M. Penka, E. Tesařová a kolektiv
Testování nukleových kyselin (NAT) bez kompromisů Systém cobas s 201 je spolehlivý, snadno ovladatelný systém s rychlým startem a minimální denní údržbou. Souprava cobas® TaqScreen MPX Test detekuje všechny známé genotypy a subtypy HIV-1 skupin M a O, HIV-2, HCV a HBV a jde tak o nejkomplexnější test, jež je v současné době k dispozici. Tento multiplexní test má CE a FDA certifikaci a je používán ve více než 175 krevních centrech po celém světě. Systém cobas s 201 je navržen tak, aby bylo v budoucnu možné rozšíření diagnostikovaných virů a současně také využít 4kanálové vícebarevné technologie pro přímý průkaz jednotlivých virů v reálném čase. ROCHE, COBAS, COBAS S, LIFE NEEDS ANSWERS, a TAQSCREEN, jsou chráněné známky skupiny Roche.
Roche s.r.o. Diagnostics Division Karlovo nám. 17 120 00 Praha 2 www.roche-diagnostics.cz
Hematologie a transfuzní lékařství II
cobas s 201 – jeden systém mnoho možností
Miroslav Penka, Eva Tesařová a kolektiv
Hematologie a transfuzní lékařství II Transfuzní lékařství
Miroslav Penka, Eva Tesařová a kolektiv
Hematologie a transfuzní lékařství II Transfuzní lékařství
GRADA Publishing
Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.
Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., MUDr. Eva Tesařová a kolektiv
HEMATOLOGIE A TRANSFUZNÍ LÉkařství II transfuzní lékařství Vedoucí autorského kolektivu: MUDr. Eva Tesařová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno Autorský kolektiv: RNDr. Libuše Janků – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno MUDr. Hana Lejdarová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno RNDr. Rita Pacasová, Ph.D. – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno MUDr. Alena Pejchalová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno MUDr. Eva Tesařová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno Recenze: MUDr. Jiří Masopust MUDr. Renata Procházková, Ph.D. Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s. Autorky děkují paní Mgr. Olze Kopalové, vedoucí odborné redaktorce, za spolupráci při vzniku této publikace, paní Janě Řehákové, DiS., za pomoc při technické realizaci obrazové přílohy ke kapitole 1, oběma recenzentům a všem sponzorům, kteří vydání publikace finančně podpořili. TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE: © Grada Publishing, a.s., 2012 Obrázky 1.1–1.18, 1.20–1.23, 1.25–1.34, 2.1–2.5, 4.1 podle podkladů autorek překreslila Jana Řeháková, DiS. Ostatní obrázky dodaly autorky. Cover Photo © fotobanka allphoto, 2012 Vydala Grada Publishing, a.s., U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 5007. publikaci Odpovědný redaktor Mgr. Luděk Neužil Sazba a zlom Jana Řeháková, DiS. Počet stran 192 + 16 stran barevné přílohy 1. vydání, Praha 2012 Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s. Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky. ISBN 978-80-247-3460-6 ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE: ISBN 978-80-247-7901-0 (pro formát PDF) ISBN 978-80-247-7904-1 (pro formát EPUB)
Obsah Předmluva................................................................................................................ 9 Seznam použitých zkratek a jejich význam.......................................................... 11 1 Imunologie erytrocytů (A. Pejchalová) ............................................................ 17 1.1 Obecná imunohematologie................................................................................ 17 1.1.1 Imunitní systém....................................................................................... 17 1.1.2 Antigeny.................................................................................................... 17 1.1.3 Protilátky.................................................................................................. 18 1.1.4 Komplementový systém.......................................................................... 20 1.1.5 Reakce antigenu s protilátkou................................................................ 22 1.1.6 Imunohematologické testy..................................................................... 24 1.2 Krevní skupiny..................................................................................................... 27 1.2.1 AB0 systém............................................................................................... 28 1.2.2 Rh systém.................................................................................................. 33 1.2.3 Ostatní krevní skupiny .......................................................................... 40 1.3 Předtransfuzní vyšetření.................................................................................... 45 1.3.1 Vyšetření krevní skupiny (stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D)............................................................................................ 47 1.3.2 Screeningové vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům ................................................................................... 48 1.3.3 Test kompatibility ................................................................................... 49 1.3.4 Mimořádné situace při předtransfuzním vyšetření .......................... 53 1.4 Imunohematologické vyšetření v těhotenství................................................. 54 1.5 Hemolytické onemocnění novorozence........................................................... 55 1.5.1 Imunohematologické vyšetření novorozence ..................................... 58 1.5.2 Léčba hemolytického onemocnění novorozence................................ 59 1.5.3 Prevence hemolytického onemocnění novorozence .......................... 60 1.6 Autoimunitní hemolytické anémie................................................................... 60 1.6.1 Dělení autoimunitních hemolytických anémií................................... 61 1.7 Imunohematologická vyšetření dárce krve..................................................... 65 1.7.1 Vyšetření krevní skupiny........................................................................ 65 1.7.2 Detekce nepravidelných protilátek proti erytrocytům...................... 66 1.8 Kontroly kvality v imunohematologické laboratoři....................................... 66 2 HLA systém, imunologie leukocytů a trombocytů (L. Janků)......................... 69 2.1 HLA systém.......................................................................................................... 69 2.1.1 Definice HLA systému, historie objevů HLA...................................... 69 2.1.2 Struktura molekul HLA I. třídy............................................................ 70 2.1.3 Struktura molekul HLA II. třídy........................................................... 71 2.1.4 Genetická organizace HLA systému..................................................... 72 2.1.5 Dědičnost HLA systému......................................................................... 74 2.1.6 Crossing-over, rekombinace HLA haplotypů...................................... 74 2.1.7 Vazebná nerovnováha............................................................................. 75 5
Transfuzní lékařství 2.1.8 Polymorfizmus HLA systému................................................................ 76 2.1.9 Nomenklatura HLA systému................................................................. 76 2.1.10 HLA systém a choroby............................................................................ 78 2.1.11 HLA systém a transplantace.................................................................. 80 2.1.12 Význam HLA systému............................................................................ 83 2.1.13 Typizace HLA systému........................................................................... 84 2.2 Imunologie leukocytů ........................................................................................ 86 2.2.1 HLA antigeny leukocytů........................................................................ 86 2.2.2 Klinické symptomy způsobené anti-HLA protilátkami.................... 87 2.2.3 HNA antigeny (human neutrophil antigens)...................................... 87 2.2.4 Klinické symptomy způsobené anti-HNA protilátkami................... 88 2.2.5 Způsoby detekce anti-HNA protilátek................................................. 89 2.2.6 HMA antigeny (human monocyte antigens)...................................... 89 2.3 Imunologie trombocytů..................................................................................... 90 2.3.1 HPA antigeny (human platelet antigens)............................................. 90 2.3.2 Klinické symptomy způsobené antitrombocytárními protilátkami.... 91 2.3.3 Screeningové testy pro detekci antitrombocytárních protilátek...... 92 3 Výroba transfuzních přípravků (R. Pacasová)................................................. 95 3.1 Dárcovství krve (H. Lejdarová)......................................................................... 95 3.1.1 Obecné principy dárcovství krve.......................................................... 95 3.1.2 Postup při odběru krve........................................................................... 96 3.1.3 Kritéria pro přijetí dárců krve............................................................... 96 3.1.4 Kritéria pro vyloučení dárců krve ........................................................ 97 3.1.5 Typy odběrů krve..................................................................................... 99 3.1.6 Patofyziologie odběrů krve ................................................................. 101 3.1.7 Registry dárců krve............................................................................... 102 3.2 Autotransfuze (E. Tesařová)............................................................................. 103 3.2.1 Předoperační autologní odběr............................................................. 103 3.2.2 Akutní normovolemická hemodiluce................................................. 106 3.2.3 Perioperační sběr krve.......................................................................... 107 3.3 Principy výroby transfuzních přípravků (R. Pacasová) .............................. 107 3.3.1 Vstupní materiál pro výrobu transfuzních přípravků..................... 107 3.3.2 Odběrový materiál................................................................................. 107 3.3.3 Konzervace krve a krevních složek..................................................... 108 3.3.4 Zpracování krve..................................................................................... 111 3.3.5 Deleukotizace transfuzních přípravků............................................... 113 3.3.6 Ozařování transfuzních přípravků paprsky γ................................... 114 3.3.7 Dělení transfuzních přípravků............................................................ 114 3.3.8 Promývání transfuzních přípravků.................................................... 114 3.3.9 Metody inaktivace patogenů v transfuzních přípravcích................ 115 3.3.10 Principy značení, dokumentace........................................................... 115 3.3.11 Skladování transfuzních přípravků.................................................... 115 3.3.12 Výdej, distribuce a transport transfuzních přípravků..................... 116 3.4 Transfuzní přípravky (R. Pacasová) ............................................................... 117 3.4.1 Erytrocytové transfuzní přípravky..................................................... 118 3.4.2 Trombocytové transfuzní přípravky................................................... 119 6
Obsah 3.4.3 Plazmatické transfuzní přípravky....................................................... 120 3.4.4 Ostatní typy transfuzních přípravků.................................................. 121 3.5 Plazma pro frakcionaci (E. Tesařová)............................................................. 121 3.5.1 Frakcionace plazmy .............................................................................. 121 3.5.2 Metody inaktivace a eliminace patogenů v krevních derivátech .... 122 3.5.3 Krevní deriváty vyrobené z lidské krevní plazmy............................ 123 3.5.4 Krevní deriváty vyrobené rekombinantními technikami .............. 123 3.6 Kontroly kvality v zařízeních transfuzní služby (R. Pacasová).................. 123 3.6.1 Vyšetření vzorků krve dárce při odběru............................................ 124 3.6.2 Kontroly kvality meziproduktů a kontroly kvality transfuzních přípravků ................................................................................................ 126 3.6.3 Kontroly účinnosti dezinfekce místa venepunkce před odběrem.... 127 3.6.4 Kontroly procesu odběru a zpracování ............................................. 127 3.6.5 Kontroly čistoty výrobních prostor..................................................... 128 3.6.6 Kontroly dodaných materiálů pro odběry, zpracování a pro kontroly jakosti............................................................................... 128 4 Hemoterapie (E. Tesařová).............................................................................. 131 4.1 Historie léčby krví ............................................................................................ 131 4.1.1 Krev ve starověku .................................................................................. 131 4.1.2 První pokusy s transfuzemi ................................................................ 131 4.1.3 Objev krevního oběhu, převody zvířecí krve.................................... 131 4.1.4 Začátky transfuzí lidské krve............................................................... 132 4.1.5 Objev krevních skupin.......................................................................... 132 4.1.6 Konzervace krve.................................................................................... 133 4.1.7 Moderní éra............................................................................................ 133 4.2 Léčba transfuzními přípravky......................................................................... 134 4.2.1 Erytrocyty............................................................................................... 135 4.2.2 Trombocyty ........................................................................................... 136 4.2.3 Plazma pro klinické použití ................................................................ 139 4.2.4 Kryoprotein (kryoprecipitát) .............................................................. 140 4.2.5 Granulocyty............................................................................................ 140 4.2.6 Masivní transfuze.................................................................................. 140 4.2.7 Aplikace transfuze ................................................................................ 141 4.2.8 Léčba pacientů dětského věku............................................................. 143 4.3 Léčba krevními deriváty................................................................................... 148 4.3.1 Krevní deriváty s obsahem faktoru VIII............................................ 148 4.3.2 Krevní deriváty s obsahem faktoru VIII a von Willebrandova faktoru..................................................................................................... 149 4.3.3 Krevní deriváty s obsahem faktoru IX............................................... 149 4.3.4 Krevní deriváty s obsahem faktorů protrombinového komplexu.... 150 4.3.5 Krevní deriváty s obsahem faktoru VII............................................. 150 4.3.6 Krevní deriváty s obsahem fibrinogenu............................................. 151 4.3.7 Krevní deriváty s obsahem aktivovaných faktorů protrombinového komplexu......................................................................................................... 152 4.3.8 Krevní deriváty s obsahem rekombinantního aktivovaného faktoru VII.............................................................................................. 153 7
Transfuzní lékařství 4.3.9 Krevní deriváty s obsahem koncentrátu antitrombinu ................... 153 4.3.10 Krevní deriváty s obsahem koncentrátu proteinu C........................ 153 4.3.11 Krevní deriváty s obsahem albuminu................................................. 154 4.3.12 Krevní deriváty s obsahem imunoglobulinů .................................... 154 4.3.13 Tkáňová lepidla...................................................................................... 157 4.3.14 Balení, skladování, rekonstituce krevních derivátů......................... 157 4.4 Komplikace hemoterapie ................................................................................. 159 4.4.1 Akutní hemolytická potransfuzní reakce ......................................... 160 4.4.2 Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce.................................... 161 4.4.3 Alergická potransfuzní reakce............................................................. 161 4.4.4 Anafylaktická potransfuzní reakce..................................................... 162 4.4.5 Bakteriálně toxická potransfuzní reakce........................................... 162 4.4.6 Reakce TRALI (transfusion related acute lung injury).................... 163 4.4.7 Reakce TACO (transfusion associated circulatory overload)......... 164 4.4.8 Hypotermie ............................................................................................ 164 4.4.9 Hyperkalemie......................................................................................... 164 4.4.10 Citrátová toxicita.................................................................................... 164 4.4.11 Pozdní hemolytická potransfuzní reakce.......................................... 165 4.4.12 Potransfuzní purpura ........................................................................... 165 4.4.13 Reakce TA-GvHD (transfusion associated graft versus host disease).................................................................................................... 166 4.4.14 Přenos virů.............................................................................................. 166 4.4.15 Přenos parazitů...................................................................................... 167 4.4.16 Přenos prionů......................................................................................... 168 4.4.17 Potransfuzní hemosideróza ................................................................. 168 4.4.18 Tvorba inhibitorů................................................................................... 169 4.4.19 Toxicita plastických hmot..................................................................... 169 4.4.20 Procesní chyby....................................................................................... 170 4.4.21 Nežádoucí účinky po podání krevních derivátů.............................. 170 4.5 Hemovigilance................................................................................................... 170 4.6 Krizová krevní politika..................................................................................... 172 Historie léčby krví v datech (E. Tesařová) ........................................................... 179 Rejstřík ................................................................................................................ 181 Souhrn ................................................................................................................. 191 Summary ............................................................................................................. 192
8
Předmluva
Předmluva Druhý díl publikace Hematologie a transfuzní lékařství předkládá text z oboru transfuzního lékařství, který je psán s didaktickým záměrem seznámit čtenáře s problematikou oboru a se základními postuláty hemoterapie, včetně specifik ve vztahu k péči o novorozence a děti vůbec. Jedná se o přehled, který definuje obzor základních vědomostí oboru a vymezuje platný legislativní rámec pro činnost zařízení transfuzní služby v České republice. Autorský kolektiv byl sestaven z odborníků vlastního pracoviště Fakultní nemocnice Brno, recenzemi byli pověřeni erudovaní kolegové s letitými praktickými zkušenostmi, kteří pravidelně v oboru transfuzního lékařství publikují. Text publikace je rozdělen do čtyř logických celků, a to imunologie erytrocytů, imunologie leukocytů a trombocytů, včetně problematiky HLA systému, výroba transfuzních přípravků a hemoterapie. V kapitole hemoterapie je stručně popsána metodika zásobování nemocnic transfuzními přípravky v průběhu hromadných katastrof s postižením velkého počtu osob. Zároveň je v kapitole vymezena časová osa hemoterapie, kterou pro přehlednost určují významná historická data. Pro zvýšení didaktického účinku obsahuje publikace řadu schémat a obrázků, seznam zkratek a rejstřík. Dovoluji si doufat, že publikace pomůže čtenářům proniknout do složité problematiky transfuzního lékařství, které v současnosti představuje průsečík několika lékařských specializací a mnoha vědních oborů. Svým spoluautorům a recenzentům děkuji za úsilí, které vzniku publikace věnovali. Moje poděkování patří také sponzorům, kteří vydání této publikace finančně podpořili. Eva Tesařová
9
Seznam použitých zkratek a jejich význam
Seznam použitých zkratek a jejich význam Ab AB0 ACD ACE ADP ADSOL Ag AGH AIDS AIHA ALI AMP ANH APC ARIP ATP C C1–C9 CCI CJD CMV CPD CPDA CSF ČČK ČLS JEP ČR D variant D weak DAF DDAVP DEPH DIFT Dia DIC Dib DMSO DNA Doa
antibody (protilátka) skupinový systém erytrocytů AB0 1. antikoagulační roztok (acidum citricum, citrate, dextrose) 2. anaemia of chronic diseases (anémie chronických chorob) acetylcholinesteráza adenosindifosfát adenine and dextrose solution (konzervační roztok) antigen antiglobulinum humanum (antiglobulinové sérum) acquired immunodeficiency syndrom (syndrom získané lidské imunodeficience) autoimunitní hemolytická anémie acute lung injury (akutní poškození plic) adenosinmonofosfát akutní normovolemická diluce antigen presenting cell (antigen prezentující buňka) anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče adenosintrifosfát komplement složky komplementu corrected count increment (přepočítaný vzestup počtu trombocytů po transfuzi) Creutzfeldt-Jacob disease (Creutzfeldtova-Jacobova choroba) cytomegalovirus antikoagulační roztok (citrate, phosphate, dextrose) antikoagulační roztok (citrate, phosphate, dextrose, adenine) colony stimulating factor Český červený kříž Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně Česká republika parciální D-antigen slabý D-antigen decay accelerating factor 1-deamino-8-D-arginin vazopresin di(2-etylhexyl)ftalát destičkový imunofluorescenční test antigen erytrocytů Diego (a) disseminated intravascular coagulopathy (diseminovaná intravaskulární koagulace) antigen erytrocytů Diego (b) dimetylsulfoxid kyselina deoxyribonukleová antigen erytrocytů Dombrock (a) 11
Transfuzní lékařství Dob DP EBR EBV EIA ELFO ELISA EU FI FEIBA FVIII: C FV FCM FFP FITC FMAIT FMH FHTR FNHTR FSF FTA FUT Fya Fyb GA GCT GIFT GP GvHD HBV HBsAg Hc HCV HHV HIV HIT HLA HMA HNA HOFN HON HPA Hs HSV Hv 12
antigen erytrocytů Dombrock (b) double population (dvojí populace erytrocytů) erytrocyty bez buffy coatu resuspendované virus Epsteina-Barrové enzymová imunoanalýza elektroforéza enzyme linked immunosorbent assay Evropská unie faktor I, fibrinogen factor eight inhibitor bypassing activity koagulační aktivita faktoru VIII faktor V flowcytometry (průtoková cytometrie) fresh frozen plasma (čerstvá zmražená plazma) fluoresceinizothiokyanát fetomaternální aloimunitní trombocytopenie fetomaternal haemorrhage (fetomaternální krvácení) febrile haemolytic transfusion reaction febrile nonhaemolytic transfusion reaction fibrin stabilizující faktor (faktor XIII) fluorescence Treponema absorbtion fukosyltransferáza antigen systému Duffy (a) antigen systému Duffy (b) granuloaglutinační test granulocytotoxický test granuloimunofluorescenční test glykoprotein graft versus host disease (reakce štěpu proti hostiteli) hepatitis B virus (virus hepatitidy B) povrchový antigen viru hepatitidy B hematokrit cílový hepatitis C virus (virus hepatitidy C) human herpes virus human immunodeficiency virus (virus lidské imunodeficience) heparinem indukovaná trombocytopenie human leukocyte antigen (lidský hlavní histokompatibilní systém) human monocyte antigen human neutrophil antigen hemolytické onemocnění fetu a novorozence hemolytické onemocnění novorozence human platelet antigen hematokrit střední herpes simplex virus hematokrit výchozí
Seznam použitých zkratek a jejich význam HVLP ICHS Ig INR i.m. IMIG ITP ITT IU IUT i.v. IVIG IVLP Jka Jkb KTC LDH LISS LISS NAT Lea Leb Lua Lub MAC MAIPA MASP MBL MEIA MF MHC MZ NaCl NAIN NAIT NAT NEC NK NRL OBI PAMPS
hromadně vyráběný léčivý přípravek ischemická choroba srdeční imunoglobulin international normalised ratio (mezinárodní normalizovaný poměr) intramuskulární aplikace imunoglobuliny pro intramuskulární aplikaci imunitní trombocytopenie immune tolerance therapy (imunotoleranční léčba) international unit (mezinárodní jednotka) intrauterinní transfuze intravenózní aplikace imunoglobuliny pro intravenózní aplikaci individuálně vyráběný léčivý přípravek antigen systému Kidd (a) antigen systému Kidd (b) krizové transfuzní centrum laktát dehydrogenáza low ionic strength salt solution (solný roztok s nízkou iontovou silou) nepřímý antiglobulinový test s použitím LISS antigen systému Lewis (a) antigen systému Lewis (b) antigen systému Lutheran (a) antigen systému Lutheran (b) membrane attack complex monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens MBL-associated serine proteases mannose binding lectin enzymová imunoanalýza na mikročásticích mixed field (smíšená populace, smíšené reakce) major histocompatibility complex (hlavní histokompatibilní systém) ministerstvo zdravotnictví chlorid sodný, fyziologický roztok novorozenecká aloimunitní neutropenie novorozenecká aloimunitní trombocytopenie 1. nepřímý antiglobulinový test 2. nucleic acid amplification techniques (metoda amplifikace nukleových kyselin) nekrotizující enterokolitida 1. natural killer (NK buňka) 2. nukleová kyselina Národní referenční laboratoř occult (hepatitis) B infection pathogen associated molecular patterns 13
Transfuzní lékařství PAO PAT PAS PEG PCH PCR PCR-SSO PCR-SSP PE PID PIGA PNH plt PSK PT PTP PVC q PCR RIA Rh rhG-CSF RhIg RNA RRR rt PCR SAGM SBT s.c. SCIG SD SID SMP SOP SPC SPHA SSPt STL SZÚ TACO TAD TA-GvHD TBBV T.D. TIBC 14
předoperační autologní odběr přímý antiglobulinový test platelet aditive solution (náhradní roztok pro skladování trombocytů) polyetylenglykol paroxyzmální chladová hemoglobinurie polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PCR s následnou hybridizací se sekvenčně specifickými oligonukleotidy PCR se sekvenčně specifickými primery phycoerythrin primární imunodeficience gen kódující změny u paroxyzmální noční hemoglobinurie paroxyzmální noční hemoglobinurie platelets (trombocyty) perioperační sběr krve prothrombin time (protrombinový čas) potransfuzní trombocytopenická purpura polyvinylchlorid quantitative polymerase chain reaction radio immuno assay skupinový systém erytrocytů Rhesus rekombinantní faktor stimulující granulocyty anti-D imunoglobulin (Rh imunoglobulin) kyselina ribonukleová rychlá reagínová reakce real time polymerase chain reaction konzervační roztok (solution of adenine, glukose, mannitol) sequencing based typing subkutánní aplikace imunoglobuliny pro subkutánní aplikaci solvent detergent sekundární imunodeficience small membrane protein standardní operační postup statistic process control (statistická analýza procesu) solid phasis haemadsorbtion náhradní resuspenzní roztok pro trombocyty Společnost pro transfuzní lékařství Státní zdravotní ústav transfusion acute circulatory overload trombocyty z aferézy deleukotizované transfusion associated graft versus host disease (reakce štěpu proti hostiteli vázaná na transfuzi) total body blood volum (objem cirkulující krve) terapeutická dávka total iron binding capacity (celková vazebná kapacita železa)
Seznam použitých zkratek a jejich význam TNF TP TPHA TP-PA TRALI TSE TTI TTD TTP T.U. ÚILC UV v. vCJD vWF vWF:Ag vWF:RCof VZV WNV WHO Yta Ytb ZTS ZULP ZZ
tumor necrosis factor transfuzní přípravek Treponema passive hemagglutination Treponema pallidum particule aglutination transfusion related acute lung injury transmisivní spongiformní encefalopatie transfusion transmited infection transfusion transmited diseases trombotická trombocytopenická purpura transfuzní jednotka Ústřední informační a logistické centrum ultraviolet (ultrafialové záření) véna (žíla) variant Creutzfeldt-Jacob disease (variantní forma Creutzfeldtovy-Jacobovy choroby) von Willebrandův faktor antigen von Willebrandova faktoru ristocetin kofaktor, kofaktor von Willebrandova faktoru varicella zoster virus west Nile virus World Health Organisation (Světová zdravotnická organizace) antigen erytrocytů Cartwright (a) antigen erytrocytů Cartwright (b) zařízení transfuzní služby zvlášť účtovaný léčivý přípravek zdravotnické zařízení
15
:
Imunologie erytrocytů
1
Imunologie erytrocytů (A. Pejchalová)
1.1
Obecná imunohematologie
1.1.1
Imunitní systém
Imunitní systém zajišťuje obranu organizmu proti cizorodým molekulám. Základní funkcí imunitního systému je obranyschopnost, autotolerance a imunitní dohled. Formy imunity lze rozlišit na přirozenou a získanou. Přirozená (nespecifická, vrozená) imunita je první linií obrany. Je založená na mechanizmech, které jsou stejně účinné proti různým antigenům, reaguje během minut až hodin. Patří k ní faktory mechanické, které zabraňují vstupu mikroorganizmů do těla (kůže, sliznice), faktory chemické a biologické (opsoniny, fyziologická mikrobiální flóra), faktory humorální (komplementový systém, lysozymy, interferony), fagocytující buňky (monocyty/makrofágy, neutrofily), bazofily, eozinofily, žírné buňky, trombocyty a NK buňky. Receptory těchto buněk rozpoznávají cizorodé molekuly (PAMPS) a buňky imunitního systému patogeny ničí. Získaná (specifická, adaptivní) imunita je pomalejší, reaguje v průběhu dnů a je antigenně specifická. Je pro ni charakteristický vznik protilátek a buňkami zprostředkovaná odpověď na antigeny v situacích, kdy buňky imunitního systému obsahují receptor pro daný antigen. Má schopnost imunologické paměti. V koordinaci této odpovědi hrají svoji roli různé signální molekuly, kterými jsou lymfokiny, cytokiny či chemokiny. K buňkám adaptivní imunity patří B a T lymfocyty. Po expozici antigenu proliferují B lymfocyty, které se diferencují do plazmatických buněk s tvorbou protilátek (imunoglobulinů) a vznikají paměťové buňky. Podobně se T lymfocyty po rozpoznání antigenu diferencují do Tc nebo Th lymfocytů. Zvláštním druhem buněk jsou specializované buňky dendritické a makrofágy (APC), které jsou schopné štěpit antigeny na peptidy a ve spojení s molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) je předkládat T lymfocytům. B lymfocyty rozeznávají solubilní antigeny proteinové a polysacharidové, některé lipidy, nukleové kyseliny a hapteny. T lymfocyty rozpoznávají nerozpustné proteinové antigeny, a to ve spojení s MHC I. nebo II. třídy pro lymfocyty Tc nebo Th. Protilátky se uplatňují v obraně proti extracelulárním (exogenním) antigenům, které neutralizují, opsonizují nebo vedou k aktivaci komplementu a lýze patogenů. V obraně proti intracelulárním (endogenním) patogenům se uplatňuje buňkami zprostředkovaná cytotoxická odpověď s účastí T lymfocytů.
1.1.2 Antigeny Imunogen je substance, která navodí imunitní odpověď. Antigen je substance, která reaguje s produkty specifické imunitní odpovědi (protilátkami). Hapten je malá molekula, která je antigenní, ale nikoli imunogenní, avšak po vazbě na imunogenní nosič může vést k tvorbě protilátek. 17
1
1
Transfuzní lékařství Epitop je část antigenu, na kterou se naváže produkt specifické odpovědi (protilátka). Protilátka je specifický protein, který vznikl jako odpověď na imunogen a který reaguje s antigenem. Imunogenicita (navození imunitní odpovědi) je závislá na cizorodosti patogenní molekuly. Imunitní systém rozlišuje za normálních okolností vlastní a cizí a reaguje na cizí molekuly, na jejich velikost (větší molekula je silnějším imunogenem) a složení (složené komplexy jsou více imunogenní), na fyzikální formu antigenu (solubilní antigen je méně imunogenní než pevná částice) a na způsob odstraňování antigenu z organizmu (fagocytované molekuly jsou více imunogenní). O imunogenicitě rozhoduje také způsob podání antigenu (např. intravenózní, subkutánní) a množství podané substance. Antigenicita je schopnost antigenu specificky vázat protilátky nebo receptory T lymfocytů (obr. 1.1 v barevné příloze). Lze konstatovat, že všechny imunogeny jsou antigeny, ale ne všechny antigeny jsou imunogenní. V imunohematologii se uplatňují převážně antigeny nezávislé na T lymfocytech, které přímo aktivují B lymfocyty a nevyžadují pro tvorbu protilátky pomoc T buněk (které jsou vyžadované u reakce na proteinové antigeny). Typickým příkladem těchto antigenů jsou polysacharidové antigeny krevních skupin. Antigen je rozpoznán protilátkou nebo B lymfocytem na základě uspořádání jeho molekuly v místě zvaném epitop (antigenní determinant). Následně tento antigen vyvolá polyklonální aktivaci B lymfocytů, kdy různé klony lymfocytů specifických pro daný antigen sekretují polyklonální protilátky, respektive heterogenní směs protilátek, kdy každá protilátka je specifická pro různé epitopy antigenu. Kromě polyklonálních protilátek mohou vznikat také monoklonální protilátky, tvořené jediným B buněčným klonem. Ty mají stejný izotyp, tzn. obsahují stejný těžký imunoglobulinový řetězec, jsou biochemicky shodné a rozpoznávají stejný antigenní epitop. Monoklonální protilátky lze vyrobit pomocí konstrukce hybridomu, tzn. izolací klonu B lymfocytů, který produkuje protilátku žádané specifity a jeho dalším pěstováním v buněčné kultuře. Výsledkem této fúze buněk je hybridom, který tvoří stejné protilátky jako původní lymfocyt. V imunohematologii se monoklonální protilátky používají k diagnostickým účelům (diagnostická séra). Přínosné je však i jejich léčebné použití. Jiným typem reagencií používaných v imunohematologických laboratořích jsou lektiny. Jsou to látky, keré se podobně jako protilátky připojují ke specifickým antigenům buněk a vedou k aglutinaci. Nejčastěji používané jsou lektiny rostlinné, které reagují s jednoduchými cukry na povrchu buněk, např. s galaktózou, fukózou či galaktosaminem. Nejobvyklejší je jejich diagnostické použití při vyšetřování krevních podskupin.
1.1.3 Protilátky Protilátky v plazmě jsou rozpustnou formou antigenně specifických receptorů B lymfocytů. Protilátky jsou glykoproteiny, které vznikají jako odpověď na imunogen a reagují se specifickými antigeny. Připojují se k antigenům tak, že se každá protilátka váže ke specifickému antigennímu epitopu na základě vzájemné komplementarity („klíč a zámek“) v místech označovaných jako variabilní domény. Proti jednomu epitopu vzniká řada protilátek, každá kopíruje jeho povrch jinak. 18
Imunologie erytrocytů Kromě této základní funkce mají imunoglobuliny i jiné efektorové vlastnosti, např. mohou vázat komplement a tím uvolnit biologicky aktivní molekuly a vést k lýze buňky nebo se připojit k jiným buňkám, které pro ně mají receptor (fagocyty, lymfocyty, žírné buňky, buňky placenty) a tyto buňky následně aktivovat k činnosti. Základní jednotka imunoglobulinu se skládá ze dvou stejných lehkých a dvou stejných těžkých řetězců, které jsou spojené disulfidickými vazbami (obr. 1.2 v barevné příloze). Lehké i těžké řetězce sestávají z části variabilní (Fab) a konstantní (Fc) a jsou stočeny do kompaktních globulí, tzv. domén. Středová část označovaná jako pantová je flexibilní a umožňuje v omezeném rozsahu pohyb Fab částí (obr. 1.3 a 1.5 v barevné příloze). V tomto místě lze protilátku štěpit. Proteolytickým štěpením papainem lze získat dva shodné Fab fragmenty dvou lehkých a dvou těžkých řetězců, které obsahují vazebná místa pro antigen (přitom každý fragment má jedno místo vazby) a fragment Fc, tvořený dvěma těžkými řetězci, který plní efektorovou funkci imunoglobulinu. Při štěpení molekuly imunoglobulinu pepsinem vzniká jeden fragment F(ab)2, který má dvě vazebná místa pro antigen a oddělená Fc část je rozložena na malé peptidy – proto nemá žádnou efektorovou funkci (obr. 1.4 v barevné příloze). Podle aminokyselin v těžkých řetězcích lze imunoglobuliny rozdělit do pěti imunoglobulinových tříd na izotypy IgG (γ řetězce), IgM (μ řetězce), IgA (α řetězce), IgD (δ řetězce) a IgE (ε řetězce). Dále je lze diferencovat na podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 a IgA2. Lehké řetězce jsou dvojího typu: κ (kappa) nebo λ (lambda), ty poslední lze také rozlišit na subtypy λ1–4. Imunoglobuliny tvoří heterogenní populaci různých tříd a podtříd těžkých řetězců s různými typy a subtypy lehkých řetězců. Každá molekula imunoglobulinu se však liší od jiné protilátkové molekuly vazebným místem pro antigen, pro který je specifická. V imunohematologii se uplatňují IgG a IgM protilátky. IgG se vyskytují jako monomery v plazmě i extravaskulárně a jsou transportovatelné přes placentu do oběhu plodu. Mohou vázat komplement, ale málokdy jej aktivují až k lýze erytrocytů. Aktivace obvykle probíhá po C3 složku. Aktivace komplementu přitom vyžaduje, na rozdíl od IgM, dvě molekuly IgG k tomu, aby mohlo dojít k vazbě C1q složky komplementu na Fc fragment protilátek (obr. 1.6 v barevné příloze). Lytická vlastnost IgG je proto poměrně malá. Protilátky IgG se však snadno navazují na jiné buňky (makrofágy, monocyty, leukocyty), které mají receptor pro jejich Fc část. Spojením s těmito buňkami protilátka připraví navázaný antigen k odstranění fagocytózou (tzv. opsonizace) v retikuloendoteliálním systému. IgM molekula má řetězce polymerizované do pentameru, dobře váže komplement a je schopná ho aktivovat až k hemolýze. Již jedna molekula IgM stačí k aktivaci komplementu. Z uvedeného důvodu mají IgM protilátky velkou lytickou schopnost, typická je hemolýza po podání AB0 inkompatibilní transfuze. S ohledem na strukturu má IgM velmi dobré aglutinující schopnosti, podobně jako IgG se váže na jiné buňky pomocí Fc receptoru. Jako jediný imunoglobulinový typ může IgM protilátku vytvořit za určitých patologických stavů (infekce) již i plod intrauterinně. Podle příčiny vzniku jsou v imunohematologii protilátky děleny na tzv. přirozené a imunitní. U imunitních protilátek se předpokládá, že jejich tvorbě předcházela imunizace jedince erytrocytárními antigeny při transfuzi nebo během těhotenství na rozdíl od přirozených protilátek, které si organizmus vytváří sice také po anti19
1
1
Transfuzní lékařství genní stimulaci, avšak při běžném kontaktu s antigeny z okolního prostředí. Tyto antigeny bývají chemicky podobné antigenům krevních skupin. Jiné rozdělení protilátek je na skupiny aloprotilátek a autoprotilátek, tedy podle toho, zda se antigen, proti kterému protilátka vznikla, nenachází nebo nachází na erytrocytech daného jedince. Autoprotilátky jsou projevem autoimunity. Protilátky mohou být také namířené proti konkrétnímu erytrocytárnímu antigenu, ty označujeme jako specifické protilátky. Nespecifické nebo zkříženě reagující protilátky vykazují širokou reaktivitu s různými nebo podobnými antigeny. Podle optimální teploty, při které protilátky vážou antigen, lze protilátky rozdělit na tepelné, které reagují při tělesné teplotě 37 °C, a chladové, které lze nejlépe detekovat v testech při teplotách od 20 °C do 23 °C (tzv. pokojová teplota) nebo při teplotách nižších. V imunohematologii běžně používané označení protilátky kompletní a inkompletní není imunologicky zcela přesné a vyjadřuje pouze vlastnost protilátek aglutinovat erytrocyty. U kompletních protilátek (často IgM) jde o přímou aglutinaci erytrocytů v solném testu, u inkompletních protilátek (IgG) je k vyvolání aglutinace a k jejich průkazu obvykle nutná další „pomoc“ laboratorní úpravou testu, například změnou prostředí, ve kterém je test prováděný.
1.1.4 Komplementový systém Komplement je součástí specifické i nespecifické imunity. Může opsonizovat bakterie při fagocytóze, aktivovat různé typy buněk, účastnit se regulace protilátkové odpovědi, působit při odstranění imunitních komplexů a apoptotických buněk. Na druhé straně však může nepříznivě ovlivňovat organizmus v souvislosti se zánětem a poškozením tkání. Komplementový systém se skládá z dvaceti odlišných sérových proteinů, které syntetizují různé buňky, například hepatocyty, makrofágy a buňky střevního epitelu. Některé složky komplementu se mohou vázat k imunoglobulinům nebo k buněčné membráně. Jiné mají vlastnosti proenzymů, které po své aktivaci štěpí další proteiny komplementu. Přitom vznikají fragmenty jednotlivých proteinů, které aktivují buňky, zvyšují cévní permeabilitu a opsonizují bakterie. Aktivace komplementu může nastat třemi způsoby: cestou klasickou, alternativní a lektinovou, na které navazuje cesta lytická (vznik membránového komplexu). Jejich aktivací vzniká C5 konvertáza a C5b fragment, které mají zásadní význam v aktivaci závěrečné cesty lytické (obr. 1.7). klasická cesta
lektinová cesta
závislá na protilátce
alternativní cesta nezávislá na protilátce
aktivace C3 a vznik C5 konvertázy aktivace C5 lytická cesta
Obr. 1.7 Cesty aktivace komplementu. Tři cesty aktivace komplementu se liší inicializačním podnětem: kontaktem s protilátkou, chemickou látkou (endotoxinem bakterií) nebo sérovým lektinem (upraveno podle Complement. Imunology. Mayer, Gene [online], 2011) 20
Imunologie erytrocytů Klasická cesta aktivace komplementu se spouští vazbou C1 proteinu k Fc oblasti IgG nebo IgM molekuly specifické protilátky. Spojení C1 s protilátkou vyžaduje alespoň dvě molekuly protilátky, aby mohlo být pevné. Vzniklý aktivovaný C1qrs (C1q, C1r, C1s jsou subjednotky C1) enzymaticky štěpí C4 na fragmenty C4a a C4b a zahajuje tak celý komplex dalších dějů: C4b se naváže na buněčnou membránu, přitom fragment C4a je uvolněný do prostředí mimo buňku (aktivovaný C1qrs štěpí C2 na fragmenty C2a a C2b), C2a se spolu s C4b váže na membránu do komplexu C4bC2a nazývaného C3 konvertáza (štěpí C3 na fragmenty C3a a C3b), C3b vytváří spolu s C4b a C2a na membráně komplex C4bC2aC3b zvaný C5 konvertáza. Jejím vznikem končí klasická cesta aktivace (obr. 1.8 v barevné příloze). Aktivace komplementu vyžaduje kromě aktivačních dějů také regulaci probíhajících procesů tak, aby nedošlo k nadměrné produkci některých fragmentů. V této regulaci se uplatňují inhibiční a inaktivační mechanizmy, které působí na různých úrovních. Patří k nim C1 inhibitor, C3a inaktivátor, faktory H a I (ovlivňují C3b), C3-INA (působí na C4a) a C4 binding protein (degraduje C4b). Alternativní cesta aktivace komplementu začíná aktivací C3 a vyžaduje faktory B a D a kationty hořčíku, které jsou všechny obsaženy v séru (obr. 1.9 v barevné příloze). V aktivaci alternativní cesty se neuplatňují protilátky, patří však k první linii obrany organizmu proti infekcím. Lektinová cesta aktivace komplementu je podobná cestě klasické (obr. 1.10 v barevné příloze). Zahajuje ji vazba lektinu (MBL – mannose binding lectin) na bakteriální povrchy obsahující polysacharidy (manany), při které vznikají další proteázy: MASP-1 a MASP-2 (mannose associated serine proteases). Proteázy spolu s lektinem vytváří biologicky aktivní komplex, který následně štěpí jednotlivé složky komplementu. Lytická cesta aktivace komplementu (vznik membránového komplexu) od C5 konvertázy přes připojení C6, 7, 8 a vazbu C9 vede k lýze buňky. Lýza nepředstavuje enzymatický proces, ale fyzikální poškození membrány. Konečný komplex C5bC6C7C8C9 je označován jako MAC. C5 je biologicky aktivní látka, silný anafylatoxin a chemotaktický faktor pro neutrofily, stimuluje makrofágy. Někdy může dojít k uvolnění C5b67 komplexu z membrány a jeho vazbě na jiné buňky, které mohou podléhat rozpadu. Proces se označuje jako „bystender“ lýza (obr. 1.11 v barevné příloze). V imunohematologii erytrocytů nachází uplatnění (s ohledem na reakci protilátek s antigeny erytrocytů) cesta klasická a lytická, výjimečně lektinová. Souvislost komplementu s krevními skupinami byla zjištěna poprvé u krevní skupiny Chido/Rogers. Antigeny skupiny Chido/Rogers jsou determinantami C4 slož ky komplementu a na erytrocyty jsou adsorbované z plazmy, ve které jsou běžně přítomné. Jedinci Ch/Rg negativní jsou vzácní a mohou se u nich vyskytovat protilátky proti těmto antigenům. Protilátky však nejsou považované za nebezpečné, nebývají příčinou závažnější transfuzní komplikace. Jiné spojení s komplementem mají antigeny skupiny Cromer, které se nachází na glykoproteinu DAF (decay accelerating factor, CD55). Ten je jako membránový protein na různých buňkách včetně erytrocytů, leukocytů, trombocytů, buňkách epitelu a endotelu a uplatňuje se jako regulátor komplementu při obraně autologních buněk před poškozením komplementem. Komplement mohou aktivovat klasickou cestou AB0 protilátky i některé nepravidelné antierytrocytární protilátky, které vznikly jako následek imunitní odpovědi na 21
1
1
Transfuzní lékařství cizorodé antigeny erytrocytů v transfuzi nebo na antigeny plodu v těhotenství, např. protilátky proti skupinám Duffy, Kidd, Kell. Tyto aloprotilátky mohou vést k hemolýze erytrocytů, které nesou antigen, proti kterému je protilátka specifická. Jinou příčinou hemolýzy mohou být některé léky, které aktivují různými mechanizmy vznik protilátek a vedou k imunokomplexům, závislých na komplementu. Hemolýza může probíhat rychle, akutně s projevy intravaskulární hemolýzy, kdy dochází k aktivaci komplementu lytickou cestou (obvykle při transfuzi AB0 inkompatibilních erytrocytů), nebo může probíhat pomaleji, s pozdními příznaky, obvykle při extravaskulárním rozpadu erytrocytů (při inkompatibilitě erytrocytů např. v Rh antigenech), kdy proběhne aktivace komplementu klasickou cestou a nenavazuje část lytická (obr. 1.12 v barevné příloze). Situace se klinicky projevují jako hemolytické reakce (u novorozence hemolytické onemocnění novorozence), které mohou mít v závislosti na množství antigenu a protilátky a s ohledem na imunologické vlastnosti protilátky různou intenzitu a v těžkých případech mohou končit i fatálně. Analogií efektu komplementu u potransfuzní hemolýzy je úloha komplementu u autoimunitních hemolytických anémií, kdy zvláště u patologických chladových protilátek, typicky u Donathova-Landsteinerova autohemolyzinu, lze komplement prokázat na erytrocytech nemocných pacientů pomocí anti-C3d protilátky. Komplement se uplatňuje také v patogenezi paroxyzmální noční hemoglobinurie (PNH).
1.1.5
Reakce antigenu s protilátkou
Protilátky se připojují k antigenům nekovalentními vazbami. K těm patří spojení vodíkové, elektrostatické síly, Van der Waalsovy síly a hydrofobní vazby. Tyto vazby jsou slabé, fungují jen na malou vzdálenost a jsou reverzibilní (obr. 1.13). Pevné spojení protilátky a antigenu vyžaduje velké množství vazeb a vysokou vzájemnou komplementaritu antigenu a protilátky. Afinita je síla vazby mezi jedním epitopem antigenu a jedním vazebným místem protilátky. Avidita je síla vazby antigenu, který obsahuje vícečetné epitopy s multivalentními protilátkami (obr. 1.14). Typ síly
Vznik síly
Elektrostatické síly
Spojení mezi opozitními náboji
– NH3 OOC –
Vodíkové můstky
Interakce atomu vodíku se dvěma elektronegativními prvky
N—H--O=C δ- δ+ δ-
Hydrofobní síly
Voda vede ke shlukování hydrofobních skupin. Molekula vody přitom přechází z hydrofobního povrchu do roztoku
HH H O H O δ+ δ O H H δ O δ+ HH
Van der Waalsovy síly
Kladný a záporný náboj na opačných stranách molekuly vytvoří přitažlivou sílu mezi opačně nabitými konci
δ+
δ-
δ-
δ+
Obr. 1.13 Nekovalentní vazebné síly ovlivňující spojení antigenu s protilátkou (reverzibilní vazby) (upraveno podle Antigen-antibody interactions involve a variety of forces. The noncovalent forces that hold together the antigen:antibody komplex [online], 2011) 22
Imunologie erytrocytů
Keq=
104 afinita
106 avidita
1010 avidita
Obr. 1.14 Afinita a avidita protilátky. Suma jednotlivých nekovalentních vazeb mezi paratopem a epitopem se rovná afinitě protilátky pro daný epitop. Avidita vyjadřuje pevnost vazeb mezi antigenem a protilátkou – jsou zřejmé rozdíly mezi izotypem IgG a IgM (upraveno podle Mayer, Gene. Immunoglobulins-Antigen-Antibody reaction. Avidity. Immunology Chapter Seven [online], 2011) Specifičnost reakce je vlastnost protilátky reagovat jen s jedním epitopem, obecně vlastnost protilátek reagovat jen s jedním antigenem. Zkřížená reaktivita je schopnost protilátky reagovat s více než jedním epitopem, pokud jsou zkříženě reagující epitopy podobné antigenu, který navodil imunizaci. Vzájemné spojení antigenu a protilátky ovlivňují různé faktory. Patří k nim: teplota, při které protilátka optimálně reaguje s antigenem a jež také určuje klinický význam protilátky (klinický význam je ekvivalentní hemolýze erytrocytů). Většina klinicky významných protilátek reaguje při teplotě 37 °C. Výjimkou jsou AB0 protilátky. Při vyšší teplotě může dojít k uvolnění protilátky z vazby na antigen, toho se využívá diagnosticky např. u elučních testů. Poměr množství antigenu a protilátky musí být vyvážený, má vliv na počet vznikajících komplexů. Základním požadavkem pro síly mezi molekulami je co nejtěsnější přiblížení antigenu a protilátky tak, aby se mezi nimi mohly uplatnit přitažlivé síly. Sílu vazby mezi dvěma částicemi, tedy míru afinity protilátky, lze vyjádřit pomocí tzv. rovnovážné konstanty, která je měřítkem pevnosti vazby (disociace molekul) a charakterizuje efektivnost této vazby. Při interakci antigenu a protilátky tedy vzniká rovnovážný stav, kdy je při vzájemné rovnováze rychlost asociace rovna rychlosti disociace. Při vysoké koncentraci protilátky, např. při jejím nadbytku, je inhibována aglutinace (efekt prozóny). Optimální pH prostředí je pro různé protilátky odlišné, ale obecně jsou používány testy s pH kolem hodnoty 7. Snížení pH zvyšuje disociaci protilátky z komplexu s antigenem. Doba inkubace je čas potřebný k dosažení rovnováhy mezi molekulami antigenu a protilátky. Pro různé protilátky závisí na třídě imunoglobulinu a schopnosti připojení protilátky ke specifickému antigenu. Přibližně 25 % z celkového množství protilátky se v solném roztoku naváže na antigen během prvních 15 minut, zbývajících 75 % v průběhu hodiny. Přidání dalších látek může ovlivnit množství protilátky, které se váže v prvních desítkách minut a zkrátit tím i celkový čas inkubace. Odpudivé síly mezi antigenem a protilátkou mohou být redukované snížením iontové síly prostředí. Obecně platí, že se snížením koncentrace NaCl dochází ke zlepšení vazby protilátky. Průběh reakce dále ovlivňuje počet (množství) antigenních epitopů a jejich vzájemná vzdálenost na membráně erytrocytu nebo imunologické vlastnosti protilátky. 23
1
1
Transfuzní lékařství
1.1.6
Imunohematologické testy
Principem imunohematologických testů je aglutinační reakce. V první fázi reakce erytrocytárního antigenu s protilátkou dojde ke spojení protilátky a antigenu, k tzv. senzibilizaci erytrocytu. Aby následně vznikla hemaglutinace je nutné, aby se protilátka navázala ještě na jiný erytrocyt, tzn. aby překlenula vzdálenost 7–8 nm, která odpovídá průměru erytrocytu. Vzdálenost mezi vazebnými místy pro antigen je u molekuly IgG maximálně 14 nm, u IgM 35 nm. S ohledem na tyto vzdálenosti může velká molekula IgM snadněji aglutinovat erytrocyty než molekula IgG. Navíc IgM protilátka má ve srovnání s protilátkou IgG pětkrát více vazebných míst. Pomocí aglutinace je možné vyšetřovat antigeny na erytrocytech (krevní skupiny) i protilátky proti erytrocytům v séru či plazmě. V přímé aglutinaci se uplatní ty protilátky, které jsou schopné překlenout vzdálenost mezi erytrocyty (erytrocyty od sebe oddělují odpudivé síly způsobené rozdílem v elektrickém potenciálu mezi negativně nabitými erytrocyty a pozitivními ionty v okolním prostředí, tzv. zeta potenciál) a svými Fab fragmenty spojí antigeny na sousedních erytrocytech (obr. 1.15). iontový mrak
bez aglutinace
erytrocyt
IgG 14 nm
25 nm
35 nm
IgG aglutinace
Obr. 1.15 Elektronegativní zóna – „zeta potenciál“ erytrocytů a jeho vliv na aglutinaci. Při neutrálním pH se erytrocyty nacházejí v negativním iontovém mraku a vzájemně se odpuzují. Tyto odpudivé síly se označují jako zeta potenciál. Tento potenciál musí protilátka překonat, aby došlo k aglutinaci (upraveno podle Blood bank antigens and antibodies [online], 2011) To je charakteristické pro IgM (obr. 1.16). IgM protilátky reagují typicky při nízké teplotě a používají se jako monoklonální nebo polyklonální protilátky k vyšetření antigenů krevních skupin. Jsou však známé i IgG, které přímo aglutinují erytrocyty, a to zvláště v situaci, kdy erytrocyty mají velký počet antigenních míst umístěných 24
Imunologie erytrocytů blízko sebe a malé molekule IgG se podaří sousedící erytrocyty spojit. K těmto patří např. protilátky anti-A, anti-B a anti-M. Aglutinační testy je možné provádět sklíčkovou metodou, zkumavkovým testem, metodou pevné fáze nebo technikou sloupcové aglutinace. Aglutinační test lze také kvantifikovat pro stanovení množství protilátky pomocí sériového ředění vzorku, ve kterém se stanovují protilátky, kdy se ke každému ředění séra přidá vždy konstantní množství antigenu. V tomto případě označujeme nejvyšší ředění, při kterém ještě nastala aglutinace, jako titr. Titrační vyšetření se používá většinou ke stanovení množství protilátky v séru těhotných žen nebo při vyšetření AB0 protilátek u dárců krve („high titre“ dárci s vysokým množstvím anti-A, anti-B) a při speciálních testech pro průkaz slabých antigenů nebo protilátek. Testy antiglobulinové (AGH testy, Coombsovy testy) jsou nejdůležitějšími imunohematologickými testy. Používají se k průkazu protilátek, které přímo neaglutinují erytrocyty výše popsaným způsobem, pouze erytrocyty senzibilizují. Podle této vlastnosti bývají označované jako inkompletní protilátky. Aby bylo možné tyto protilátky prokázat, přidává se do reakce další protilátka proti původní, senzibilizující protilátce. Tento anti-imunoglobulin (AGH sérum, antiglobulinové sérum detekující lidskou protilátku) následně zajistí vzájemné spojení jednotlivých senzibilizovaných erytrocytů a vizualizuje aglutinační reakci. Test rozlišujeme ve dvou provedeních – jako přímý nebo nepřímý antiglobulinový test (obr. 1.17, obr. 1.18 v barevné příloze).
Obr. 1.16 Princip aglutinační reakce, přímá vazba antigenu a protilátky (upraveno podle Mayer, Gene. Immunoglobulins-Antigen-Antibody reaction. Qualitative agglutination test. Immunology Chapter Seven [online], 2011) přímý antiglobulinový test promyté erytrocyty pacienta přidat antiglobulin centrifugace
negativní na erytrocytech není protilátka ani komplement
pozitivní protilátka nebo komplement jsou navázané na erytrocytech
nepřímý antiglobulinový test
přidat sérum pacienta
inkubace 37 ˚C
přidat antiglobulin
negativní v séru není protilátka
3 promytí centrifugace diagnostické erytrocyty
pozitivní v séru je protilátka
Obr. 1.17 Princip antiglobulinových testů: PAT, NAT (upraveno podle Coombs test Hinds Community College in Mississippi [online], 2011) 25
1
1
Transfuzní lékařství Přímý antiglobulinový test (PAT) detekuje erytrocyty senzibilizované protilátkou in vivo v organizmu. Používá se při průkazu imunitního typu hemolýzy u pa cientů po transfuzích, transplantacích, u potransfuzních reakcí, u hemolytického onemocnění novorozence, u pacientů s projevy autoimunity, respektive k laboratornímu průkazu autoimunitní hemolytické anémie. Nepřímý antiglobulinový test (NAT) slouží k průkazu protilátky proti erytrocytům, která se nachází volně v séru nebo v plazmě a kterou lze prokázat pomocí AGH séra až po inkubaci vyšetřovaného séra s antigeny erytrocytů. Je to test, který prokazuje klinicky významné nepravidelné protilátky proti erytrocytům, určuje kompatibilitu erytrocytů při předtransfuzním vyšetření a lze jím vyšetřovat antigeny některých krevních skupin. AGH sérum používané v antiglobulinových testech musí být komplexní, tzn. že musí obsahovat složku anti-IgG a anti-C3 proto, aby detekovalo protilátky IgG i protilátky závislé na komplementu, kterými jsou všechny patologické chladové protilátky. V některých situacích, vyžadujících objasnění nálezu, lze použít k vyšetření pouze anti-IgG složku, tzv. monospecifické AGH sérum. Modifikované AGH testy mohou obsahovat reagencie, které dalším způsobem usnadňují vznik imunitních komplexů, např. se přidává polyetylenglykol nebo roztok o nízké iontové síle. Nepřímý antiglobulinový test, ve kterém je suspenze erytrocytů připravena v roztoku LISS, se označuje jako LISS-NAT. AGH testy provedené zkumavkově nebo na pevné fázi vyžadují precizní provedení. Před přidáním AGH séra je nutné odstranit z vyšetřované suspenze veškeré reziduální proteiny, které se nenavázaly na erytrocyty a které mohou AGH sérum neutralizovat a vést k falešně negativnímu výsledku. Pro kontrolu správného provedení testu se proto přidávají k negativním testům kontrolní erytrocyty, kterými jsou erytrocyty senzibilizované IgG protilátkou. Pokud v reakčním prostředí zůstalo AGH sérum nespotřebované, reaguje s nimi pozitivní reakcí, která dokazuje validitu testu. Metoda sloupcové aglutinace v gelu zavedla „no-wash“ techniku, při níž tekutý gel mikrozkumavek, který obsahuje AGH, propouští pouze erytrocyty, nikoli sérum nebo plazmu. AGH proto nelze zneutralizovat zbytkovými proteiny a zřetelně a jednoduše bez promývání detekuje a vizualizuje erytrocyty s navázanou protilátkou. K průkazu senzibilizujících protilátek lze použít i enzymové testy, jejichž provedení sice není povinné, je však vhodné např. při vyšetření potransfuzních reakcí a u pacientů opakovaně transfundovaných s velkým rizikem imunizace. Z enzymů se nejčastěji používají papain, bromelin a ficin. Proteázy zvyšují schopnost protilátek aglutinovat erytrocyty různými způsoby, např. snižují elektronegativní náboj erytrocytů, redukují množství kyseliny sialové na povrchu erytrocytové membrány, odstraňují některé membránové antigeny, či uvolňují molekuly vody z povrchu erytrocytů. Detekci protilátek lze také usnadnit přidáním dalších komponent, např. albuminu, polybrenu nebo výše zmíněného roztoku o nízké iontové síle, tj. látek, které obecně vedou ke zmenšení vzdálenosti mezi erytrocyty nebo zesilují vazbu mezi antigenem a protilátkou. V imunohematologii lze použít i jiné typy testů (metody průtokové cytometrie nebo radioimunologickou analýzu), které se však s ohledem na jejich složité provedení nebo vysoké finanční náklady (při srovnání s aglutinačními testy) rutinně 26
Imunologie erytrocytů nevyužívají. Stále rozšířenějšími se v imunohematologii stávají metody molekulárně-genetické, kterými lze určit genotyp, rozpoznat polymorfizmy krevních skupin, definovat anomální skupiny, určit zygozitu, tzn. například předpovědět riziko hemolytického onemocnění novorozence, zajistit vhodné erytrocyty pro polytransfundované pacient y, umožnit přesné vyšetření genotypů u dárců krve – tedy obecně zvýšit imunologickou bezpečnost transfuze. Hodnocení aglutinačních reakcí Zjištění rozsahu aglutinace je důležité, agregáty erytrocytů musí být správně zhodnocené a zaznamenané. Stupeň aglutinace dává přehled o množství vzniklých imunitních komplexů. Způsob, jakým je prováděno resuspendování sedimentu erytrocytů při vyšetření ve zkumavkových testech je zásadní pro správné zhodnocení výsledků – nadměrné třepání fragilních aglutinátů vede k falešně negativním reakcím, naopak nedostačující resuspendování vede ke smíšeným reakcím. Pro hodnocení aglutinací je zavedený systém pro stanovení síly reakce, a to pro makroskopické a mikroskopické odečítání. Odečítání výsledků reakcí v testech sloupcové aglutinace má narozdíl od zkumavkových testů standardizovaný způsob hodnocení od 4+ reakce jako nejsilnější přes reakce typu dvojí populace, kdy nacházíme směs antigenně odlišných typů eryt rocytů až k negativní reakci (obr. 1.19 v barevné příloze).
1.2 Krevní skupiny Genetickou výbavu člověka tvoří 23 párů chromozomů. Jeden pár, u žen XX a u mu žů XY, obsahuje geny určující pohlaví. Zbývajících 22 párů jsou autozomy. Gen je úsek molekuly DNA, lokalizovaný na specifické pozici chromozomu, v tzv. lokusu. Pokud jsou lokusy s geny umístěné na stejném chromozomu, mluvíme o jejich cis pozici. Pokud jsou umístěny na opozitních chromozomech, jsou v trans pozici. V jednom lokusu se mohou nacházet alternativní geny, které označujeme jako alely (např. u krevní skupiny Kell jde o párovou alelu K a k). Alelický pár se skládá z jedné alely otcovské a jedné mateřské a přenos alel podléhá základním Mendelovým pravidlům dědičnosti. Alely mohou být dominantní nebo recesivní, přitom dominantní alela potlačuje projevy alely recesivní. Jestliže se u heterozygota projeví obě alely a navzájem se neovlivňují, jde o jejich kodominanci (např. alely krevních skupin A a B jsou vzájemně kodominantní a jejich fenotypovým projevem je krevní skupina AB). K alele 0 jsou však obě uvedené alely dominantní (genotypu A0 odpovídá fenotyp skupiny A, B0 fenotyp B). Alela 0 je vůči nim v postavení recesivním. Jedinec, který zdědí identické alely (KK, kk, AA, 00) je homozygot. Heterozygot má v každém lokusu neidentické alely (Kk, A0). U některých krevních skupin exprimují homozygotní erytrocyty více antigenu než heterozygotní a tento rozdíl můžeme zaznamenat při sérologickém vyšetření rozdílem v síle reakce jako tzv. efekt dávky (častý u Rh antigenů). Genotyp je soubor genů. Fenotyp je soubor morfologických a funkčních znaků jedince. Jako mutace označujeme změny genů. Genetická informace je obsažena v sekvenci DNA, odkud se přepisuje a převádí do struktury bílkovin. Přímým produktem genu se tak stává protein (pro sacharidové antigeny krevních skupin pro27
1
Transfuzní lékařství tein = enzym, který následně syntetizuje antigen, pro proteinové antigeny krevních skupin protein = antigen). Antigeny krevních skupin jsou proteiny, glykoproteiny nebo glykolipidy, zakomponované do membrány erytrocytů a lze je rozeznat pomocí specifických protilátek. Kromě erytrocytů se mohou vyskytovat i na jiných buňkách 0,5 h + 4 (obr. 1.20).
glykoforin A Band 3
vertikální interakce
1
ankyrin
Band 3
glykoforin C Band 3
Band 3 adducin
4.2
4.9 aktin
β-spektrin
p55
tropomyozin
α-spektrin
tropomodulin
horizontální interakce
Obr. 1.20 Struktura membrány erytrocytů (upraveno podle Sant-RaynPasricha. The Red Cell Membrane: structure and pathologie [online], 2011) Erytrocytární antigeny zastávají v buňce různé funkce. Strukturální glykosylující membránové proteiny a lipidy (krevní skupiny AB0, H, I, Lewis, P) jsou integrované do membrány erytrocytů a pomáhají udržet tvar erytrocytů. Funkční proteiny (Rh, Kidd, Colton, MNS, Lutheran, Kell, Ch/Rg) se účastní transportu v buňce, mají enzymatickou aktivitu, regulují komplement, slouží jako receptory pro ligandy, uplatňují se v adhezi.
1.2.1
AB0 systém
Systém byl poprvé popsán v roce 1901 Landsteinerem, který rozlišil tři krevní skupiny A, B, C (později reklasifikované na A, B, 0) a postavil tak základy praktické imunohematologie. Za dva roky poté byla objevena další a poslední krevní skupina AB. Postupně bylo rozpoznáno chemické složení AB0 antigenů a způsob jejich dědičnosti a antigeny AB0 se staly nejvýznamnějším systémem krevních skupin. S ohledem na jejich přítomnost v různých tkáních a v sekretech jsou označované jako histokompatibilní antigeny. V objevu AB0 systému figuruje i jméno českého lékaře Jana Janského. Chemické složení AB0 antigeny jsou oligosacharidy složené z řetězců jednoduchých cukrů: D-glukózy, D-galaktózy, D-manózy, N-acetyl-D-glukosaminu, N-acetyl-D-galaktosaminu a L-fukózy. Jsou součástí glykoproteinů a glykolipidů v membráně erytrocytů a jejich 28
Imunologie erytrocytů rozpustná forma je také obsažena v sekretech. Podle typu chemické vazby koncového sacharidu rozeznáváme čtyři typy oligosacharidových řetězců: řetězec typu 2 je typický pro membránu erytrocytů, řetězec typu 1 se nachází převážně v sekretech, tělních tekutinách a různých tkáních, ale může být odsud adsorbovaný i na erytrocyty. Řetězci typu 3 a 4 se vzájemně odlišují podskupiny A1 a A2. Dědičnost Dědičnost A a B genu se projevuje expresí A a B antigenů na erytrocytech. Antigeny A, B a H nejsou, na rozdíl od jiných krevních skupin, přímým produktem genu. Přítomnost genu podmiňuje syntézu enzymu – glykosyltransferázy, která katalyzuje přenos a připojení molekul monosacharidu specifického pro danou krevní skupinu ke galaktóze prekurzorové substance, k tzv. H antigenu. Biochemická aktivita transferáz tedy spočívá v tom, že v závislosti na AB0 alele připojují imunodominantní oligosacharid k H antigenu (obr. 1.21 v barevné příloze). Vlivem genu H dochází k syntéze H-transferázy, která připojením fukózy ke galaktóze v oligosacharidovém řetězci dává vznik prekurzorovému H antigenu. Ten je imunodominantním monosacharidem pro krevní skupinu 0 a nevykazuje žádnou antigenicitu. Je receptorem (prekurzorem) pro další sacharidy specifické pro krevní skupinu A nebo B. Gen A umožňuje vznik A transferázy, která katalyzuje připojení N-acetyl-galaktosaminu (GalNAc) k H antigenu, tj. galaktosamin je terminálním a imunodominantním monosacharidem pro A antigen. Vlivem genu B se syntetizuje B transferáza, která specificky připojuje D-galaktózu (Gal) k H antigenu, tzn. pro B antigen je galaktóza terminálním imunodominantním monosacharidem (obr. 1.22 v barevné příloze). Gen 0 u jedinců skupiny 0 je amorfní, tichá alela, u které nebyl zjištěný proteinový produkt a zřejmě nemá transferázovou aktivitu. Proto nedochází k připojení žádného dalšího monosacharidu k receptorové H substanci. Antigeny H a A, B jsou vzájemně geneticky nezávislé, jejich geny se nacházejí na různých chromozomech (geny AB0 na 9. chromozomu, gen FUT1 pro H-fukosyl transferázu na 19. chromozomu). Pokud gen FUT1 chybí, nevzniká H-transferáza ani H antigen a také nemůže dojít k připojení A nebo B imunodominantního monosacharidu k H prekurzoru. Těmto jedincům, kteří mají hh genotyp, zcela chybí na membráně erytrocytů antigeny H, A a B (fenotyp Bombay). ABH antigeny jsou syntetizované převážně na prekurzorech erytrocytů v hematopoetické tkáni. Jen přibližně 1 % antigenů je na erytrocyty adsorbované z plazmy. ABH antigeny s řetězcem typu 2, které vznikají na erytrocytech (tyto antigeny se po transplantaci mění na fenotyp dárcovský) jsou geneticky kontrolované pouze ABH geny. ABH antigeny s typem 1 řetězce, které se na erytrocyty adsorbují z plazmy, jsou závislé na ABH genech a současně i na sekretorských Se genech. Sekretorství Přibližně 80 % osob tvoří H, H a A nebo H a B antigeny, které jsou rozpustné ve vodě a jsou přítomné ve slinách, sekretech a různých tělních tekutinách. Sekrece těchto solubilních AB0 antigenů je řízená sekretorským genem, který je nezávislý na genech H, A a B. Gen Se a jeho druhá recesivní alela se nemají přímý vliv na transferázy, pouze ovlivňují přítomnost nebo deficit H substance v sekretech. Pro vylučovatelství 29
1
1
Transfuzní lékařství je zásadní alespoň jeden Se gen: sekrety jedinců, kterým chybí (homozygoti sese), neobsahují H, A nebo B antigeny. Gen Se nijak neovlivňuje H, A a B transferázy v hematopoetických tkáních a vznik antigenů na erytrocytech. Laboratorní detekce H, A nebo B antigenu ve slinách sekretora může přispět k průkazu slabé krevní skupiny (používá se test inhibice hemaglutinace). AB0 fenotypy Různé alely AB0 lokusu umožňují vznik transferáz s odlišnými vlastnostmi. Nejčastějšími A fenotypy jsou podskupiny A1 a A2 , mezi kterými existují kvantitativní i kvalitativní rozdíly. Například A1 má kromě antigenu A navíc antigen A1. A1 má také větší počet antigenních míst; odlišuje se reakcí s lektiny (tab. 1). Tab. 1 Reakce odpovídající fenotypům A1 a A2 počet antigenních Dg. sérum Dg. sérum lektin AB0 protilátky míst na erytrocytu anti-A anti-A1 anti-H podskupina A1
4+
4+
0
anti-B
900 × 103
podskupina A2
4+
0
3+
anti-B někdy anti-A1
250 × 103
A3 a další vzácné podskupiny (např. A x, Am, Ael aj.) vznikají při mutacích alel, kdy se vzniklé transferázy liší typem řetězce, vykazují nízkou biologickou aktivitu a A antigeny proto bývají slabě exprimované na erytrocytech. Transferáza u jedinců skupiny B má obvykle uniformní vlastnosti. Vzácnému genotypu odpovídají fenotypy deficitní pro H antigen. Homozygotní mutace genu FUT1 vede k tomu, že nevzniká H substance a chybí tak prekurzor pro syntézu A nebo B antigenu. Erytrocyty se fenotypově projevují jako skupina 0. Jedinci s tímto typem mutace mohou být sekretoři nebo nonsekretoři. Nonsekretoři (typ Bombay) tvoří pravidelně protilátku anti-H a protilátky anti-A a anti-B. Protilátka anti-H je imunní, může vést k hemolýze erytrocytů exprimujících H antigen a pro tyto jedince je problematické zajistit vhodnou transfuzi. U sekretorů s touto mutací se antigen H prokáže v sekretech, ale nenachází se na erytrocytech. Tito nemají protilátku anti-H, ale protilátku anti-HI (podobně jako bývá u A1 skupiny), která nemusí mít hemolytické vlastnosti. Ke změnám AB0 antigenů může dojít u některých onemocnění, kdy např. u pacientů s akutní leukemií lze pozorovat zeslabení A antigenu. U infekcí zažívacího traktu, pokud bakteriální enzymy přítomné v krvi odštěpí acetylovou skupinu N-acet yl-D-galaktosaminu z antigenu A, je vzniklý galaktosamin podobný struktuře B antigenu a reaguje s diagnostickými séry používanými pro průkaz skupiny B (tzv. získaný B antigen u skupiny A). Unikátní situací je fenotyp cisAB, při kterém se oba AB antigeny dědí od jednoho rodiče (transferáza má duální aktivitu A i B). Změny v antigenech lze pozorovat také u pacientů po transfuzích, při fetomaternálním krvácení nebo u příjemců alogenních hematopoetických buněk, u nichž je možné detekovat různé smíšené fenotypy (chimérické skupiny) podle typu přítomných erytrocytů. Funkce sacharidových antigenů není definitivně objasněná, avšak předpokládá se jejich účast v první linii obrany buněk při invazi patogenů. 30
Imunologie erytrocytů AB0 antigeny jsou zařazené do systému proto, že se v rámci určité skupiny vyskytuje pravidelný nález na erytrocytech i v séru. K AB0 skupinovému systému patří čtyři základní fenotypy: A, B, 0 a AB. Celosvětově nejrozšířenějšími skupinami jsou skupiny 0 a A, v populaci méně zastoupené jsou B a AB. Četnost výskytu se však liší podle oblastí, regionálně i rasově, v České republice je nejběžnější krevní skupina A (obr. 1.23). 60 % 50 %
57 % 50 % 45 % 40 %
40 %
41 %
31 %
30 %
26 %
28 %
26 % 20 %
20 % 11 %
10 %
10 % 3% 4% 2%
0%
0 Kavkazané
A Afroameričané
B Latinoameričané
6%
AB Asiaté
Obr. 1.23 Zastoupení krevních skupin v závislosti na příslušnosti k lidské rase Vyšetření AB0 skupiny Sérologické určení krevní skupiny spočívá v průkazu A a B antigenu na erytrocytech a pravidelných AB0 protilátek v séru (plazmě). U jednoho jedince se současně nevyskytuje antigen a protilátka proti němu (obr. 1.24 v barevné příloze). Anti-A a anti-B jsou dvě pravidelně se vyskytující protilátky, které vznikají přirozenou imunizací jedince substancemi podobnými antigenům A, B (pravděpodobně protilátky proti bakteriálním antigenům) a nachází se u jedince v závislosti na jeho krevní skupině. Výjimkou, kdy protilátky chybí, jsou novorozenci (jejich sérum obsahuje převážně mateřské protilátky). Množství AB0 protilátek se zvyšuje s věkem a kolem 5. roku života dosahuje normálních hodnot. Někdy vedou ke změně protilátek některé patologické stavy (protilátkový deficit, slabé skupiny). AB0 protilátky jsou většinou imunoglobuliny třídy IgM, mohou se vyskytovat i jako IgG nebo IgA izotypy. Protilátka anti-A, B (společná protilátka proti antigenu A i B) se nachází u jedinců skupiny 0 a má charakter IgG imunoglobulinu (hemolyzinu). Anti-A a anti-B protilátky aglutinují A nebo B erytrocyty v solné suspenzi při pokojové teplotě a v přítomnosti komplementu mohou vést k hemolýze. Imunizací jedince (těhotenství, transfuze) může dojít ke vzniku imunních protilátek anti-A a anti-B, které mohou mít vysoký titr a mohou být příčinou hemolýzy. Obvykle se s nimi setkáme u skupiny 0, méně často u skupiny A nebo B. Tento typ protilátek se uplatňuje v etiologii hemolytického onemocnění novorozence, potransfuzních reakcí a u pacientů po transplantaci orgánů. Nepravidelná protilátka anti-H, někdy přítomná u jedinců skupiny A1, je jiným typem protilátky, než byla zmíněná u H-deficitního fenotypu Bombay. Vyskytuje se jako protilátka aglutinující erytrocyty při pokojové teplotě, není imunní a reaguje 31
1
1
Transfuzní lékařství s antigenem H, tj. s antigenem přítomným na erytrocytech 0 a na erytrocytech slabých A skupin. Nebývá klinicky významná. Další nepravidelnou protilátkou v rámci A skupiny je anti-A1, která také reaguje jako chladová, málokdy jako imunní protilátka s erytrocyty A1 a lze ji nalézt u některých jedinců podskupiny A2. Pokud nekomplikuje test kompatibility, není považovaná za důležitou protilátku. Rutinní laboratorní vyšetření AB0 skupiny zahrnuje vyšetření A a B antigenů (aglutinogenů) na erytrocytech a stanovení AB0 protilátek (aglutininů) v séru nebo v plazmě. Erytrocyty se vyšetřují minimálně pomocí monoklonálních anti-A a anti-B diagnostických protilátek, přitom diagnostické sérum anti-B nemá detekovat získaný B antigen. Testy se provádějí při pokojové teplotě na sklíčku, ve zkumavce, v gelu nebo na mikrotitrační desce. AB0 protilátky se stanovují pomocí A1 a B diagnostických erytrocytů, vhodné je zařadit autokontrolu nebo kontrolní 0 erytrocyty, které mohou být přínosné pro vyšetření u některých pacientů s protilátkami. Pokud nález při vyšetření antigenů a protilátek koresponduje, lze výsledek krevní skupiny uzavřít. Objeví-li se diskrepance, je nutné problém objasnit. Je vhodné vyžádat si nový krevní vzorek, aby byl k dispozici materiál pro konfirmaci testu v případě, že pacientovi musí být neodkladně podané univerzální erytrocyty. Pokud jde o nesrovnalost při vyšetření krevní skupiny dárce, erytrocyty nelze až do vyřešení problému použít k hemoterapii. K diskrepantním výsledkům může dojít v rámci technických chyb, při abnormalitách erytrocytárních antigenů nebo vyšetřovaného séra či plazmy. Technické chyby nebývají častou příčinou problémů. Obvykle jde o chyby v identifikaci vzorků nebo jiného materiálu použitého v testech nebo o chyby v dokumentování výsledků. Může dojít k opomenutí přidání diagnostik do reakce a k získání falešně negativních výsledků. Kontaminace diagnostik i vzorku může způsobit falešně pozitivní nebo negativní výsledky. Použití reagencií v nesprávně zvoleném poměru nebo špatně zvolená centrifugace může být také příčinou chybně pozitivního i negativního výsledku. Někdy může vést k falešně pozitivní reakci použitý materiál (např. skleněná zkumavka). Problémy při vyšetření erytrocytárních antigenů mohou nastat u mimořádně vysoké koncentrace sérových bílkovin nebo jiných makromolekul ve vyšetřovaném vzorku, když se použijí erytrocyty resuspendované ve vlastním séru. To může vést k falešně pozitivním výsledkům. Recentně transfundovaní pacienti nebo příjemci hematopoetických buněk mohou vykazovat nález dvojí populace erytrocytů – vlastních a dárcovských. Problematické může být vyšetření polyaglutinabilních erytrocytů. Erytrocyty s navázanými autoprotilátkami typickými pro pacienty s autoimunitní hemolytickou anémií také mohou poskytovat falešně pozitivní reakce s diagnostickými séry. Jindy mohou být antigeny na membráně slabě exprimované, může se jednat o získané antigeny. Vysoká koncentrace solubilních A, B substancí v séru pacienta může při testování erytrocytů resuspendovaných ve vlastním séru inhibovat reakci diagnostické protilátky. Problémy při vyšetření AB0 protilátek se objevují při změnách v sérových proteinech nebo při abnormálních proteinech, např. u příjemců náhradních vysokomo32
Imunologie erytrocytů lekulárních roztoků nebo kontrastních látek. Problémy dále nastávají, jestliže jsou přítomné nepravidelné protilátky, které reagují s jinými antigeny než A1 a B a také při nepravidelných protilátkách anti-A1 a anti-H. Atypické nálezy nacházíme u příjemců AB0 neshodných transplantátů, po výměnné plazmaferéze s použitím jinoskupinové plazmy pro náhradu objemu, u pacientů s protilátkami proti složkám reagentů použitých při testování. Řešení neshod spočívá v první řadě v opakování celého vyšetření doplněného o kontroly. Vyšetření provedené z nového vzorku pomůže odhalit chyby ve značení vzorků nebo kontaminované vzorky. Promytí erytrocytů, provedení přímého antiglobulinového testu, použití speciálně vybraných erytrocytů do reakce se sérem (např. I negativní pupečníkové erytrocyty), vyšetření při jiných teplotách, reakce s dalšími diagnostiky (např. s anti-AB, -A1, -H), doplňující adsorpční, eluční, inhibiční techniky nebo genetické vyšetření je možné použít podle individuální situace. Transfuze AB0 inkompatibilních erytrocytů (tzv. velká inkompatibilita) vede k akutní hemolytické potransfuzní reakci a může být příčinou selhání ledvin i smrti. AB0 protilátky bývají zdrojem komplikací při transplantacích neshodných v AB0 antigenech – mohou být příčinou pozdního přihojení a insuficientní krvetvorby, příčinou rejekce solidního orgánu. Erytrocyty skupiny 0 jsou považované za „univerzální“ a jejich transfuze příjemci skupiny A nebo B představuje kompatibilní transfuzi v situaci, kdy stejnoskupinové erytrocyty nejsou dostupné nebo není známá krevní skupina příjemce. Plazma skupiny AB je ekvivalentní „univerzální“ náhradě plazmy (tab. 2). Tab. 2 Jednotlivé krevní skupiny – AB0 antigeny, AB0 protilátky, výběr shodných a kompatibilních erytrocytů krevní skupina
AB0 antigeny
AB0 protilátky
AB0 shodné erytrocyty
AB0 kompatibilní erytrocyty
0
H
anti-A, anti-B
0
0
A
A
anti-B
A
A, 0
B
B
anti-A
B
B, 0
AB
A, B
žádné
AB
AB, A, B, 0
1.2.2
Rh systém
Rh systém je druhým nejvýznamnějším systémem krevních skupin. Byl objevený Landsteinerem v roce 1939, když v séru ženy po porodu byla nalezena protilátka proti paternálnímu antigenu plodu. Protilátka byla příčinou hemolytické reakce na transfuzi krve od jejího manžela. Ve stejné době byla v séru králíků v experimentu imunizovaných krvinkami opice Macacus rhesus nalezena protilátka, která reagovala jak s antigenem opičích erytrocytů, tak i s většinou lidských erytrocytů. Později však nebyla potvrzena identita této králičí anti-rhesus protilátky s protilátkou lidskou a heteroprotilátka byla přejmenovaná na anti-LW, zatímco lidská protilátka na anti-D. K nejvýznamnějším a nejznámějším antigenům Rh systému, kterých je rozpoznaných více než padesát, patří antigeny D, C, c, E a e. Jedinci s exprimovaným 33
1
1
Transfuzní lékařství D antigenem se označují jako RhD pozitivní (D pozitivní), jedinci s chybějícím D antigenem jako RhD negativní (D negativní). Proti Rh antigenům se nevytváří přirozené protilátky (vzácně bývá anti-E), vznik Rh protilátek předpokládá antigenní stimulaci imunitního systému jedince např. transfuzí nebo těhotenstvím. Rh antigeny kódují dva homologní geny RHCE a RHD, které podléhají autozomálně dominantnímu typu dědičnosti a jsou umístěné na 1. chromozomu. Rh antigeny se dědí „en bloc“ jako set genů jednoho chromozomu (otce a matky). Tři páry alel D/d, C/c, E/e umožňují vznik 8 haplotypů (DCe, dce, DcE, Dce, dcE, dCe, DCE, dCE) a kombinaci 36 odlišných genotypů. Sérologickými vyšetřeními pomocí protilátek anti-D, -C, -c, -E, -e lze rozeznat pouze 18 fenotypů, protože neexistuje sérum anti-d k odlišení homozygozity D/D nebo hemizygozity D/d a také nelze odlišit cis pozici D vůči C (c) u heterozygotních forem (např. DCe/dce od Dce/dCe). Pořadí nejfrekventovanějších haplotypů je DCe, dce, Dce, dCe, DcE, dcE, DCE až dCE. V upraveném označení jde o fenotypy R1, r, Ro, r´, R 2, r´´, R Z, r y (velké písmeno R pokud je antigen D vyjádřený, malé r pokud antigen D chybí) (tab. 3). Tab. 3 Komplexy Rh genů a korespondujících antigenů haplotyp
geny
antigeny
fenotyp
R
RHD, RHCe
D, C, e
R1
1
r
RHce
c, e
r
2
RHD, RHcE
D, c, E
R2
R0
RHD, RHce
D, c, e
R0
r´
RHCe
C, e
r´
R
r´´
RHcE
c, E
r´´
Rz
RHD, RHCE
D, C, E
Rz
ry
RHCE
C, E
ry
Používání zkrácené terminologické verze má svůj význam v transfuziologii jako prostředek k jednoduchému vyjádření Rh fenotypu. Zastoupení Rh antigenů se liší u různých populací. V kavkazské populaci převažuje typ D+C+c+E-e+. Tento fenotyp může odpovídat genotypu DCe/Dce nebo Dce/dCe nebo DCe/dce. Pro kavkazskou populaci je nejpravděpodobnější genotyp DCe/dce. Nejdůležitějším antigenem Rh systému je antigen D, který je také významným imunogenem. Protilátku anti-D po transfuzi D pozitivních erytrocytů vytváří více než 30 % D negativních příjemců transfuze. Původní vyjádření pro přítomnost nebo chybění antigenu D bylo označení Rh pozitivní a Rh negativní. Přibližně 85 % Evropanů je D pozitivních, Afričanů asi 95 %. Pokud RhD protein chybí, nacházíme D negativní fenotyp. U naší populace je to výsledek homozygotní delece genu. U Afričanů gen nechybí, jejich gen je inaktivní, tzv. pseudogen, který neumožňuje vznik proteinu. Lidé D pozitivní mohou být pro antigen D homozygoti (D/D) nebo hemizygoti (D/d). RH lokus znázorňují obrázky 1.25 a 1.26. K označení antigenů, proteinů a genů Rh systému byly vytvořené různé nomenklatury. Běžně se používá tradiční nomenklatura alfabetická (antigeny D, C, E), kdy se antigeny zapisují v pořadí DCE. Přestože antigen antitetický k antigenu D neexistuje, písmeno d se používá k označení D negativního fenotypu. 34
Imunologie erytrocytů RH LOKUS RHD Rh pozitivní
RHCE
5
Rh negativní
3
deleted RHD
ce, Ce, cE nebo CE
5
3
ce
5
C/c Ser103Pro
Rh proteiny RhD
3
E/e Pro226Ala
RhCE 32–35 rozdílů aminokyselin
Obr. 1.25 RH geny, Rh proteiny, Rh antigeny. Dva geny RHD a RHCE kódují RhD a RhCcEe proteiny. RHD je duplikovaný gen, jeho delece je příčinou D negativního fenotypu. Rh proteiny prostupují membránou erytrocytu a vytvářejí šest extracelulárních kliček. Rh antigeny jsou lokalizované na Rh proteinech (upraveno podle Chou, ST., Westhoff, CM. Molecular biology of the Rh system: clinical considerations for transfusion in sickle cell disease [online], 2011) RHD
SMP1
RHCE
A extracelulární
B
intracelulární
Obr. 1.26 Geny RhD a RhCE. Dva vysoce homologní geny jsou opozitně orientované. Oba obsahují deset exonů. RHD gen obklopují z obou stran Rh boxy orientované stejným směrem. Mezi geny je umístěný další gen SMP1, který kóduje protein ze skupiny malých membránových proteinů (upraveno podle Flegel, WA., Wagner, FF. Molecular Biology of partial D and weak D: Implications for Blood Bank Practice. Clin. Lab. [online], 2011) Teorie dědičnosti Podle Fischera a Raceho jsou antigeny Rh systému D, C, E, c, e závislé na třech párech genů nebo alel: D/d, C/c nebo E/e. Alela D je dominantní k alele d, ale Cc a Ee jsou alelami kodominantními. 35
1
1
Transfuzní lékařství Wienerova teorie předpokládá jeden Rh gen a jeden aglutinogen, složený z více faktorů. Např. gen R1 tvoří aglutinogen Rh1 (vlastně haplotyp), který se skládá ze tří faktorů rh´, Rh(o), hr´´ (analogie antigenů D, C, e). Alternativní Tippetova teorie z roku 1986 připouští existenci dvou Rh lokusů, kdy dvě alely prvního genu kódují D antigen a čtyři alely druhého genu antigeny C/c a E/e, které se kombinují do typů ce, Ce, cE, CE. Správnost této teorie dědičnosti následně potvrdily molekulárně genetické studie. Kromě výše uvedených se používá, zvláště při písemném a počítačovém zpracování, číselná nomenklatura Rosenfieldova, která přiřazuje jednotlivým Rh antigenům číslice. Např. pokud antigen D chybí, je označený Rh:-1, pokud je přítomný Rh:1. Rh geny, Rh antigeny Rh antigeny jsou kódované dvěma geny: genem RHD pro expresi antigenu D a genem RHC pro antigeny C, c, E, e. Oba Rh geny mají 10 exonů a jsou z 94 % shodné. Geneticky úzce vázané geny jsou na chromozomu opozitně orientované, což usnadňuje jejich párování v cis pozici a mají přilehlé 3´ konce. Jsou vzájemně oddělené malým genem s nejasným významem SMP1. Gen RHD je z obou stran ohraničený shodně orientovanými Rh boxy. RHD a RHCE se vzájemně liší nejčastěji v intronu 4 (delece) nebo v intronech 2, 8 (polymorfizmy). RhD a RhCcEe proteiny se odlišují pouze v 31–35 aminokyselinách. Rh proteiny prochází dvanáctkrát membránou erytrocytu a vytvářejí 6 extracelulárních domén (kliček), na nichž se nachází Rh antigeny. Antigeny jsou závislé na tvaru proteinu: změny aminokyselin mohou vést ke změnám proteinu a mohou být příčinou změny antigenu nebo vzniku zcela nového antigenu. Rh proteiny souvisí s RhAG (Rh-associated glycoprotein). Tento protein sice nenese antigeny, avšak jeho přítomnost je nutná k tomu, aby se všechny Rh antigeny na erytrocytu exprimovaly. Rh antigeny vytvářejí s RhAG vzájemně spojený tetrametrický komplex (obr. 1.27 v barevné příloze). Oba Rh geny se mohou navzájem ovlivňovat. Pokud jeden gen působí na druhý na stejném chromozomu tak, že dochází ke zvýšení nebo snížení množství antigenu, mluvíme o cis efektu. Pokud gen jednoho chromozomu ovlivňuje gen druhého chromozomu v homologním páru, jedná se o trans efekt. Např. při cis efektu dochází k zeslabení exprese E antigenu u DcE/dce. Většina transpozičních efektů spočívá v zeslabení D antigenu, pokud se nachází alela C v transpozici k alele D, např. Dce/ dCe. Jiné případy zesílení D antigenu u D--, Dc- a odvozených typů zase vyplývají ze zvýšeného počtu antigenních míst na erytrocytu. Počet antigenních míst lze zjistit pomocí průtokové cytometrie. Některé změny genů se mohou manifestovat jako tzv. variantní D antigeny, které nejčastěji vznikají v důsledku mutací RHD nebo při vzniku hybridních genů spojených s výměnou genetického materiálu mezi RHD a RHCE. Lze rozeznat kolem 170 alel RHD, z toho více jak 130 je spojeno se slabou expresí D antigenu, dalších asi 65 jsou parciální D alely. Všechny změny nelze sérologickým vyšetřením rozpoznat, lze je kategorizovat molekulárně-genetickým vyšetřením. Normální D antigen sestává z více jak 30 částí, označovaných jako epitopy. Variantní D antigeny (tab. 4) lze zásadně rozdělit do dvou kategorií, které se vzájemně liší počtem antigenních míst na erytrocytu a změnami D epitopů. Jsou jimi slabé 36
Imunologie erytrocytů D antigeny (Dweak) (obr. 1.28 a 1.29) a varianty antigenu D (Dvariant) (obr. 1.30). K další kategorii bývají řazeny typy DEL, které jsou charakterizované velmi slabým D antigenem, který lze prokázat pouze po adsorpci-eluci v nepřímém antiglobulinovém testu. Tab. 4 Variantní D antigeny Příčina: Dweak Mutace genu vede k záměně (Dw, dříve označení Du) aminokyselin D proteinu v jeho cytoplazmatické nebo membránové části. V kavkazské populaci nejčastější typy 1, 2, 3.
Kvantitativní varianta antigenu – kompletní antigen, ale s redukovaným počtem antigenních míst. Odlišná reaktivita s anti-D séry. Není riziko vzniku anti-D. Jedince lze považovat za D+ (dárce, příjemce i těhotnou).
Dvariant (Dvar)
Kvalitativní změna antigenu – nekompletní antigen, chybí jeden nebo více D epitopů. Odlišná reaktivita s anti-D séry. Riziko vzniku anti-D u některých variant. Bez specifikovaného typu varianty je jedinec považovaný za D(nikoliv dárce krve, ten je zařazený jako D+). Těhotné podat RhIg profylaxi.
Příčina: Mutace RHD nebo hybridní gen vede k alteraci proteinu v jeho extracelulární části. V kavkazské populaci nejčastěji varianta DVI.
typ 11 (M295I) typ 15 (G282D) typ 5 (A149D)
typ 12 (G277E)
typ 9 (A294P) typ 8 (G307R)
Dol (Exon 9 deletion) typ 2 (G385A) typ 6 (R10Q)
typ 10 (W393R)
typ 3 (S3C)
typ 13 (A276P)
typ 4 (T201R; F223V) typ 14 (S182T; K198N; T201R)
typ 1 (V270G)
typ 7 (G339E)
typ 16 (W220R)
Obr. 1.28 Příklady některých typů mutací RhD, které jsou typické pro Dweak fenotypy (upraveno podle Avent, ND., REID, ME. The Rh blood group system: a review. Molecular basis of weak D phenotypes [on line], 2011) erytrocyty s normálním množstvím D antigenu
Dweak
Obr. 1.29 Kvantitativní rozdíl mezi Dweak a normálním D antigenem (upraveno podle Wilkins, RN. Rh Blood Group System: Part II [on line], 2011) 37
1
1
Transfuzní lékařství
chybějící část antigenu (epitop) u parciálního D
Obr. 1.30 Změny na membráně erytrocytu u Dweak a Dvariant (upraveno podle Wil kins, RN. Rh Blood Group System: Part II [on line], 2011) Rh antigeny se objevují na erytropoetických buňkách v časné fázi jejich diferenciace. Na fetálních erytrocytech jsou exprimované od 6. týdne. Buněčná funkce Rh proteinů není zcela jasná: účastní se transportu amoniaku a jiných kationů, zřejmě zajišťují strukturální funkci buňky a účastní se také výměny CO2 a O2. Na odpovídajících místech Rh proteinu se antigeny nachází v počtu desítek tisíc molekul na jeden erytrocyt. Pro normální D antigen je antigenní denzita 13 000–24 500, pro variantu DVI odpovídá 1000–14 000, pro DVII je 8390, u weak D typ 1 se udává 533–1285, weak D typ 2 potom 446–950, weak D typ 15 má 133–297 antigenů, weak D typ 4.2 kolem 1650. Nízká antigenní denzita pod 400 je rizikem pro vznik aloprotilátky anti-D. Rh antigeny jsou závislé na genotypu a fenotypu a na homozygocii nebo heterozygocii pro daný antigen (při sérologickém vyšetření již zmiňovaný efekt dávky). Antigen D U D negativní kavkazské populace (přibližně 15 % populace) chybí D protein a tedy všechny epitopy D antigenu při homozygotní deleci RHD genu. U černochů RHD gen sice nechybí, je kompletní, ale je inaktivní (tzv. pseudogen) a nekóduje D protein ani D antigen. Jinou možností vzniku D negativního fenotypu jsou hybridní geny. Exprese D antigenu na erytrocytu se liší kvantitativně od nejsilnějšího u D-- ke slabšímu Dw. Extrémně slabá je u DEL fenotypu. Snížení síly D antigenu odpovídá pořadí fenotypů: DcE/DcE > Dce/DcE > Dce/Dce > DcE/dce > Dce/dce. Antigeny C, c, E, e Polymorfizmus C/c je dán substitucí 4 aminokyselin proteinu RhCcEe, polymorfiz mus E/e vzniká při záměně pouze jediné aminokyseliny. U DCE haplotypu vzniká slabé C. Cu, Ew jsou vzácnější antigeny. Společné CE antigeny Společné CE antigeny vznikají, když jsou antigeny c a e, C a e, C a E nebo c a E tvořené stejným RHCE genem. K těmto společným antigenům patří antigen ce (f), Ce, CE, cE. Antigen G Antigen G se nachází téměř na všech RhD i RhC proteinech, zato erytrocyty rG/dce jsou velmi vzácné. Protilátka specifická jako anti-C+D může obsahovat anti-G složku, kterou lze izolovat adsorpcí rG/dce krvinkami. Anti-C+G může být příčinou lehčího typu HON. Stejnou protilátku si může vytvořit i D negativní příjemce D- C+ erytrocytů, přitom tato anti-C+G napodobuje specifitu anti-C+D. 38
Imunologie erytrocytů Antigeny Cw a Cx Antigeny Cw a Cx vznikají při změnách proteinu jako málo četné antigeny. Cw+ erytrocyty jsou skoro vždy C+, ale C antigen je na nich exprimovaný slaběji. Obvykle je Cw typ spojovaný s haplotypem DCe. Vyšetření antigenu D (určení RhD) K sérologickému určení D antigenu se používají monoklonální protilátky, přičemž každá protilátka detekuje určitý epitop (epD). Pomocí těchto anti-epitopových protilátek lze rozlišit přibližně 30 epitopů. Všechny tyto diagnostické protilátky však nejsou běžně dostupné. Rozlišení výše uvedených atypických expresí D antigenu se provádí kombinací sérologického vyšetření a vyšetření DNA, které pomůže kategorizovat variantní antigeny. Rutinně se D antigen při laboratorním vyšetření prokazuje dvojím vyšetřením erytrocytů pomocí IgM monoklonálních anti-D diagnostických protilátek (použijí se dvě diagnostická séra obsahující různé klony protilátek proti odlišným epitopům). Vyšetřuje se v solném testu při pokojové teplotě. Pokud se vyšetření provádí automatizovaně s použitím čárových kódů pro značení vzorků, lze použít k vyšetření pouze jedno diagnostické sérum. Podle doporučení výrobce se jako součást testu používá kontrolní diagnostikum, tzv. Rh kontrola, která je určena k vyloučení falešně pozitivních výsledků. Pro vyšetření pacientů (včetně těhotných žen) nesmí použitá anti-D reagovat s erytrocyty kategorie DVI proto, aby jedinci s DVI variantou, která je nejčastějším typem parciálního D v naší populaci, mohli být označeni jako D negativní. Naopak při vyšetření dárců krve musí být zajištěné, aby dárci s variantním D antigenem byli vedeni jako D pozitivní a jejich krev byla použita k léčbě D pozitivních pacientů. Proto jsou kladeny jiné požadavky na anti-D séra používaná pro vyšetření dárců krve ve srovnání s diagnostickými séry pro vyšetření pacientů (a těhotných): nepřímý antiglobulinový test, který se používá k průkazu variantního D antigenu, je povinnou součástí vyšetření skupiny u dárců krve, zatímco u pacientů a těhotných žen se toto došetření neprovádí. Na variantní D antigen může upozornit slabší reakce obou anti-D sér, odlišné reakce nebo rozdíl v síle reakcí jednotlivých sér, také rozdílné anamnestické údaje o vyšetření antigenu. Rh protilátky Rh protilátky patří ke klinicky významným protilátkám. Vznikají jako odpověď na imunizaci transfuzí nebo těhotenstvím, vzácně lze nalézt i přirozené protilátky. Jejich klinický význam spočívá v tom, že mohou vést k hemolýze krve neshodné s příjemcem v Rh antigenech nebo k hemolytickému onemocnění fetu a novorozence při jeho inkompatibilitě v Rh antigenech s matkou. Obvykle se jedná o IgG imunoglobuliny. Optimálně reagují při 37 °C a jejich reaktivita bývá zvýrazněná při použití erytrocytů upravených proteázami nebo při vyšetření v testu s přidáním enzymu. Známý je efekt dávky, který pozorujeme jako zesílenou reakci při vyšetření protilátky s erytrocyty homozygotními pro antigen. Protilátky přímo neaglutinují antigen-pozitivní erytrocyty, lze je prokázat jako senzibilizující protilátky v enzymovém nebo nepřímém antiglobulinovém testu. Neaktivují komplement. Nejčastějšími typy aloprotilátek jsou anti-D, anti-C, která se často nachází společně s anti-D, dále anti-E a anti-c. Některé typy Rh protilátek se jako autoprotilátky 39
1
1
Transfuzní lékařství uplatňují u autoimunitní hemolytické anémie. V této souvislosti mívají často specifitu auto-anti-e, -Ce, často také vznikají proti základnímu Rh proteinu a reagují při sérologickém vyšetření se všemi Rh pozitivními i negativními erytrocyty s výjimkou Rhnull (typ erytrocytů, který nemá na membráně žádný Rh antigen). D negativní jedinci, příjemci transfuze, by neměli být transfundováni D pozitivními erytrocyty. Zcela zásadní je dodržet toto opatření u dívek a žen ve fertilním věku. Pokud jim bylo nutné podat D pozitivní erytrocyty, musí dostat k potlačení imunitní odpovědi profylaktickou dávku RhIg, vypočítanou s ohledem na množství transfundovaných erytrocytů. Pro transfuzní praxi je také vhodné respektovat obvyklý ccee fenotyp u D negativních mladých žen. Ženám D negativním se profylakticky podává RhIg také po porodu D pozitivního dítěte a i v jiných stanovených gynekologických situacích. Jeho včasné podání (do 72 hodin) má zabránit imunizaci matky D pozitivními erytrocyty dítěte, které se při fetomaternálním krvácení dostaly do kontaktu s její krví (viz kapitola Hemolytické onemocnění novorozence).
1.2.3
Ostatní krevní skupiny
Skupinový systém Lewis Skupinový systém Lewis (obr. 1.31 v barevné příloze) byl objeven spolu s nálezem protilátky anti-Lea, další protilátka proti antigenu Leb byla nalezena později. Lea a Leb jsou dva antigeny Lewis systému, které jsou kontrolované Le genem na 19. chromozomu. Vznik antigenů Lewis však ovlivňují ještě další dva nezávislé geny: ABH a Se. Lewis antigeny jsou podobně jako ABH antigeny syntetizované specifickou transferázou, která připojuje monosacharid fukózu k prekurzorovému řetězci. Syntéza probíhá v plazmě, sekretech a endodermálních tkáních, nikoli na erytrocytech, na nichž se daný typ prekurzorového řetězce nenachází. Vznik antigenů vyžaduje geny H, Se a Le. Výsledným produktem je antigen Lea. Antigen Lea je adsorbován z plazmy na membránu erytrocytů, které tím získají fenotyp Le(a+b-). Pokud je jedinec ABH sekretorem, dochází k připojení další molekuly fukózy k sacharidovému řetězci a antigen Lea se mění na antigen Leb. Tento antigen může vzniknout nejen v sekretech, ale také na erytrocytech. Fenotyp erytrocytů získává typ Le(a-b+). Pokud není jedinec ABH sekretorem (homozygot sese), nedochází ke konverzi Lea na Leb, tzn. sekrety neobsahují Leb a také erytrocyty nemění původní fenotyp Le(a+b-). Jak je zřejmé z tabulky 5, Le(a-b-) typ erytrocytů je u sekretorů i nonsekretorů bez Le genu. Le(a+b+) je fenotyp unikátní u slabých sekretorů při slabé expresi H a nekompletní fukosylaci řetězce. Kromě výše jmenovaných antigenů existují v systému Lewis i další antigeny, např. Lex, Ley. Tab. 5 Geny související se syntézou antigenů Lewis geny
fenotyp
Le, se, H
Le(a+b-)
Le, Se, H
Le(a-b+)
le, se, H
Le(a-b-)
le, se, hh
Le(a-b-)
40