. Az 1. passzázsból származó PTHSG sejtek plasztik aljzaton csak elszórtan mutattak rendkívül gyenge amiláz-immunreaktivitást, míg a BME felületén növesztett PTHSG sejtekből kialakult acino-tubuláris struktúrák erősen amiláz-pozitívak voltak. Konfokális mikroszkóppal megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az egy-egy acináris struktúrát alkotó sejtek amilázexpressziója nem egységes, az erősen festődőek mellett találhattunk amiláz-negatív sejteket is. A passzázs-szám növekedésével párhuzamosan az immunhisztokémiailag azonosítható amiláz expressziója csökkent. A PTHSG sejtek 1. passzázsából származó BME- és plasztik aljzatú kultúrákon is kimutattuk az occludin jelenlétét, mely az epitéliális sejtekre jellemző sejtkapcsoló struktúrák (tight junction) egyik alkotófehérjéje. Az 1. passzázsú PTHSG sejtek plasztik aljzaton nőve erős vimentin immunreaktivitást mutattak, míg a BME felületén kialakuló globuláris struktúrák vimentin-negatívak voltak. A BME felületén acináris struktúrákká differenciálódott PTHSG sejtek némelyikén azonosítottuk az AQP5 fehérjét. A korábbi munkákkal megegyezően a humán nyálmirigyacinusokon az AQP5 az apikális plazmamembránon lokalizálódik, míg a duktális struktúrákon nem tudtuk kimutatni.
10
Következtetések Az immortális HSG sejtek (melyeket eddig az acináris differenciálódás in vitro modelljeként tartottak számon) Matrigel®-ben egyforma méretű és hasonló alakzatú diszkrét acinusokat formáltak. Proliferációjukban a plasztikon nevelt tenyészetekével összevetve először a sejtosztódás visszaesését, majd apoptózist tapasztaltunk, mely a tenyésztés 5.-6. napjára a sejtek összességét érintette. A programozott sejthalál folyamatában résztvevő szabályzó szerepű survivin és effektor–funkciójú kaszpáz-3 fehérjék mennyiségi változásait nyomon követtük. A HSG sejtekből kialakult acinusok apoptózisának reverzibilitása időhöz kötött; Matrigel®-ben töltött 3 nap után visszafordíthatatlan a sejtpusztulás. Eredményeink alapján a HSG sejtvonal csak korlátozott érvényű modell a nyálmirigysejtek differenciálódására. A szöveti specializálódás kezdeti lépéseit lehetővé teszi ugyan az extracelluláris mátrix-fehérjék környezete, viszont a tényleges szöveti strukturálódás nem következik be. A mutált p53 fehérjét tartalmazó HSG sejtek a körülményektől függően vagy a folyamatosan osztódó, elkötelezetlen állapotban vannak, vagy tömeges programozott sejthalát szenvednek el, ellentétben az in vivo nyálmirigyfejlődés során összehangoltan, időben és térben együttesen működő proliferációs és apoptotikus folyamatokkal. A valódi organogenezis sajátossága az egymás mellett létező eltérően specializálódó sejtek visszacsatoló kommunikációja, amely a monoklonális eredetű neoplasztikus HSG esetében nem valósul meg. Indokoltnak láttuk tehát egy olyan in vitro modell kialakítását, amely egészséges nyálmirigyek sejtjeiből építkezik. Törekedtünk a szövettani heterogenitás megtartására már a primer tenyészet létrehozásában is. A fej-nyaksebészeti műtétek során eltávolított ép szubmandibuláris nyálmirigyszövetből heterogén sejtösszetételű primer kultúrát (PTHSG) hoztunk létre. Az in vitro sejttenyésztési körülmények csak közelíteni tudják az ép szervezet dinamikusan változó körülményeit, ezért a heterogén sejtállományban inkább feltételezhető kompenzációs mechanizmusokat tartottuk a hosszútávon fenntartható differenciálódási folyamat kulcsának. Bazális Membrán Exraktum (BME) felületén az izolált PTHSG sejtek 24 óra alatt migrációval acinotubuláris struktúrákká alakultak, melyek szerkezete 6 napig dinamikusan változott. A BME környezetben tenyésztett sejtek proliferációja csökkent a plasztikon nevelt kultúrákéhoz képest. A PTHSG tenyészetek fehérje és génexpressziós változásait vizsgálva megállapítottuk, hogy progenitor sejtek és már differenciálódott epitéliális-, illetve mezenchimális sejtek is alkotják a kultúrát. Az extracelluláris mátrix-összetevők hatására kialakult acinotubuláris struktúrák elsősorban epitéliális sajátságúak. A differenciált 11
nyálmirigyekre jellemző szervezettség és specifikus fehérjék (amiláz, cisztatin, klaudin1, klaudin3, vimentin) expressziója a BME felületén indukálódhat, de a mértéke a donor nyálmirigytől is függ. Az extracelluláris mátrixfehérjék környezete valószínűleg a morfológiai szerveződés kezdeti lépéseit biztosítja. A heterogén sejtösszetétel ugyan lehetővé teszi a differenciálódott kultúra hosszútávú fenntartását, ugyanakkor megnehezíti az egyes sejtsorsok nyomonkövetését. A PTHSG sejtkultúra tehát modellje lehet az acinotubuláris szerveződés tanulmányozásának, differenciációs kapacitásából adódóan pedig alkalmas lehet a sejtpótlás és szövetregeneráció vizsgálatára. Kiterjedtebb mintagyűjtéssel és a donorok különböző paramétereinek figyelembevételével tisztázható lehet a regenerációs potenciál és a hosszútávú túlélés határa is.
Saját publikációk Az értekezéshez felhasznált közlemények Szlavik, V., J. Vag, K. Marko, K. Demeter, E. Madarasz, I. Olah, T. Zelles, B.C. O'Connell, and G. Varga, Matrigel-induced acinar differentiation is followed by apoptosis in HSG cells. J Cell Biochem, 2008. 103(1): p. 284-95. IF: 3,075 Szlávik, V., Szabó, B.,Vicsek, T., Barabás, J., Bogdán, S., Gresz, V., Varga, G., O, Connell B.C. and Vág, J. Differentiation of primary human submandibular gland cells cultured on basement membrane extract. Tissue Eng., 2008 –elfogadva IF: 3,725
Egyéb közlemények Kornyei, Z., V. Szlavik, B. Szabo, E. Gocza, A. Czirok, and E. Madarasz, Humoral and contact interactions in astroglia/stem cell co-cultures in the course of glia-induced neurogenesis. Glia, 2005. 49(3): p. 430-44. IF: 4,809 Racz, G.Z., A. Szucs, V. Szlavik, J. Vag, B. Burghardt, A.C. Elliott, and G. Varga, Possible role of duration of PKC-induced ERK activation in the effects of agonists and phorbol esters on DNA synthesis in Panc-1 cells. J Cell Biochem, 2006. 98(6): p. IF: 3,075 Nagy, K., V. Szlavik, G. Racz, G. Ovari, J. Vag, and G. Varga, Human submandibular gland (HSG) cell line as a model for studying salivary gland Ca2+ signalling mechanisms. Acta Physiol Hung, 2007. 94(4): p. 301-13. 12
