Projektszám: 85öu1
HUF EUR
Pályázó neve: Dr. Gácser Attila
Intézménye: Szegedi Tudományegyetem
Projektpartner neve: Prof. Dr. Karl Kuchler
Intézménye: Medizinische Universität Wien
Pályázat címe: Infektion und Immunantwort humanpatogener Pilze, Candida albicans und Candida parapsilosis. A projekt jellege: (kérjük bejelölni) Workshop, konferencia Publikáció, tananyag Kutatási együttműködés Oktatási program Beszámoló/Eredmények 1. célkitűzés: A Candida fajok által kiváltott szisztémás megbetegedések száma 30 év óta folyamatosan emelkedik. A génusz képviselői közül napjainkig 15-20 fajt írtak le humán patogénként. Ezek az élesztők elsősorban legyengült immunrendszerű egyéneket betegítenek, bőrfelszínt, nyálkahártyát érintő és szisztémás fertőzéseket (candidémia) kiváltva. A candidiázis leggyakoribb okozóiként 5 fajt emelhetünk ki (az izolálás gyakoriságának sorrendjében): a Candida albicans-t, a C. parapsilosis-t, a C. glabrata-t, a C. tropicalis-t és a C. krusei-t. A kezdeti vizsgálatok a C. albicans-szal (mint domináns fajjal) kezdődtek meg, így a legtöbb ismeret (a fertőzés lefolyásá, kezelés, stb.) ezzel az élesztővel kapcsolatban halmozódott fel. Az elmúlt egy évtized során a C. albicans elleni terápia hatékony alkalmazásával a fent említett fajok térnyerése volt jellemző. Az ezekkel kapcsolatos kutatások felhívták a figyelmet arra, hogy bár egy nemzetség tagjai, mégis bizonyos tulajdonságaikban (antifungális érzékenység, veszélyeztetett korcsoport, fagocitákkal való kölcsönhatásban szerepet játszó molekulák tekintetében) lényeges eltéréseket mutatnak. Ezek közül különösen a C. parapsilosis epidemiológiája tér el alapvetően a C. albicans-étól, ugyanis az előbbi faj az egy éven aluli, candidémiában szenvedő betegek körében kiemelten nagy arányban izolálható. A projekt során modellrendszerünkben igazoltuk, hogy az alkalmazott J774.2 makrofágok képesek fagocitálni és eliminálni a fertőzéshez használt C. parapsilosis GA1 törzs sejtjeit. A fertőzés 3. és 8. órájában elvégzett RNS microarray vizsgálat eredményei szerint egy transzmembrán fehérje, a Tnfrsf9 génjének transzkripciója szignifikánsan megemelkedik. A fehérje szerepét eddig bakteriális fertőzésekben igazolták, és a CD4+ T-sejtek kostimulátoraként azonosították. Munkánk során megfigyeltük, hogy a különböző C. parapsilosis izolátumok virulenciája bizonyos kísérletekben eltérést mutat. C. albicans-ban a jelenség ismeretes, és gyakran genetikai különbségekkel párosul, C. parapsilosis-ban azonban ez kevéssé vizsgált. A különböző izolátumok molekuláris különbségeinek feltérképezése céljából össesen három (egy klinikai és két környezeti) izolátum kariotipizálása és teljes genom szekvenciájának meghatározása mellett döntöttünk. Ezek a kísérletek folyamtban vannak. Mivel az említett kostimulációs molekulák az interakció későbbi időpontjában jutnak szerephez, ezért az RNS kivonást a fertőzés 24. órájában is elvégeztük, és adatainkat ezzel illetve a fertőzés során az egyes citokinek expressziójában bekövektező változások vizsgálatával egészítettük ki. A makrofágokat nem csak a C. parapsilosis GA1 izolátumával, hanem ennek szekretált lipázokra (LIP1 és LIP2) nézve deléciós törzsével is indukáltuk, annak kiderítésére, hogy ezek az enzimek betöltenek-e valamilyen szerepet a fertőzés során. A munkám során tehát RNS-t izoláltam a gazda sejtekből, ezekből cDNS-t írtam és qRT-PCR analízist végeztem a célszekvenciákra (CD83, IL1b, IL15, PTGS-2,
TNFa és TNFRSF9) tervezett primerek felhasználásával. TNFRSF9 gén expressiójának vizsgálata primer sejteken GA1 és lipáz mutáns törzzsel történő indukciót követően. A modellrendszerünk továbbfejlesztése érdekében Prof. Karl Kuchler csoportjával együttműködve kidolgoztunk egy primer csontvelőből differenciáltatott rendszert. Ebben az in vitro fertőzési modellben kívánjuk vizsgálni a későbbiekben a természetes immunválaszban szerepet játszó molekulák működését C. prapsilosis fertőzések során.
J774.2 makrofágok CD83, IL1β, IL15, PTGS-2, TNFα, TNFRSF9 génjeinek regulációja C. parapsilosis GA1 (kék oszlopok) törzzsel történő kölcsönhatás eredményeként a fertőzés 3., 8. és 24. órájában az aktuális időpont nem fertőzött kontrolljához (zöld oszlop) viszonyítva. A grafikonokon a nem fertőzött kontrollra vonatkoztatott szignifikancia értékek kerültek feltüntetésre.
C. parapsilosis GA1 törzzsel indukált J774.2 makrofágok áramlási citometria analízise flourofórral fikoeritrinnel konjugált anti-Tnfrsf9 antitesttel való jelölést követően. Az „A” panel a hisztogramokat a „B” panel az ezeken adatokból számított relatív fehérjemennyiségeket ábrázolja a 0 órás kontrollra normalizálva. Az RNS kivonási protokoll optimalizálása során minőségű, és a gazda valamint az élesztő tartalmazó minta izolálásának kulcslépése egyrészt másrészt a gazda sejtek feltárás előtti kezelése. továbbítása megtörtént. Előzetes vizsgálatok szerint a szekvenálása megkezdődött Prof. Karl Kuchler laboratóriumában.
úgy találtuk, hogy a megfelelő transzkriptómot megfelelő arányban a megfelelő sejtszám alkalmazása Az RNS izolálása, és a minták minták jó minőségűek. Az RNS
2. célkitűzés.
Általánosan a Candida fajok okozta fertőzések kezelésére különböző azolokat, echinokandinokat és bizonyos súlyosabb esetekben amphotericinB-t alkalmaznak. Ezen antimikotikumok ellen a gombák több módon is képesek védekezni, mely rezisztencia kialakulásához vezet. Egyik ilyen rezisztencia mechanizmus a különböző efflux pumpák megjelenése a sejtek membránján. C. albicansban a CDR1 és CDR2 gének termékeit azonosították, mint azol és amphotericinB rezisztenciáért felelős ABC-transzportereket. Míg C. albicansban az efflux-pumpák kutatása előrehaladott, addig C. parapsilosisban egyelőre nem jelentős ezen terület felderítettsége. A Candida parapsilosis GA1 vad típusú klinikai törzsből kiindulva hoztunk létre targetált deléciós módszerrel a CDR1-2 deléciós mutáns törzseket. A deléciós kazetta létrehozásához amplifikáltuk: a CDR2 gén upstream régióját, , valamint a CDR1 gén downstream régióját. Az így nyert amplikonokat pSFS2 vektorba klónoztuk a megfelelő hasító helyekre. Az így létrehozott deléciós kazetta felépítése a következő:
1. A genomba integrálódott deléciós kazetta felépítése az up- és downstream homológ szakaszok rekombinációját követően. 2. A maltóz promóter indukálása után az FLP enzim eliminálja a deléciós kazettát a genomból az FRT régiók mentén.
Southern hibridizációval ellenőriztük a transzformánsokban a helyes integrációt: genomi DNS ScaI emésztése esetén a zöld négyzettel jelölt próba a megadott méret magasságában volt detektálható a háromféle genotípusú törzs esetén. Az így létrehozott CDR1-2 heterozigóta és homozigóta deléciós törzsek flukonazol, caspofungin és amphotericinB érzékenységének tesztelésével folytattuk a munkát. Ehhez az NCLSI által kiadott M27-A3 kódú protokollt alkalmaztuk. A MIC érték meghatározás során használtunk két referencia törzset (ATCC22019, ATCC6258) az antimikotikumok minőségi kontrolljának érdekében. Eredményeink azt mutatták, hogy a vad típusú és a heterozigóta deléciós mutáns törzsünk MIC értéke flukonazolra 0,5 µg/ml volt, caspofunginra pedig 4 µg/ml. A homozigóta deléciós mutáns törzs MIC értéke flukonazolra 0,25 µg/ml, caspofunginra pedig 2 µg/ml volt. Amphotericin B esetében mind a három törzs MIC értéke 0,25 µg/ml volt. J774.2 egér eredetű makrofág sejtvonal segítségével vizsgáltuk a törzseink (C. p. WT GA1, C. p. CDR1-2 Heterozigóta és C. p. Homozigóta deléciós mutáns) gomba eliminációs folyamatokkal szemben mutatott érzékenységét. Érdekes módon mind a homozigóta és mind a heterozigóta mutáns hatékonyabban volt képes túlélni a J774.2 sejtvonal eliminációs mechanizmusait. Az eredményeket az alábbi diagramm mutatja be.
A calcein-acetoxi-metilészter egy membrán permeábilis festék, amely ebben a formában nem mutat zöld fluoreszenciát. A permeabilitási tulajdonsága miatt azonban könnyen átjut a plazmamembránon, ahol az ott található észterázok lehasítják az acetoxi-metil csoportot, ez által a calcein membrán permeabilitása megszűnik, így felhalmozódik a sejtek citoplazmájában, valamin az észter kötés hasadását követően a calcein zöld színű fluoreszenciát mutat, amelynek intenzitása áramlási citometriás módszerekkel elemezhető. A sejtekben felhalmozódó calcein az észter kötés hasadását követően kizárólag bizonyos ABC-transzporterek segítségével juthat ki a sejtből. Az ilyen típusú pumpa aktivitás jellemző például az emberben található MDR1-transzporterre, valamint a Saccharomyces cerevisiae PDR5-transzporterére. Kísérleteink során vizsgáltuk, hogy a calcein mely törzsünkben halmozódik fel nagyobb mértékben. Ennek érdekében C. parapsilosis WT és C. parapsilosis CDR1-2 KO mutáns törzsünket festettük calceinnel. A 11. ábrán látható, hogy a C. parapsilosis CDR1-2 KO mutáns törzsünk körülbelül 4X erősebben festődött a vad típusú törzshöz képest, amely festődés jellemző a már említett MDR1-et és PDR5-öt nem expresszáló sejtek festődésére. Ezen adatok szerint az általunk deletált CDR1-2 gének olyan fehérjét kódolnak, amely calcein festéssel jellemezhető funkcionális szerkezete alapján az ABCB-transzporter családba tartozik az MDR1- és PDR5-transzporterekhez hasonlóan.
A vizsgálatok kiteljesedéséhez szükségünk van reintegrációs mutánsok létrehozására. Ennek kivitelezése mindezidáig technikai nehézségekbe ütközött. Ennek kiküszöbölésére Prof. Karl Kuchler laboratóriumában alkalmazott módszert sajátítottuk el és a jövőben az in vivo rekombinációs technika alkalmazásával kívánjuk a targetáló vektorainak előállítani. Publikációs jegyzék: Publikáció:
HUF EUR
Projektnummer: Antragsteller: Dr. Attila Gácser
Institut: University of Szeged
Projektpartner: Prof. Dr. Karl Kuchler
Institut: Medizinische Universität Wien
Titel: Infektion und Immunantwort humanpatogener Pilze, Candida albicans und Candida parapsilosis. Art der Förderung: Workshop, Konferenz Publikation, Lehrmaterial Forschungsprojekt Unterrichtsprojekt FINAL REPORT “Infektion und Immunantwort humanpatogener Pilze, Candida albicans und Candida parapsilosis.” AIM 1. Establish novel or further improved in vitro infection models for C. parapsilosis Introduction Candidiasis is the most commonly diagnosed yeast related infection worldwide. Symptoms ranges from superficial, mucosal - to life-threating systemic infections. These yeasts are the fourth most common cause of hospital-acquired bloodstream infections in the US. Newborns with low birthweight, patients getting intensive steroid treatment or having impaired immune response (neutropenia or HIV-infection) are particularly endangered. Candida species can persist in hospital environment for a long time, therefore prolonged medical attendance is also considered as a predisposing factor. Although the predominant species is still C. albicans, other members of the genus like C. parapsilosis, C. glabrata and C. tropicalis are isolated more and more often in our days. Depending on the geographic area and the timeperiod of the given study C. parapsilosis sometimes outranks even C. albicans. Furthermore C. parapsilosis infections are often related to children under the age of two. The distribution of this yeast can exceed 66% in this age-group. Despite its increasing clinical relevance little is known about its interaction with the host and the mechanisms playing role in the recognition and elimination of the pathogen. To fill this gap an in vitro modell system was introduced to study the physiological and transcriptional changes of the host in the presence of C. parapsilosis. The response of J774.2 murine macrophages given to C. parapsilosis was observed by flow cytometer, scanning electron microscope, flourescent microscope and confocal fluorescent microscope. It was established that J774.2 macrophages uptake C. parapsilosis cells . Phagosome-lysosome colocalisation and elimination of the yeasts also occurs. Based on these results, microarray analysis was performed with the host RNA isolated at three and eight hour postinfection. Genes taking part mostly in wound healing, stress or immune response were upregulated. Six genes were choosen to validate the microarray results by qRT-PCR. The overexpression of CD83, IL1β, IL15, TNFα, and interestingly TNFRSF9 (a gene of transmembrane protein, a costimulatory molecule) and PTGS-2 (gene of a cytoplasmic enzyme responsible for prostaglandin biosynthesis) genes were examined and confirmed in samples from three different timepoints, 3, 8 and 24 hour by qRT-PCR (Figure 1). Flow cytometry analysis established that C. parapsilosis was able to increase the level of the functional protein on the surface of the phagocytes compared to the control (0 h) (Figure 2). However J774 macrophages are often used cells for studying host-pathogen interactions they have an altered cellcycle that can affect immune precesses (recognition, signal transduction, cytokine production etc.) too. The Introduction of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) and bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) in the model instead of cell lines would provide an alternative. Many articles reported RNAseq as the novel method for studying transcriptional changes in host – pathogen interactions nowadays. We decided to apply this new method for examining the transcriptional profile of primary mouse phagocytes (instead of cell lines) upon infection with C. parapsilosis. This approach could give us a more accurate understanding of the networks involved in recognition of this pathogenic yeast. To perform these experiments, the isolation of BMDMs/BMDCs and the basics of the RNAseq data analysis must have been acquired.
Working in collaboration with the Medical University Vienna was a wonderful opportunity. Professor Karl Kuchler is one of the greatest and most acknowledged scientists on the field. It was an honor to acquire all these techniques from his laboratory where these methods are used routinely. During this period we studied not only how to isolate and differentiate cells from mouse bone marrow but also how to make specific cell lines to produce macrophage- and granulocyte-monocyte colony stimulating factor (M-CSF and GM-CSF) that are essential elements of the differentiation procedure. We developed acquainted with an optimised protocol for isolating RNA from mouse phagocytes and with the basics of raw RNAseq data analysis. To do so we joined to an ongoing RNAseq project to follow every steps of the data analysis from the quality check to the expression normalisation. AIM 2. Identify and compare fungal and host factors necessary or required for virulence and the pathogenic switch for C. parapsilosis Introduction The incidence of invasive fungal infections has significantly increased over the past 30 years, with the Candida genus representing the most common cause of disease. Candida parapsilosis is now the second or third most common cause of bloodstream infections in intensive care units. Triazoles are commonly used to combat diverse forms of candidiasis. The prolonged and frequent use of azoles drugs has led to the development of multidrug resistance (MDR) mechanisms in Candida. Several mechanisms have been characterized that contribute to MDR in these yeasts. One of these mechanisms is the overexpression of efflux pump proteins that function as ATP-binding cassette (ABC) and major facilitator superfamily (MFS) transporters. Major C. albicans ABC-transporters involved in azole resistance are candida drug resistance protein 1 and 2 (Cdr1p, Cdr2p). Previous work In contrast of the well studied C. albicans ABC-transporters, little is known about the role of CDR genes in Candida parapsilosis. To clarify the significance of CpCDR, we have generated C. parapsilosis CDR1CDR2 (CpCDR1-CDR2) double deletion mutant (Figure 3 and Figure 4) and determined the minimal inhibitory concentration (MIC) for amphotericin B, fluconazole and caspofungin. Our results showed decreased MIC for fluconazole and caspofungin, respectively. Flow cytometry experiments using calcein dyeing was performed to determine the structure specificity of Cdr1p and Cdr2p beside the ABC-transporter superfamily. Our data demonstrated that the double deletion mutants were stained on a higher level than the wild type, respectively (Figure 5). This staining feature is typical to a mammal ABC-transporter called MDR1. The knock out mutants showed similar sensitivity against osmotic and oxidative stress to that of the wild type. Interestingly, the killing of CDR1-2 deletion mutant yeasts by murine monocyte-like cells (J774.2) was significantly decreased relative to WT. Furthermore, we showed that CDR1-2 deletion yeast cells were more resistant against the host killing mechanisms during infection of A/J mice, suggesting an involvement of these transporters in the pathobiology of the fungus. To support our interesting findings reconstructed mutants are required to be generated. For the generation of these mutants four plasmid construct has to be constructed. We selected different techniques to reintroduce the original CDR genes: 1; targeting the original locus, or targeting the C. parapsilosis RP10 locus; 2; vector construction with CDR1, or CDR2. As generation of reconstruction plasmids using the conventional restriction enzyme digestion-ligation method failed, thus in the frame of this project we applied a new strategy for plasmid construction. At the Medical University of Vienna, the laboratory of Karl Kuchler a novel cloning method is used to generate plasmids, termed in vivo cloning. Applying the new method we designed targeting fragments using PCR. Later the purified, appropriate fragments with overlapping ends were mixed and Saccharomyces cerevisiae cells were transformed with mixed fragments. In transformants containing all of the required fragments the plasmids were constructed by recombination system of S. cerevisiae. As all of reconstruction plasmid contains CaSAT1 cassette, nourseothricin were used for selection of transformants. Ready plasmids were rescued from transformant cells and E. coli cells were transformed with rescued plasmids. Using this method the RP10 targeting plasmids were successfully rescued from transformant S. cerevisiae and fragment parts of original locus targeting plasmids were amplified. This work will be continued in the Hungarian laboratory by generating the reconstructed C. parapsilosis mutants.
Figures:
Fig1. Fig 1. Validation of RNA microarray data by using Quantitative Real-Time PCR. J774.2 cells were co-incubated with C. parapsilosis for 3 or 8 h at a ratio of 1:5 and the expression of IL1-b, IL-15, TNFa, CD83, PTGS-2 and TNFRSF9 was determined by qRT-PCR. Data are normalized to uninfected control samples and indicate mean fold change ± SEM of three independent replicates. Cp, C. parapsilosis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Fig 2. Interaction with Candida parapsilosis promotes the overexpression of TNFRSF9 protein by J774.2 cells. J774.2 cells were co-incubated with C. parapsilosis for 12, 24 or 36 h and the expression of TNFRSF9 (CD137) on macrophages was analyzed by flow cytometry following staining with PE-conjugated anti-mouse CD137 Ab. (A) histogram of expression of TNFRSF9 on J774.2 cells, (B) mean fluorescence intensity levels normalized to the uninfected control.
Fig 3. Structure of the CDR gene-targeting vector to generate knock out mutants in C. parapsilosis
Fig 4. Southern blot analysis of CDR1-2 knock out generation in C. parapsilosis GA1 strain
Figure 5. FACS analysis of the CDR1-2 mutants and the wild type strain. Flow cytometry experiments using calcein dyeing was performed to determine the structure specificity of Cdr1p and Cdr2p beside the ABCtransporter superfamily.
Publikationsliste: Publikationsverzeichnis:
Abschlußbericht Weitere Fragen zu den Ergebnissen: 1. Nutzung und Verbreitung der Ergebnisse: Welchen konkreten Nutzen konnten Sie und Ihr Kooperationspartner aus dem Projekt gewinnen. Bitte denken Sie insbesonders an Publikationen, Experimente, gemeinsame Seminare, Sommerschools und/oder an eine anderweitige Umsetzung in die Praxis. Wir haben gemeinsame Seminare organisiert. Unsere Forschungsgruppe hat mehrere Methoden gelernt und wir haben ein gemeinsames EU Projektantrag organisiert (ImResFun Marie Curie ITN).
2. Durchführung: Welche konkrete Änderungen gegenüber der Planung ergaben sich hinsichtlich Inhalte und Mitarbeit/Anzahl der Teilnehmer während des Projektverlaufes? Wegen Renovierungsarbeiten in unserem Forschungsgebäude waren einige besuche von Karl Kuchler’s Lab verschoben, diese Forschungsvisite werden von andre Quellen finanziert in der Zukunft. 3. Bewertung: Bitte führen Sie besonders positive, aber auch negative Beobachtungen und Erfahrungen an. Ev. langfristige Auswirkungen Ihres Projektes? Ich kann nur positives Erfahrungen benachrichtigen. Wir haben zusammen mit Prof. Karl Kuchler in einem EU Programm (Marie Curie ITN) erfolgreich beworben. Die neue Kooperation hat am Anfang 2014 begonnen. 4. Perspektiven: Hat sich eine Fortführung der Kooperation ergeben? a. Welche geplante Fortführung gibt es? Gemeinsame Forsungsantrag in der Zukunft (OTKA oder FWF). b. Welche konkrete Fortführung gibt es? Erfolgreiche Antraf für ITN in FP7 EU Programm.
5. Verbesserungsvorschläge: Nenne Sie uns, Bitte, Verbesserungsvorschläge, wie Sie Ihre Arbeit oder wie wir unseren Service besser gestalten könnten? Keine. Datum: 27.02.2014
________________________________ Antragsteller (Unterschrift)
__________________________________ Projektpartner (Unterschrift)
